DE19545974C2 - Highly sensitive enzyme immunoassay for the determination of haptens and antigens and their use - Google Patents
Highly sensitive enzyme immunoassay for the determination of haptens and antigens and their useInfo
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Description
Die Erfindung betrifft einen hochempfindlichen Enzym- Immunoassay und seine Verwendung zur Bestimmung von Haptenen und Antigenen.The invention relates to a highly sensitive enzyme Immunoassay and its use in the determination of haptens and antigens.
Ein Einsatz von Immunoassays erfolgt in den am häufigsten durchgeführten Analyseverfahren (mehr als 2 Mrd/a). In der klinischen Diagnostik, Umweltanalytik und Lebensmittelchemie ist es erforderlich, für unterschiedliche Substanzen - nieder molekulare Haptene, wie Herbizide, Steroidhormone, Pharmaka oder hochmolekulare Antigene, wie Tumormarker, Reste von Nukleinsäuren, Zellen - die untere Erfassungsgrenze zu verbessern.Immunoassays are used most frequently carried out analysis methods (more than 2 billion / a). In the clinical diagnostics, environmental analysis and food chemistry it is necessary for different substances - down molecular haptens, such as herbicides, steroid hormones, pharmaceuticals or high molecular weight antigens such as tumor markers, residues of Nucleic acids, cells - the lower detection limit too improve.
Bekannt sind indirekte Immunosensoren, die Markersysteme zur Quantifizierung der Antigen-Antikörper-Reaktion, d. h. zur Konzentrationsbestimmung nutzen. Dabei besitzen Enzyme den entscheidenden Vorteil, daß sie als Biokatalysatoren die Bildung eines leicht anzeigbaren Produktes katalysieren, wobei die Produktmenge der Enzymaktivität proportional ist und damit in einem direkten oder indirekten Verhältnis zur Antigenmenge steht.Indirect immunosensors are known, the marker systems for Quantification of the antigen-antibody response, i. H. to Use concentration determination. Enzymes have the decisive advantage that they are the biocatalysts Catalyze formation of an easily displayable product, whereby the product amount is proportional to the enzyme activity and thus in a direct or indirect relationship to the amount of antigen stands.
Eine Kopplung von einem Enzymimmunoassay und enzymatischer bzw. chemisch/enzymatischer Signalverstärkung ist für Sandwich- Assays bekannt, wobei als Markerenzym alkalische Phosphatase benutzt wird (EP 0 060 123; Stanley, C. et al. Amer. Biotechnol. Lab. May/June 1985). Dieses Sandwich-Assay ist jedoch nur anwendbar zur Bestimmung von Antigenen mit hohen Molekulargewichten.A coupling of an enzyme immunoassay and an enzymatic or chemical / enzymatic signal amplification is for sandwich Assays known, using alkaline phosphatase as a marker enzyme is used (EP 0 060 123; Stanley, C. et al. Amer. Biotechnol. Lab. May / June 1985). This sandwich assay is however only applicable for the determination of antigens with high Molecular weights.
Außerdem ist ein Immunosensor zur kontinuierlichen Anzeige von Analytkonzentrationen in einem Medienstrom bekannt (W. Schramm und Se-Hwan Paek, reproductive Sciences Program and Bioengineering Program. 300 N. Ingalls, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48 105, USA). Dieser Immunosensor besteht in seinen Grundkomponenten aus einer Kombination von 2 monoklonalen Antikörpern, die an separaten Sensoren immobilisiert sind, und einem heterobifunktionellen Konjugat zwischen dem Analyt und einem Enzym (Enzym-Analyt-Konjugat), wobei das Medium von den Sensorabteilungen durch eine semipermeable Membran getrennt ist. Dieser Immunosensor hat den Nachteil, daß wegen des langsamen Abdissoziierens des Antigens der Meßprozeß sehr zeitaufwendig ist. Weiterhin wird die Empfindlichkeit durch die katalytische Aktivität des Markerenzyms bestimmt, d. h. es wird keine enzymatische Verstärkungsreaktion eingesetzt.There is also an immunosensor for the continuous display of Analyte concentrations in a media stream are known (W. Schramm and Se-Hwan Paek, reproductive Sciences Program and Bioengineering program. 300 N. Ingalls, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48 105, USA). This immunosensor consists of its basic components from a combination of 2 monoclonal antibodies on separate sensors are immobilized, and a heterobifunctional conjugate between the analyte and an enzyme (enzyme-analyte conjugate), where the medium from the sensor departments through a semipermeable membrane is separated. This immunosensor has that Disadvantage that because of the slow dissociation of the antigen the measuring process is very time consuming. Furthermore, the Sensitivity due to the catalytic activity of the Marker enzyme determined, d. H. it won't be enzymatic Reinforcement reaction used.
