DE19917052A1

DE19917052A1 - Chemical or biochemical assay, involving electrochemically assessing a change in diffusion coefficient of redox-active species due to a specific binding reaction, useful e.g. for determining antigens or DNA fragments

Info

Publication number: DE19917052A1
Application number: DE19917052A
Authority: DE
Inventors: Marcus Mosbach; Wolfgang Schuhmann
Original assignee: Individual
Current assignee: FRIZ BIOCHEM GESELLSCHAFT FUER BIOANALYTIK MBH, 814
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 1999-04-15
Publication date: 2000-10-19

Abstract

A method for the determination of chemical or biochemical analytes (A) comprising modulating the diffusion coefficient of a redox-active species coupled with a specific recognition element by binding with a complementary recognition structure and electrochemically detecting the modulation of the diffusion coefficient, under amplification by recycling the redox species, is new. An Independent claim is also included for apparatus for carrying out the method, comprising an electrochemical measuring cell of volume 10 mu l to 1 ml (preferably less than 300 mu l) with a reference electrode, counter-electrode and macroscopic regeneration surface, in which a micro-electrode of active diameter 0.1-500 mu m can be positioned adjacent to the regeneration surface using positioning elements. In alternative forms of the apparatus: (a) the cell is formed by an array of measuring cells, especially of the microtiter plate type, the base of which forms a one combined or several separate conductive regeneration surfaces; (b) the cell has no walls contacting the reaction solution; or (c) several microelectrodes can be placed in parallel (using positioning elements) in several measuring cells or drops of the determination solution can be applied to each measuring surface, so that several samples can be tested simultaneously.

Description

1 Darstellung des technischen Gebietes1 Presentation of the technical area

Die Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur qualitativen und quantitati ven Bestimmung eines oder mehrerer chemischer und biochemischer Analyte. Durch selektive Bindung des Analyten an ein komplementäres spezifisches Erken nungselement, das mit einer elektroche misch aktiven Substanz (einem Redoxme diator) modifiziert ist, wird der Diffusions koeffizient dieses Redoxmediators modu liert. Die Veränderung des Diffusionskoef fizienten des Redoxmediators und damit der Massentransport zur Oberfläche einer geeigneten Elektrode wird mit Hilfe einer Meßelektrode detektiert. Eine Verstärkung des Meßeffektes wird durch die lokale elektrochemische Regenerierung des Redoxmediators an einer leitenden Ober fläche oder Elektrode in unmittelbaren Nähe der Meßelektrode erreicht.The invention relates to devices and Procedures for qualitative and quantitative ven determination of one or more chemical and biochemical analytes. By selective binding of the analyte a complementary specific discovery element with an electroche mixed active substance (a redox diator) is modified, the diffusion coefficient of this redox mediator modu liert. The change in the diffusion coefficient of the redox mediator and thus the mass transport to the surface of a suitable electrode is using a Measuring electrode detected. A reinforcement the measuring effect is determined by the local electrochemical regeneration of the Redox mediators on a senior staff area or electrode in immediate Reached near the measuring electrode.

2 Technischer Hintergrund2 Technical background 2.1 Bindungsassays2.1 Binding Assays

Die Erkennung und Quantifizierung von Bindungsereignissen zwischen komple mentären Erkennungsstrukturen wie Antigen/Antikörper, Hapten/Antikörper, Enzym/Substrat, Lectin/Kohlenhydrat, Rezeptor/Hormon, Oligonukleotid/DNA- oder RNA-Halbstrang dient als Grundlage sogenannter Assays, die einen wichtigen Bereich der klinischen, biochemischen und chemischen Analytik darstellen. Infolge der selektiven Erkennung der komplemen tären Strukturelemente können entspre chende Analyte zumeist ohne aufwendige Abtrennung in ihrer komplexen Matrix qualitativ und/oder quantitativ bestimmt werden. Der Einsatz solcher Assays wird durch ihre Selektivität, die im wesentlichen durch die Bindungskonstante für die dem Erkennungsvorgang zugrunde liegende Reaktion bestimmt ist, durch ihre Sensiti vität, den notwendigen Zeitaufwand, die notwendigen Reagenz- und Analytvolu mina, ihre Automatisierbarkeit und durch den Preis bestimmt.The detection and quantification of Binding events between comp mental recognition structures such as Antigen / antibody, hapten / antibody, Enzyme / substrate, lectin / carbohydrate, Receptor / hormone, oligonucleotide / DNA or RNA half strand serves as the basis so-called assays, which are important Area of clinical, biochemical and represent chemical analysis. As a result selective detection of complements tary structural elements can correspond correct analytes mostly without complex Separation in their complex matrix determined qualitatively and / or quantitatively become. The use of such assays will through their selectivity, which is essentially through the binding constant for the Underlying recognition process Reaction is determined by their sensitivity vity, the time required, the necessary reagent and analyte volume mina, its automation and through determines the price.

2.2 Redoxreaktionen an Mikroelektroden2.2 Redox reactions on microelectrodes

Wird eine Elektrode auf ein geeignetes konstantes Potential gegenüber einer Refe renzelektrode mit Hilfe eines Potentiosta ten polarisiert, kann eine sich in Lösung befindliche Redoxspezies entsprechend des Potentials oxidiert bzw. reduziert werden. Infolge des Umsatzes der Redoxspezies an einer Mikroelektrode entsteht ein Konzen trationsgradient vom Volumen der Lösung in Richtung der Elektrode, was den Aufbau eines hemisphärischen Diffusionsfeldes vor der Mikroelektrode zur Folge hat, in dem die Redoxspezies durch Diffusion zur Elektrodenoberfläche transportiert wird. Wird die Konzentration der umzusetzenden Redoxspezies am Ort der Elektrode gleich null, limitiert der diffusionelle Massen transport den Umsatz an der Elektrode, und man erhält als Maximalstrom den soge nannten Diffusionsgrenzstrom.Will an electrode on a suitable constant potential compared to a ref reference electrode with the help of a potentiosta polarized, one can be in solution existing redox species according to the Potential are oxidized or reduced. As a result of sales of the redox species a microelectrode is formed gradation gradient from the volume of the solution towards the electrode, what the build up of a hemispherical diffusion field in front of the microelectrode, in which the redox species diffuses to Electrode surface is transported. Will the concentration of those to be implemented Redox species at the location of the electrode zero, limited the diffusional masses transport sales at the electrode, and one obtains the so-called maximum current called diffusion limit current.

2.3 Elektrochemisches Recycling2.3 Electrochemical recycling

Wird eine Mikroelektrode, an der diffu sionslimitiert eine Oxidations- oder Reduktionsreaktion eines im Elektrolyten gelösten Redoxmediators abläuft, an eine makroskopische, leitende Oberfläche so weit angenähert, daß das hemisphärische Diffusionsprofil vor der Mikroelektrode durch diese Oberfläche gestört wird, kann - bei geeignetem Potential an der makro skopischen Elektrode - die Rückreaktion der an der Mikroelektrode stattfindenden Reaktion ablaufen. Infolge dieser Rückre aktion werden im Volumenraum des Diffu sionsprofils in der Zeiteinheit die Zahl der an der Mikroelektrode umzusetzenden Redoxspezies vergrößert, so daß als Folge der Diffusionsgrenzstrom anwächst. Diese Amplifizierung ist abhängig von der Kon zentration der Redoxspezies, von der hete rogenen Elektronentransferkinetik an der Mikroelektrode und der leitenden Oberflä che, sowie insbesondere vom Abstand der Mikroelektrode zur gegenüberliegenden Oberfläche. Diese Amplifizierung durch Recycling der Redoxkomponente wird im Folgenden "positiver Feedback" genannt.If a microelectrode is attached to the diffu limits an oxidation or Reduction reaction of one in the electrolyte dissolved redox mediator runs to a macroscopic, conductive surface like this far approximated that the hemispherical Diffusion profile in front of the microelectrode can be disturbed by this surface - with suitable potential on the macro scopic electrode - the reverse reaction the one taking place at the microelectrode Reaction run off. As a result of this return action in the volume space of the Diffu sions profile in the unit of time the number of to be implemented on the microelectrode Redox species enlarged so that as a result the diffusion limit current increases. This Amplification depends on the con concentration of redox species, from the hete rogen electron transfer kinetics at the Microelectrode and the conductive surface che, and in particular the distance of the Microelectrode to the opposite Surface. This amplification by Recycling of the redox component is carried out in Hereinafter called "positive feedback".

3 Stand der Technik3 State of the art

Die bisher beschriebenen Sensoren und Testverfahren zur Erkennung und Quanti fizierung von Bindungsereignissen zwischen komplementären biologischen oder chemischen Strukturen beruhen über wiegend auf dem Nachweis einer Markie rung (Enzym, Floureszenzmarker, Radio isotop), die durch aufwendige Synthese schritte an kompetitiv wirksamen Erken nungsstrukturen angebracht werden müssen. Diese markierten Analytderivate müssen bei einem kompetitiven Assay der Probe zugesetzt werden, so daß sie ver braucht werden. Obwohl die Analysevo lumina sehr stark reduziert wurden, stellt der Verbrauch der markierten Analytmole küle bei kompetitiven Assays einen wesentlichen Kostenfaktor dar.The sensors and described so far Test procedure for detection and quanti creation of binding events between complementary biological or chemical structures are based on weighing on the detection of a markie tion (enzyme, fluorescent marker, radio isotope) by complex synthesis steps on competitive orbs structures are attached have to. These labeled analyte derivatives in a competitive assay Sample are added so that they ver need to be. Although the Analysevo lumina were reduced very much the consumption of the labeled analyte moles cool you in competitive assays essential cost factor.

