DE19626373A1

DE19626373A1 - Novel use of active ingredients that affect the function of non-neuronal acetylcholine

Info

Publication number: DE19626373A1
Application number: DE19626373A
Authority: DE
Inventors: Ignaz Prof Dr Med Wessler
Original assignee: Boehringer Ingelheim GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim GmbH
Priority date: 1996-07-02
Filing date: 1996-07-02
Publication date: 1998-01-08
Also published as: WO1998000119A2; ZA975804B; WO1998000119A3; AU3263297A

Abstract

The present invention relates to a process for determining the functional state of non-neuronal acetylcholine in human tissue or cells which are accessible either directly or by endoscopy. It also relates to the use of active ingredients which can affect the synthesis, release, inactivation and function of non-neuronal acetylcholine.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Verwendung von Wirkstoffen, mit denen die Funktionen von nicht neuronalem Acetylcholin - z. B. epithelialem Acetylcholin - beeinflußt werden kann.The present invention relates to a novel use of active ingredients with which have the functions of non-neuronal acetylcholine - e.g. B. epithelial Acetylcholine - can be influenced.

Acetylcholin wirkt als zentraler Neurotransmitter im zentralen, peripheren und enteralen Nervensystem. Demgemäß kann Acetylcholin in den entsprechenden Neuronen nachgewiesen werden.Acetylcholine acts as a central neurotransmitter in the central, peripheral and enteral nervous system. Accordingly, acetylcholine can be used in the corresponding Neurons are detected.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Acetylcholin nicht nur in Neuronen als Neurotransmitter eine zentrale Aufgabe erfüllt, sondern, daß sogenanntes nicht-neuronales Acetylcholin im humanen Oberflächenepithel eine wichtige Rolle spielt und dort durch das Enzym Gholin-Acetyltransferase (ChAT) synthetisiert wird.Surprisingly, it has now been found that acetylcholine is not only found in Neurons as a neurotransmitter fulfills a central task, but that so-called non-neuronal acetylcholine in human surface epithelium plays an important role and there by the enzyme gholin acetyltransferase (ChAT) is synthesized.

So kann nicht-neuronales Acetylcholin beispielsweise in dem Oberflächenepithel humaner Atemwege, des Magen-Darm-Traktes - wie Dünndarm, Colon, Sigma und Gallenblase - der vaginalen Schleimhaut und auch der Epidermis der menschlichen Haut nachgewiesen werden.For example, non-neuronal acetylcholine can be found in the surface epithelium human respiratory tract, gastrointestinal tract - such as small intestine, colon, sigma and Gallbladder - the vaginal mucosa and also the epidermis of the human skin.

Die - überraschenderweise - weite Verbreitung von Acetylcholin im menschlichen Epithel konnte dabei in mehrfacher Weise mittels experimentell unterschiedlicher Ansätze nachgewiesen werden: z. B.The - surprisingly - widespread use of acetylcholine in humans Epithelium could be experimentally different in several ways Approaches are demonstrated: e.g. B.

- Nachweis der Gegenwart des ChAT-Proteins auf dem Wege der Immunohistochemie und Western Blot;- Detection of the presence of the ChAT protein by the Immunohistochemistry and western blot;
- Nachweis der ChAT-Ezymaktivität in isolierten Epithel-Zellen - und- Detection of ChAT enzyme activity in isolated epithelial cells - and
- Nachweis von Acetylcholin in Epithel-Zellen mittels HPLC-Analyse.- Detection of acetylcholine in epithelial cells using HPLC analysis.

Der Nachweis von nicht-neuronalem Acetylcholin kann durch einfaches "Abwischen" der entsprechenden Oberflächen mit einem Wattestäbchen erfolgen. Das dabei von der Watte aufgenommene Zellmaterial enthält soviel Acetylcholin, daß es für einen analytischen Nachweis ausreicht. Bei dieser Methode der Probennahme wird beispielsweise weder die Basalmembran-(Bronchien) noch die Lamina muscularis mucosae (Intestinum) beschädigt, wodurch eine Kontamination der aus der Watte gewonnenen Extrakte mit cholinergen Neuronen ausgeschlossen ist. Daneben ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß das Oberflächenepithel humaner Atemwege - ebenso wie die humane Epidernis - nicht durch cholinerge Neuronen innerviert wird.The detection of non-neuronal acetylcholine can be done by simple "Wipe" the corresponding surfaces with a cotton swab. The cell material absorbed by the cotton contains so much acetylcholine, that it is sufficient for an analytical proof. With this method of For example, neither the basement membrane (bronchi) nor the Lamina muscularis mucosae (intestinum) damaged, causing contamination the extracts obtained from the cotton wool with cholinergic neurons is excluded. In addition, it is known from the prior art that the Surface epithelium of human airways - just like the human epidernis - does not is innervated by cholinergic neurons.

Neben anderen überzeugenden Nachweisen liefert die sogenannte Western Blot- Analyse einen eindrucksvollen Beweis für die Anwesenheit von ChAT-Proteinen in den erwähnten Epithelzellen. So konnten u. a. aus humanen Bronchial- Epithelzellen ChAT-Proteine mit Molekulargewichten von ca. 45 und 51 kD extrahiert werden, wobei dem letzteren eine dominante Expression zugeordnet werden kann.In addition to other convincing evidence, the so-called Western blot Analysis provides impressive evidence for the presence of ChAT proteins in the epithelial cells mentioned. So u. a. from human bronchial Epithelial cells ChAT proteins with molecular weights of approx. 45 and 51 kD are extracted, the latter being assigned a dominant expression can be.

Im Intestinum konnte eine starke ChAT-entsprechende Immunoreaktivität in Epithelzellen nachgewiesen werden. Diese immunpositiven Enterozyten verkörpern Brush-Border-Zellen, die Microvilli aufweisen, und die in das Absorptions- und Sekretionsgeschehen eingebunden sind.In the intestine, a strong ChAT-related immunoreactivity was found in Epithelial cells are detected. These immunopositive enterocytes embody brush border cells that have microvilli and that in the Absorption and secretion processes are involved.

Epitheliales Acetylcholin konnte überraschenderweise entlang des gesamten Intestinaltraktes - beginnend in der Mundschleimhaut bis zum Dünn- und Dickdarm sowie in der Gallenblase - nachgewiesen werden. Gleiches gilt für die Atemwege, wobei Acetylcholin in großen wie auch in kleinen Bronchien nachgewiesen werden konnte. Ebenso wurde epidermales Acetylcholin im Bereich der nahezu gesamten Körperoberfläche gefunden (obere und untere Extremitäten Thorax, Bauch und Rücken). Eine besonders ausgeprägte ChAT-entsprechende Immunoreaktivität wurde in der Wachstumszone der Haare, den Haarfollikeln, gefunden. Daneben konnte Acetylcholin in den humanen Körperhaaren nachgewiesen werden.Epithelial acetylcholine was surprisingly found along the entire Intestinal tract - starting in the oral mucosa to the thin and Colon and gallbladder - can be detected. The same applies to the Respiratory tract, with acetylcholine in both large and small bronchi could be demonstrated. Likewise, epidermal acetylcholine was in the area found almost the entire body surface (upper and lower extremities Thorax, abdomen and back). A particularly pronounced ChAT corresponding Immunoreactivity was in the growth zone of the hair, the hair follicles, found. In addition, acetylcholine could be found in the human body hair be detected.

In diesem Zusammenhang sei auf die Wirkungen von Acetylcholin auf die Funktion von Epithel-/Epiderniszellen hingewiesen:In this context, the effects of acetylcholine on the Function of epithelial / epidernal cells noted:

- Steigerung der Chloridsekretion- Increased chloride secretion
- Steigerung der Zilientätigkeit- Increase in cilia activity
- Regulation der Zell-Zellkommunikation mit Beeinflussung der Funktion von "tight-junctions", "gap-junctions" und Desmosomen- Regulation of cell-cell communication with influencing the function of "tight junctions", "gap junctions" and desmosomes
- Proliferationssteigerung- increase in proliferation
- Sekretion von Phopholipiden- Phopholipid secretion
- Regulation der Resorption (z. B. Cholin)- regulation of absorption (e.g. choline)

In der Tat konnte der experimentelle Beweis erbracht werden, daß nicht- neuronales Acetylcholin wichtige Funktionen von nicht-neuronalen Zellen (Epithelzellen) reguliert: Zell-Zellkontakt, Barriere-Funktion, Lymphdrainage, Proliferation. Diese neuen Erkenntnisse ermöglichen es, bei Krankheitszuständen die mit einer Verstellung des nicht-neuronalen Acetylcholinsysterns einhergehen, die erfindungsgemäßen Maßnahmen anzuwenden.Indeed, experimental evidence has been provided that non- Neural acetylcholine important functions of non-neuronal cells (Epithelial cells) regulates: cell-cell contact, barrier function, lymphatic drainage, Proliferation. These new discoveries make it possible to treat illnesses associated with an adjustment of the non-neuronal acetylcholine system, to apply the measures according to the invention.