Weiterhin sind aus DE 41 26 692 A1, DE 43 14 417 A1, DE 43 42 351 A1 und DE 43 44 646 A1 verschiedene Enzym-Immunoassays bzw. Enzymverstärkersysteme bekannt, die jedoch keine genügend hohe Spezifität besitzen bzw. deren Meßzeiten zu lang sind.Furthermore, from DE 41 26 692 A1, DE 43 14 417 A1, DE 43 42 351 A1 and DE 43 44 646 A1 various enzyme immunoassays and Enzyme amplification systems are known, but they are not sufficiently high Have specificity or the measuring times are too long.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen hochempfindlichen Enyzm-Immunoassay bereitzustellen, der es gestattet, Haptene und Antigene in sehr niedrigen Konzentrationen zu bestimmen.The object of the invention is a to provide a highly sensitive enzyme immunoassay that uses it allowed haptens and antigens in very low levels To determine concentrations.
Der erfindungsgemäße hochempfindliche Enzym-Immunoassay ist
gekennzeichnet durch
The highly sensitive enzyme immunoassay according to the invention is characterized by
- - einen Partner der Immunbindungsreaktion mit einem Markerenzym (Hapten- oder Antikörper-Marker Komplex),- a partner of the immune binding reaction with a Marker enzyme (hapten or antibody-marker complex),
- - ein Substrat für das Markerenzym und- a substrate for the marker enzyme and
- - ein Enzymverstärkungssystem,- an enzyme enhancement system,
wobei als Markerenzym β-Galaktosidase, alkalische oder saure Phosphatase, Cholinesterase, Carboxyesterasen oder Sulfatasen, als Substrate Phenylphosphat, Phenylsulfat oder Phenyl-β- Galactosid und als Enzymverstärkungssystem eine Kombination aus Tyrosinase mit NADH-unabhängiger Glucosedehydrogenase (GDH) oder aus Tyrosinase mit Oligosaccarid-Dehydrogenase eingesetzt werden.being the marker enzyme β-galactosidase, alkaline or acidic Phosphatase, cholinesterase, carboxyesterases or sulfatases, as substrates phenyl phosphate, phenyl sulfate or phenyl-β- Galactoside and a combination of as an enzyme enhancement system Tyrosinase with NADH-independent glucose dehydrogenase (GDH) or from tyrosinase with oligosaccaride dehydrogenase become.
Die Auswertung der Immunreaktion erfolgt mittels Amplifizierungs-Enzym-Sensoren. Diese Biosensoren sind Elektroden, ionensensitive Feldeffekttransistoren oder Thermistoren mit immobilisierten Enzymen, die eine Amplifizierung gewährleisten.The immune response is evaluated using Amplification enzyme sensors. These are biosensors Electrodes, ion sensitive field effect transistors or Thermistors with immobilized enzymes, one Ensure amplification.
Überraschend wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäße Kombination mit dem Enzymverstärkungssystem in einer Biosensormembran für die Bestimmung von Phenol und damit enzymmarkierter Haptene und Antigene einen Nachweis sehr niedriger Konzentrationen ermöglicht.It was surprisingly found that the invention Combination with the enzyme amplification system in one Biosensor membrane for the determination of phenol and thus enzyme-labeled haptens and antigens are very proof allows lower concentrations.
