DE19624624A1 - Verfahren zur Verbesserung der Produktausbeute bei Fermentationsprozessen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Verbesserung von Fermenta­ tionsverfahren zwecks Erhöhung der Ausbeute der mit Hilfe von Mikroorganismen in diesen Fermentationsprozessen hergestell­ ten biologischen Produkte bzw. Wertstoffe.

Die Fermentation von Mikroorganismen dient u. a. zur Produktion von biologischen Produkten oder Wertstoffen, wie beispielsweise Proteine, Enzyme oder auch andere chemische Wertstoffe, z. B. gegebenenfalls auch mit pharmazeutischer Wirkung. Hierbei benötigen die Mikroorganismen sowohl für die intrazelluläre als auch die extrazelluläre Bildung der Pro­ dukte bzw. Wertstoffe Nährstoffmedien, die in der Regel eine sogenannte Kohlenstoff-Quelle ("C-Quelle"), eine Stickstoff- Quelle ("N-Quelle") und sogenannte Suppline wie Salze und Vitamine enthalten. Als N-Quelle können niedermolekulare che­ mische Substanzen wie Ammoniumsalze bzw. Harnstoff oder aber hochmolekulare, stickstoffhaltige Substrate wie Proteine na­ türlicher Herkunft, z. B. Sojamehle, Baumwollsaatproteine, Getreideproteine, Proteine tierischer Herkunft wie Fischmehle usw. Verwendung finden. Insbesondere die N-Quellen pflanzli­ cher Herkunft können neben dem Proteingehalt mehr oder weni­ ger hohe Gehalte an Stärke aufweisen und so gleichzeitig als C-Quelle dienen. Als C-Quellen werden im Stand der Technik Kohlenhydrate, vor allem Mono-, Di-, Tri- und Oligosaccharide, aber auch polymere Kohlenhydrate wie Getreide, Kartoffelstär­ ken, Tapiokastärke oder Stärke der Yamswurzel verwendet.

Einige C-Quellen wie z. B. Glucose, Fructose, Dextrine werden durch die Mikroorganismen sehr leicht metabolisiert und führen daher zu einer explosionsartigen Vermehrung der Mikroorganismen, einhergehend mit rascher Sauerstoffverarmung in der Fermentationsnährlösung. Die Sauerstoffverarmung zieht eine Umstellung des Mikroorganismenstoffwechsels nach sich, so daß die gewünschten Fermentationsprodukte nicht mehr oder nur in ungenügender Menge produziert werden; im ungünstigsten Falle sterben die Mikroorganismen sogar wegen Sauerstoffman­ gel ab. Weiterhin behindern Glucose und andere Mono- oder Disacharide in der Mikroorganismenzelle sehr häufig die in­ trazelluläre Induktion von Enzymen zur Ausscheidung eines gewünschten Wertstoffes, von Enzymen zum Stärkeabbau (z. B. von Amlyase) oder von anderen Enzymen. Die erwünschte Produk­ tion des biologischen Produktes bzw. Wertstoffes geht in der Folge daher häufig auf geringe Mengen zurück und wird teil­ weise sogar gänzlich von den Mikroorganismen eingestellt.