Demzufolge kann mit Substanzen, die eine Wirkung auf die Funktion von nicht- neuronalem Acetylcholin entfalten können, auch ein positiver therapeutischer Effekt bezüglich Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes, der Atemwege und der Haut, die in Zusammenhang mit einer gestörten Funktion von nicht-neuronalem Acetylcholin stehen, erzielt werden.As a result, substances that have an effect on the function of non- neuronal acetylcholine can develop, also a positive therapeutic Effect on diseases of the gastrointestinal tract, respiratory tract and Skin associated with impaired function of non-neuronal Acetylcholine stand can be achieved.

So eröffnet beispielsweise die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, die wässerige Diarrhoe - wie sie z. B. bei der Cholera beobachtet wird - mit topisch wirkenden Antagonisten an Muskarinrezeptoren (nicht-selektive und M1-selektive Antagonisten) therapieren zu können. Daneben wird die Therapie von entzündlichen Darmerkrankungen - wie z. B. der Colitis ulzerosa - mit topisch wirksamen Agonisten an Muskarin-/Nikotinrezeptoren ermöglicht, da bei diesem Krankheitsbild die Barrierefunktion der Schleimhaut gestört ist.For example, the present invention opens up the possibility of watery diarrhea - such as B. is observed in cholera - with topical antagonists acting on muscarinic receptors (non-selective and M1-selective Antagonists). In addition, the therapy of inflammatory bowel diseases - such as B. Ulcerative colitis - with topical effective agonists on muscarinic / nicotine receptors, because with this Disease condition the barrier function of the mucous membrane is disturbed.

Bezüglich der Atemwegserkrankungen kann erfindungsgemäß die zystische Fibrose mit topisch wirkenden Agonisten an Muskarinrezeptoren, mit nicht- selektiven oder M1-selektiven Agonisten oder topisch-wirksamen Hemmstoffen der Cholinesterase ermöglicht werden. With regard to respiratory diseases, the cystic Fibrosis with topical agonists on muscarinic receptors, with non- selective or M1 selective agonists or topically active inhibitors the cholinesterase.

Erfindungsgemäß wird auch eine Therapiemöglichkeit der Hypersensivität (Asthma bronchiale) mit topisch wirkenden Antagonisten an Muskarinrezeptoren (nicht subtypenselektiven M1-Rezeptoren) eröffnet.According to the invention, there is also a therapy option for hypersensitivity (Bronchial asthma) with topically acting antagonists at muscarinic receptors (non-subtype-selective M1 receptors) opened.

Letztendlich erschließt die vorliegende Erfindung bei Hauterkrankungen - wie zum Beispiel bei der Behandlung des Pemphigus - und von Wundheilungsstörungen mit Medikamenten, die eine stimulierende Wirkung auf die Funktion des epidermalen cholinergen Systems ausüben - wie z. B. Agonisten an Muskarin- oder Nikotinrezeptoren, Hemmstoffen der Cholinesterase, Aktivatoren des epidermalen Acetylcholins, Aktivatoren für die Freisetzung und Verstärkung bezüglich der Expression des synthetisierenden Enzyms ChAT - den Zugang zu einem positiven therapeutischen Effekt.Ultimately, the present invention opens up for skin diseases - such as Example in the treatment of pemphigus and wound healing disorders with drugs that have a stimulating effect on the function of the exercise epidermal cholinergic system - such as B. agonists on muscarinic or Nicotine receptors, cholinesterase inhibitors, activators of the epidermal Acetylcholins, activators for release and enhancement related to the Expression of the synthesizing enzyme ChAT - access to a positive therapeutic effect.

Auf der anderen Seite wird erfindungsgemäß eine erfolgreiche Behandlung - beispielsweise der atopischen Dermatitis, der Neurodermatitis, der Psorasis und z. B. der cholinergen Utricaria - mit Wirkstoffen, die eine hemmende Wirkung auf die Funktion von epidermalen Acetylcholin ausüben - wie z. B. Antagonisten an Muskarin-bzw. Nikotinrnzeptoren, Hemmstoffen der Cholinacetyltransferase, Hemmern der epidermalen Acetylcholin-Freisetzung und Reduktoren bezüglich der Expression des synthetisierenden Enzyms Cholinacetyltransferase - erzielt.On the other hand, according to the invention, a successful treatment - for example atopic dermatitis, neurodermatitis, psorasis and e.g. B. Cholinergic Utricaria - with active ingredients that have an inhibitory effect on perform the function of epidermal acetylcholine - such as B. antagonists Muscarinic or Nicotine receptors, choline acetyltransferase inhibitors, Epidermal acetylcholine release inhibitors and reducers related the expression of the synthesizing enzyme choline acetyl transferase - achieved.

Dabei eignen sich als topisch wirkende Agonisten zur Behandlung von Atemwegserkrankungen beispielsweise Wirkstoffe wie sie in der Deutschen Offenlegungsschrift DE-OS 38 39 385 offenbart sind - insbesondere Wal 2014. Daneben kommen z. B. Verbindungen wie Carbachol oder Acetylcholin selbst in Frage.They are suitable as topical agonists for the treatment of Respiratory diseases, for example active ingredients such as those in the German Patent Application DE-OS 38 39 385 are disclosed - in particular Wal 2014. In addition, z. B. compounds such as carbachol or acetylcholine itself in Question.

Daneben kommt als nikotinischer Antagonisten beispielsweise DMPP (Dimethyl-4- phenylpiperazinium) in Frage.In addition, DMPP (dimethyl-4- phenylpiperazinium) in question.

Als - u. a. topisch wirksame - Hemmstoffe der Cholinesterase seien neben Tacrine und Physostigmin beispielsweise Verbindungen wie sie in der Europäischen Offenlegungsschrift EP-A-0 296 650 - insbesondere Donepezil und seine Säureadditionssalze oder Wirkstoffe, wie sie in der Deutschen Offenlegungsschrift DE-OS 38 05 744 - insbesondere SDZ-ENA-713 - offenbart sind, genannt. As - u. a. topically active - cholinesterase inhibitors are in addition to tacrine and physostigmine for example compounds like those in the European Publication EP-A-0 296 650 - in particular Donepezil and his Acid addition salts or active substances, as described in the German Offenlegungsschrift DE-OS 38 05 744 - in particular SDZ-ENA-713 - are disclosed.

Als - u. a. - topisch wirkende Antagonisten an Muskarinrezeptoren seien beispielsweise - neben Wirkstoffen wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind - Atrovent, Propantelin, Buscopan, Alginor, Oxivent, Scopolamin und Atropin genannt und Verbindungen, wie sie aus der Deutschen Offenlegungsschrift 39 31 041 bekannt sind - insbesondere BA 679, BEA 2108 (Bromid des endo-3-[(Hydroxidi-2-thienylacetyl)oxy]-8,8-dimethyl-8-azonia- bicyclo[3.2.1]oct-6-ens) und BA 253 genannt.As - u. a. - Are topically acting antagonists on muscarinic receptors for example - in addition to active ingredients as known from the prior art are - Atrovent, Propantelin, Buscopan, Alginor, Oxivent, Scopolamin and Called atropine and compounds as they come from the German Disclosure 39 31 041 are known - in particular BA 679, BEA 2108 (Bromide of endo-3 - [(Hydroxidi-2-thienylacetyl) oxy] -8,8-dimethyl-8-azonia- bicyclo [3.2.1] oct-6-ens) and BA 253.

In Hinblick auf topisch wirksame Antagonisten an Muskarin- oder Nikotinrezeptoren zur Behandlung von Hauterkrankungen sei in erster Linie auf nikotinische Blocker, wie z. B. Tubocurarin, Alcuronium, Galamin und Decamethonium und Pancuronium verwiesen.With regard to topically effective antagonists on muscarinic or Nicotine receptors for the treatment of skin diseases are primarily on nicotinic blockers such as B. tubocurarine, alcuronium, galamine and Decamethonium and Pancuronium referenced.