Direkte Meßverfahren, also solche, bei denen das Bindungsereignis ohne Zugabe markierter Analytmoleküle detektiert werden kann, beruhen überwiegend auf optischen Detektionsmethoden unter Nutzung des evaneszenten Feldes elektro magnetischer Wellen an Grenzflächen unterschiedlicher Brechungsindizes (Ober flächen-Plasmon-Spektroskopie, Gitter koppler, Interferometrie, Ellipsometrie) oder der Beobachtung von Massenän derungen mit einem Schwingquarz oder Oberflächenwellensensor (SAW). Im Allgemeinen ist dabei ein Partner der komplementären Erkennungsreaktion an der Oberfläche des Meßsystems immobili siert, da Brechungsindexänderungen nur in der Abklingdistanz des evaneszenten Feldes (ca. 100 nm) detektiert werden können, bzw. die Resonanzfrequenz bei Mikrowaagen nur durch oberflächenge bundene Strukturen wirksam moduliert werden kann. Derartige Assays sind häufig apparativ aufwendig und müssen zumeist für jeden Anwendungsfall optimiert werden.Direct measuring methods, i.e. those with which the binding event without addition labeled analyte molecules detected can mainly be based on optical detection methods under Use of the evanescent field electro magnetic waves at interfaces different refractive indices (upper surface plasmon spectroscopy, grating coupler, interferometry, ellipsometry) or the observation of masseuses with a quartz crystal or Surface wave sensor (SAW). in the Generally, is a partner of complementary recognition reaction the surface of the measuring system immobili due to changes in refractive index only in the decay distance of the evanescent Field (approx. 100 nm) can be detected can, or the resonance frequency at Microbalances only through surface bound structures effectively modulated can be. Such assays are common expensive in terms of equipment and usually have to optimized for every application become.

Obwohl elektrochemische Verfahren hin sichtlich der apparativen Anforderungen einfach sind, wurden sie aufgrund der geringen Sensitivität nur wenig für Assays eingesetzt. Insbesondere mikroelektroche mische Assays auf der Basis der besonde ren Eigenschaften von Ultramikroelektro den sind bisher wenig untersucht.Although electrochemical processes are out visually the equipment requirements are simple, they were due to the low sensitivity little for assays used. Especially microelectrochemicals mix assays based on the particular properties of ultramicroelectro So far, little has been investigated.

Sugawara et al. beschrieben direkte elek trochemische Assays für das Biotin- Avidin-System. Entweder wurde Biotin mit Daunomycin (Talanta, 1997, 44, 357-363; Analytleal Chemistry, 1995, 67, 299-302) oder mit Nil-Blau (Bioelectrochemistry & Bioenergetics, 1996, 41 (2), 167-I 72) als elektrochemisch aktiver Gruppe markiert oder Biotin-Hy drazid wurde als elektrochemisch aktives Biotinderivat (Bioelectrochemistry & Bioenergetics, 1994, 33, 205-207) benutzt. Binden die oben genannten Biotinderivate an Avidin, so werden die elektrochemisch aktiven Molekülteile mit in die Bindungs tasche des Avidins gezogen, was in allen beschriebenen Fällen zu einem Verlust der elektrochemischen Aktivität führt. Die Nachteile dieser Verfahren sind, daß der beschriebene Mechanismus auf das Avidin-Biotin-System beschränkt ist und somit nicht auf beliebige Analyten zu übertragen ist. Weiterhin ist, infolge der notwendigen intensiven Vorbehandlung der Meßelektroden vor jeder Messung, die schnelle Untersuchung einer großen Anzahl von Proben nicht möglich. Sugawara et al. described direct elec trochemical assays for biotin Avidin system. Either became biotin with daunomycin (Talanta, 1997, 44, 357-363; Analytleal Chemistry, 1995, 67, 299-302) or with Nile blue (Bioelectrochemistry & Bioenergetics, 1996, 41 (2), 167-I 72) as electrochemical active group or Biotin-Hy drazid was considered to be electrochemically active Biotin derivative (bioelectrochemistry & Bioenergetics, 1994, 33, 205-207). Bind the above biotin derivatives to avidin, so they become electrochemical active parts of the molecule in the binding bag of avidins drawn in all described cases to a loss of leads electrochemical activity. The Disadvantages of these methods are that the mechanism described on the Avidin-biotin system is limited and thus not towards any analyte is transferred. Furthermore, due to the necessary intensive pretreatment the measuring electrodes before each measurement quick investigation of a large Number of samples not possible.

Elektrochemische Verstärkung als Folge von Recyclingprozessen wurde für Interdi gitalstrukturen (Paeschke et al.: Sensors & Actuators B-Chemical. 1995, 27, 394-397; Paeschke et al.: Analytica Chimica Acta, 1995, 305, 126-136; Hintsche et al.: Bio sensors & Bioelectronics, 1994, 9, 697- 705) und als Methode zur Abbildung der elektrochemischen Aktivität von Oberflä chen mittels der elektrochemischen Rastermikroskopie (SECM) (Horrocks et al.: Anal. Chem., 1993, 65, 3605-3614; Pierce et al.: tat Chem., 1992, 64, 1795) beschrieben.Electrochemical amplification as a result of recycling processes for Interdi gital structures (Paeschke et al .: Sensors & Actuators B-Chemical. 1995, 27, 394-397; Paeschke et al .: Analytica Chimica Acta, 1995, 305, 126-136; Hintsche et al .: Bio sensors & Bioelectronics, 1994, 9, 697- 705) and as a method for mapping the electrochemical activity of surface chen by means of the electrochemical Scanning microscopy (SECM) (Horrocks et al .: Anal. Chem., 1993, 65, 3605-3614; Pierce et al .: tat Chem., 1992, 64, 1795) described.

Interdigitalelektroden besitzen aufgrund des konstanten Abstandes zwischen den Elektrodenkämmen ein festes Verstär kungsverhältnis. Der positive Feedback- Effekt beim SECM wurde bisher nicht zur Entwicklung amplifizierter Assays genutzt.Due to interdigital electrodes the constant distance between the Electrode combs a firm reinforcement ratio. The positive feedback So far, the SECM has not had any effect Development of amplified assays used.

4 Aufgabe der Erfindung4 Object of the invention

Der hier beschriebenen Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein sensitives elektro chemisches Assay-System für die qualita tive und/oder quantitative Bestimmung von Substanzen in einer komplexen Matrix zu entwickeln. Die Selektivität wird durch die molekulare Erkennung zwischen Struktur bereichen der zu analysierenden Substanz und einem komplementären, mit einer redoxaktiven Gruppe modifizierten Bin dungspartner gewährleistet. Das Verfahren und die zur Durchführung des Verfahrens notwendigen Vorrichtungen sollen prinzi piell die Analyse beliebiger komplementä rer Bindungsereignisse erlauben, über eine variable Verstärkung zur Anpassung des Meßbereiches verfügen, und in sehr klei nen Reaktionsvolumina durchgeführt werden können. Die Möglichkeit zur Miniaturisierung impliziert gleichzeitig die Parallelisierung der Verfahren und der Vorrichtungen sowie den extrem geringen Verbrauch notwendiger Reagenzien.The invention described here is the Task based on a sensitive electro chemical assay system for qualita tive and / or quantitative determination of Substances in a complex matrix too develop. The selectivity is through the molecular recognition between structure areas of the substance to be analyzed and a complementary one redox active group modified bin partner guaranteed. The procedure and the one to carry out the procedure necessary devices should be prince piell the analysis of any complementary allow binding events via a variable gain to adjust the Have measuring range, and in very small NEN reaction volumes performed can be. The opportunity to Miniaturization also implies that Parallelization of procedures and Devices as well as the extremely small Consumption of necessary reagents.