Im Stand der Technik hat es nicht an Versuchen gefehlt, die vorstehenden Schwierigkeiten zu umgehen. Beispielsweise wurde versucht C-Quellen höherer Molekulargewichte einzuset­ zen, wie die bereits genannten Kohlenhydrate oder Stärken. Grundsätzlich können alle pflanzlichen Stärkequellen als po­ tentielle C-Quellen herangezogen werden. Häufig werden die Stärkeprodukte hierzu nicht aus den Pflanzen isoliert, son­ dern gleich die auch zur Stärkeherstellung dienenden pflanz­ lichen Ausgangsstoffe wie gemahlene Früchte oder Speicheror­ gane von Pflanzen wie Wurzelknollen oder Wurzelrhizome ver­ wendet. In der Regel handelt es sich bei solchen polymeren C-Quellen dann z. B. um Mehle von Getreiden, wie Weizenmehl oder Maismehl, von Kartoffelmehl oder Tapiokamehl verschiede­ ner Korngrößen. Die Mehle und Stärken werden aber vor der Fer­ mentation sehr häufig noch einer enzymatischen Behandlung unterzogen, um die Viskosität des Fermentationsmediums zu erniedrigen. Hierdurch soll einerseits die Neigung der Stär­ ken, in Wasser zu verkleistern und zu gelieren, vermindert und somit die Rührfähigkeit des Fermentationsmediums gewähr­ leistet werden, und andererseits auch der für die Fermenta­ tion der Mikroorganismen erforderliche Stofftransport von Sauerstoff und Kohlendioxid gesteigert werden. In der Regel sind die polymeren C-Quellen wie Stärke oder stärkehaltige Mehle somit nicht ohne Vorbehandlung verwendbar, da sie an­ sonsten zu hochviskosen Suspensionen oder Lösungen führen und gelegentlich auch gelieren. Um die damit einhergehenden Sau­ erstoff- und Durchmischungsprobleme zu beheben, werden die polymeren Kohlenhydrat-Quellen in der Regel daher mit Enzymen (beispielsweise mit Amylasen oder Glucoamylasen) soweit abge­ baut, daß zwar das rechte Maß an Viskosität im Fermentations­ medium eingestellt, eine nachteilige Substratrepression durch niedermolekulare Kohlenhydratefragmente aber vermieden wird.

Weiterhin ist es im Stand der Technik bekannt, daß die Ausbeute an Wertstoffen bei biologischen Prozessen, z. B. zur Herstellung von Enzymen, eng mit dem im Fermentationsmedium bereitgestellten Verhältnis von C- zu N-Quelle verknüpft ist. Bei Kenntnis dieses optimalen Verhältnisses kann dann in der Folge durch eine gezielte Steigerung der Menge an Substraten wie Stärke oder stärkehaltigen Mehlen im Fermentationsmedium die Ausbeute an Enzymen bzw. anderen Wertstoffen erhöht wer­ den. Die Steigerung der Menge des zur Verfügung gestellten Substrates findet aber ihre natürliche Grenze darin, daß die wäßrigen Fermentationsmedien die gelösten oder suspendierten Rohstoffe nur bis zu einem hantierbaren Grenzgehalt aufnehmen können. Über diesen Grenzgehalt hinaus ist eine weitere Aus­ beutesteigerung durch Erhöhung der C-Substratmenge nicht mög­ lich, da wiederum - auch bei vorangegangenem enzymatischen Abbau der C-Quellen - hochviskose Fermentationsmedien und mangelhafter Stofftransport bewirkt würden. Durch das damit einhergehende verringerte Wachstum der Mikroorganismen würde auch die Ausbeute an Wertstoffen, z. B. an Enzymen, außeror­ dentlich klein ausfallen. Um diese Schwierigkeiten zu umge­ hen, wurde im Stand der Technik versucht, C-Quellen (z. B. Glucose oder z. B. enzymatisch abgebaute Stärke) so nachzudo­ sieren, daß das Konzentrationsniveau im Fermentationsmedium niedrig gehalten und der Fermentationsprozeß stabilisiert werden kann. Die geeignete Dosierung über die Dauer des Fer­ mentationsprozesses erfordert jedoch eine komplizierte Tech­ nik; es muß eine aufwendige Meß- und Regeltechnik vorgehalten werden, und auch der analytische Aufwand für den Fermenta­ tionsprozeß, z. B. für die Kontrolle der Substrataufnahme durch die Mikroorganismen, steigt stark an. Auch nimmt der apparative Aufwand zu, da weitere Vorratsgefäße benötigt wer­ den. Weiterhin wird der Prozeß durch häufiges Nachdosieren von Rohstoff technisch aufwendiger, da die Rohstoffe satzwei­ se oder kontinuierlich sterilisiert werden müssen, wobei trotz dieser Maßnahmen das Kontaminationsrisiko mit Fremdkeimen dennoch wesentlich erhöht wird.

