DE19629281A1 - Verfahren zur Vorbereitung von Biomaterialproben für die massenspektrometrische Analyse von Genmerkmalen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemischen Probenvorbereitung von Biomaterial für die massenspektrometrische Analyse zur Feststellung der Anwesenheit bestimmter geneti­ scher Merkmale im Biomaterial.

Die Erfindung besteht in der Umwandlung der Information des genetischen Merkmals, das in einem genau definierbaren Teilstück der DNA verschlüsselt ist, in Analytmoleküle mit einem Molekulargewicht, das für das Merkmal charakteristisch ist, und in der Bereitstellung genü­ gend solcher Analytmoleküle für eine massenspektrometrische Molekulargewichtsbestimmung. Letztere gibt dann Auskunft über die Anwesenheit des gesuchten Merkmals. Die Analytmole­ küle können beispielsweise selbst je eine Kopie des Teilstücks der DNA - verändert oder un­ verändert - enthalten, wobei die Vervielfältigung der DNA in bekannter Weise durch das PCR-Verfahren vorgenommen werden kann. Die Probenvorbereitung kann massiv-parallel in Reak­ torsystemen mit sehr großen Anzahlen von Einzelreaktoren vorgenommen werden. Die Mole­ kulargewichtsbestimmung kann beispielsweise in Flugzeit-Massenspektrometern mit Hilfe der MALDI-Ionisierung vorgenommen werden. Für komplexe, aber häufig vorkommende konkre­ te Fragestellungen nach vielen Merkmalen gleichzeitig (beispielsweise für ein Mutationsscree­ ning) können benutzungsfertige Reaktorsysteme mit vielen biochemisch vorpräparierten Ein­ zelreaktorgefäßen verwendet werden.

Stand der Technik

In Biochemie und molekularer Genetik tritt in zunehmender Weise die Frage nach dem Vor­ handensein bestimmter genetischer Merkmale in einem gegebenen Biomaterial auf. Diese Merkmale sind in der DNA des Biomaterials verschlüsselt Fragen dieser Art (und die zugehö­ rigen analytischen Feststellungen) bilden die Grundlage der Genotypisierung, also der Bestim­ mung des Zusammenhangs zwischen phänotypischen Merkmalen und genetischen Merkmalen. Aber auch die Mutationsforschung, und mehr noch das Mutationsscreening, läuft auf Analysen dieser Art hinaus. Im weiteren Sinne sind Feststellungen dieser Art auch für die Identifizierung und Charakterisierung von Biomaterial wichtig. So kann man auf diese Weise krebsbefallenes Gewebe von nicht befallenem Gewebe eines Patienten unterscheiden. Oder man kann die An­ wesenheit von Viren oder Bakterien bestimmter Arten anhand von charakteristischen Teilstüc­ ken ihrer DNA in beliebigem Biomaterial feststellen. Schließlich kann durch die Bestimmung einer genügenden Anzahl dieser Merkmale auch die Zugehörigkeit von Biomaterial zu einem bestimmten Individuum festgestellt werden ("genetischer Fingerabdruck"). Auch künstlich ge­ netisch verändertes Material und seine Vererbung kann festgestellt werden.

Die DNA besteht bekanntermaßen aus zwei komplementären Ketten von vier sich abwechseln­ den Nucleotiden, deren Reihenfolge den genetischen Code bilden. Die Nucleotide bestehen jeweils aus einem Zucker (Ribose), einer Phosphorsäuregruppe, und einer Base. Zucker und Phosphorsäure bilden das Rückgrat der Kette, die vier charakteristischen Basen sind jeweils seitlich an der Phosphorsäuregruppe befestigt. Die beiden Ketten sind in Form einer Doppelhe­ lix verbunden, wobei jeweils komplementäre Nucleotide (sogenannte Basenpaare) über Was­ serstoffbrücken miteinander verbunden sind.