Die beschriebene Erfindung wird nunmehr durch die folgenden Beispiele erläutert. Verschiedenartige, andere Ausgestaltungen werden für den Fachmann aus der vorliegenden Beschreibung ersichtlich. Es wird jedoch ausdrücklich darauf hingewiesen, daß die Beispiele und die Beschreibung lediglich zur Erläuterung vorgesehen und nicht als Einschränkung der Erfindung anzusehen sind.The invention described will now be illustrated by the following examples. Various other configurations are known to those skilled in the art from present description can be seen. However, it is expressly pointed out noted that the examples and description are for illustration only provided and are not to be regarded as a limitation of the invention.

Zur Bestimmung des Funktionszustandes von nicht-neuronalem Acetylcholin in direkt oder endoskopisch zugänglichem humanen Geweben oder Zellen ist vorab zu bemerken, daß diese im allgemeinen dadurch erfolgen kann, daß man aus diesen Geweben eine Probe nimmt und in dieser Probe auf an sich bekannte Weise den Gehalt an Acetylcholin bestimmt.To determine the functional state of non-neuronal acetylcholine in human tissues or cells that are directly or endoscopically accessible is upfront to note that this can generally be done by takes a sample from these tissues and in this sample is known per se Way determined the content of acetylcholine.

Dabei kann die Probennahme beispielsweise durch Wischen der Oberfläche mit einem Wattestäbchen erfolgen. Daneben kann - beispielsweise zur Bestimmung der Funktion des epithelialen Acetylcholins innerhalb des Respirationsepithels - die Probennahme in der Weise erfolgen, daß man die Probe mit einer - ggf. mit einer Testflüssigkeit - angefeuchteten Watterolle gewinnt.Sampling can be carried out, for example, by wiping the surface a cotton swab. In addition - for example for determination the function of the epithelial acetylcholine within the respiratory epithelium - the sampling takes place in such a way that the sample with - if necessary with a test liquid - moistened cotton roll wins.

Des weiteren kann zur Bestimmung des Acetylcholins aus der Haut, der Mundschleimhaut und der vaginalen Schleimhaut die sog. "Cup"-Technik angewandt werden. Dazu wird ein zur Probennahme geeignetes und mit einer das Acetylcholin aufnehmenden Flüssigkeit beschicktes Gefäß so auf die Haut aufgesetzt, daß das Acetylcholin in die Vorrichtung hinein diffundieren kann. Furthermore, to determine the acetylcholine from the skin, the Oral mucosa and the vaginal mucosa the so-called "cup" technique be applied. For this purpose, a suitable for sampling and with a Acetylcholine-absorbing liquid-loaded vessel so on the skin put on that the acetylcholine can diffuse into the device.

Daneben können zur Bestimmung der Funktionalität von nicht-neuronalem Acetylcholin Stimulationslösungen eingesetzt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind - wie z. B. Lösungen von Nikotin, Zitronensäure oder β- Adrenorezeptor-Agonisten.In addition, to determine the functionality of non-neuronal Acetylcholine stimulation solutions are used that are from the state of the art Technology are known - such. B. solutions of nicotine, citric acid or β- Adrenoreceptor agonists.

BeispieleExamples MethodenMethods Separierung der Epithel-ZellenSeparation of the epithelial cells

Humanes Gewebe (Bronchien, Intestinalgewebe) wurde von Operationsmaterial gewonnen, das im Rahmen der Tumor- und Steinchirurgie anfiel.Human tissue (bronchi, intestinal tissue) was made from surgical material won, which was incurred in the context of tumor and stone surgery.

Kleine Stücke humaner Haut (10 bis 50 mg) wurden ebenfalls aus Operations material gewonnen. Dabei wurde auschließlich nur - makroskopisch - tumorfreies Gewebe analysiert. Humane Bronchien (bis zu einem Durchmesser von 4 mm) oder Intestinalgewebe (Magen, Dünndarm und Dickdarm sowie Gallenblase) wurden vorsichtig unmittelbar nach der Dissektion von anhängenden Gewebeteilen befreit und auf dem Wege vom Krankenhaus zum Labor in einer oxygenierten Salzlösung (Zusammensetzung in mMol = 125 NaCl, 23.8 NaHCO₃, 5.05 Glukose, 2.68 KCl, 1.80 CaCl₂, 0.539 NaH₂PO₄, 0.0567 Ascorbinsäure und 0.001 Cholinchlorid) aufbewahrt.Small pieces of human skin (10 to 50 mg) were also removed from operations material won. It was only - macroscopic - tumor-free Tissue analyzed. Human bronchi (up to a diameter of 4 mm) or intestinal tissue (stomach, small intestine and large intestine as well as gallbladder) were cautious immediately after the dissection from attached Tissue parts freed and on the way from the hospital to the laboratory in one oxygenated salt solution (composition in mmol = 125 NaCl, 23.8 NaHCO₃, 5.05 glucose, 2.68 KCl, 1.80 CaCl₂, 0.539 NaH₂PO₄, 0.0567 ascorbic acid and 0.001 choline chloride).

Die Acetylcholin- und ChAT-Aktivität wurde an mechanisch oder enzymatisch isolierten Epithelzellen bestimmt. Zur mechanischen Isolierung wurde die luminale Oberfläche des jeweiligen Gewebes vorsichtig mit einem Wattestäbchen (Q-Tip) abgestrichen.The acetylcholine and ChAT activity was mechanical or enzymatic isolated epithelial cells. The luminal was used for mechanical insulation Surface of the respective tissue carefully with a cotton swab (Q-Tip) smeared.

Zum Beispiel wurden humane Bronchien oder Jejenum in einer Petrischale mit der luminalen Seite nach oben fixiert. Mit einem Wattestäbchen wurde die luminale Oberfläche abgestrichen (Wischzeit ca. 5 Sekunden), wobei das Wattestäbchen in keinem Fall die epitheliale Oberfläche bis zur Basalmembran durchdrang, d. h. die darunterliegende Lamina propria blieb unbeschädigt. Dies wurde histologisch mehrfach überprüft.For example, human bronchi or jejenum were placed in a petri dish with the luminal side fixed upwards. With a cotton swab, the luminal Wiped surface (wiping time approx. 5 seconds), with the cotton swab in never penetrated the epithelial surface to the basement membrane, d. H. the the underlying lamina propria remained undamaged. This became histological checked several times.

In gleicher Weise wurde die epitheliale Oberfläche von intestinalen Gewebe untersucht, wobei strikt darauf geachtet wurde, daß die Lamina muscularis mucosa mit dem darunterliegenden cholinergen, submucosalen, Plexus unversehrt blieb. Auch hierzu erfolgte eine histologische Überprüfung.In the same way, the epithelial surface of intestinal tissue examined, taking great care to ensure that the lamina muscularis mucosa with the underlying cholinergic, submucosal, plexus remained intact. A histological check was also carried out on this.

In analoger Weise wurden Proben von der epithelialen Oberfläche der Mundschleimhaut bzw. der vaginalen Schleimhaut genommen.In an analogous manner, samples were taken from the epithelial surface of the Oral mucosa or the vaginal mucosa taken.

Nach dem Abwischen wurden die Wattestäbchen mit 1 ml einer 15-Vol.-%igen Ameisensäurelösung in Aceton extrahiert. Aus diesem Extrakt erfolgte dann der Nachweis des Acetylcholins.After wiping, the cotton swabs were washed with 1 ml of 15 vol% Formic acid solution extracted in acetone. This extract was then used for Detection of acetylcholine.

Epitheliale Zellen der humanen Bronchien und des Dünndarms wurden auf enzymatischem Wege isoliert - durch Inkubation (2h bei 36°C oder 24 h bei 4°C) mit 0,1%-iger Pronase in einem DMEM/F12-Medium zwecks Isolierung der Epithelzellen und nachfolgender Messung der Enzymaktivität bzw. zur "Western- Blot-Analyse" behandelt. Isolierte Epithelzellen wurden durch Färbung mit einem Antikörper gegen Pan-Zytokeratin auf ihren epithalialen Ursprung hin überprüft.Epithelial cells of the human bronchi and small intestine were revealed enzymatically isolated - by incubation (2h at 36 ° C or 24h at 4 ° C) with 0.1% pronase in a DMEM / F12 medium to isolate the Epithelial cells and subsequent measurement of enzyme activity or for "Western Blot analysis ". Isolated epithelial cells were stained with a Antibodies against pan-cytokeratin checked for their epithalial origin.