5 Erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe5 Solution according to the invention task

Die erfindungsgemäße Lösung der Auf gabe erfolgt durch ein Verfahren zur Bestimmung von chemischen oder bio chemischen Analyten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Diffusions koeffizient einer redoxaktiven Spezies, die mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelt ist, durch Anbindung einer komplementären Erkennungsstruktur moduliert wird, und die Modulation des Diffusionskoeffizienten mit einem elektro chemischen Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies detek tiert wird. Dabei ist das Verfahren durch eine Meßelektrode gekennzeichnet, die als Makro- oder Mikroelektrode mit einem aktiven Durchmesser zwischen 0.1 und 500 µm, bevorzugt 1-100 µm, insbesondere 10-50 µm ausgebildet ist, wobei die aktive Scheibenelektrode von einem isolie renden Mantel aus Glas oder Polymeren umgeben ist, der die Diffusion von Redox spezies zur aktiven Elektrodenoberfläche moduliert. Die Meßelektrode wird mittels Positionierelementen einer makroskopi schen leitenden Oberfläche soweit angenä hert, daß das Diffusionsprofil der mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelten Redoxspezies durch diese Oberfläche verändert wird. Das an den Redoxmediator gekoppelte Erkennungs element kann alternativ Biotin, ein Hapten, ein Antigen, ein Antikörper, ein Lectin, ein Kohlehydrat, ein DNA-Fragment, ein DNA-Halbstrang, ein RNA-Fragment, ein Oligonucleotid, ein Hormon, ein Rezeptor oder ein künstliches Wirtsmolekül sein, für das eine komplementäre Erkennungs struktur existiert, die selektiv gebunden werden kann. Alternativ kann auch über eine Zwischenstruktur mit mehr als einer Bindungsstelle der Redoxmediator und der Analyt spezifisch erkannt und gebunden werden kann, so daß ein Sandwich-Assay entsteht. Das Signal des zur Anwendung kommenden elektrochemischen Verfahrens muß durch den Diffusionskoeffizient der Redoxspezies bestimmt werden. Die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe betrifft weiterhin die Konzeption von Vorrichtungen die die Durchführung des Verfahrens ermöglichen. In einer ersten Vorrichtung wird in einer Meßzelle mit Referenzelektrode, Gegenelektrode und makroskopischer Regenerationsoberfläche mit einem Volumen von 10 µl-1 ml, bevorzugt einem Volumen < 300 µl eine Mikroelektrode mittels Positionierele menten an die Regenerationsoberfläche angenähert. Eine zweite Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß die elek trochemische Meßzelle als ein Meß zellenarray ausgebildet ist, insbesondere nach Art von Mikrotiterplatten, dessen Boden eine gemeinsame leitende Regene rationsoberfläche bilden. Eine dritte Vor richtung benutzt einen Flüssigkeitstropfen als wandfreie "Meßzelle", in die die Redoxmediatorlösung über eine die Mikro elektrode umschließende Kapillare zudo siert wird, so daß sich ein das leitende Substrat und die Spitze der Mikroelektrode umgebender Tropfen bildet.The solution according to the invention is given by a procedure for Determination of chemical or bio chemical analyte by that is characterized in that the diffusion coefficient of a redox active species, the with a specific recognition element is coupled, by connecting a complementary recognition structure is modulated, and the modulation of the Diffusion coefficient with an electro chemical process under reinforcement by recycling the redox species detek is tiert. The procedure is done a measuring electrode marked as Macro or microelectrode with one active diameter between 0.1 and 500 µm, preferably 1-100 µm, in particular 10-50 microns is formed, the active disc electrode from an isolie sheath made of glass or polymers surrounded by redox diffusion species to the active electrode surface modulated. The measuring electrode is by means of Positioning elements of a macroscopic conductive surface as far as possible that the diffusion profile with a specific recognition element coupled redox species through this Surface is changed. That to the Redox mediator coupled detection Alternatively, biotin, a hapten, an antigen, an antibody, a lectin Carbohydrate, a DNA fragment, a DNA half-strand, an RNA fragment Oligonucleotide, a hormone, a receptor or be an artificial host molecule for which is a complementary recognition structure exists that is selectively bound can be. Alternatively, you can use an intermediate structure with more than one Binding site of the redox mediator and the Analyte specifically recognized and bound can be so that a sandwich assay arises. The signal of the application upcoming electrochemical process must by the diffusion coefficient Redox species can be determined. The Solution of the task according to the invention still concerns the conception of Devices that carry out the Allow procedure. In a first Device is in a measuring cell with Reference electrode, counter electrode and macroscopic regeneration surface with a volume of 10 µl-1 ml, preferably a volume of <300 µl Microelectrode using a positioning element elements on the regeneration surface approximated. A second device is characterized in that the elec trochemical measuring cell as a measuring cell array is formed, in particular in the manner of microtiter plates, the Soil a common conductive rain ration surface. A third before direction uses a drop of liquid as a wall-free "measuring cell" into which the Redox mediator solution via a the micro electrode enclosing capillary zudo Is siert, so that the leading Substrate and the tip of the microelectrode surrounding drop forms.

Prinzipiell ist es möglich, das Verfahren unter Nutzung der unterschiedlichen Vor richtungen sequentiell durch Repositionie rung der Mikroelektrode in verschiedenen Meßzellen eines Arrays durchzuführen, wobei mehrere Proben unter Nutzung einer gemeinsamen leitenden Regenerations oberfläche vermessen werden können.In principle, it is possible to use the procedure using the different pre directions sequentially through repositioning tion of the microelectrode in different Perform measuring cells of an array, taking multiple samples using one common senior regeneration surface can be measured.

Weiterhin gelingt es, mittels unabhängiger Positionierelemente mehrere Mikroelek troden parallel in mehreren Meßzellen oder Tropfen der Meßlösung an die jeweilige Regenerationsoberfläche anzunähern, so daß gleichzeitig mehrere Proben vermessen werden können.Furthermore, it succeeds by means of independent Positioning elements of several microelectrics tread in parallel in several measuring cells or Drop the measuring solution to the respective Approach regeneration surface, so that measure several samples at the same time can be.

6 Beschreibung der Erfindung6 Description of the invention

In dem erfindungsgemäßen Verfahren und den zugehörigen Vorrichtungen wurde ein neuartiges Assay-System konzipiert, das die Modulation des Diffusionskoeffizien ten einer mit einem Erkennungselement modifizierten redoxaktiven Spezies als Folge der Anbindung eines komplementä ren Bindungspartners nutzt, um qualitative und quantitative Informationen über das Vorhandensein und die Konzentration des Analyten zu erhalten. Als Detektions system wird dazu eine Mikroelektrode benutzt, an der bei einem geeigneten Potential der im Elektrolyt gelöste, mit dem Erkennungselement modifizierte Redoxmediator diffusionskontrolliert oxidiert bzw. reduziert wird. Die moleku lare Erkennung des Bindungspartners führt unter anderem zu einer Vergrößerung des Molekulargewichtes und damit verbunden zu einer Modulation des Diffusionskoeffi zienten der Redoxspezies, was durch eine Verminderung des Massentransports zur Mikroelektrode zu einer Verringerung des Diffusionsgrenzstromes führt. Die Detek tion des diffusionsabhängigen Fara day'schen Stromes an der Mikroelektrode kann statisch bei einem der Mikroelektrode aufgeprägten konstanten Potential oder dynamisch mittels cyclischer Voltamme trie, Differential-Puls-Voltammetrie, Potentialsprung-Techniken etc. erfolgen. Zur Signalamplifizierung als Vorausset zung für eine Erhöhung der Sensitivität und der möglichen Anpassung der Kali brierfunktion an die tatsächlich vorliegende Analytkonzentration wird die Meßelek trode (eine Mikroelektrode mit einem typischen Radius < 100 µm in einer Isola tionshülle mit einem mehrfachen Durch messer der aktiven Elektrodenscheibe (Abb. 1) mittels Verschiebeelemente (z. B. Schrittmotor-getriebene oder manu elle Mikrometerschrauben, Piezostapel) an eine gegenüberliegende, leitende Ober fläche angenähert, so daß das Diffusions profil der Redoxspezies vor der Mikroelek trode bis zur gegenüberliegenden leitenden Oberfläche reicht (Abb. 2). Die Regeneration des Redoxmediators an dieser Oberfläche ist entweder bedingt durch die Einstellung des Nernstpotentials in weiter Entfernung der positionierten Mikroelektrode oder wird durch das Auf prägen eines geeigneten Potentials mittels eines Bipotentiostaten erzwungen. Diese Regeneration des Redoxmediators führt zu einer durch den Abstand der Mikroelek trode in weiten Grenzen wählbaren Ampli fizierung des Stromes in Abhängigkeit des Diffusionskoeffizienten der an der Mikro elektrode umgesetzten Redoxspezies.In the method according to the invention and the associated devices, a novel assay system was designed which uses the modulation of the diffusion coefficient of a redox-active species modified with a recognition element as a result of the connection of a complementary binding partner to provide qualitative and quantitative information about the presence and the concentration of the analyte. For this purpose, a microelectrode is used as the detection system, at which the redox mediator dissolved in the electrolyte and modified with the detection element is oxidized or reduced in a diffusion-controlled manner at a suitable potential. The molecular recognition of the binding partner leads, among other things, to an increase in the molecular weight and therefore to a modulation of the diffusion coefficient of the redox species, which leads to a reduction in the diffusion limiting current due to a reduction in mass transport to the microelectrode. The detection of the diffusion-dependent Fara day current at the microelectrode can be carried out statically at a constant potential impressed on the microelectrode or dynamically by means of cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, potential jump techniques etc. To amplify the signal as a prerequisite for increasing the sensitivity and the possible adjustment of the calibration function to the actual analyte concentration, the measuring electrode (a microelectrode with a typical radius <100 µm in an insulation sleeve with a multiple diameter of the active electrode disk ( Fig . 1) by means of displacement elements (e.g. stepper motor-driven or manual micrometer screws, piezo stack) approximated to an opposite, conductive surface, so that the diffusion profile of the redox species in front of the microelectrode extends to the opposite conductive surface ( Fig. 2 The regeneration of the redox mediator on this surface is either due to the setting of the Nernst potential far away from the positioned microelectrode or is forced by applying a suitable potential by means of a bipotentiostat t to an amplification of the current that can be selected within wide limits due to the distance between the microelectrodes, depending on the diffusion coefficient of the redox species converted on the microelectrode.