Unter einem "genetischen Merkmal" wird hier die Ausformung eines genau festgelegten Teil­ stücks eines Einzelteilstrangs der DNA des betrachteten Biomaterials, also eines genau defi­ nierten Teilstücks des Genoms, verstanden. Dieses Teilstück ist in der Regel nicht sehr lang und soll im hier verstandenen Sinne nur etwa 20 bis 100 Nucleotide umfassen. Das Genom einer Spezies ist durch die Reihenfolge der Nucleotide an sich prinzipiell festgelegt, wobei aber neben Teilstücken ohne jede Variabilität auch eine Anzahl einzelner Teilstücke mit mäßiger Variabilität, also mit veränderten Reihenfolgen der Nucleotide, vorkommen. Diese "Mutanten" bilden die individuelle Ausformung des Genoms, wie sie ein Individuum einer Spezies von den Vorfahren über Vater und Mutter ererbt, wie sie aber auch gelegentlich durch spontane Ände­ rungen in einem Individuum neu auftreten oder sogar künstlich erzeugt werden können. Die hier definierten Teilstücke mit genetischen Merkmalen sind nicht mit den normalerweise sehr viel größeren Genen identisch, sie können Teilstücke von Genen sein, aber auch Teilstücke von sogenannter "nichtkodierender DNA" ("introns"), die nicht zu Genen gehören, aber durchaus Informationen über Spezies oder Individuum tragen können. Ein Gen kann durchaus mehrere Stellen mit genetischen Individualmerkmalen im hier gebrauchten Sinn enthalten. Bereits heute sind etwa 50 Mutanten bekannt, deren Vorhandensein beim Menschen das Entstehen bestimm­ ter Krankheiten begünstigt, die Zahl nimmt zur Zeit wöchentlich um die Entdeckung einer sol­ chen Mutante zu. Es steht zu erwarten, daß wir in fünf Jahren alle Gene kennen, in zehn Jahren alle Mutationen.

Die genaue Festlegung des DNA-Teilstücks als Träger des interessierenden genetischen Merk­ mals kann über die Festlegung von genügend langen DNA-Sequenzen an beiden Rändern des Teilstücks erfolgen. Diese charakteristischen Randsequenzen sollten sinnvollerweise in Gebie­ ten ohne Variabilität liegen. Die Sicherheit der Festlegung hängt von der Länge des definierten Randgebiets ab. Wählt man beispielsweise für die Festlegung der Randsequenz eine Länge von 20 Nucleotiden, so kommt diese Sequenz nur noch unter DNA-Strängen der Länge von 4²⁰ ≈ 1 Billion Basenpaaren statistisch einmal vor; selbst in menschlicher DNA mit etwa 3,5 Milliar­ den Basenpaaren ist daher eine Verwechslung praktisch ausgeschlossen.

Das PCR-Verfahren (PCR = polymerase chain reaction) ist eine Methode, solche durch Rand­ gebiete definierten Teilstücke der DNA als Träger von genetischen Merkmalen aus einem ge­ samten Genom selektiv zu vervielfältigen. Die Ränder der Teilstücke werden dabei über syn­ thetisch hergestellte Nucleotid-Sequenzen definiert. Diese Sequenzen heißen "Primer", sie la­ gern sich an der ausgewählten Stelle einer einzelsträngigen DNA durch Hybridisierung an und bilden dann den Startpunkt einer enzymatischen Komplettierung des helixförmigen Doppel­ stranges der DNA aus einzelnen Nucleinsäuren durch ein beigegebenes Enzym (DNA-Polyme­ rase). In einem Folgeschritt wird dann der Doppelstrang durch Hitzedenaturierung wieder in zwei Einzelstränge zerlegt. Die zyklisch häufig wiederholten PCR-Schritte enden mit einer großen Anzahl von genauen Kopien des DNA-Teilstücks, das zwischen den beiden durch die Primer definierten Randsequenzen liegt. In 30 solcher Zyklen werden aus einem einzigen sol­ chen DNA-Teilstück durch jeweilige Verdoppelung der Anzahl 2³⁰ ≈ 1 Milliarde≈ 1,6 Femto­ mol solcher Kopien.

Nach dem Stand der Technik können die so hergestellten DNA-Kopien ("PCR-Transscripte") einerseits durch Gelelektrophorese direkt auf ihr Molekulargewicht hin untersucht werden. Dieser Vorgang ist zeitraubend, nicht sehr genau, wenig empfindlich und nicht besonders für eine massiv-parallele Verarbeitung geeignet. Andererseits können die Basensequenzen durch Sangersequenzierung mit Gelelektrophorese als Bestimmungsmethode ermittelt werden, diese Methode liefert mehr Information, ist aber noch aufwendiger. Die Laufzeit der elektrophoreti­ schen Trennung ist bei beiden Verfahren der zeitbestimmende Faktor, der die Analysenge­ schwindigkeit limitiert. Die Elektrophoresegeschwindigkeit ist aus physikalischen Gründen begrenzt.