Messung des endogenen AcetylcholinsMeasurement of endogenous acetylcholine

Die Bestimmung des Acetylcholingehalts erfolgte in Wattestäbchen-Extrakten von Oberflächenepithelien und in homogenisierter humaner Haut. Die Haut wurde in 1 ml einer 15-Vol.-%igen Lösung von Ameisensäure in Aceton gegeben und mit einem Messer zerkleinert.The acetylcholine content was determined in cotton swab extracts from Surface epithelia and in homogenized human skin. The skin was in 1 ml of a 15 vol .-% solution of formic acid in acetone and with crushed with a knife.

Nach dem 30-minütigen Aufbewahren auf Eis wurde das Extraktionsmedium zentrifugiert (10 min. 4000 Upm) und der Überstand wurde bis zur Trockne im Stickstoffstrom eingeengt. Das Sediment der getrockneten Probe wurde in 300-500 µl der mobilen Phase für die HPLC-Analyse resuspendiert. Ein Volumen von 20 µl wurde injiziert, wobei das Acetylcholin durch Kationen-Austausch-HPLC mittels elektrochemischer Detektion bestimmt wurde; dazu wurde das "BAS 481 Microbore System" benutzt. Cholin und Acetylcholin wurden an einer Sep Stik- Säule (1 × 530 mm) mit einer mobilen Phase eines 40 mM Phosphat Puffers und 0.3 mM EDTA (eingestellt auf pH 8.5) chromatographiert.After being kept on ice for 30 minutes, the extraction medium became centrifuged (10 min. 4000 rpm) and the supernatant was dried to dryness in the Narrowed stream of nitrogen. The sediment of the dried sample was in 300-500 ul the mobile phase for HPLC analysis resuspended. A volume of 20 µl was injected, the acetylcholine by cation exchange HPLC was determined by means of electrochemical detection; the "BAS 481 Microbore System ". Choline and acetylcholine were used on a Sep Column (1 × 530 mm) with a mobile phase of a 40 mM phosphate buffer and Chromatographed 0.3 mM EDTA (adjusted to pH 8.5).

Der analytischen Säule folgte eine Reaktionsstufe mit einem immobilisierten Enzym (Sep Stik IMER 2/pkg), in der das Acetylcholin hydrolisiert wurde. Durch die anschließende Umsetzung mit Cholinoxidase wurde Wasserstoffperoxid gebildet, welches eine Platin-Elektrode umspülte (Referenzelektrode Ag/AgCl, 0,5 V). Der dadurch entstehende Strom verhält sich proportional zur Menge des gebildeten Acetylcholins [Reinheimer, T., P. Bernedo, H. Klapproth, H. Oelert, B. Zeiske, K. Rack´, and I. Wessler, 1996. Acetylcholine in isolated airways of rat, guinea-pig, and human: species differences in the role of airway mucosa, Am. J. Physiol. 14, L722-728], wobei die Nachweisgrenze für Acetylcholin bei 10 fmol pro 20 µl Injektionsvolumen liegt [Ricny J., K.-D. Höhle, K. Rack´ and I.Wessler, 1995. Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589]. Um eine Kontamination während des Extraktionsverfahrens ausschließen zu können, wurden Wattestäbchen, die nicht mit humanem Gewebe in Kontakt gekommen waren, unter analogen Bedingungen extrahiert. Die so gewonnenen Extrakte lieferten kein Signal für Acetylcholin.The analytical column was followed by a reaction step with an immobilized Enzyme (Sep Stik IMER 2 / pkg) in which the acetylcholine was hydrolyzed. By the subsequent reaction with choline oxidase became hydrogen peroxide formed, which washes around a platinum electrode (reference electrode Ag / AgCl, 0.5 V). The resulting current is proportional to the amount of formed acetylcholins [Reinheimer, T., P. Bernedo, H. Klapproth, H. Oelert, B. Zeiske, K. Rack, and I. Wessler, 1996. Acetylcholine in isolated airways of rat, guinea-pig, and human: species differences in the role of airway mucosa, Am. J. Physiol. 14, L722-728], the detection limit for acetylcholine at 10 fmol per 20 µl injection volume is [Ricny J., K.-D. Höhle, K. Rack´ and I.Wessler, 1995. Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589]. To avoid contamination during the To exclude extraction procedures, cotton swabs were not had come into contact with human tissue under analogous conditions extracted. The extracts obtained in this way gave no signal for acetylcholine.

Immunohistochemie und "Western Blot-Analyse"Immunohistochemistry and "Western Blot Analysis"

Das ChAT-Protein konnte auf immunohistochemischem Weg und durch "Western Blot-Analyse" durch Verwendung eines polyclonalen anti-ChAT-Antikörpers nachgewiesen werden [Schemann, M., H. Sann, C. Schaaf, and M. Mäder, 1993, Identification of cholinergic neurons in enteric nervous by antibodies against choline acetyltransferase, Am. J. Physiol. 265, G1005-G1009].The ChAT protein could be immunohistochemically and by "Western Blot analysis "using a polyclonal anti-ChAT antibody can be demonstrated [Schemann, M., H. Sann, C. Schaaf, and M. Mäder, 1993, Identification of cholinergic neurons in enteric nervous by antibodies against choline acetyltransferase, Am. J. Physiol. 265, G1005-G1009].

Dazu wurde tumorfreies, humanes Gewebe (Bronchien, Dünndarm und Magen, Haut) unmittelbar nach der operativen Isolierung mit Isopentan blitzgefroren und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Gefrorene Schnitte (4 µm) wurden - jeweils über einen Zeitraum von 15 min. - mit 4%-iger Formaldehydlösung und durch Inkubierung mit 0.1%-iger Triton X-100 Lösung permeabilisiert. For this purpose, tumor-free, human tissue (bronchi, small intestine and stomach, Skin) immediately after operative isolation with isopentane and then stored in liquid nitrogen. Frozen sections (4 µm) were - each over a period of 15 min. - With 4% formaldehyde solution and permeabilized by incubation with 0.1% Triton X-100 solution.

Zur Detektion des ChAT-Antigens wurde das Alkaline-Phosphatase-Anti-Alkaline Verfahren (APAAP) eingesetzt.The alkaline phosphatase anti-alkaline was used to detect the ChAT antigen Procedure (APAAP) used.

Dazu wurde der Anti-ChAT-Kaninchen-Antikörper (in einer Verdünnung von 1: 800) über den Zeitraum von einer Stunde behandelt. Nach 60-minütiger Inkubierung mit Anti-Kaninchen-Antikörper wurden die Schnitte über einen Zeitraum von 30 Minuten mit einem Komplex bestehend aus "Alkaline Phosphatase" und "Anti-Alkaline-Phosphatase-Maus-Antikörper" (1 : 100) inkubiert. Die Visualisierung erfolgte nach einer Entwicklungszeit von 15 und 30 Minuten in einer chromogenen Lösung, die 0.0135 g Naphthol-AS-bisphosphonat sowie "Fast Red TR-Salz" enthielt. Daraufhin wurden die Schnitte mit Hematoxylin behandelt.The anti-ChAT rabbit antibody (in a dilution of 1: 800) treated over a period of one hour. After 60 minutes Incisions were made using an anti-rabbit antibody Period of 30 minutes with a complex consisting of "alkaline Phosphatase "and" Anti-Alkaline Phosphatase Mouse Antibodies "(1: 100) incubated. The visualization took place after a development time of 15 and 30 Minutes in a chromogenic solution containing 0.0135 g of naphthol AS bisphosphonate as well as "Fast Red TR Salt". Thereupon the cuts were made with hematoxylin treated.

Für die "Western-Blot- Analyse" wurden auf enzymatischem Wege isolierte Epithelzellen bzw. - zum Vergleich - homogenisiertes Rattenhirn lysiert und die Proteine des Cytosols wurden mittels Ultrazentrifugation extrahiert. 100 µg des Proteins wurden separiert (SDS-PAGE) und auf Nitrocellulose aufgebracht.For the "Western blot analysis" were isolated enzymatically Epithelial cells or - for comparison - homogenized rat brain lysed and the Proteins from the cytosol were extracted by ultracentrifugation. 100 µg of Proteins were separated (SDS-PAGE) and applied to nitrocellulose.