Das eingesetzte Biosensorsystem besteht aus einer Fließzelle (Schema 1), die einen Kanal für die Probelösung enthält, an dessen Kopf- und Fußfläche je eine Sauerstoffelektrode befestigt ist. Über dem Elektrodenkopf befindet sich eine Biosensormembran, die eine Kombination aus Tyrosinase und Glucose-Dehydrogenase oder Tyrosinase und Oligosaccharid Dehydrogenase enthält. Elektrodenseitig ist sie durch eine Sauerstoff-durchlässige Membran vom Elektrolyt getrennt, vom Puffer durch eine Dialysemembran.The biosensor system used consists of a flow cell (Scheme 1), which contains a channel for the sample solution the top and bottom of each an oxygen electrode is attached. There is one above the electrode head Biosensor membrane, which is a combination of tyrosinase and Glucose dehydrogenase or tyrosinase and oligosaccharide Contains dehydrogenase. On the electrode side it is through a Oxygen-permeable membrane separated from the electrolyte Buffer through a dialysis membrane.
Die Verwendung des hochempfindlichen Enzym-Immunoassays erfolgt erfindungsgemäß einerseits zur Bestimmung niedermolekularer Haptene wie Herbizide, Steroidhormone oder Pharmaka im kompetitiven Assay oder im IEMA-Verfahren (Immunoenzymometric Assay) und andererseits zur Bestimmung hochmolekularer Antigene wie Tumormarker, Reste von Nukleinsäuren oder Zellen mit Doppelantikörperverfahren, wobei der sekundäre Antikörper mit dem Markerenzym kovalent oder nicht kovalent konjugiert ist. Diese Verfahren (Kompetitiver IA und IEMA) erlauben kleinere Haptenmengen nachzuweisen, wenn man sie mit sehr geringen Mengen an Hapten-Marker-Komplex betreibt. Deshalb ist die empfindliche Anzeige der Enzymaktivität des Hapten-Marker- Komplexes für eine effektive Nutzung dieser Verfahren erforderlich. Im erfindungsgemäßen hochempfindlichen Enzym- Immunoassay kann die sehr hohe Signalverstärkung durch die enzymatische Verstärkungsreaktion deshalb neben der raschen Messung des Hapten-Marker-Konjugates in besonderer Weise zum Erzielen hochempfindlicher Hapten-Messungen eingesetzt werden. The highly sensitive enzyme immunoassay is used according to the invention on the one hand for the determination of low molecular weight Haptens such as herbicides, steroid hormones or pharmaceuticals competitive assay or in the IEMA method (Immunoenzymometric Assay) and on the other hand for the determination of high molecular antigens such as tumor markers, residues of nucleic acids or cells with Double antibody method, the secondary antibody with the marker enzyme is covalently or non-covalently conjugated. These procedures (competitive IA and IEMA) allow smaller ones Detect quantities of hapten when you use them with very small amounts Amounts of hapten-marker complex operates. That is why sensitive display of the enzyme activity of the hapten marker Complexes for effective use of these processes required. In the highly sensitive enzyme The very high signal amplification by the immunoassay enzymatic amplification reaction, therefore, in addition to the rapid Measurement of the hapten-marker conjugate in a special way Achieve highly sensitive hapten measurements.
Die vorliegende Erfindung erlaubt den Zugang zu sehr niedrigen Konzentrationen durch die Verbindung eines optimierten Reaktionsansatzes mit der hochempfindlichen Anzeige durch ein Enzymverstärkersystem. Durch dieses erfindungsgemäße enzymatische Verstärkungssystem wird eine Signalverstärkung um den Faktor 100 bis 2000 erreicht.The present invention allows access to very low Concentrations optimized by combining an Reaction approach with the highly sensitive display by a Enzyme Enhancement System. Through this invention enzymatic amplification system is a signal amplification around reached the factor 100 to 2000.
Tyrosinase [EC 1.14.18.1], Mes von Sigma, Deutschland. Rinderserum-Albumin, Alkalische Phosphatase [EC 3.1.3.1., ALP, EIA grade] und Glucose-Dehydrogenase (GDH) mit Pyrrolo quinolinequinone (PQQ) als Cofaktor von Boehringer Mannheim, Deutschland. Polyvinyl-Alkohol von Serva, Deutschland. Glucose, NaH2PO4, NaOH und Phenylphosphat von Merck, Deutschland. Sauerstoff-Elektroden SM-06 von Elbau, Berlin, Deutschland. Zwei nA-mV Verstärker GKM 01, Zentralwerkstatt der Akademie der Wissenschaften, Berlin, Deutschland und ein Schreiber (Kipp & Zonen, Niederlande).Tyrosinase [EC 1.14.18.1], Mes from Sigma, Germany. Bovine serum albumin, alkaline phosphatase [EC 3.1.3.1., ALP, EIA grade] and glucose dehydrogenase (GDH) with pyrrolo quinolinequinone (PQQ) as a cofactor from Boehringer Mannheim, Germany. Polyvinyl alcohol from Serva, Germany. Glucose, NaH 2 PO 4 , NaOH and phenyl phosphate from Merck, Germany. Oxygen electrodes SM-06 from Elbau, Berlin, Germany. Two nA-mV amplifiers GKM 01, central workshop of the Academy of Sciences, Berlin, Germany and a writer (Kipp & Zonen, Netherlands).