Ein vollständiger analytischer Zyklus ist aus mindestens 4 Verfahrensschritte aufge baut (Abb. 3):
A complete analytical cycle is made up of at least 4 process steps ( Fig. 3):

- Bestimmung des durch Umsatz des mit der spezifischen Erkennungsstruktur modifizierten Redoxmediators erzeug ten Faraday'schen Stromes an der Mikroelektrode in Abhängigkeit des Abstandes Mikroelektrode/Regenera tionsoberfläche.- Determination of the turnover of the the specific recognition structure generate modified redox mediators ten Faraday current on the Microelectrode depending on the Distance microelectrode / Regenera tion surface.
- Zugabe der Probe zur Lösung des Redoxmediators und Inkubation für einen festgelegten Zeitraum, der im wesentlichen von der Bindungskon stante der komplementären Erkennungs strukturen bestimmt wird.- Add the sample to the solution of the Redox mediators and incubation for a specified period of time in essential of the binding con constant of complementary recognition structures is determined.
- Bestimmung des durch Umsatz des mit dem Komplex zwischen den komple mentären Erkennungsstrukturen modifi zierten Redoxmediators erzeugten Faraday'schen Stromes an der Mikro elektrode in Abhängigkeit des Abstan des Mikroelektrode/Regenerationsober fläche.- Determination of the turnover of the the complex between the comple mental recognition structures modifi graced redox mediators Faraday current on the micro electrode depending on the distance of the microelectrode / regeneration top area.
- Auswertung der Stromabnahme mittels Kalibrierfunktionen unter Berücksichti gung der Volumenveränderung des Elektrolyten nach Zugabe des Analyten und des durch Recycling des Redoxme diators erhaltenen Verstärkungseffektes.- Evaluation of the current draw using Calibration functions taking into account volume change of the Electrolytes after adding the analyte and that by recycling the redox diator obtained gain effect.

Für die erfindungsgemäße Durchführung der Analysenverfahren wurden unter schiedliche Vorrichtungen konzipiert, die den verschiedenen Einsatzmöglichkeiten der Assays hinsichtlich Zahl der Proben und verfügbarem Probenvolumen Rech nung tragen.For the implementation according to the invention the analytical procedures were under different devices designed that the various uses of assays for number of samples and available sample volume Rech wear.

1. Vorrichtung zur Bestimmung von chemischen oder biochemischen Ana lyten über die Anbindung an eine elek trochemisch aktive Substanz mit Hilfe von Mikroelektroden, welche gekenn zeichnet ist durch, eine elektrochemi sche Zelle mit einem Volumen ≦ 10 ml, bevorzugt ≦ 1 ml, insbesondere ≦ 300 µl mit Referenzelektrode, Gegenelektrode, Vorrichtungen zum Entgasen der Lösung und zum Überleiten von Schutzgas über die Lösung, sowie einer leitenden ebenen kontaktierbaren Elektrode auf dem Meßzellenboden. Die Vorrichtung ist darüberhinaus gekenn zeichnet durch eine Scheibenmikro elektrode mit einem Durchmesser der elektrochemisch aktiven Oberfläche von 0.1-1000 µm, bevorzugt 10-50 µm, einer mit Motoren bevorzugt Schritt motoren, manuell und/oder Piezoele menten getriebenen Feinverstelleinheit für die Höhenpositionierung der Schei benmikroelektrode relativ zur Regene rationsoberfläche auf dem Meßzellen boden, optional einer mit Motoren, bevorzugt Schrittmotoren, manuell oder mit Piezoelementen getriebenen Einheit zur lateralen Verschiebung der Meß zelle, einen Potentiostaten und einen Personal-Computer zur Steuerung des Potentiostaten und der Verstelleinhei ten, sowie zur Meßwertaufnahme und Meßwertverarbeitung (Abb. 4).1. Device for the determination of chemical or biochemical analytes via the connection to an electrochemically active substance with the aid of microelectrodes, which is characterized by an electrochemical cell with a volume ≦ 10 ml, preferably ≦ 1 ml, in particular ≦ 300 µl with reference electrode, counter electrode, devices for degassing the solution and for passing protective gas over the solution, as well as a conductive flat contactable electrode on the bottom of the measuring cell. The device is also characterized by a disk micro electrode with a diameter of the electrochemically active surface of 0.1-1000 microns, preferably 10-50 microns, with motors, preferably stepper motors, manually and / or piezoelectric elements, fine adjustment unit for the height positioning of the disk ben microelectrode Relative to the regeneration surface on the measuring cell floor, optionally a unit with motors, preferably stepper motors, manually or with piezo elements for the lateral displacement of the measuring cell, a potentiostat and a personal computer for controlling the potentiostat and the adjusting units, as well as for measuring value recording and Measured value processing ( Fig. 4).
2. Vorrichtung zur schnellen sequentiellen Bestimmung von chemischen oder bio chemischen Analyten über die Anbin dung an eine elektrochemisch aktive Substanz mit Hilfe von Mikroelektro den, welche gekennzeichnet ist durch einen Meßzellenverbund (analog einer Mikrotiterplatte), deren Boden leitfähig beschichtet ist. Die Referenz- und Gegenelektrode werden zusammen mit der als Meßelektrode dienenden Schei benmikroelektrode in die jeweils zu vermessende Meßzelle des Verbundes eingetaucht. Da Größe, Zahl und Abstände zwischen den Meßzellen bekannt sind, lassen sich die einzelnen Meßzellen automatisiert sequentiell mit der Mikroelektrode über die lateralen Verstelleinheiten anfahren und vermes sen (Abb. 5).2. Device for the rapid sequential determination of chemical or bio-chemical analytes via the connection to an electrochemically active substance with the aid of microelectro, which is characterized by a measuring cell network (analogous to a microtiter plate), the bottom of which is conductively coated. The reference and counter electrodes, together with the disk micro-electrode serving as the measuring electrode, are immersed in the measuring cell of the assembly to be measured in each case. Since the size, number and distances between the measuring cells are known, the individual measuring cells can be automatically started and measured sequentially with the microelectrode via the lateral adjustment units ( Fig. 5).
3. Vorrichtung zur Bestimmung von che mischen oder biochemischen Analyten über die Anbindung an eine elektro chemisch aktive Substanz mit Hilfe von Mikroelektroden, welche gekennzeich net ist durch einen Meßzellenverbund (analog einer Mikrotiterplatte), deren Boden leitfähig beschichtet ist, und mehreren der Zeilen- oder Spaltenzahl des Meßzellenverbundes angepaßten und im Meßzellenabstand voneinander parallel angeordneten positionierbaren Mikroelektroden, die unabhängig von einander in ihrer Höhe variiert werden können. Diese Vorrichtung gestattet die automatisierte, simultane Durchführung des erfindungsgemäßen Analyseverfah rens (Abb. 6).3. Device for the determination of chemical or biochemical analytes via the connection to an electrochemically active substance with the aid of microelectrodes, which is characterized by a measuring cell network (analogous to a microtiter plate), the bottom of which is conductively coated, and several of the rows or Number of columns of the measuring cell network adapted and positionable in parallel in the measuring cell spacing from each other positioned microelectrodes, which can be varied in height independently of each other. This device allows the automated, simultaneous implementation of the analytical method according to the invention ( Fig. 6).
4. Vorrichtung zur Bestimmung von chemischen oder biochemischen Analyten über die Anbindung an eine elektrochemisch aktive Substanz mit Hilfe von Mikroelektroden, welche gekennzeichnet ist durch eine Positio nierung der Mikromeßelektrode und der Referenz- und Gegenelektrode, zumindest jedoch einer Referenzelek trode, in einem auf der Regenera tionsoberfläche aufgebrachten Tropfen unter Verzicht auf eine Meßzellenwand. Das Volumen des Tropfens ist nach oben durch die Oberflächenspannung des verwendeten Elektrolyten, nach unten durch die Positioniergenauigkeit der Mikroelektrode mit Referenzelek trode über der Regenerationsoberfläche begrenzt. Erfindungsgemäß beträgt das Tropfenvolumen bevorzugt 0.001- 500 µl, insbesondere 1-100 µl (Abb. 7). Die Vorrichtung ist optional weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersu chende Probenlösung entweder mittels einer Mikrokapillare durch iontopho retische Injektion, durch Kapillarkräfte, bzw. unter Verwendung von Mikro pumpen oder mittels einer Düse, bevorzugt einem Piezodispenser, als Mikrotröpfchen, eventuell auch berührungslos über einen Luftspalt, in den das Meßvolumen bestimmenden Elektrolyttropfen eingebracht wird.4. Device for determining chemical or biochemical analytes via the connection to an electrochemically active substance with the aid of microelectrodes, which is characterized by a positioning of the micromeasuring electrode and the reference and counterelectrode, but at least one reference electrode, in one on the Regenera tion surface applied drops without a measuring cell wall. The volume of the drop is limited by the surface tension of the electrolyte used, down by the positioning accuracy of the microelectrode with reference electrode above the regeneration surface. According to the invention, the drop volume is preferably 0.001-500 µl, in particular 1-100 µl ( Fig. 7). The device is optionally further characterized in that the sample solution to be investigated either by means of a microcapillary by iontophoreic injection, by capillary forces or using micro pumps or by means of a nozzle, preferably a piezo dispenser, as microdroplets, possibly also contactlessly via a Air gap into which the electrolyte drop determining the measuring volume is introduced.