Die Visualisierung erfolgte mittels des anti-ChAT-Antikörpers und dem anti- Kaninchen-IgG-Antikörper-Phosphatase-Konjugat.The visualization was carried out using the anti-ChAT antibody and the anti Rabbit IgG antibody phosphatase conjugate.

Messung der ChAT-AktivitätMeasurement of ChAT activity

Die Bestimmung der ChAT-Enzym-Aktivität wurde in Extrakten der Wattestäbchen von Abstrichen der Darmoberfläche oder in Extrakten von enzymatisch isolierten Epithel-Zellen (aus humanen Bronchien und Dünndarm) oder auch von Extrakten humaner Haut vorgenommen.The determination of ChAT enzyme activity was in extracts of cotton swabs from smears of the intestinal surface or in extracts from enzymatically isolated Epithelial cells (from human bronchi and small intestine) or from extracts human skin.

Der ChAT-Assay wurde nach Methoden durchgeführt, die aus dem Stand der Technik bekannt sind [Reinheimer, T., P. Bernedo, H. Klapproth, H. Oelert, B. Zeiske, K. Rack´, and I. Wessler, 1966. Acetylcholine in isolated airways of rat, guinea-pig, and human: species differences in the role of airway mucosa, Am. J. Physiol. In press und Ricny J., K.-D. Höhle, K. Rack´ and I.Wessler, 1995: Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589]. The ChAT assay was carried out according to methods from the prior art Technology are known [Reinheimer, T., P. Bernedo, H. Klapproth, H. Oelert, B. Zeiske, K. Rack, and I. Wessler, 1966. Acetylcholine in isolated airways of rat, guinea-pig, and human: species differences in the role of airway mucosa, Am. J. Physiol. In press and Ricny J., K.-D. Höhle, K. Rack´ and I.Wessler, 1995: Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589].

Enzymatisch isolierte Epithelzellen wurden aus einem DMEM/F12-Medium durch vorsichtige Zentrifugation (5 min, 200 Upm) und nachfolgendem dreimaligem Waschen der so erhaltenen Pellets mit jeweils 3 ml phosphat- gepufferter Salzlösung vorbereitet. Das Zell-Pellet bzw. Wattestäbchen wurden mit 0,5 1 ml Extraktionspuffer in Kontakt gebracht (10 mM Na₂HPO₄, 100 NaCl, 2 mM EDTA, 0,5% (v/v) Triton X-100). Nach 15-minütiger Eiskühlung wurden die Proben zentrifugiert (3 min; 12 000 Upm; 0°C). Ein Aliquot (20 µl) der überstehenden Lösung wurde einem Puffer zugegeben, der 8 mM Cholinchlorid, 0.1 mM Physostigmin und 0.2 mM [³H] AcCoA enthielt. Die enzymatische Reaktion wurde nach 30 Minuten gestoppt und das synthetisierte [³H]Acetylcholin wurde mittels Ionenpaar-Extraktion isoliert und der Tritium-Gehalt wurde mit Hilfe der Flüssigkeits-Scintillationsspektrometrie bestimmt, [Ricny J., K.-D. Höhle, K. Rack´ and I.Wessler, 1995. Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589]. Um die spezifische ChAT- Aktivität bestimmen zu können, wurde der selektive Inhibitor Bromacetylcholin zum Assay-Pufferzugefügt. Der Protein-Gehalt wurde gemäß Smith etal. [Smith, P.K, R.I. Krohn, G.T. Hermanson, A.K. Mallia, F.H. Gartner, M.D. Provenzano, E.K Fujimoto, N.M. Goeke, B.J. Olson, and D.C. Klenk (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150: 76-85] bestimmt.Enzymatically isolated epithelial cells were removed from a DMEM / F12 medium careful centrifugation (5 min, 200 rpm) and subsequent three times Washing the pellets thus obtained with 3 ml of phosphate buffered saline solution prepared. The cell pellet or cotton swab were included 0.5 1 ml of extraction buffer brought into contact (10 mM Na₂HPO₄, 100 NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% (v / v) Triton X-100). After 15 minutes of ice cooling, the Centrifuged samples (3 min; 12,000 rpm; 0 ° C). An aliquot (20 µl) of the the supernatant solution was added to a buffer containing 8 mM choline chloride, Contained 0.1 mM physostigmine and 0.2 mM [3 H] AcCoA. The enzymatic Reaction was stopped after 30 minutes and the [3 H] acetylcholine synthesized was isolated by ion pair extraction and the tritium content was determined using of liquid scintillation spectrometry, [Ricny J., K.-D. Höhle, K. Rack and I.Wessler, 1995. Effect of inhaled steroids on cholinergic transmission in human isolated bronchi. Eur. Respir. J. 8: 587-589]. To the specific ChAT To be able to determine activity, the selective inhibitor bromoacetylcholine was used Assay buffer added. The protein content was determined according to Smith et al. [Smith, P.K, R.I. Krohn, G.T. Hermanson, A.K. Mallia, F.H. Gartner, M.D. Provenzano, E.K. Fujimoto, N.M. Goeke, B.J. Olson, and D.C. Klenk (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150: 76-85].

ErgebnisseResults Endogenes Acetylcholin in humanen EpithelzellenEndogenous acetylcholine in human epithelial cells

Die Epithelzellen wurden durch leichtes Abreiben der luminalen Oberfläche isolierter Bronchien mit einem Wattestäbchen gewonnen, ohne dabei die Basalmembran zu durchdringen. In den Extrakten der an der Oberfläche befindlichen Epithelzellenschicht konnten so signifikante Mengen Acetylcholin (33 ± 10 pmol/g Bronchien (n = 15) mittels HPLC-EC nachgewiesen werden. Dabei konnte die Spezifität des Peaks, der in dem Chromatogramm dem Acetylcholin zugeordnet wurde, mehrfach gesichert werden. The epithelial cells were removed by lightly rubbing the luminal surface isolated bronchi with a cotton swab without losing the To penetrate the basement membrane. In the extracts of the surface epithelial cell layer could thus significant amounts of acetylcholine (33 ± 10 pmol / g bronchi (n = 15) can be detected by HPLC-EC. Here could the specificity of the peak in the chromatogram the acetylcholine assigned, can be backed up multiple times.

Der Nachweis von Acetylcholin in Epithelzellen humaner Atemwege weist darauf hin, daß wichtige epitheliale Funktionen durch nicht-neurales Acetylcholin reguliert werden (Sekretion, mukoziliäre Clearance, Barrierefunktion, Zellproliferation).Evidence of acetylcholine in epithelial cells in human respiratory tracts indicates this indicates that important epithelial functions are regulated by non-neural acetylcholine (secretion, mucociliary clearance, barrier function, cell proliferation).

Dieser überraschende Effekt eröffnet somit eine neue Therapiemöglichkeit zur Behandlung von Atemwegserkrankungen - wie z. B. der zystischen Fibrose -, mit topisch wirkenden Agonisten an Muskarinrezeptoren (nicht-selektive oder M1- selektive Agonisten) oder topisch wirksamen Hemmstoffen oder Cholinesterinase oder des Asthma bronchiale mit Antagonisten an Muskarinrezeptoren (nicht- subtypenselektive oder selektive M1-Rezeptoren).This surprising effect thus opens up a new therapeutic option Treatment of respiratory diseases - such as B. cystic fibrosis - with topical agonists on muscarinic receptors (non-selective or M1- selective agonists) or topically active inhibitors or cholinesterinase or bronchial asthma with antagonists at muscarinic receptors (non- subtype-selective or selective M1 receptors).

Auf vergleichbare Weise konnten humane Epithelzellen aus dem Intestinaltrakt gewonnen werden. Dabei wurden tumorfreie Segmente des Magens der Jejunums des Ileums, des Colons und des Sigmas von Patienten mit Tumoren im Intestinalbereich untersucht. Lichtmikroskopische Aufnahmen der Präparate belegen, daß nach dem Abreiben der luminalen Oberfläche lediglich einige Villi entfernt wurden, wohingegen die Lamina muscularis mucosa mit dem darunterliegenden submucosalen cholinergen Plexus vollkommen intakt geblieben waren.In a comparable way, human epithelial cells from the intestinal tract be won. Thereby, tumor-free segments of the jejunal stomach the ileum, the colon and the sigma of patients with tumors in the Intestinal area examined. Light microscopic images of the preparations prove that only a few villi after rubbing the luminal surface were removed, whereas the lamina muscularis mucosa with the underlying submucosal cholinergic plexus remained completely intact were.