2 peristalische Pumpen (minipuls 3, Abimed-Gilson, Langenfeld, Deutschland), Verbindungschläuche aus Teflon und Tygon (0,5 mm Innendurchmesser), 2 T-Stücke mit 0,9 mm ID (Reichelt, Heidelberg, Deutschland), Injektionsventil V7 (Pharmacia, Deutschland).2 peristalic pumps (minipuls 3, Abimed-Gilson, Langenfeld, Germany), connecting hoses made of Teflon and Tygon (0.5 mm Inner diameter), 2 T-pieces with 0.9 mm ID (Reichelt, Heidelberg, Germany), injection valve V7 (Pharmacia, Germany).
Die Membranen enthielten GDH, PQQ und Tyrosinase und bestanden aus PVA. 2,0 mg GDH wurde in 30 µl 0,5 mM PQQ (0,1 M Mes- Puffer, pH 6,5) gelöst. 1 mg Tyrosinase und 30 µl 20% PVA/H2O wurden untergerührt. 2 µl der Lösung wurde auf 4 mm Durchmesser Polyacryl-Kunststoff-Scheiben verteilt und 30 min mit UV-Licht bestrahlt. Die polymerisierten und getrockneten Membranen wurden danach von der Kunststoff-Unterlage entfernt und bei 4°C aufbewahrt.The membranes contained GDH, PQQ and tyrosinase and consisted of PVA. 2.0 mg of GDH was dissolved in 30 μl of 0.5 mM PQQ (0.1 M measurement buffer, pH 6.5). 1 mg tyrosinase and 30 µl 20% PVA / H 2 O were stirred in. 2 μl of the solution was distributed over 4 mm diameter polyacrylic plastic discs and irradiated with UV light for 30 min. The polymerized and dried membranes were then removed from the plastic base and stored at 4 ° C.
Vor der Messung wurden sie in einer selbstgebauten Messzelle befestigt (Schema 1). Diese Fließzelle besteht aus einem Polyacryl-Zylinder der von einem 0,6 mm Innendurchmesser-Kanal für die Probelösung parallel zur runden Kopf- und Fußfläche mittig duchbohrt ist. In die Kopf- und Fußfläche kann man je eine Sauerstoffelektrode (Clarkelektrode mit Pt- Arbeitselektrode und Ag/AgCl Referenzelektrode) einschrauben, so daß die Platinelektrode direkt hinter den zwei Öffnungen des Kanals liegt. Über den Elektrodenkopf wird die Biosensor- Membran gezogen. Sie ist elektrodenseitig durch eine Sauerstoff-durchlässige 6 µm dicke Polypropylen-Membran vom Elektrolyt (gesättigte KCl-Lösung) getrennt. Vom fließenden Puffer wird sie durch eine Dialysemembran (10 kD Ausschlußgrenze, 10 µm Dicke) aus Cellulose getrennt.Before the measurement, they were in a self-made measuring cell attached (Scheme 1). This flow cell consists of one Polyacrylic cylinder of a 0.6 mm inner diameter channel for the test solution parallel to the round head and foot surface is pierced in the middle. In the head and foot area you can ever an oxygen electrode (Clark electrode with Pt Screw in working electrode and Ag / AgCl reference electrode), so that the platinum electrode is just behind the two openings of the Channel lies. The biosensor is Membrane pulled. It is through an electrode Oxygen-permeable 6 µm thick polypropylene membrane from Electrolyte (saturated KCl solution) separated. From the flowing It is buffered by a dialysis membrane (10 kD Exclusion limit, 10 µm thick) separated from cellulose.