Es ist aber zu erwarten, daß massenspektrometrische Messungen des Molekulargewichts mit weit höherer Empfindlichkeit und weit höheren Geschwindigkeiten möglich sein werden. Der gegenwärtig rasche Fortschritt in der MALDI-Technik führt zu hohem Automatisierungsgrad der Probenionisierung und zu kurzzeitigen Analysen. Es werden damit Molekulargewichtsbe­ stimmungen auch sehr großer Analytmoleküle in Mengen von einigen hundert Attomol in Meßdauern von wenigen Sekunden möglich. Auf einem Probenträger können viele Tausende von Proben untergebracht werden. Die Automatisierung und die hohe Dichte an Proben eröff­ nen die Möglichkeit zu einer massiv-parallelen Verarbeitung von einigen zehntausend Proben pro Tag auch in der massenspektrometrischen Analyse.

Massenspektrometer mit MALDI- oder ESI-Technik (ESI = Elektrosprüh-Ionisierung) werden bereits für die Sequenzierung der DNA nach dem Sanger-Schema unter Benutzung von PCR-Verfahren eingesetzt, siehe dazu PCT/US94/00193.

In der Biochemie und der Molekulargenetik haben sich für die parallele (synchrone) Verarbei­ tung vieler Proben sogenannte Mikrotiterplatten durchgesetzt. Es gibt bereits heute kommer­ ziell erhältliche Probenvorbereitungssysteme, die mit Mikrotiterplatten arbeiten. Diese enthiel­ ten ursprünglich auf einer nutzbaren Fläche von 72 mal 108 Millimeter 96 kleine Reaktionsge­ fäße in einem 9-mm-Raster. Heute haben sich Platten der gleichen Größe mit 384 fest im Kunststoff eingelassenen Reaktionsgefäßen im 4,5-mm-Raster durchgesetzt. Platten mit 864 Reaktionsgefäßen im 3-mm-Raster sind im Kommen, und noch viel höhere Dichten sind in Diskussion.

Die häufig "massiv-parallel" genannte Verarbeitung von Proben, beispielsweise in der moleku­ laren Genetik, besteht nun einerseits darin, nicht nur mit einer einzigen solchen Mikrotiterplatte zu arbeiten, sondern mit einer großen Anzahl solcher Platten parallel. Beispielsweise können bei gleichzeitiger Behandlung von 120 solcher Platten in einer einzigen PCR-Apparatur mehr als 46 000 DNA-Proben gleichzeitig in einer Zeit von etwa 3 Stunden jeweils milliardenfach vervielfältigt werden. Andererseits ist zu erwarten, daß sich die PCR-Zeit für eine Vermilliar­ denfachung mit miniaturisierten Reaktionssystemen in naher Zukunft auf weniger als 10 Minu­ ten reduzieren wird, wobei sich durch die Verkleinerung der Reaktionssysteme auf wenige Mikroliter Inhalt mehr als Tausend solcher Reaktionssysteme auf der Fläche einer heutigen Mi­ krotiterplatte unterbringen lassen. Beispielsweise ergeben sich auf der Fläche heutiger Mikroti­ terplatten 1944 Probengefäße im 2-mm-Raster oder 3456 Gefäße im 1,5-mm-Raster. Die Ein­ führung der Mikrosystemtechnik kann zu weiterer Verkleinerung führen. Die synchrone Über­ tragung aller Proben aus diesen Mikroreaktoren auf MALDI-Trägerplatten wird folgen.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu finden, mit dem sich die Anwesenheit von bekannten Ausformungen genetischer Merkmale in Biomaterial schnell massenspektrometrisch feststellen läßt. Das Verfahren soll einer massiv-parallelen Verarbeitung mit einer schnellen Feststellung von vielen genetischen Merkmalen im selben Biomaterial zugänglich sein. Schließ­ lich soll es möglich sein, für komplexe, aber häufig vorkommende konkrete Fragestellungen nach vielen Merkmalen gleichzeitig (beispielsweise für ein Mutationsscreening) ein benutzungs­ fertiges Reaktorsystem mit vielen einzeln biochemisch so vorpräparierten Reaktorgefäßen zu verwenden, daß alle Gefäße nur noch mit gleichen Proben- und Reaktionsmaterialien zu be­ schicken sind.