Die Extrakte aus Epithelzellen des humanen Dünndarms enthielten etwa 1 nmol/g Jejunum. Dagegen konnte deutlich weniger Acetylcholin in den entsprechenden epithelialen Extrakten des Colons oder des Sigmas (1-50 pmol/g) nachgewiesen werden. In den entsprechenden Extrakten von Epithelzellen der Magenschleimhaut (pylorischer Teil) konnte dagegen kein epitheliales Acetylcholin nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite wurden signifikante Mengen von Acetylcholin in epithelialen Extrakten der Gallenblase (12 ± 5 pmol/g, n = 5) nachgewiesen.The extracts from epithelial cells of the human small intestine contained approximately 1 nmol / g Jejunum. In contrast, significantly less acetylcholine in the corresponding epithelial extracts of the colon or sigma (1-50 pmol / g) were detected will. In the corresponding extracts of epithelial cells of the In contrast, gastric mucosa (pyloric part) could not epithelial Acetylcholine can be detected. On the other hand, they were significant Amounts of acetylcholine in epithelial extracts of the gallbladder (12 ± 5 pmol / g, n = 5) demonstrated.

Dieser unerwartete Nachweis von epithelialem Acetylcholin im Darmtrakt und die beobachteten zellulären Wirkungen von Acetylcholin erschließt einen neuen Therapieweg zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes - wie zum Beispiel der Colitis ulzerosa - mit topisch wirksamen Agonisten an Muskarin/Nikotinrezeptoren - oder der wässerigen Diarrhoe, wie sie beispielsweise bei der Cholera beobachtet wird - mit topisch wirkenden Antagonisten an Muskarinrezeptoren (nicht selektiver und M1- selektiver Art) behandeln zu können.This unexpected detection of epithelial acetylcholine in the intestinal tract and the observed cellular effects of acetylcholine opens up a new one Therapy route for the treatment of inflammatory diseases of the Gastrointestinal tract - such as ulcerative colitis - with topical effective agonists on muscarinic / nicotine receptors - or the aqueous Diarrhea, as seen for example in cholera - with topical acting antagonists on muscarinic receptors (non-selective and M1- selective type).

Zusätzlich zu den schon erwähnten Epithelzellen der Atemwege und des Intestinums konnte Acetylcholin in den Epithelzellen der Mundschleimhaut und der Mucosa der Vagina nachgewiesen werden. So wiesen die Epithelzellen männlicher Erwachsener 8 ± 2 pmol (n=5) Acetylcholin pro Extrakt auf. Der Acetylcholingehalt der Epithelzellen von Schleimhäuten vaginaler Herkunft lag bei 6 ± 2 pmol Acetylcholin (n = 4).In addition to the previously mentioned epithelial cells of the respiratory tract and the Acetylcholine was found in the epithelial cells of the oral mucosa and the intestine Mucosa of the vagina can be detected. So the epithelial cells showed male adult 8 ± 2 pmol (n = 5) acetylcholine per extract. Of the Acetylcholine content of the epithelial cells of mucous membranes of vaginal origin was included 6 ± 2 pmol acetylcholine (n = 4).

Dazu ergänzend konnten in Schnitten humaner Haut (Epidermis/Dermis) signifikante Mengen an Acetylcholin nachgewiesen werden (1000 ± 300 pmol/g, n = 7). Der Acetylcholingehalt der huamenen Kopfhaare betrug 1,5 ± 02 nmol/g (n = 3). In allen Fällen konnte die Spezifität des Acetylcholinpeaks von allen genannten Proben im Rahmen der HPCL gesichert werden.In addition, sections of human skin (epidermis / dermis) significant amounts of acetylcholine can be detected (1000 ± 300 pmol / g, n = 7). The acetylcholine content of the hairy scalp hair was 1.5 ± 02 nmol / g (n = 3). In all cases, the specificity of the acetylcholine peak of all mentioned samples are secured within the framework of the HPCL.

Der Nachweis von epidermalem Acetylcholin und die beobachteten zellulären Wirkungen erschließt erfindungsgemäß einen neuen Zugang zur Behandlung von Hauterkrankungen - wie beispielsweise des Pemphigus - oder von Wundheilungsstörungen mit pharmazeutischen Wirkstoffen, die eine stimulierende Wirkung auf die Funktion des epidermalen, cholinergen Systems ausüben - wie z. B. Agonisten an Muskarin- oder Nikotinrezeptoren, Hemmstoffe der Cholinesterase, Aktivatoren des epidermalen Acetylcholins, Aktivatoren für die Freisetzung und Verstärkung bezüglich der Expression des synthetisierenden Enzyms Cholinacetyltransferase. Gleiches gilt auch für Störungen des Haarwuchses bzw. Haarausfall.The detection of epidermal acetylcholine and the observed cellular Effects opens up a new approach to the treatment of Skin diseases - such as the pemphigus - or from Wound healing disorders with active pharmaceutical ingredients that stimulate Effect on the function of the epidermal, cholinergic system - how e.g. B. agonists on muscarinic or nicotine receptors, inhibitors of Cholinesterase, activators of epidermal acetylcholine, activators for the Release and enhancement regarding the expression of the synthesizing Enzyme choline acetyltransferase. The same applies to disturbances of the Hair growth or hair loss.

Weiterhin ermöglichen die beschriebenen unerwarteten Befunde einen neuen Ansatz zur erfolgreichen Behandlung von Erkrankungen der Haut - wie z. B. der atopischen Dermatitis, der Neurodermatitis, der Psoriasis und der cholinergen Utricaria - mit Wirkstoffen, die eine hemmende Wirkung auf die Funktion von epidermalen Acetylcholin ausüben können - wie z. B. Antagonisten an Muskarin- bzw. Nikotinrezeptoren, Hemmstoffen der Cholinacetyltransferase, Hemmern der epidermalen Acetylcholin-Freisetzung sowie Inhibitoren bezüglich der Expression des synthetisierenden Enzyms Cholinacetyltransferase. Furthermore, the unexpected findings described enable a new one Approach to the successful treatment of skin diseases - such as B. the atopic dermatitis, neurodermatitis, psoriasis and cholinergic Utricaria - with active ingredients that have an inhibitory effect on the function of can exercise epidermal acetylcholine - such. B. Antagonists to Muscarinic or nicotine receptors, choline acetyltransferase inhibitors, inhibitors of epidermal acetylcholine release and expression inhibitors of the synthesizing enzyme choline acetyltransferase.

Immunohistochemie bezüglich des ChAT-ProteinsImmunohistochemistry for the ChAT protein

In weiterführenden Experimenten konnte die Frage geklärt werden, ob das für die Synthese des Acetylcholins verantwortliche Enzym ChAT in den epithelialen Zellen auf den Oberflächen der Bronchien und des Intestinums expremiert wird. In der Tat konnte eine spezifische und intensive ChAT-Immunoreaktivität im Oberflächenepithel humaner Bronchien und in weitaus höherem Ausmaß im humanen Dünndarm nachgewiesen werden - dagegen nicht in der Mucosa des pylorischen Teils des menschlichen Magens. Eine spezifische ChAT-analoge Immunoreaktivität konnte ebenso in Epithelzellen des menschlichen Colons und der Gallenblase und in humaner Haut nachgewiesen werden.In further experiments, the question of whether this was for the Synthesis of the enzyme ChAT responsible for acetylcholine in the epithelial Cells are expressed on the surfaces of the bronchi and intestine. In in fact, a specific and intense ChAT immunoreactivity in the Surface epithelium of human bronchi and to a much greater extent in human small intestine are detected - however not in the mucosa of the pyloric part of the human stomach. A specific ChAT analog Immunoreactivity was also found in human colon and epithelial cells the gallbladder and in human skin.

"Western-Blot-Analyse" bezüglich des ChAT-Proteins in epithelialen Zellen humaner Bronchien"Western blot analysis" for the ChAT protein in epithelial cells human bronchi

Die "Western-Blot-Analyse" des Proteins, das auf enzymatischem Wege aus Epithelzellen von humanen Bronchien isoliert wurde, lieferte einen weiteren Beleg für die Anwesenheit des ChAT-Proteins. Zum Vergleich wurde ein Homogenisat aus Rattenhirn ebenfalls untersucht.The "Western blot analysis" of the protein, which is carried out enzymatically Epithelial cells isolated from human bronchi provided further evidence for the presence of the ChAT protein. A homogenate was used for comparison from rat brain also examined.