Es bestand daher die Aufgabe, ein einfaches und kosten­ günstiges Fermentationsverfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem die Substratausbeute bezüglich der C-Quelle verbes­ sert ist, ohne daß eine in der Produktion bereits bestehendes Fermentationstechnologie im Hinblick auf apparative Ausstat­ tung, Meß- und Regeltechnik bzw. analytischen Aufwand verän­ dert werden muß; das Fermentationsverfahren sollte gleichzei­ tig zu einer Erhöhung der Ausbeute der im Fermentationsprozeß hergestellten biologischen Produkte oder Wertstoffe, z. B. der hergestellten Enzyme, führen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Aufgabe durch die Verwendung von chemisch modifizierten Kohlenhydrat­ quellen gelöst werden kann. Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Fermentation von Mikroorganismen zur Her­ stellung von biologischen Produkten oder Wertstoffen, bei dem man in der Fermentation ein Nährstoffmedium zur Verwertung durch die Mikroorganismen einsetzt, das als C-Quellen-Sub­ strat eine chemisch modifizierte Kohlenhydratquelle, insbe­ sondere eine chemisch modifizierte oligomere oder polymere Kohlenhydratquelle, enthält. Der chemisch modifizierten Koh­ lenhydratquelle können dabei alle an sich üblichen Kohlenhy­ drat-haltigen Substrate zugrundeliegen, die nach an sich be­ kannten chemischen Methoden modifiziert werden können. Solche zugrundeliegenden Kohlenhydrate sind daher Mono-, Di-, Tri- und Oligosaccharide und insbesondere aber polymere Kohlenhy­ drate, wobei grundsätzlich alle pflanzlichen Stärkequellen in Frage kommen; beispielsweise können Mehle aus Mais, Reis, Getreide, Kartoffeln, Tapioka oder Yamswurzel sowie die aus diesen Pflanzen gewonnen Stärken nach chemischer Modifizie­ rung im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden. Die im erfin­ dungsgemäßen Verfahren verwendete chemisch modifizierte Koh­ lenhydratquelle kann im Fermentationsverfahren sowohl als einzige Kohlenhydratquelle eingesetzt werden, oder anderer­ seits auch nur einen gewünschten Anteil einer an sich übli­ chen, nicht-modifizierten Kohlenhydratquelle ersetzen bzw. diese mengenmäßig ergänzen. Es besteht hierbei auch die Mög­ lichkeit, die erfindungsgemäß modifizierte Kohlenhydratquel­ le, inbesondere derivatisierte Stärke, sowohl zeitgleich mit der nicht-modifizierten Kohlenhydratquelle oder auch zu einem geeigneten späteren Zeitpunkt satzweise oder kontinuierlich in den Fermenter zu dosieren.

Die chemische Modifizierung erfolgt hierbei über die freien Hydroxygruppen der Glucosebausteine der jeweiligen Kohlenhydratquelle. Diese Hydroxygruppen erlauben beispiels­ weise Veretherungen, Veresterungen, Oxidationen und Querver­ netzungen mit bi- oder polyfunktionellen organischen Verbin­ dungen. Beispiele sind: für Veretherungen die Hydroxyethylie­ rung mit Ethylenoxid, für Veresterungen die Acetylierung z. B. mit Acetylchlorid oder Acetanhydrid, oder für Quervernetzun­ gen die Umsetzung mit Epichlorhydrin oder Phosphorsäure­ chloriden. Zur Erzielung der erfinderischen Effekte reichen bereits geringe Modifizierungsgrade, um die Ausbeute an fer­ mentativ herzustellenden Wertstoffen bzw. Enzymen wesentlich zu erhöhen. Als Modifizierungsgrad wird hierbei ganz allge­ mein die Anzahl der chemisch modifizierten Hydroxygruppen pro Glucoseeinheit der Kohlenhydratquelle in mol/mol verstanden. Zweckmäßigerweise beträgt der Modifizierungsgrad 0,005 bis 4 mol/mol, und insbesondere 0,01 bis 1 mol/mol. Den zweckmäßi­ gen Modifizierungsgrad kann der Fachmann in diesem Rahmen für den jeweiligen konkreten Fermentationsprozeß mit wenigen Ver­ suchen ermitteln.