Das erfindungsgemäße Meßverfahren wird im folgenden beispielhaft unter Nutzung der Vorrichtung 1 und anhand der Cyclo voltammetrie als dem zur Anwendung kommenden elektrochemischen Verfahren erläutert; die Übertragung der Erläuter ungen auf andere elektrochemische Meß verfahren wie der Amperometrie bei kon stantem Potential, unterschiedlicher Puls- Voltammetrieverfahren, Chronoampero metrie etc. sind einem Fachmann möglich. Im cyclovoltammetrischen Experiment bewirkt ab einem bestimmten Potential wert eine weitere Potentialerhöhung keine weitere Erhöhung des Faraday'schen Stromes. Die Parameter, die diesen diffu sionskontrolliert fließenden Grenzstrom bestimmen sind die Elektrodengröße, die Konzentration der Redoxspecies, die Zahl der pro Formelumsatz übertragenen Elek tronen, sowie der Diffusionskoeffizient der Redoxspezies. Der Diffusionskoeffizient ist für das erfindungsgemäße Verfahren von besonderer Bedeutung, da die Regene ration des Redoxmediators durch seine wechselseitige Diffusion zwischen der Mikromeßelektrode und der Regenera tionsoberfläche bestimmt wird.The measuring method according to the invention is explained below using the device 1 and cyclo voltammetry as the electrochemical method used; the transfer of the explanations to other electrochemical measuring methods such as amperometry at constant potential, different pulse voltammetry methods, chronoamperometry etc. are possible for a person skilled in the art. In the cyclic voltammetric experiment, a further increase in potential does not cause a further increase in Faraday current from a certain potential value. The parameters that determine this diffusion-controlled flowing limiting current are the electrode size, the concentration of the redox species, the number of electrons transferred per formula conversion, and the diffusion coefficient of the redox species. The diffusion coefficient is of particular importance for the method according to the invention, since the regeneration of the redox mediator is determined by its mutual diffusion between the micro measuring electrode and the regeneration surface.

Wird nun die komplementäre Erkennungs struktur (das heißt die zu bestimmende Substanz) zum am Redoxmediator gebun denen Erkennungselement zugegeben, so erfolgt die molekulare Erkennung unter Bildung eines Affinitätskomplexes zwischen den komplementären Strukturen mit einer für das gewählte Erkennungs system spezifischen Affinitätskonstanten (Bindungskonstante). Nach einer Inkuba tionszeit, die entweder ausreichend ist, um die Gleichgewichtskonzentration des Affi nitätskomplexes zu erhalten, oder die exakt reproduziert werden muß, ist der mittlere Diffusionskoeffizient des an der Mikro elektrode umzusetzenden Redoxmediators infolge der Vergrößerung des Molekular gewichtes erniedrigt. Wird die Erkennungsstruktur in fester Form zuge geben, so bleiben die Parameter Elektro dengröße, Abstand Mikroelektrode/Rege nerationsoberfläche, Zahl der ausge tauschten Elektronen und Konzentration des Redoxmediators konstant. Die erfolgte Abnahme des diffusionskontrolliert fließenden Faraday-Stromes im erneuten cyclovoltammetrischen Experiment ist somit ausschließlich auf die Modulation des Diffusionskoeffizienten als Folge der molekularen Erkennungsreaktion zurück zuführen. Die Abnahme des Stromes ist dabei ein Maß für die gebildete Menge des Affinitätskomplexes. Die Differenz der Diffusionsgrenzströme in den vor und nach der Zugabe des Analyten aufgenommenen Cyclovoltammogrammen stellt somit das auszuwertende Meßsignal des erfindungs gemäßen Verfahrens dar. Aufgrund der hohen Spezifität der molekularen Erken nungsreaktion besitzt dieses Verfahren eine geringe Querempfindlichkeit, so daß eine vorherige Probenaufbereitung zumeist entfallen kann.Now becomes the complementary recognition structure (i.e. the one to be determined Substance) for the redox mediator to which recognition element is added, so the molecular recognition takes place under Formation of an affinity complex between the complementary structures with one for the chosen recognition system specific affinity constants (Binding constant). After an Incuba tion time, which is either sufficient to the equilibrium concentration of the Affi nity complex to maintain, or the exact must be reproduced is the middle one Diffusion coefficient of the at the micro redox mediator to be implemented due to the enlargement of the molecular weight decreased. Will the Detection structure in solid form the electrical parameters remain size, distance between microelectrode and rain generation surface, number of out exchanged electrons and concentration of the redox mediator constant. That was done Decrease in diffusion controlled flowing Faraday current in the renewed cyclic voltammetric experiment thus exclusively on the modulation of the diffusion coefficient as a result of molecular recognition reaction respectively. The decrease in the current is a measure of the amount of Affinity complex. The difference in Diffusion limit currents in the before and after the addition of the analyte Cyclic voltammograms therefore represent this Measurement signal of the invention to be evaluated according to the procedure. Due to the high specificity of molecular branches This process has a reaction low cross-sensitivity, so that a previous sample preparation mostly can be omitted.

Alternativ läßt sich das Erkennungselement auch in Lösung zugeben. Wichtig hierbei ist, daß sich nun neben dem Diffusions koeffizienten des Redoxmediators auch die Konzentration ändert. Um diesen Effekt möglichst gering zu halten, ist es erforder lich, das zugegebene Probevolumen im Vergleich zum Volumen der Redoxme diatorlösung in der Meßzelle möglichst gering zu halten, oder die Konzentrations abnahme durch die Volumenvergrößerung rechnerisch oder durch eine einmal aufge nommene Kalibrierfunktion, die nur den Volumenzuwachs berücksichtigt, zu elimi nieren.Alternatively, the detection element also add in solution. Important here is that next to diffusion coefficients of the redox mediator also Concentration changes. To this effect It is necessary to keep it as low as possible Lich, the added sample volume in Comparison to the volume of the redox diator solution in the measuring cell if possible to keep low, or the concentration decrease due to the increase in volume arithmetically or by one once taken calibration function that only the Volume increase taken into account to elimi kidneys.

Weiterhin ist es auch möglich, Probe und Redoxmediatorlösung vor der Messung zu vermischen und nach der Inkubationszeit mit nur einer elektrochemischen Messung zu untersuchen. Der Gehalt des Analyten in der Probe kann dann über eine mit Stan dardlösungen erhaltene Kalibrierfunktion erhalten werden.Furthermore, it is also possible to sample and Redox mediator solution before the measurement mix and after the incubation period with just one electrochemical measurement to investigate. The content of the analyte in the sample can then have a Stan calibration functions obtained be preserved.

Im Falle eines Analyten, der mehrere Bindungsstellen besitzt, kann das Meßver fahren auf ein Sandwich-Konzept erweitert werden. Bei identischen Bindungsstellen setzt man in einem ersten Reaktionsschritt einen Überschuß des Analyten zur Redox mediatorlösung zu. Aufgrund des Über schusses können nicht alle Bindungsstellen des Analyten mit Redoxmediator molekülen besetzt werden, so daß sta tistisch einige Bindungsstellen eines Analytmoleküls mit dem Redoxmediator besetzt sind und einige frei sind. Bei verschiedenen Bindungsstellen genügt eine Absättigung aller Bindungsstellen des Analyten, die den Redoxmediator binden können. Die erfolgreiche Anbindung kann durch das beschriebene Meßverfahren kontrolliert werden.In the case of one analyte, several Has binding sites, the measuring ver drive extended to a sandwich concept become. With identical binding sites one sets in a first reaction step an excess of the analyte to the redox mediator solution too. Because of the over Not all binding sites can be shot of the analyte with redox mediator molecules are occupied, so that sta some binding points of a Analyte molecule with the redox mediator are occupied and some are free. At different binding sites suffice Saturation of all binding sites of the Analytes that bind the redox mediator can. The successful connection can through the measuring method described to be controlled.

Die freien Bindungsstellen stellen die Grundlage für den Sandwich-Assay dar, da über diese ein weiteres zu dieser Bindungs stellen komplementäres Erkennungsele ment anbinden kann und somit die Mol masse des Redoxmediators weiter zunimmt, was zu einer weiteren Verringe rung des Diffusionskoeffizienten der Redoxspezies führt. Dieses läßt sich über resultierende Abnahme des Diffusions grenzstromes mit dem beschriebenen Meßverfahren detektieren.The free binding sites represent the The basis for the sandwich assay is there about this one more about this binding represent complementary recognition elements ment and thus the Mol mass of the redox mediator increases, resulting in further reductions tion of the diffusion coefficient of Redox species leads. This can be done resulting decrease in diffusion limit current with the described Detect measuring method.