Die Elektrode produziert einen Grundstrom. Sauerstoff der Probenlösung diffundiert durch die Membranen und wird an der Clark-Elektrode bei -600 mV vs. Ag/AgCl reduziert. Bei Anwesenheit des Analyten (hier von Phenol) wird ein Teil des eindiffundierenden Sauerstoffs durch das Enzympaar verbraucht. Der abgesenkte Sauerstoff-Strom ist das von der Analyt- Konzentration abhängige Signal. Es wird elektronisch verstärkt (GKM 01) und auf einem Schreiber ausgegeben.The electrode produces a basic current. Oxygen the Sample solution diffuses through the membranes and is at the Clark electrode at -600 mV vs. Ag / AgCl reduced. At The presence of the analyte (here of phenol) becomes part of the diffusing oxygen consumed by the pair of enzymes. The reduced oxygen flow is that of the analyte Concentration dependent signal. It is amplified electronically (GKM 01) and issued on a recorder.
Das Fließsystem ist H-förmig. Die beiden Zugänge im linken Teil dienen der 1 : 1 Mischung zweier Puffer. Die beiden Abflüsse im rechten Teil dienen der Messung mit der Biosensor-Fließzelle. Die Puffer in den Zugängen (Puffer 1 (Substratpuffer): 0,01 M Tris/HCl, 1 mg/ml MgCl2, pH 9 mit (bei ALP-Messungen) 100 µM Phenylphosphat) und Puffer 2 : 0,2 M Phosphat-Puffer, 20 mM Glucose, pH 6,5) werden von einer peristalischen Pumpe mit 100 µl/min gepumpt. Die Puffer haben Raumtemperatur und sind mit Luft gesättigt. Vor der Pumpe in der Zuleitung für den Substratpuffer sitzt ein Injektionsventil mit 100 µL Probenschleife. Die Alkalische Phosphatase wird außerhalb des Fließsystems inkubiert (hier verwendete Methode) und injiziert oder innerhalb des Fließsystems in einer temperierten Probenschleife inkubiert. Nach der Zuleitungspumpe werden die beiden Puffer in einem T-Stück gemischt. Nach der vollständigen Mischung wird der Fluß gesplittet, so daß etwa 90% der Lösung durch die Biosensor-Fließzelle laufen und ca. 10% in die zweite Abflußleitung laufen. Diese zweite Leitung dient dazu Pulsationen der ersten Pumpe und eventuelle Luftblasen abzuführen. Der Puffer in der Detektorleitung wird unmittelbar vor der Fließzelle auf 20-25°C temperiert. Die Flußrate in der Detektorleitung wird durch eine zweite peristalische Pumpe kontrolliert, die sich hinter dem Detektor befindet. Beide Abflußleitungen enden in einem Abfallgefäß.The flow system is H-shaped. The two accesses in the left part serve to mix two buffers 1: 1. The two drains in the right part are used for measurement with the biosensor flow cell. The buffers in the entrances (buffer 1 (substrate buffer): 0.01 M Tris / HCl, 1 mg / ml MgCl 2 , pH 9 with (for ALP measurements) 100 µM phenyl phosphate) and buffer 2: 0.2 M phosphate Buffers, 20 mM glucose, pH 6.5) are pumped by a peristalic pump at 100 µl / min. The buffers are at room temperature and are saturated with air. An injection valve with a 100 µL sample loop is located in front of the pump in the feed line for the substrate buffer. The alkaline phosphatase is incubated outside the flow system (method used here) and injected or incubated within the flow system in a temperature-controlled sample loop. After the feed pump, the two buffers are mixed in a T-piece. After complete mixing, the flow is split so that approximately 90% of the solution passes through the biosensor flow cell and approximately 10% flows into the second drain line. This second line is used to remove pulsations from the first pump and any air bubbles. The buffer in the detector line is tempered to 20-25 ° C immediately before the flow cell. The flow rate in the detector line is controlled by a second peristaltic pump, which is located behind the detector. Both drain lines end in a waste container.