Zweckmäßige, im erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren einsetzbare, chemisch modifizierte Kohlenhydratquellen sind daher insbesondere solche, bei denen die Kohlenhydratquelle chemisch umgewandelt und/oder derivatisiert ist. Vorzugsweise ist diese als C-Quellen-Substrat dienende Kohlenhydratquelle durch Veresterung oder Veretherung derivatisiert oder durch Oxidation oder Vernetzung chemisch umgewandelt. Hierbei zeichnen sich bevorzugte chemisch modifizierte Kohlenhydrat­ quellen dadurch aus, daß diese durch Veresterung, insbesonde­ re durch Acetylierung freier Kohlenhydrat-Hydroxygruppen, derivatisiert sind. Besonders günstige Ausbeuteerhöhungen bei der Enzymherstellung werden bei Verwendung von verester­ ter, insbesondere acetylierter Stärke erzielt, wobei schon relativ geringe Derivatisierungsgrade (Acetylisierungsgrade) ausreichen. Der Veresterungsgrad der veresterten bzw. acety­ lierten Kohlenhydratquellen, vorzugsweise der Veresterungs- bzw. Acetylierungsgrad erfindungsgemäß verwendeter Stärke, läßt sich bestimmen, indem man eine definierte Menge einer spezifizierten, veresterten bzw. acetylierten Kohlenhydrat­ quelle mit einem ebenfalls definierten Überschuß alkalischer Base, z. B. Natriumhydroxid, verseift und man danach die nicht verbrauchte Menge der Base quantitativ bestimmt. Der Substitutionsgrad (DS = degree of substitution), also der Veresterungs- bzw. Acetylierungsgrad kann dann aus der mola­ ren Menge an verbrauchter Base als Anzahl der Ester- bzw. Acetylgruppen pro Glucoseeinheit der jeweiligen veresterten bzw. acetylierten Kohlenhydratquelle berechnet werden. In bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung beträgt der Ver­ esterungsgrad bzw. Acetylierungsgrad, bestimmt durch Versei­ fung der veresterten Kohlenhydratquelle als Anzahl der Sub­ stitutionsgruppen pro Glucoseeinheit (DS) hierbei 0,005 bis 4 mol/mol, und insbesondere 0,01 bis 1 mol/mol. Besonders be­ vorzugt sind Veresterungs- bzw. Acetylierungsgrade von 0,02 bis 0,15 mol/mol.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfin­ dungsgemäßen Fermentationsverfahrens wird eine chemisch modi­ fizierte Kohlenhydratquelle eingesetzt, der eine (isolierte) Stärke oder eine natürliche Stärkequelle, insbesondere reine Stärke oder stärkehaltiges Mehl, zugrundeliegt. Als chemisch derivatisierte, insbesondere veresterte bzw. acetylierte Stärke ist Acetylstärke zu nennen, beispielsweise der unter "FARAZYM T®" im Handel (z. B. von der Firma AVEBE Deutsch­ land, Meerbusch, geliefert; produziert von Avebe B.A., Fox­ hol, NL) erhältliche Tapiokastärke-Acetylester mit einem Sub­ stitutionsgrad DS von 0,025 bis 0,032 mol/mol, oder eine ent­ sprechende, von Avebe erhältliche acetylierte Kartoffelstärke ("FARAZYM 76®").

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht mit einfachen Mitteln eine bessere Substratausnutzung bei Verwendung von chemisch modifizierten Kohlenhydratquellen (C-Quellen), um zu einer Ausbeuteerhöhung an fermentativ hergestellten Wertstof­ fen, z. B. biologische Produkte wie Enzyme, zu gelangen. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet darüber hinaus den Vorteil, daß es in bestehenden Fermentationsanlagen ohne Veränderung der Technologie oder des apparativen bzw. analytischen oder Kontroll- und Meßaufwandes eingesetzt werden kann. Schwierige Dosiertechnologien werden vermieden. Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß es bei beliebigen Fermentationen eingesetzt werden kann, und somit für eine Vielzahl der übli­ cherweise für Fermentationen eingesetzten Mikroorganismen die Verwendung der vorteilhaften, chemisch modifizierten Kohlen­ hydratquellen erlaubt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher insbesondere bei Mikroorganismen der Familien Fungus und Bakterien, insbesondere bei Mikroorganismen, die zur Pro­ duktion von Enzymen herangezogen werden, vielfältig einge­ setzt werden. Beispiele für einsetzbare Mikroorganismen sind z. B. die Gattungen Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Peni­ cillium und Bacillus. Spezielle Beispiele für die Gattung Bacillus sind insbesondere Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, die in der Technologie zur Enzymherstel­ lung hinreichend beschrieben sind. Die Vorteile der Erfindung lassen sich auch mit optimierten, z. B. gentechnisch veränder­ ten, Mikroorganismen, insbesondere auch solchen, die zur Pro­ duktion von Enzymen im industriellen Maßstab eingesetzt wer­ den, erzielen.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, ohne sie jedoch in ihrem Umfange zu beschränken.