In der Probe aus dem Hirn der Ratte entspricht die prominente Bande dem bisher schon bekannten 68 kd "neuronalem" ChAT-Protein; dagegen werden in Epithelzellen bronchialen Ursprungs ChAT-Proteine mit niedrigerem Molekulargewicht von 41 und 54 kd aufgefunden.In the sample from the rat's brain, the prominent band corresponds to that so far already known 68 kd "neuronal" ChAT protein; against that in Epithelial cells of lower bronchial origin ChAT proteins Molecular weights of 41 and 54 kd found.

ChAT-Enzymaktivität in EpithelzellenChAT enzyme activity in epithelial cells

Einen weiteren Beweis lieferte die direkte Messung der ChAT-Enzymaktivität in den Extrakten des intestinalen Epithels, die mittels Wattestäbchen gewonnen wurden oder in Extrakten, die auf enzymatischem Wege aus Epithellzellen gewonnen wurden.A further proof was provided by the direct measurement of the ChAT enzyme activity in the extracts of the intestinal epithelium, obtained with cotton swabs were or in extracts that were obtained enzymatically from epithelial cells won.

ChAT-Aktivitäten von 3.5 ± 1.3 (n = 5) und 28 ± 11 (n = 5) nmol/mg Protein/h wurden in einem so isolierten Material aus humanen Bronchien sowie Dünndarm ermittelt. ChAT activities of 3.5 ± 1.3 (n = 5) and 28 ± 11 (n = 5) nmol / mg protein / h were in such an isolated material from human bronchi as well as small intestine determined.

Bromacetylcholin (30 µM), welches einen spezifischen ChAT-Inhibitor darstellt, reduzierte die Enzymaktivität um 80-90%.Bromoacetylcholine (30 µM), which is a specific ChAT inhibitor, reduced enzyme activity by 80-90%.

Untersuchungen zur Funktion von nicht-neuronalem AcetylcholinStudies on the function of non-neuronal acetylcholine Untersuchungen an humaner HautExaminations on human skin

Kleine (1 × 0,4 cm) Hautstücke wurden aus frischem Operationsmaterial gewonnen und in eine oxygenierte Nährlösung gegeben. Die Nährlösung enthielt entweder den Zusatz von 1 γM Atropin (Blockade von Muskarinrezeptoren) oder 30 γM Tubocurarin (Blockade von Nikotinrezeptoren); die Kontrolle wurde ohne Zusatz eines Medikamentes durchgeführt. Nach 30 min und 2,5 Stunden wurden Hautstücke aus dem Medium entnommen und nach dem Stand der Technik zur Elektronenmikroskopie aufgearbeitet. Dabei zeigte sich, daß die Behandlung mit Atropin nach 30 min zu einer Erweiterung des Zwischenzellraums, zu einer Auflockerung von Keratinfilamenten und Desmosomen geführt hat. Der Zwischenraum würde morphometrisch ausgemessen (NIH-Image-Programm). Der mittlere Abstand zwischen zwei benachbarten Zellenbetrug in der Kontrolle 0,781 ± 0,06 γM (Auszählung von 20 Grenzflächen), nach Atropin-Behandlung 1,06 ± 0,006 γM (Auszählung von 20 Grenzflächen; p < 0.01) und nach Tubocurarin 0,756 ± 0,035 (Auszählung von 16 Grenzflächen). Nach 2,5 Stunden Einwirkzeit hatte sich auch nach Behandlung mit Tubocurarin eine Erweiterung eingestellt (Kontrolle: 0,728 ± 0,037 γm, Auszählung von 20 Grenzflächen; Tubocurarin: 0,926 ± 0,118 γm, Auszählung von 20 Grenzflächen, p < 0,001).Small (1 × 0.4 cm) pieces of skin were made from fresh surgical material obtained and placed in an oxygenated nutrient solution. The nutrient solution contained either the addition of 1 γM atropine (blockade of muscarinic receptors) or 30 γM tubocurarine (blockage of nicotine receptors); control was without Addition of a drug performed. After 30 min and 2.5 hours Pieces of skin removed from the medium and according to the prior art Refurbished electron microscopy. It was found that treatment with Atropine after 30 min to widen the intercellular space, to one Loosening of keratin filaments and desmosomes. Of the The space in between would be measured morphometrically (NIH image program). Of the mean distance between two neighboring cells in the control was 0.781 ± 0.06 γM (20 interfaces), after atropine treatment 1.06 ± 0.006 γM (count of 20 interfaces; p <0.01) and according to Tubocurarin 0.756 ± 0.035 (counting 16 interfaces). After 2.5 hours of exposure had also expanded after treatment with tubocurarine (Control: 0.728 ± 0.037 γm, counting 20 interfaces; tubocurarine: 0.926 ± 0.118 γm, counting 20 interfaces, p <0.001).

Untersuchungen an humanem DünndarmInvestigations on human small intestine

Dünndarmstücke wurden aus frischem Operationsmaterial erhalten und in ähnlicher Weise wie für Haut beschrieben in oxygenierter Nährlösung inkubiert. Anstelle einer elektronenmikroskopischen Untersuchung wurde eine Lichtmikroskopie nach vorheriger HE-Färbung vorgenommen. Dabei zeigte sich, daß Atropin im Vergleich zur Kontrolle nach 30 minütiger Einwirkzeit eine deutliche Erweiterung kleiner Lymphgefäße und ein Lymphödem im Zottenstroma herbeiführte. Es ist bekannt, daß eine intakte Funktion von "gap-juction" für die geordnete kontraktile Aktivität kleiner Lymphgefäße notwendig ist (Zawieja et al., Am J. Physiol 264, H1283-91, 1993). Durch Blockade von Muskarinrezeptoren, d. h. durch Ausschaltung der Funktion von Acetylcholin wurde eine Störung des Lymphflusses ausgelöst.Small intestine pieces were obtained from fresh surgical material and in incubated in an oxygenated nutrient solution in a similar manner to that described for skin. Instead of an electron microscopic examination, a Light microscopy carried out after prior HE staining. It showed that atropine compared to the control after 30 minutes of exposure significant enlargement of small lymphatic vessels and lymphedema in the villous stroma brought about. It is known that an intact function of "gap-juction" for the orderly contractile activity of small lymphatic vessels is necessary (Zawieja et al., Am J. Physiol 264, H1283-91, 1993). By blocking muscarinic receptors, d. H. by switching off the function of acetylcholine a disturbance of the Lymphatic flow triggered.

Untersuchungen an kultivierten Epithelzellen humaner BronchienStudies on cultivated epithelial cells in human bronchi

Aus frischem Operationsmaterial wurden Bronchien isoliert und nach dem Stand der Technik Epithelzellen gewonnen (Reinheimer et al., Am J. Physiol 270, L 722- 8, 1996). Zur Messung der Zellproliferation wurde ein standardisiertes Meßverfahren, die MTT-Methode, eingesetzt (Bagge et al., J Immunol Meth 119, 203-10, 1989). Dabei zeigte sich, daß zugesetztes Acetylcholin eine konzentrationsabhängige Steigerung der Zellproliferation (0.1 nM - 10 µM) auslöste, während Bromacetylcholin, ein Hemmstoff der Acetylcholinsynthese, das Gegenteil herbeiführt. Diese Befunde zeigen, daß nicht-neuronales Acetylcholin an der Regulation der Zellproliferation beteiligt ist.Bronchi were isolated from fresh surgical material and according to the state der Technik epithelial cells obtained (Reinheimer et al., Am J. Physiol 270, L 722- 8, 1996). A standardized was used to measure cell proliferation Measuring method, the MTT method, used (Bagge et al., J Immunol Meth 119, 203-10, 1989). It was found that added acetylcholine a concentration-dependent increase in cell proliferation (0.1 nM - 10 µM) triggered, while bromoacetylcholine, an inhibitor of acetylcholine synthesis, the Causes the opposite. These findings show that non-neuronal acetylcholine is involved in the regulation of cell proliferation.