Das Fließsystem sieht T-förmig aus. Es hat auf der linken Seite eine Zuleitung (0,1 M Mespuffer, 1 mM MgCl2 und (für β- Galactosidase-Messungen) 1 mM Phenyl-β-Galactosid) in der sich auch das Injektionsventil befindet. Die Flußrate beträgt 200 µl/min. Die Ableitungen und der Detektor auf der rechten Seite sind wie oben beschrieben.The flow system looks T-shaped. On the left side there is a supply line (0.1 M Mespuffer, 1 mM MgCl 2 and (for β-galactosidase measurements) 1 mM phenyl-β-galactoside) in which the injection valve is also located. The flow rate is 200 µl / min. The leads and detector on the right are as described above.
2,4-Diphenoxyessigsäure (2,4-D) von Aldrich, Deutschland. 2-(5- Norbornene-2,3-carbodiimid)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TNTU) von Calbiochem-Novabiochem, Großbrittanien. N-Methyl-Morpholin (NMM) von Fluka, Deutschland. Alkalische Phosphatase [3.1.3.1., EIA grade] und Rinderserum-Albumin von Boehringer Mannheim. Sephadex G-25 Säule von Pharmacia, Deutschland. Anti-Maus-IgG-Antikörper aus Ziege und Tris-[Hydroxymethyl]-aminomethan (Tris) von Sigma, Deutschland. Mikrotiterplatten "Maxisorp" von Nunc, Dänemark. Tween 20 von Serva, Deutschland. Monoklonaler anti-2,4-D Antikörper von Dr. Frànek, Brno, Tschechische Republik. Phenylphosphat von Merck. Sulfosuccinimidyl-6 (biotinamido) hexanoate (NHS-LC-Biotin, Biotinylation Kit) von Pierce, USA. 2,4-Diphenoxyacetic acid (2,4-D) from Aldrich, Germany. 2- (5- Norbornene-2,3-carbodiimide) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TNTU) from Calbiochem-Novabiochem, Great Britain. N-methyl-morpholine (NMM) from Fluka, Germany. Alkaline phosphatase [3.1.3.1., EIA grade] and Bovine serum albumin from Boehringer Mannheim. Sephadex G-25 Pillar of Pharmacia, Germany. Anti-mouse IgG antibodies Goat and tris [hydroxymethyl] aminomethane (Tris) from Sigma, Germany. "Maxisorp" microtiter plates from Nunc, Denmark. Tween 20 from Serva, Germany. Monoclonal anti-2,4-D Antibodies from Dr. Frànek, Brno, Czech Republic. Phenylphosphate from Merck. Sulfosuccinimidyl-6 (biotinamido) hexanoate (NHS-LC-Biotin, Biotinylation Kit) from Pierce, USA.
Anti-hTSH-Antikörper und Streptavidin-β-Galactosidase Konjugat von BYK Gulden (Comano, Italien). Menschliches Tyroidstimulierendes Hormon (hTSH) und Phenyl-β-D-Galactosid von Sigma. Caseinhydrolysat von Merck.Anti-hTSH antibody and streptavidin-β-galactosidase conjugate by BYK Gulden (Comano, Italy). Human Tyroid stimulating hormone (hTSH) and phenyl-β-D-galactoside by Sigma. Casein hydrolyzate from Merck.
2,4-D wird als gemischtes Anhydrid aktiviert. Eine äquimolare Lösung (71.5 mM) 2,4-D, TNTU und NMM wird 15 Minuten lang in trockenem DMF inkubiert. Währenddessen wird Alkalische Phosphatase (10 mg/ml) in 0,1 M NaCl, pH 8,2 auf 1 mg/ml verdünnt. Der 2,4-D-Aktivester wird 1 : 100 in DMF verdünnt. 22 µl Aktivester werden zu 200 µl der Enzymlösung gegeben (zehnfacher molarer Überschuß des Aktivesters). Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung über Nacht gegen 0,1 M Tris, 1 mg/ml MgCl2, pH 7,6 bei 4°C dialysiert. Das Konjugat wird auf einer Sephadex G-25 Säule entsalzt und bei 4°C als 0,1 mg/ml Protein-Lösung aufbewahrt.2,4-D is activated as a mixed anhydride. An equimolar solution (71.5 mM) of 2,4-D, TNTU and NMM is incubated in dry DMF for 15 minutes. Meanwhile, alkaline phosphatase (10 mg / ml) in 0.1 M NaCl, pH 8.2 is diluted to 1 mg / ml. The 2,4-D active ester is diluted 1: 100 in DMF. 22 µl of active ester are added to 200 µl of the enzyme solution (ten-fold molar excess of the active ester). After 2 hours at room temperature, the reaction solution is dialyzed overnight against 0.1 M Tris, 1 mg / ml MgCl 2 , pH 7.6 at 4 ° C. The conjugate is desalted on a Sephadex G-25 column and stored at 4 ° C as a 0.1 mg / ml protein solution.