Beispiele Beispiel 1 Fermentation zur Herstellung einer hochalkalischen Protease

Unter den Standardbedingungen zur Herstellung einer hochalka­ lischen Protease vom Subtilisin-Typ 309 wurden im Vergleich als C-Quelle einerseits Kartoffelstärke und native Tapioka­ stärke (nicht erfindungsgemäß als Standard) sowie anderer­ seits acetylierte Tapiokastärke bei pH-Werten von 6,0 oder 7,0 mittels eines Bacillus alcalophilus Stammlinie HAI (be­ schrieben in der publizierten EP-A 415 296), durch herkömm­ liche Mutation und gentechnische Veränderung optimiert, fer­ mentiert. Nachfolgend wurde in an sich üblicher Weise die erzielte Aktivitätsausbeute an Protease in DU/ml ermittelt. Unter "DU" wird dabei die enzymatische Aktivität in Delft Units verstanden, wobei 1.000 DU der proteolytischen Aktivi­ tät entsprechen, die bei einem Volumen von 1 ml einer 2-W/W-%igen Enzymlösung nach Abbau von Kasein eine Extink­ tionsdifferenz (1 cm Lichtweg; 275 nm; Bestimmung gegen Blindprobentest) von 0,4000 ergibt.

Die eingesetzten nativen und chemisch modifizierten Stärken wiesen folgende Eigenschaften auf:

Kartoffelstärke
Feuchtegehalt
15 bis 20 Gew.-%
pH-Wert (30 mg/g-Lösung in Aqua dest.)	6 bis 8
Löslichkeit	< 10-2 g/l
Keimzahl	< 50.000 KBE/g*)
Siebanalyse < 1 mm (10 Min. mechanisches Sieben über 1 mm-Sieb)	100 Gew.-%

Tapiokastärke, nativ
Feuchtegehalt
11 bis 14 Gew.-%
pH-Wert (30 mg/g-Lösung in Aqua dest.)	6 bis 8
Asche (auf Trockenstoff gemessen)	2 mg/g
Keimzahl	50.000 KBE/g*)
Siebanalyse < 1 mm (10 Min. mechanisches Sieben über 1 mm-Sieb)	100 Gew.-%
(*) KBE = Keimbildende Einheiten)

Tapiokastärke, acetyliert
Feuchtegehalt (5 g, getrocknet bei 130°C für 90 Min.)
110 bis 140 mg/g
pH-Wert (30 mg/g-Lösung in Aqua dest.)	5 bis 7
Substitutionsgrad (DS)	0,025 bis 0,032 mol/mol
Siebanalyse < 1 mm (10 Min. mechanisches Sieben über 1 mm-Sieb)	100 Gew.-%

Die vorstehenden handelsüblichen Stärken, Kartoffelstärke und Tapiokastärke (nativ oder acetyliert), können beispielsweise bei der Firma AVEBE Deutschland (in Meerbusch) bezogen wer­ den.

Für die Fermentation mit den vorstehend angegebenen Stärken bzw. Stärkederivaten wurden folgende Ergebnisse im Hinblick auf die jeweilige maximal erzielte Aktivitätsausbeute (bei einer Fermentationsdauer von 72 h) gefunden:

Die erfindungsgemäß eingesetzte, acetylierte Tapiokastärke zeigte in der Aktivitätsbildung eine herausragende Verbesse­ rung, die deutlich über dem Ergebnis der als Standard aufge­ führten Kartoffelstärke und auch der nativen Tapiokastärke liegt.