Die Besonderheit des Meßverfahrens der vorliegenden Erfindung ist die zusätzliche Verstärkung des Meßeffektes durch den positiven Feedback-Effekt (Redoxme diatorrecycling) an der Regenerations oberfläche, der einfach durch Annäherung der Mikromeßelektrode an die Regenera tionsoberfläche erreicht werden kann, und über die Variation des Abstand zwischen Mikroelektrode und Regenerationsober fläche an die Erfordernisse von verschiedenen Analyten angepaßt werden kann. Hier liegt ein klarer Vorteil gegen über Verstärkungsmechanismen, die an aufwendig herzustellenden Interdigital- Elektroden zustande kommen, und an denen dieser Verstärkungseffekt nicht moduliert werden kann. Das erfindungs gemäße Analysenverfahren und die Vor richtungen weisen den Vorteil auf, daß lediglich ein Monopotentiostat benötigt wird, da im allgemeinen lediglich der Mikromeßelektrode Potentiale aufgeprägt werden müssen. Die zur Anwendung kommenden Mikroelektroden können durch Polieren mit Polierpasten gereinigt werden, so daß sie über eine große Zahl von Analysen reproduzierbar verwendet werden können.The peculiarity of the measuring method of present invention is the additional Amplification of the measuring effect by the positive feedback effect (redox diator recycling) at the regeneration surface that simply by approximation the micro measuring electrode to the Regenera tion surface can be reached, and about the variation of the distance between Microelectrode and regeneration top area to meet the requirements of be adapted to different analytes can. There is a clear advantage here about reinforcement mechanisms that elaborate interdigital Electrodes come about, and on which this reinforcing effect does not can be modulated. The invention appropriate analytical procedures and the pre directions have the advantage that only a monopotentiostat is required will, since generally only the Micrometer potentials imprinted Need to become. The application coming microelectrodes can cleaned by polishing with polishing pastes be so that they have a large number used reproducibly by analyzes can be.

7 Beispiele7 examples

Im folgenden wird das der Erfindung zugrunde liegende Prinzip anhand von Beispielen erläutert:The following is the invention underlying principle based on Examples explained:

7.1 Biotin/Streptavidin Assay unter Verwendung von Vorrichtung 17.1 Biotin / streptavidin assay below Use of device 1

Als Redoxmediator wird ein mit Biotin modifiziertes Ferrocenderivat verwendet. Die Darstellung gelingt über die Umset zung eines wasserlöslichen Ferrocen- Alkylamins mit Hydroxysuccinimid- Biotin. Die Reaktionsprodukte werden mit Hilfe einer mit monomeren Avidin beschichteten Säule getrennt. Als Mikro elektrode dient eine glasummantelte Platinmikroelektrode mit einem Durch messer der aktiven Elektrodenoberfläche von 50 µm. Als elektrochemisches Detek tionsverfahren dient die cyclische Voltammetrie.As a redox mediator, one with biotin modified ferrocene derivative used. The presentation succeeds through the implementation a water-soluble ferrocene Alkylamines with hydroxysuccinimide Biotin. The reaction products are with Help one with monomeric avidin coated column separately. As a micro the electrode is covered with a glass One-pass platinum microelectrode knife of the active electrode surface of 50 µm. As an electrochemical detector tion process serves the cyclic Voltammetry.

Abb. 8 (Kurve 1) zeigt ein Cyclo voltammogramm (Lösungsvolumen 300 µl; Vorrichtung 1) des biotinilierten Ferrocen-Komplexes (im folgenden Fc- Biotin genannt). Abb. 8 (Kurve 2) zeigt das Cyclovoltammogram nach Zugabe von 8 µl 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7). Die sehr geringe Abnahme des Faraday'schen Stromes ist auf die Volu menvergrößerung zurückzuführen. Die Kurven 3-5 zeigen die Cyclovoltammo gramme nach der Zugabe von jeweils 8 µl einer 0.15 mM Streptavidinlösung. Fig. 8 (curve 1 ) shows a cyclovoltammogram (solution volume 300 µl; device 1) of the biotinylated ferrocene complex (hereinafter referred to as Fc-biotin). Fig. 8 (curve 2 ) shows the cyclic voltammogram after adding 8 µl 0.1 M phosphate buffer (pH 7). The very small decrease in Faraday's current is due to the increase in volume. Curves 3-5 show the cyclic voltammograms after the addition of 8 µl of 0.15 mM streptavidin solution.

Aufgrund der Erniedrigung des Diffu sionskoeffizienten des Fc-Biotins durch die Anbindung des Streptavidins nimmt der Faraday-Strom an der Mikroelektrode ab.Due to the decrease in diffusion tion coefficient of the Fc biotin by the The streptavidin is connected Faraday current on the microelectrode.

Nach mehrfacher Zugabe des Analyten tritt Sättigung ein (Abb. 8, Kurve 5).Saturation occurs after multiple additions of the analyte ( Fig. 8, curve 5 ).

Abb. 9 zeigt eine analoge Messung unter Nutzung des Redoxrecycling an der der Mikromeßelektrode gegenüberliegen den Regenerationsoberfläche. Die im Vergleich zu Abb. 8 wesentlich höheren Ströme zeigen den erwarteten Verstärkungseffekt. Fig. 9 shows an analog measurement using redox recycling at the regeneration surface opposite the micro measuring electrode. The significantly higher currents compared to Fig. 8 show the expected amplification effect.

Dieser Verstärkungseffekt wird in Abb. 10 verdeutlicht, in der die Faraday'schen Ströme, normiert auf den Anfangsstrom vor der Zugabe von Streptavidin, gegen die Streptavidinkon zentration in der Meßzelle aufgetragen ist.This amplification effect is illustrated in Fig. 10, in which the Faraday currents, normalized to the initial current before the addition of streptavidin, are plotted against the streptavidin concentration in the measuring cell.

Die Messung mit Verstärkung durch Redoxrecycling zeigt eine um den Faktor 3 erhöhte Sensitivität. Für das hier gezeigte Beispiel lassen sich mit dem beschriebenen Verfahren Konzentrationen von Streptavi din von 1-10 µmol/l bestimmen.The measurement with gain through Redox recycling shows a factor of 3 increased sensitivity. For the one shown here Example can be described with the Procedure concentrations of streptavi Determine din from 1-10 µmol / l.

7.2 Biotin/Streptavidin Assay unter Verwendung von Vorrichtung 47.2 Biotin / streptavidin assay below Use of device 4

Eine weitere Verringerung der einzuset zenden Substanzmengen läßt sich durch die Anwendung des Meßverfahrens in "freier" Umgebung ohne die Volumenbe grenzung durch Meßzellen erreichen.A further reduction in the stake quantities of substance can be the application of the measuring method in "free" environment without the volume achieve limit by measuring cells.

Eine Mikroelektrode wird senkrecht sehr dicht an eine makroskopische Elektrode angenähert. Anschließend werden 20 µl Redoxmediatorlösung zudosiert, so daß sich eine die Mikro- und Makroelektrode umschließender Tropfen bildet. In diesen werden zusätzlich ein chloridisierter Silberdraht als Pseudo-Referenzelektrode und ein Platindraht als Gegenelektrode eingetaucht. Der Meßvorgang kann nach dem bereits beschriebenen Meßprinzip mit oder ohne Redoxamplifizierung erfolgen. Die Zugabe der Probe erfolgt aufgrund der kleinen Gesamtvolumina in einer für feste und flüssige Proben unterschiedlicher Weise. Im Falle fester Proben wird diese in einer Redoxmediatorlösung, welche die gleiche Konzentration an Redoxmediator aufweist wie die Referenz-Meßlösung, gelöst. Im Falle flüssiger Proben wird durch Vermischung der Probelösung mit einer höher konzentrierten Redoxmedia torlösung eine Lösung hergestellt, welche die gleiche Konzentration an Redoxspezies wie die Referenz-Meßlösung des Tropfens besitzt. Volumina bis zu 50 µl dieser Probenlösungen können in den Tropfen injiziert werden. Da Meß- und Referenz- Probenlösung die gleiche Konzentration an Redoxspezies besitzen, müssen Verdün nungseffekte nicht berücksichtigt werden. Abb. 11 Kurve 1 zeigt ein mit dieser Versuchsanordnung aufgenommenes Cyclovoltammogramm von Fc-Biotin mit Redoxamplifizierung. Über das beschrie bene Verfahren wurden 0.1 mg Streptavi din in 15 µl Meßlösung in den freien Trop fen zudosiert. Das entsprechende Cyclo voltammogramm (Abb. 11 Kurve 2) zeigt die resultierende Stromabnahme des Diffusionsgrenzstromes. Bei einer weiteren Zugabe von Streptavidin befindet sich das System bereits im Sättigungsbereich, so daß keine weitere signifikante Abnahme des Diffusionsgrenzstroms zu verzeichnen ist (Abb. 11 Kurve 3).A microelectrode is approached very closely vertically to a macroscopic electrode. Then 20 µl redox mediator solution are metered in, so that a drop enclosing the micro and macroelectrode is formed. A chloridized silver wire as pseudo reference electrode and a platinum wire as counter electrode are also immersed in these. The measuring process can be carried out according to the measuring principle already described with or without redox amplification. Due to the small total volumes, the sample is added in a different way for solid and liquid samples. In the case of solid samples, this is dissolved in a redox mediator solution which has the same concentration of redox mediator as the reference measuring solution. In the case of liquid samples, a solution is prepared by mixing the sample solution with a more highly concentrated redox media solution, which has the same concentration of redox species as the reference measuring solution of the drop. Volumes up to 50 µl of these sample solutions can be injected into the drops. Since measurement and reference sample solutions have the same concentration of redox species, dilution effects do not have to be taken into account. Fig. 11 Curve 1 shows a cyclic voltammogram of Fc-biotin with redox amplification recorded with this experimental arrangement. Using the method described, 0.1 mg streptavi din in 15 µl measuring solution was metered into the free drops. The corresponding cyclo voltammogram ( Fig. 11 Curve 2 ) shows the resulting current decrease in the diffusion limit current. If streptavidin is added, the system is already in the saturation range, so that there is no further significant decrease in the diffusion limit current ( Fig. 11, curve 3 ).