Für den kompetitiven Immunoassay wird ein anti-Maus-IgG- Antikörper (5 µg/ml) in einer Mikrotiterplatte in 100 µl/well 50 mM NaCl, pH 9,6 bei 4°C über Nacht adsorbiert. Nach sechsmaligem Waschen (0,85% NaCl, 0,05% Tween 20, 4 mM Phosphatpuffer, pH 7,2) wird der monoklonale anti-2,4-D Antikörper gebunden durch einstündige Inkubation von 100 µl/well 0,01 µg/ml Antikörperlösung in 40 mM Phosphatpuffer, 0,85% NaCl, pH 7,2. Nach erneutem sechsmaligem Waschen wie oben werden 2,4-D-Proben, Blindwerte, Kontrollproben etc. pipettiert. Danach werden 50 µl einer 1 : 10000 Verdünnung von 2,4-D-Alkalische Phosphatase Konjugat dazugegeben und eine Stunde inkubiert.For the competitive immunoassay, an anti-mouse IgG Antibodies (5 µg / ml) in a microtiter plate in 100 µl / well 50 mM NaCl, pH 9.6 adsorbed at 4 ° C overnight. To washing six times (0.85% NaCl, 0.05% Tween 20, 4 mM Phosphate buffer, pH 7.2) becomes the monoclonal anti-2,4-D Antibodies bound by incubation of 100 for 1 hour µl / well 0.01 µg / ml antibody solution in 40 mM phosphate buffer, 0.85% NaCl, pH 7.2. After washing again six times as above 2.4-D samples, blank values, control samples etc. pipetted. Then 50 µl of a 1: 10000 dilution of 2,4-D-Alkaline phosphatase conjugate added and a Incubated for one hour.
Für die Biosensor Messung werden die Proben unter 0,1 M Tris, 1 mg/ml MgCl2, 1 mg/ml Rinderserum-Albumin, pH 7,6 bei 4°C aufbewahrt. Vor der Messung wird dieser Aufbewahrungs-Puffer abgesaugt, 250 µl/well (statt 100 µl!) des im Fließsystem verwendeten Substratpuffers (siehe oben) bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubiert und danach injiziert.For the biosensor measurement, the samples are stored under 0.1 M Tris, 1 mg / ml MgCl 2 , 1 mg / ml bovine serum albumin, pH 7.6 at 4 ° C. Before the measurement, this storage buffer is aspirated, 250 µl / well (instead of 100 µl!) Of the substrate buffer used in the flow system (see above) is incubated at room temperature for 2 minutes and then injected.
Der anti-hTSH-Antikörper wird nach der Testkit-Vorschrift biotinyliert und über eine Sephadex G-25 Säule von Biotin gereinigt. Er wird als 10 µg/ml Lösung in 20 mM Tris, pH 7 bei -18°C aufbewahrt.The anti-hTSH antibody is according to the test kit instructions biotinylated and via a Sephadex G-25 column of biotin cleaned. It is added as a 10 µg / ml solution in 20 mM Tris, pH 7 Store at -18 ° C.
Eine Stunde vor dem Einsatz im Immunoassay wird eine 1 : 1000 Verdünnung des biotinylierten Antikörpers äquimolar mit einem Streptavidin-β-Galactosidase Konjugat in 20 mM Tris, 0,1% Caseinhydrolysat, pH 7 gemischt.An hour before use in the immunoassay is 1: 1000 Dilution of the biotinylated antibody equimolar with a Streptavidin-β-galactosidase conjugate in 20 mM Tris, 0.1% Casein hydrolyzate, pH 7 mixed.