Beschreibung der Erfindung

Es ist der Grundgedanke der Erfindung, den DNA-Strang mit dem genetischen Merkmal durch eine biochemische Verarbeitung des Biomaterials im Rahmen der Probenvorbereitung für die Erzeugung einer Vielzahl von Molekülen zu verwenden, die massenspektrometrisch gut detek­ tierbar sind, und die bekannte Ausformung des Merkmals, dessen Anwesenheit festgestellt werden soll, zur Ausbildung eines charakteristischen Molekulargewichts dieser Moleküle zu benutzen, so daß die massenspektrometrische Messung des Molekulargewichts die Information über die Anwesenheit dieser bestimmten Ausformung des genetischen Merkmals im untersuch­ ten Biomaterial ergibt. Dabei können andere Ausformungen des Merkmals zu anderen Moleku­ largewichten führen, so daß die massenspektrometrische Messung auch Auskunft über die Anwesenheit anderer Ausformungen des genetischen Merkmals geben kann.

Einfacher ausgedrückt soll ein gesuchtes genetisches Merkmal auf biochemischem Wege in eine Vielzahl massenspektrometrisch detektierbarer Analytmoleküle eines bestimmten Moleku­ largewichts transformiert werden und die massenspektrometrische Analyse soll Auskunft über die Anwesenheit des Merkmals geben.

Die einfachste Verwirklichung dieser Grundidee besteht darin, ein solches Teilstück der DNA-Kette mit dem genetischen Merkmal durch das an sich bekannte PCR-Verfahren aus der DNA-Kette heraus selektiv zu vervielfältigen und selbst als charakteristisches Analytmolekül zu ver­ wenden. Die PCR-Kopien dieses Teilstücks sollen also die Analytmoleküle bilden, deren Mo­ lekulargewicht bestimmt werden soll.

Mutationen eines genetischen Merkmals können Veränderungen eines einzigen Nucleotids an einer Stelle in der DNA-Kette sein, in der Regel ein Ersatz des Nucleotids durch ein anderes. Man spricht dann von Punktmutationen. Es findet dabei bereits eine Änderung des Molekular­ gewichts dieser DNA-Kette statt, die allerdings nur wenige atomare Masseneinheiten beträgt, und bei großen Absolutmassen schwer zu messen ist.

Anscheinend häufiger sind aber Mutationen, die durch Einfügen oder Weglassen einiger Nucleotide zustandekommen. Diese Mutationen zeichnen sich durch weit kräftigere Änderun­ gen des Molekulargewichts der DNA-Kette aus. Wird aus einer DNA-Kette ein Teilstück der Länge von 100 Nucleotiden herausgeschnitten und vervielfacht, so ändert das Einfügen je eines Nucleotids das Molekulargewicht des Teilstücks bereits um etwa ein Prozent. Änderungen dieser Größenordnung sind leicht massenspektrometrisch zu messen.

Die schwerer direkt meßbaren Punktmutationen lassen sich durch biochemische Mittel, bei­ spielsweise durch Hybridisierung mit anschließendem enzymatischen Zerschneiden gezielt in zwei DNA-Teilstücke zerlegen, und damit wieder in Analytmoleküle umwandeln, deren cha­ rakteristisches Molekulargewicht leicht zu messen ist.

Es ist nun eine weitere Ausformung der Erfindung, das bekannte Verfahren der matrixunter­ stützten Laserdesorption (MALDI) für die Ionisierung der Analytmoleküle zu verwenden und in einem geeigneten Massenspektrometer einzusetzen. Besonders vorteilhaft können hier Flug­ zeit-Massenspektrometer verwendet werden. Dieses Verfahren ist aber auch für alle Arten von speichernden Massenspektrometern, wie Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen oder Ionen-Cyclotron-Resonanz-Spektrometer geeignet.