7.3 Sandwich Assay7.3 Sandwich assay Biotin/Streptavidin/Biotinderivat unter Verwendung von Vorrichtung 1Biotin / streptavidin / biotin derivative under Use of device 1

Zur Demonstration eines Sandwich-Assays wird auf das bereits beschriebene Biotin- Streptavidin-System zurückgegriffen. Als zusätzlicher Analyt zum Anbinden an die freien Bindungsstellen von Streptavidin wird beispielhaft mit Biotin modifizierte Glucoseoxidase (im folgenden GOD- Biotin genannt) verwendet. Die Darstel lung dieser Verbindung gelingt über die Umsetzung von Glucoseoxidase mit Hydroxysuccinimid-Biotin und anschlie ßender Trennung der Reaktionsprodukte über eine monomere Avidin-Säule. Die Durchführung der Messung erfolgt nach Annäherung der Mikroelektrode an die Regenerationsoberfläche unter Wirkung der Redoxamplifizierung (siehe Abschnitt 7.1). Abb. 12 Kurve 1 zeigt das Cyclovoltammogramm von Fc-Biotin mit Redoxamplifizierung. Abb. 12 Kurve 2 zeigt das Cyclovoltammogramm nach Zusatz eines Überschusses von Streptavi din. Das Cyclovoltammogramm in Abb. 12 Kurve 3 zeigt die auf die Volu menzunahme um 15 µl Phosphatpuffer zurückzuführende Stromabnahme. Abb. 12 Kurve 4 zeigt das Cyclovoltam mogramm nach Zugabe von 15 µl GOD- Biotin-Lösung. Die Abnahme des Faraday'schen Stromes ist wesentlich höher als die durch die Volumenzunahme verursachte Stromabnahme. Diese ist auf die weitere Abnahme des Diffusions koeffizienten der Redoxspezies zurückzu führen. Weiterhin zu bemerken ist, daß die Abnahme viel größer ist als im Falle des Biotin-Streptavidin-Systems. Zum einen ist die Molmasse von Glucoseoxidase mit ca. 186.000 Dalton fast um das 2.8-fache größer als die von Streptavidin (ca. 67.000 Dalton), zum anderen besitzt das Glucose oxidasemolekül mehrere Aminogruppen, die mit Biotin derivatisiert werden können. Dies kann dazu führen, daß durch die Verknüpfung von mehreren biotinilierten Glucoseoxidasemolekülen über ein Strept avidinmolekül oder ein "Streptavidin-Fc- Biotin"-Molekül mit mindestens zwei freien Bindungsstellen sehr große Redox mediatoren entstehen, die einen entspre chend niedrigen Diffusionskoeffizienten besitzen.The biotin-streptavidin system already described is used to demonstrate a sandwich assay. As an additional analyte for binding to the free binding sites of streptavidin, glucose oxidase modified with biotin (hereinafter referred to as GOD-biotin) is used as an example. This compound can be produced by reacting glucose oxidase with hydroxysuccinimide biotin and then separating the reaction products on a monomeric avidin column. The measurement is carried out after the microelectrode approaches the regeneration surface under the effect of redox amplification (see section 7.1 ). Fig. 12 Curve 1 shows the cyclic voltammogram of Fc-biotin with redox amplification. Fig. 12 Curve 2 shows the cyclic voltammogram after adding an excess of Streptavi din. The cyclic voltammogram in Fig. 12 curve 3 shows the current decrease due to the volume increase of 15 µl phosphate buffer. Fig. 12 Curve 4 shows the cyclic voltamogram after adding 15 µl GOD-Biotin solution. The decrease in Faraday current is much higher than the decrease in current caused by the increase in volume. This is due to the further decrease in the diffusion coefficient of the redox species. It should also be noted that the decrease is much greater than in the case of the biotin-streptavidin system. On the one hand, the molar mass of glucose oxidase with approx. 186,000 daltons is almost 2.8 times greater than that of streptavidin (approx. 67,000 daltons), on the other hand, the glucose oxidase molecule has several amino groups that can be derivatized with biotin. This can lead to the fact that by linking several biotinylated glucose oxidase molecules via a strept avidin molecule or a "streptavidin-Fc-biotin" molecule with at least two free binding sites, very large redox mediators are formed which have a correspondingly low diffusion coefficient.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von chemi schen oder biochemischen Analyten, gekennzeichnet dadurch, daß der Diffusionskoeffizient einer redoxakti ven Spezies, die mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelt ist, durch Anbindung einer komplementären Erkennungsstruktur moduliert wird, und die Modulation des Diffusionskoeffizienten mit einem elektrochemischen Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies detektiert wird.1. A method for determining chemical or biochemical analytes, characterized in that the diffusion coefficient of a redox-active species, which is coupled to a specific detection element, is modulated by linking a complementary detection structure, and the modulation of the diffusion coefficient with an electrochemical method under amplification is detected by recycling the redox species.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Meßelektrode Makro- oder Mikroelektroden mit einem aktiven Durchmesser zwischen 0.1 und 500 µm, bevorzugt 1- 100 µm, insbesondere 10-50 µm eingesetzt werden.2. The method according to claim 1, characterized characterized in that as a measuring electrode Macro or micro electrodes with an active diameter between 0.1 and 500 µm, preferably 1- 100 µm, especially 10-50 µm be used.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßelektrode eine Scheibenelektrode ist, die von einem isolierenden Mantel aus Glas oder Polymeren umgeben ist, der die Diffusion von Redoxspezies zur aktiven Elektrodenoberfläche moduliert.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the Measuring electrode a disc electrode is that of an insulating jacket is surrounded by glass or polymers, which is the diffusion of redox species to the active electrode surface modulated.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßelektrode mittels Positionierelementen einer makroskopischen leitenden Oberfläche soweit angenähert werden kann, daß das Diffusionsprofil der mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelten Redoxspezies durch diese Oberfläche verändert wird.4. The method according to claim 1, characterized characterized that the measuring electrode by means of positioning elements macroscopic conductive surface as far as can be approximated that the diffusion profile of the one specific recognition element coupled redox species through this Surface is changed.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das an den Redoxmediator gekoppelte Erken nungselement Biotin, ein Hapten, ein Antigen, ein Antikörper, ein Lectin, ein Kohlehydrat, ein DNA-Fragment, ein DNA-Halbstrang, ein RNA-Frag ment, ein Oligonucleotid, ein Hormon, ein Rezeptor oder ein künstliches Wirtsmolekül ist, für das eine kom plementäre Erkennungsstruktur exi stiert, die selektiv gebunden wird.5. The method according to claim 1, characterized characterized in that to the Redox mediator coupled ores Biotin, a hapten Antigen, an antibody, a lectin, a carbohydrate, a DNA fragment, a DNA half strand, an RNA frag ment, an oligonucleotide, a hormone, a receptor or an artificial one Is a host molecule for which a com complementary recognition structure exi bull that is selectively bound.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestim mende Analyt Streptavidin, Avidin, Biotin, ein Hapten, ein Antigen, ein Antikörper, ein Lectin, ein Kohlehy drat, ein DNA-Fragment, ein DNA- Halbstrang, ein RNA-Fragment, Streptag I oder II modifizierte Proteine, His-Tag-modifizierte Proteine, ein Oligonucleotid, ein Hormon, ein Rezeptor oder ein künst liches Wirtsmolekül ist, vorausgesetzt, daß dieser Analyt durch komplemen täre Erkennung an den Redoxmediator modifizierten Partner spezifisch gebunden werden kann.6. The method according to claim 1, characterized characterized that the to be determined analyte streptavidin, avidin, Biotin, a hapten, an antigen, a Antibodies, a lectin, a Kohlehy drat, a DNA fragment, a DNA Half strand, an RNA fragment, Streptag I or II modified Proteins, His-Tag modified Proteins, an oligonucleotide Hormone, a receptor or an artificial host molecule, provided that that this analyte by complemen tary detection to the redox mediator modified partner specific can be bound.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß über eine Zwischenstruktur mit mehr als einer gleichartigen oder unterschiedlichen Bindungsstelle der Redoxmediator und der Analyt spezifisch erkannt und gebunden werden kann, so daß ein Sandwich-Assay entsteht.7. The method according to claim 1, characterized characterized that over a Intermediate structure with more than one similar or different Binding site of the redox mediator and the analyte specifically recognized and can be bound so that a Sandwich assay arises.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Anwen dung kommenden elektrochemischen Verfahren durch den Diffusionskoeffi zient der Redoxspezies bestimmt werden.8. The method according to claim 1, characterized characterized that the for use coming electrochemical Process through the diffusion coefficient of the redox species become.