Claims

1. Verwendung von topisch wirksamen Arzneimitteln, zur Behandlung einer Unterfunktion von nicht-neuronalem Acetylcholin im Bereich der Haut, der Atemwege und des gastro-intestinalen Traktes.1. Use of topically active drugs, for the treatment of a Hypofunction of non-neuronal acetylcholine in the area of the skin Respiratory tract and gastrointestinal tract.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel ein Agonist an Muskarin/Nikotinrezeptoren, Hemmstoff der Cholinesterasen, ein Aktivator der Synthese oder Freisetzung von nicht- neuronalem Acetylcholin ist.2. Use according to claim 1, characterized in that the Medicinal product an agonist at muscarinic / nicotine receptors, inhibitor of Cholinesterases, an activator of the synthesis or release of non- is neuronal acetylcholine.

3. Verwendung von topisch wirksamen Arzneimitteln zur Behandlung einer Überfunktion von nicht-neuronalem Acetylcholin im Bereich der Haut, der Atemwege und des gastro-intestinalen Traktes.3. Use of topically active drugs for the treatment of a Hyperfunction of non-neuronal acetylcholine in the area of the skin Respiratory tract and gastrointestinal tract.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel ein Antagonist an Muskarin/Nikotinrezeptoren, ein Hemmstoff der Freisetzung von Acetylcholin und/oder ein Hemmstoff der Synthese von Acetylcholin ist.4. Use according to claim 3, characterized in that the Medicinal product an antagonist of muscarinic / nicotine receptors, an inhibitor the release of acetylcholine and / or an inhibitor of the synthesis of Is acetylcholine.

5. Verwendung von topisch wirkenden Agonisten Muskarinrezeptoren nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung von Atemwegserkrankungen.5. Using topical agonists after muscarinic receptors Claim 1 or 2 for the treatment of respiratory diseases.

6. Verwendung von topisch wirkenden Agonisten an Muskarinrezeptoren gemäß Anspruch 5 zur Behandlung der zystischen Fibrose.6. Use of topical agonists on muscarinic receptors according to claim 5 for the treatment of cystic fibrosis.

7. Verwendung von topisch wirkenden Hemmstoffen der Cholinesterase nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung von Atemwegserkrankungen.7. Use of topical inhibitors of cholinesterase Claim 1 or 2 for the treatment of respiratory diseases.

8. Verwendung von topisch wirkenden Hemmstoffen der Cholinesterase gemäß Anspruch 7 zur Behandlung der zystischen Fibrose.8. Use of topical inhibitors of cholinesterase according to Claim 7 for the treatment of cystic fibrosis.

9. Verwendung von Stimulantien des epidermalen cholinergen Systems nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung von Hauterkrankungen. 9. Using stimulants from the epidermal cholinergic system after Claim 1 or 2 for the treatment of skin diseases.

10. Verwendung von Stimulantien des cholinergen Systems gemäß Anspruch 9 zur Behandlung des Pemphigus, Wundheilungsstörungen, Haarausfall oder Störungen des Haarwuchses.10. Use of stimulants of the cholinergic system according to claim 9 for the treatment of pemphigus, wound healing disorders, hair loss or Hair growth disorders.

11. Verwendung von topisch wirksamen Hemmstoffen der Cholinacetyltransferase nach Anspruch 3 oder 4 zur Behandlung von Hauterkrankungen.11. Use of topically active inhibitors of Choline acetyltransferase according to claim 3 or 4 for the treatment of Skin diseases.

12. Verwendung von topisch wirkenden Antagonisten an Muskarinrezeptoren nach Anspruch 3 oder 4 zur Behandlung von Atemwegserkrankungen.12. Use of topically acting antagonists on muscarinic receptors according to claim 3 or 4 for the treatment of respiratory diseases.

13. Verwendung von topisch wirkenden Antagonisten an Muskarinrezeptoren gemäß Anspruch 12 zur Behandlung von Asthma bronchiale.13. Use of topically acting antagonists on muscarinic receptors according to claim 12 for the treatment of bronchial asthma.

14. Verwendung von topisch wirkenden Agonisten/Antagonisten an Muskarin- oder Nikotinrezeptoren nach Anspruch 1 bis 4 zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes.14. Use of topical agonists / antagonists on muscarinic or nicotine receptors according to claims 1 to 4 for the treatment of inflammatory diseases of the gastrointestinal tract.

15. Verwendung von topisch wirkenden Agonisten/Antagonisten an Muskarin- oder Nikotinrezeptoren gemäß Anspruch 14 zur Behandlung der Colitis Ulzerosa.15. Use of topical agonists / antagonists on muscarinic or nicotine receptors according to claim 14 for the treatment of colitis Ulcerative.

16. Verwendung von topisch wirkenden Antagonisten an Muskarinrezeptoren nach Anspruch 3 oder 4 zur Behandlung von Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes.16. Use of topically acting antagonists on muscarinic receptors according to claim 3 or 4 for the treatment of diseases of the Gastrointestinal tract.

17. Verwendung von topisch wirksamen Antagonisten an Muskarinrezeptoren gemäß Anspruch 16 zur Behandlung der wässerigen Diarrhoe.17. Use of topically active antagonists on muscarinic receptors according to claim 16 for the treatment of aqueous diarrhea.

18. Verwendung von topisch wirksamen Antagonisten an Muskarin- oder Nikotinrezeptoren nach Anspruch 3 oder 4 zur Behandlung von entzündlichen Hauterkrankungen.18. Use of topically effective antagonists on muscarinic or Nicotine receptors according to claim 3 or 4 for the treatment of inflammatory skin diseases.

19. Verwendung von topisch wirksamen Hemmstoffen der epidermalen cholinergen Systems nach Anspruch 3 oder 4 zur Behandlung von Hauterkrankungen. 19. Use of topically active inhibitors of the epidermal cholinergic system according to claim 3 or 4 for the treatment of Skin diseases.

20. Verwendung von einer der Verbindungen nach einem der Ansprüche 11, 18 oder 19 zur Behandlung der atopischen Dermatitis.20. Use of one of the compounds according to one of claims 11, 18 or 19 for the treatment of atopic dermatitis.

21. Verwendung von einer der Verbindungen nach einem der Ansprüche 11, 18 oder 19 zur Behandlung der Neurodermatitis.21. Use of one of the compounds according to one of claims 11, 18 or 19 for the treatment of neurodermatitis.

22. Verwendung von einer der Verbindungen nach Anspruch nach einem der Ansprüche 11, 18 oder 19 zur Behandlung der Psoriasis.22. Use of one of the compounds according to claim 1 Claims 11, 18 or 19 for the treatment of psoriasis.

23. Verwendung von einer der Verbindungen nach Anspruch nach einem der Ansprüche 11, 18 oder 19 zur Behandlung der cholinergen Utricaria.23. Use of one of the compounds according to claim 1 Claims 11, 18 or 19 for the treatment of cholinergic etricaria.

24. Verfahren zur Bestimmung des Funktionszustandes von nicht-neuronalem Acetylcholin in direkten oder endoskopisch zugänglichem humanen Geweben oder Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus diesem Geweben eine Probe nimmt und in dieser Probe auf an sich bekannte Weise den Gehalt an Acetylcholin bestimmt.24. Method for determining the functional state of non-neuronal Acetylcholine in direct or endoscopically accessible human Tissues or cells, characterized in that one takes a sample of this tissue and in this sample on itself known manner determines the content of acetylcholine.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Probennahme durch Wischen der Oberfläche mit einem Wattestäbchen erfolgt.25. The method according to claim 24, characterized in that the Sampling by wiping the surface with a cotton swab he follows.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Probennahme mit einer angefeuchteten Watterolle erfolgt, um die Funktion des epithelialen Acetylcholins innerhalb des Respirationsepithels zu bestimmen.26. The method according to claim 24 or 25, characterized in that the Sampling with a moistened cotton roll is done to check the function of the epithelial acetylcholine within the respiratory epithelium determine.

27. Verfahren nach Anspruche 24, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung des Acetylcholins aus der Haut, der Mundschleimhaut und der vaginalen Schleimhaut die Cup-Technik angewandt wird.27. The method according to claim 24, characterized in that for Determination of acetylcholine from the skin, the oral mucosa and the vaginal mucosa the cup technique is applied.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Funktionalität von nicht-neuronalem Acetylcholin Stimulationslösungen eingesetzt werden. 28. The method according to any one of claims 24 to 27, characterized in that to determine the functionality of non-neuronal acetylcholine Stimulation solutions are used.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß Lösungen von Nikotin, Zitronensäure oder β-Adrenorezeptor-Agonisten eingesetzt werden.29. The method according to claim 28, characterized in that solutions of Nicotine, citric acid or β-adrenoreceptor agonists can be used.