Nun ist aber bekannt, daß sich die DNA-Teilstücke selbst für das MALDI-Verfahren sehr schlecht eignen. Die DNA ist in der sauren Umgebung der normalerweise angewandten Ma­ trixsubstanzen nicht stabil. Sie läßt sich wegen seiner großen Anzahl an negativen Ladungen sehr schlecht positiv laden, aber auch MALDI mit Nachweis der negativ geladenen Ionen bringt keine guten Resultate.

Es ist daher eine weitere Verfeinerung der Erfindung, durch ein an sich für die Verbesserung des MALDI-Verfahrens bereits bekanntes Verfahren die DNA-Teilstücke durch die Einführung von Thio-Gruppen an der Phosphorsäure des Rückgrats und durch Alkylierung so zu stabilisie­ ren, daß ein positiv ladendes MALDI möglich wird. Eine weitere Verbesserung kann durch das ebenfalls bereits bekannte Verfahren des Anhängens einer Gruppe mit einer positiven Ladung, beispielsweise durch eine quaternäre Ammonium-Gruppe, erreicht werden. Wenn diese Reak­ tionen nahezu mit 100% Ausbeute durchgeführt werden, geht die Information über die Mutan­ te des genetischen Merkmals bei diesen Umwandlungen nicht verloren.

Die Probenvorbereitung, die nach diesem Verfahren für die Feststellung verschiedener geneti­ scher Merkmale in einem Material notwendig ist, ist bis auf die Zugabe der speziellen Primer zur Definition des genetischen Merkmals für alle Proben des Materials völlig identisch. Sie läßt sich daher in geeigneten Systemen zur massiv-parallelen Vorbereitung von vielen Proben eines Biomaterials einsetzen. Es ist daher eine weitere Idee der Erfindung, eine solche massiv­ parallele Verarbeitung einzusetzen.

In der Praxis kommen immer wieder gleiche Fragestellungen nach einem festgelegten Bündel von genetischen Merkmalen vor. Das kann beispielsweise die Frage nach dem Vorkommen von einer Reihe von Viren oder Bakterien in einem Biomaterial betreffen, oder auch die Frage nach einer Reihe von krankheitsbegünstigenden Merkmalsfaktoren in menschlichem Blut. Es ist da­ her eine weitere Idee der Erfindung, ein System von Reaktoren zu benutzen, in dem die einzel­ nen Reaktoren bereits mit den für die Feststellung der Einzelmerkmale speziell gebrauchten Biochemikalien versehen sind. Im einfachsten Fall können das die Primer sein. Aber es ist auch möglich, die Polymerase und die zur Vervielfältigung notwendigen Nucleotide vorpräpariert in den Gefäßen zu haben. Es brauchen dann nur kleine Probenmengen des Biomaterials zugege­ ben werden. Alle Reaktoren werden dann synchron und parallel den Schritten der Probenvor­ bereitung unterworfen. Diese Schritte können zweckmäßigerweise in Automaten ablaufen.

Besonders günstige Ausführungsformen

Zur Schilderung einer günstigsten Ausführung werde angenommen, daß zur Feststellung der Anlage eines Patienten in bezug auf bestimmte Krankheiten die Anwesenheit von 380 festge­ legter, krankheitsfördernden Mutanten in menschlichem Blut abzufragen seien. Die Erfindung soll allerdings nicht auf diesen Fall beschränkt sein, der Fachmann kann diese Fragestellung leicht auf andere komplexe Fragestellungen übertragen.

Die zugehörigen 380 Paare von Primern für diese Fragestellung sind bereits in 380 von den insgesamt 384 Einzelgefäßen von normalen, vorpräparierten Mikrotiterplatten enthalten. Die mit geeigneter Wandadsorptivität hergestellten Mikrotiterplatten wurden in Automaten mit geringen Lösungsmengen dieser Primer befüllt und die Lösungsmengen wurden in einer Vaku­ umkammer durch Evakuieren eingetrocknet. Die Primer werden dabei von den Wänden der Einzelgefäße adsorbiert, sie sind in diesem getrockneten Zustand über lange Zeit haltbar. In die restlichen vier Einzelgefäßen, zweckmäßigerweise in den vier Ecken der Mikrotiterplatte, kön­ nen später geeignete Kalibriersubstanzen für die massenspektrometrische Messung der genauen Probenpositionen auf der Probenträgerplatte eingebracht werden. Diese Kalibriersubstanzen können aber auch Kontrollproben für das PCR- und Probenvorbereitungsverfahren anhand bekannter DNA-Teilstücke sein, in diesem Fall sind auch hier schon die Primer vorhanden.