100 µl/well 10 µg/ml anti-hTSH-Antikörper werden über Nacht bei Raumtemperatur in 0,05 M NaHCO3, pH 9,6 in einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Die verbleibende Oberfläche wird mit 1% Caseinhydrolysat in 20 mM Tris, pH 7,0 blockiert. Nach dreimaligem Waschen mit 0,9% NaCl, 0,05% Tween 20 (100 µl/well) werden die 100 µl/well hTSH-Proben, Standards, Blanks etc. für 2 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen wie oben wird nochmal mit 1% Caseinhydrolysat für 2 Stunden blockiert. Nach dreimaligem Waschen wird das anti-hTSH-Antikörper-β-Galactosidase-Konjugat (100 µl/well) für 2 h inkubiert.100 μl / well 10 μg / ml anti-hTSH antibodies are adsorbed in a microtiter plate overnight at room temperature in 0.05 M NaHCO 3 , pH 9.6. The remaining surface is blocked with 1% casein hydrolyzate in 20 mM Tris, pH 7.0. After washing three times with 0.9% NaCl, 0.05% Tween 20 (100 µl / well), the 100 µl / well hTSH samples, standards, blanks etc. are incubated for 2 hours. After washing as above, block again with 1% casein hydrolyzate for 2 hours. After washing three times, the anti-hTSH-antibody-β-galactosidase conjugate (100 μl / well) is incubated for 2 h.
Nach dem Waschen wie oben werden die Proben unter 20 mM Tris, 1% Caseinhydrolysat, pH 7,0 aufbewahrt. Vor der Messung wird der Puffer abgesaugt. In den wells wird das Enzym mit dem im Fließsystem verwendeten Substratpuffer (250 µl/well) inkubiert und nach 2 min injiziert.After washing as above, the samples are placed under 20 mM Tris, 1% casein hydrolyzate, pH 7.0. Before the measurement is made the buffer is sucked off. In the wells, the enzyme with the im Flow system used substrate buffer (250 ul / well) incubated and injected after 2 min.
Claims (3)
- 1. einen Partner der Immunbindungsreaktion mit einem Markerenzym, ausgewählt aus β-Galaktosidase, alkalische oder saure Phosphatase, Cholinesterase, Carboxyesterasen oder Sulfatasen
- 2. als Substrat für das Markerenzym Phenylphosphat, Phenylsulfat oder Phenyl-β-Galactosid und
- 3. ein Enzymverstärkungssystem bestehend aus Tyrosinase mit NADH-unabhängiger Glucosedehydrogenase oder Tyrosinase mit Oligosaccharid-Dehydrogenase.
- 1. a partner of the immune binding reaction with a marker enzyme selected from β-galactosidase, alkaline or acidic phosphatase, cholinesterase, carboxyesterases or sulfatases
- 2. as a substrate for the marker enzyme phenyl phosphate, phenyl sulfate or phenyl-β-galactoside and
- 3. an enzyme amplification system consisting of tyrosinase with NADH-independent glucose dehydrogenase or tyrosinase with oligosaccharide dehydrogenase.
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| DE19545974A DE19545974C2 (en) | 1995-07-15 | 1995-12-09 | Highly sensitive enzyme immunoassay for the determination of haptens and antigens and their use |
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| EP0060123A1 (en) * | 1981-03-07 | 1982-09-15 | Colin Henry Self | Assay and use |
| DE4126692A1 (en) * | 1991-08-13 | 1993-02-18 | Inst Molekularbiologie Ak | Immuno-sensor for sensitive detection of low mol. wt. antigen - uses displacement of enzyme conjugate, reaction with substrate and prod. amplification on bio-sensor, used esp. for drugs, herbicides and explosives |
| DE4314417A1 (en) * | 1993-05-03 | 1994-11-10 | Byk Gulden Italia Spa | Biosensor |
| DE4344646A1 (en) * | 1993-12-24 | 1995-06-29 | Frieder Prof Dr Scheller | Device for a competitive immuno-assay for the detection of hapten(s) |
-
1995
- 1995-12-09 DE DE19545974A patent/DE19545974C2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (2)
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| STANLEY, C.J. (u.a.), in: Amer. Biotechnol. Lab., May/June 1985, S. 48-53 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19545974A1 (en) | 1997-01-16 |
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