Das Verfahren ist für andere Fermentationen, z. B. zur Her­ stellung von Enzymen wie Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellu­ lasen, Glucosidasen, Amyloglucosidasen u. a. gleichfalls vor­ teilhaft anwendbar und wird im nachfolgenden Beispiel noch weiter erläutert.

Beispiel 2 Fermentation zur Herstellung einer alkalischen Protease

Unter den Standardbedingungen zur Herstellung einer alkali­ schen Protease von BPN′-Typ wurden im Vergleich als C-Quelle einerseits Kartoffelstärke (als Standard wie in Beispiel 1, nicht erfindungsgemäß) sowie andererseits acetylierte Tapio­ kastärke in zwei Fermentationsversuchen mit zwei unterschied­ lichen Bacillus licheniformis-Stämmen fermentiert und nach­ folgend in an sich üblicher Weise die erzielte Aktivitätsaus­ beute an Protease in DU/ml ermittelt (zur Einheit 1 DU/ml siehe Beispiel 1). Es wurden die im Beispiel 1 näher be­ schriebene Kartoffelstärke (als Standard) bzw. erfindungsge­ mäß acetylierte Tapiokastärke verwendet. Für die Fermentatio­ nen mit diesen Stärken bzw. Stärkederivaten wurden die fol­ genden Ergebnisse im Hinblick auf die jeweilige maximal er­ zielte Aktivitätsausbeute (bei einer Fermentationsdauer von 77 h bzw. 72 h bei Kartoffelstärke, gegenüber einer Fermenta­ tionsdauer von nur 56 h bei acetylierter Tapiokastärke) ge­ funden:

Die erfindungsgemäß eingesetzte, acetylierte Tapiokastärke zeigte in der Aktivitätsbildung eine herausragende Verbesse­ rung, die deutlich über dem Ergebnis der hier in Analogie zum Beispiel 1 als Standard aufgeführten Kartoffelstärke liegt, bei gleichzeitig vorteilhafter Verkürzung der Fermentations­ dauer bei Verwendung von acetylierter Tapiokastärke als C-Quellen-Substrat.

Claims (6)

1. Verfahren zur Fermentation von Mikroorganismen zur Herstellung von biologischen Produkten oder Wertstoffen, da­ durch gekennzeichnet, daß man in der Fermentation ein Nähr­ stoffmedium zur Verwertung durch die Mikroorganismen ein­ setzt, das als C-Quellen-Substrat eine chemisch modifizierte Kohlenhydratquelle, insbesondere eine oligomere oder polymere Kohlenhydratquelle, enthält.

2. Fermentationsverfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die chemisch modifizierte Kohlenhydratquel­ le eine chemisch umgewandelte und/oder derivatisierte Kohlen­ hydratquelle ist.

3. Fermentationsverfahren nach Anspruch 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die als C-Quellen-Substrat dienende Kohlen­ hydratquelle durch Veresterung oder Veretherung derivatisiert oder durch Oxidation oder Vernetzung chemisch umgewandelt ist.

4. Fermentationsverfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der chemisch modifizierten Kohlenhydrat­ quelle eine (isolierte) Stärke oder eine natürliche Stärke­ quelle, insbesondere reine Stärke oder stärkehaltiges Mehl, zugrundeliegt.

5. Fermentationsverfahren nach Anspruch 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die chemisch modifizierte Kohlenhydratquel­ le durch Veresterung, insbesondere durch Acetylierung freier Kohlenhydrat-Hydroxygruppen, derivatisiert ist.

6. Fermentationsverfahren nach Anspruch 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Veresterungsgrad, insbesondere der Ace­ tylierungsgrad, bestimmt durch Verseifung der veresterten Kohlenhydratquelle als Anzahl der Substitutionsgruppen pro Glucoseeinheit (DS) 0,005 bis 4 mol/mol, insbesondere 0,01 bis 1 mol/mol, beträgt.