Im Analysenlaboratorium werden nun die 380 (oder 384) Einzelgefäße der vorpräparierten Mikrotiterplatte in einem Pipettierautomaten mit gleichen Suspensionsmengen des Bluts ge­ füllt, wobei die Blutzellen in bekannter Weise so lysiert worden sind, daß die DNA frei gelöst ist. Die Suspension ist so verdünnt, daß sich die Substanzen aus etwa 10 bis hundert Blutzellen in jedem Einzelgefäß befinden. Zugegeben wird auch zu allen Reaktionsgefäßen eine gleiche Lösung mit freien Nucleotiden und einer geeigneten Polymerase für den PCR-Prozess. Es wurden aus Bakterien, die in vulkanischen Quellen leben, besondere taq-Polymerasen gewon­ nen, die bei hohen Temperaturen optimal arbeiten. Diese, besonders aber auch genetisch ver­ besserte, Polymerasen sind kommerziell erhältlich.

Durch Erhitzung auf 94°C wird dann die DNA dissoziiert, nach Abkühlung auf 40°C mit einem Primer des Primerpaares hybridisiert, und bei 73°C durch die Polymerase vom Primer ausge­ hend unter Benutzung der freien Nucleotide wieder zu einem Doppelstrang zusammengebaut Der Primer bestimmt dabei auch die Richtung, in der polymerisiert wird. Der Primer ist so kon­ struiert, daß nur in Richtung des genetischen Merkmals polymerisiert wird. Die DNA in der anderen Richtung wird nicht dupliziert. Durch zyklisches Durchfahren dieses Temperaturpro­ gramms, bei dem in statistisch zufälliger Folge jeweils einer der beiden Primer benutzt wird, wird durch fortgesetzte Duplizierung erreicht, daß nur noch der DNA-Strang zwischen den beiden Primern dupliziert wird, da jeweils diejenigen Teile der DNA, die außerhalb des Teil­ stücks mit dem genetischen Merkmal liegen, abgeschnitten werden.

Der Temperaturzyklus kann mit gegenwärtig benutzten, speziell dazu hergestellten Mikrotiter­ platten in etwa 6 Minuten durchfahren werden. Nach drei Stunden sind etwa 30 Zyklen absol­ viert, mit einer Vermilliardenfachung der Kopien. Da sich in den einzelnen Gefäßen der Mi­ krotiterplatte jeweils 10 bis hundert Blutzellen befanden, sind jetzt etwa 16 bis 160 Femtomol an Kopien vorhanden.

Diese DNA-Kopien enthalten alle einseitig einen der beiden Primer. Durch geeignete Modifi­ kation, beispielsweise mit Biotin, lassen sich die DNA-Kopien über das Biotin mit Affinitätsli­ ganden wie Avidin an den Wänden der Reaktorgefäße fixieren. Die DNA-Kopien können dann sehr einfach von allen anderen Substanzen, die sich im Reaktorgefäß befinden, durch Waschen mit leicht saurem Wasser (bespielsweise durch Zugabe von 3% Trifluoressigsäure angesäuert) befreit werden. Die DNA-Kopien können dann (in manchen Fällen auch besser vor dem Wa­ schen) stabilisiert werden. Das kann in an sich bekannter Weise durch gezielten Ersatz einer OH-Gruppe an der Phosphorsäure durch eine Thio-Gruppe, und durch Alkylierung der basen­ ständigen OH-Gruppen geschehen. Nach weiteren Reinigungsvorgängen wird die Fixierung an der Gefäßwand aufgetrennt, und ein Ende des stabilisierten DNA-Strangs wird in an sich be­ kannter Weise mit einer Gruppe versehen, die eine positive Ladung trägt, beispielsweise durch Anhängen einer quaternären Ammoniumgruppe.

In den vier Eckgefäßen der Mikrotiterplatte werden jetzt Lösungen mit der Kalibriersubstanz zugegeben, falls nicht schon als PCR-Kontrollsubstanz vorhanden.