9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die elek trochemischen Verfahren die cyclische Voltammetrie, die Chronoamperome trie, die Chronocoulometrie, die Diffe rential-Puls-Voltammetrie, die Normal-Puls-Voltammetrie, die Square-Wave-Voltammetrie, die Amperometrie bei konstantem Poten tial sind.9. The method according to claim 1 and 8, characterized in that the elec trochemical process the cyclic Voltammetry, the chronoamperoma trie, chronocoulometry, the differences rential pulse voltammetry, the Normal pulse voltammetry that Square wave voltammetry that Amperometry with constant pots tial.

10. Verfahren nach Anspruch 1, gekenn zeichnet dadurch, daß die Redoxspe zies, die mit dem spezifischen Erken nungselement gekoppelt wird, an einer Mikroelektrode mit hoher heterogener Durchtrittskinetik reversibel oxidierbar oder reduzierbar sind. 10. The method according to claim 1, characterized is characterized in that the Redoxspe zies that with the specific orken Coupling element is coupled to a High heterogeneous microelectrode Passage kinetics reversibly oxidizable or are reducible.

11. Verfahren nach Anspruch 1 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Redoxspezies ein Osmium-Komplex, ein Ferrocenderivat, eine Ferrocendendrimer ist.11. The method according to claim 1 and 10, characterized in that the Redox species an osmium complex, a ferrocene derivative, a Ferrocendendrimer is.

12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß in eine Meßzelle mit Referenzelektrode, Gegenelektrode und makroskopischer Regenerationsoberfläche mit einem Volumen von 10 µl-1 ml, bevorzugt einem Volumen < 300 µl eine Mikro elektrode nach Anspruch 2 mittels Positionierelementen an die Regenera tionsoberfläche angenähert werden kann.12. Device for carrying out the Method according to claims 1-11, characterized in that in a Measuring cell with reference electrode, Counter electrode and more macroscopic Regeneration surface with one Volume of 10 ul-1 ml, preferred a volume of less than 300 µl Electrode according to claim 2 Positioning elements on the Regenera tion surface to be approximated can.

13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die elek trochemische Meßzelle als ein Meß zellenarray ausgebildet ist, insbeson dere nach Art von Mikrotiterplatten, dessen Boden eine gemeinsame oder mehrere getrennte leitende Regenerationsoberflächen bilden.13. Device for carrying out the Method according to claims 1-11, characterized in that the elec trochemical measuring cell as a measuring cell array is formed, in particular similar to microtiter plates, whose bottom is a common or several separate senior Form regeneration surfaces.

14. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die elek trochemische Meßzelle keine Wände aufweist, die von der Reaktionslösung berührt werden.14. Device for carrying out the Method according to claims 1-11, characterized in that the elec trochem measuring cell no walls has that of the reaction solution be touched.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Redoxmediatorlösung über eine die Mikroelektrode umschließende Kapil lare zudosiert wird, so daß sich ein das leitende Substrat und die Spitze der Mikroelektrode umgebender Tropfen bildet.15. The apparatus according to claim 14, characterized in that the Redox mediator solution via a die Kapil enclosing microelectrode lare is metered in, so that the conductive substrate and the top of the Microelectrode surrounding drops forms.

16. Vorrichtung nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare gleichzeitig als Referenz elektrode ausgebildet ist.16. The apparatus of claim 14 and 15, characterized in that the Capillary at the same time for reference electrode is formed.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare ein Silberrohr bzw. ein mit Silber beschichtetes Rohr ist, das wiederum mit Silberchlorid beschich tet ist.17. The apparatus of claim 16, characterized in that the Capillary a silver tube or a with Silver coated tube is that again coated with silver chloride is.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die benutzten Reaktionsvolumina in den Größenord nungen von Tropfen liegen, speziell im Bereich von 1 nl bis 100 µl, insbeson dere im Bereich von 5 µl bis 50 µl.18. The method according to claim 1, characterized characterized that the used Reaction volumes in the order of magnitude drops, especially in the Range from 1 nl to 100 µl, in particular others in the range from 5 µl to 50 µl.

19. Verfahren nach Anspruch 1 unter Nutzung einer der Vorrichtungen nach Anspruch 14-17, dadurch gekenn zeichnet, daß die Probenlösung über eine Kapillare in den Tropfen der Redoxmediatorlösung dosiert wird.19. The method according to claim 1 under Use one of the devices after Claims 14-17, characterized records that the sample solution over a capillary in the drops of Redox mediator solution is dosed.

20. Verfahren nach Anspruch 1 und 19 unter Nutzung einer der Vorrichtungen nach Anspruch 14-17, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenlösung mittels einer Mikrodosierpumpe oder durch iontophoretische Injektion in den Tropfen der Redoxmediatorlösung dosiert wird.20. The method according to claim 1 and 19 using one of the devices according to claims 14-17, thereby characterized that the sample solution using a microdosing pump or by iontophoretic injection into the Drop of redox mediator solution is dosed.

21. Verfahren nach Anspruch 1 unter Nutzung einer der Vorrichtungen nach Anspruch 14-17, dadurch gekenn zeichnet, daß die Probenlösung mittels eines Piezodispensers als Mikro tropfen, eventuell auch berührungslos über einen Luftspalt, in den Tropfen der Redoxmediatorlösung dosiert wird.21. The method according to claim 1 under Use one of the devices after Claims 14-17, characterized records that the sample solution by means of of a piezo dispenser as a micro dripping, possibly contactless over an air gap, in the drops the redox mediator solution is dosed.

22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sequentiell mehrere Proben unter Nutzung einer gemeinsamen oder einzelner leitender Regenerationsoberflächen vermessen werden können.22. The method according to claim 1, characterized characterized that sequentially multiple samples using one joint or individual manager Measure regeneration surfaces can be.

23. Vorrichtung nach Anspruch 13 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroelektrode mittels Posi tionierelementen die Positionen des Meßzellenarrays sequentiell mit hoher Positioniergenauigkeit anfahren kann.23. The device according to claim 13 for Execution of the procedure after Claim 22, characterized in that the microelectrode by means of Posi tioning elements the positions of the Measuring cell arrays sequentially with high Positioning accuracy can approach.

24. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß mittels unabhängiger Positionierelemente mehrere Mikroelektroden parallel in mehreren Meßzellen oder Tropfen der Meßlösung an die jeweilige Regenera tionsoberfläche angenähert werden können, so daß gleichzeitig mehrere Proben vermessen werden können.24. Device for carrying out the Method according to claims 1-11, characterized in that by means of independent positioning elements several microelectrodes in parallel several measuring cells or drops of Measuring solution to the respective Regenera tion surface to be approximated can, so that several at the same time Samples can be measured.

25. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe nach Aufnahme einer Referenzmessung in fester Form zugegeben wird, in gelö ster Form hinzugegeben wird, oder vor dem Vermessen mit der Redoxmedia torlösung vermischt wird.25. The method according to claim 1, characterized characterized that the sample after Inclusion of a reference measurement in solid form is added in solution stere form is added, or before measuring with the Redoxmedia door solution is mixed.

26. Vorrichtung nach Anspruch 12, 13, 14 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß mittels eines Potentiostaten an der oder den Mikroelektrode Potentialprofile für die in Anspruch 8 und 9 genannten elektrochemischen Verfahren aufge prägt werden können.26. The device according to claim 12, 13, 14 or 24, characterized in that by means of a potentiostat on the or the microelectrode potential profiles for those mentioned in claims 8 and 9 electrochemical processes can be shaped.

27. Vorrichtung nach Anspruch 12, 13, 14 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß die makroskopische leitende Regene rationsoberfläche eine Scheibenelek trode, eine Metall- oder eine Metall bedampfte planare Oberfläche ist.27. The apparatus of claim 12, 13, 14 or 24, characterized in that the macroscopic guiding rain ration surface a disc electrode trode, a metal or a metal evaporated planar surface.

28. Vorrichtung nach Anspruch 12, 13, 14 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Regenerationsoberfläche entweder entsprechend der Nernst-Gleichung das durch den Oxidationszustand des Redoxmediators gegebene Potential annimmt oder mittels eines Bipotentio staten auf ein konstantes oder sich zeitlich änderndes Potential relativ zum Potential der Referenzelektrode polarisiert wird.28. The device according to claim 12, 13, 14 or 24, characterized in that the regeneration surface either according to the Nernst equation by the oxidation state of the Redox mediators given potential assumes or by means of a bipotentio staten on a constant or yourself relative potential over time to the potential of the reference electrode is polarized.