Die so in den einzelnen Reaktionsgefäßen gelösten stabilisierten und veränderten DNA-Kopien bilden nun die Analytmoleküle. Teilmengen der Analytmoleküle können nun, einschließlich der vier Kalibriersubstanzen, mit einer Vielfachpipette aus der Mikrotiterplatte entnommen und auf einen vorpräparierten MALDI-Probenträger aufgebracht werden. Dabei können die Analytmo­ leküle durch einen elektrophoretischen Prozeß zur Pipettenspitze hin angereichert werden. Der MALDI-Probenträger kann auch schon durch seine Vorpräparation eine Substanz enthalten, deren Molekulargewicht genau bekannt ist. Diese Substanz kann als Referenz für die Bestim­ mung des genauen Molekulargewichts diesen.

Die MALDI-Probenträger werden dann in an sich bekannter Weise der Ionenquelle des Mas­ senspektrometers zugeführt, und die einzelnen Probenaufträge werden dort in ebenfalls be­ kannter Weise automatisch auf die Molekulargewichte der Analytsubstanzen hin untersucht
Dieses Verfahren kann dabei in verschiedener Weise modifiziert werden. So ist es möglich, die Phosphorsäure-Modofizierung mit einer Thiogruppe in einem frühen Schritt vor der massen­ weisen Vervielfältigung vorzunehmen, und eine Polymerase zu benutzen, die die veränderte DNA vervielfältigt. Es können auch bereits alkylierte Nucleotide verwendet werden.

Es ist aber auch möglich, die DNA-Kopien gar nicht selbst in die Analytmoleküle einzubauen, sondern sie nur dazu zu benutzen, andere Moleküle charakteristischen Molekulargewichts zu bilden, beispielsweise durch Hybridisierung mit Abspaltung des charakteristischen Analytmole­ küls.

Claims (14)

1. Verfahren für die biochemische Vorbereitung von Biomaterialproben für die massenspek­ trometrische Analyse zur Feststellung der Anwesenheit bestimmter genetischer Merkmale, dadurch gekennzeichnet, daß die Anwesenheit eines gesuchten genetischen Merkmals im Biomaterial durch die bio­ chemische Probenvorbereitung zur Erzeugung von Analytmolekülen kennzeichnenden Molekulargewichts führt und daß ausreichend viele dieser Analytmoleküle für die massen­ spektrometrische Analyse hergestellt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenvorbereitung die selektive enzymatische Vervielfältigung eines DNA-Teilstücks umfaßt, das das genetische Merkmal enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatisch hergestellten Kopien des DNA-Teilstücks selbst in unveränderter oder veränderter Form das charakte­ ristische Analytmolekül zur Kenntlichmachung des genetischen Merkmals bilden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatisch hergestellten Kopien der DNA-Teilstücke durch Stabilisierung ihres Rückgrats, durch Stabilisierung der Basen, und/oder durch Anhängen einer spezifischen chemischen Gruppe verändert wer­ den.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die angehängte spezifische chemische Gruppe eine elektrische Ladung trägt und damit zu einer einfacheren Ionisie­ rung des Analytmoleküls beiträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische chemische Gruppe eine Fixierung des Analytmoleküls an einer vorbereiteten Festkörperoberfläche ermöglicht, wobei die Fixierung besonders zum Reinigen der Analytmoleküle dienen kann.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische chemische Gruppe eine Spaltung ermöglicht, die unter anderem auch eine Fixierung auflösen kann.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenvorbereitung für viele Biomaterialproben gleichzeitig in einer Vorrichtung mit einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen vorgenommen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mit der Viel­ zahl von Reaktionsgefäßen bereits für die Aufgabe der Analyse auf vorbestimmte Sätze von Merkmalen hin vorpräpariert ist und mindestens die für eine selektive Vervielfältigung der DNA-Teilstücke benötigten selektiven Biochemikalien ("Primer") in den Reaktionsge­ fäßen vorhanden sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrich­ tung mit der Vielzahl von Reaktionsgefäßen eine Mikrotiterplatte ist.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die massenspektrometrische Analyse des Molekulargewichts der Analytmoleküle mit Hilfe der Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption vorgenommen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die massenspektrometrische Analyse in einem Flugzeit-Massenspektrometer vorgenommen wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyt­ moleküle aus den Reaktionsgefäßen gleichzeitig auf eine Probenträgerplatte übertragen werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Übertragung mit einer Vielfachpipette automatisch erfolgt.