DE19545351C1 - Eukaryotische Zellen mit Hybridrezeptor und dadurch steuerbarem Genkonstrukt, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung dieser Zellen in der Gentherapie - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eukaryotische Zellen, die durch gentechnologische Methoden dahingehend verändert wurden, daß diese Zellen wenigstens einen Hybridrezeptor und wenigstens ein durch diesen Hybridrezeptor steuerbares Genkonstrukt enthalten.

Im Stand der Technik sind bereits bestimmte Hybridrezeptoren beschrieben worden. Brocker et al. (Eur. J. Immunol. (1993) 23, S. 1435-1439) beschreiben ein Hybridmolekül umfassend einen Teil eines einzelkettigen Antikörpers, der über eine kurze Abstandsgruppe mit der Transmembran- und Cytoplasmaregion von CD3ζ verbunden ist. Bei der CD3ζ-Kette handelt es sich um den Bereich des T-Zellenantigenrezeptors, der für die Signalweiterleitung des T-Zellantigenrezeptors in der Zelle verantwortlich ist.

Die ζ-Kette wird traditionell dem CD3-Komplex zugerechnet, welcher mit den α und β-Ketten des klassischen TCR den eigentlichen T-Zellrezeptor bildet. Es bürgert sich daher mehr und mehr ein, die ζ-Kette als Teil des TCR zu bezeichnen. Eine strenge Nomenklatur ist in der Literatur aber nicht eingehalten.

Eshhar et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90 (Januar 1993), S. 720-724) beschreiben Hybridrezeptoren, bei denen die variablen Regionen (F^ν) eines Antikörpers mit den konstanten Regionen der T-Zellrezeptorenketten verbunden wurden, wodurch T-Lymphozyten mit einer vom Antikörpertyp abhängigen Spezifität geschaffen wurden und der Hybridrezeptor ein Signal für die IL-2-Expression übertrug. Dadurch wurde in Abhängigkeit von dem Antigen die Lyse der Zielzellen gesteuert.

Moritz et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91 (Mai 1994), S. 4318-4322) beschreiben zytotoxische T-Lymphozyten, die ein Hybridgen aufweisen. Das Hybridgen wurde konstruiert aus einem einzelkettigen F^ν-Antikörper, genauer aus den verbundenen schweren und leichten Ketten der variablen Bereiche eines monoklonalen Antikörpers gegen den extrazellulären Bereich des ERBB2-Rezeptors, einer Verbindungsregion als Abstandsgruppe und der ζ-Kette des T-Zellantigenrezeptors (TCR). Dieses Gen wurde mit Hilfe von retroviralem Gentransfer in die zytotoxischen T-Lymphozyten eingeführt.

In eukaryotischen Zellen wird die Expression der Gene meist über verhältnismäßig komplizierte Mechanismen reguliert. Die einzelnen Gene können durch Signale von außerhalb der Zelle entweder an- oder abgeschaltet werden. Den Weg des Signals von der Zelloberfläche über einen für das Signal spezifischen Rezeptor und gegebenenfalls mehrere Zwischenmoleküle wie beispielsweise Kinasen oder Phosphatasen in den Zellkern und die Regulation der Genexpression über DNA-bindende Transkriptionsfaktoren bezeichnet man als Signaltransduktion.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, solche Zellen zur Verfügung zu stellen, bei denen durch ein außerhalb der Zelle vorhandenes Signal die Expression eines geeigneten Gens im Zellinneren bewirkt werden kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher eukaryotische Zellen mit einem Hybridrezeptor, der einen an der Außenseite der Zelle lokalisierten, für ein bestimmtes Signalmolekül spezifischen Rezeptorteil und ein von einem anderen Rezeptor stammendes, im Inneren der Zelle lokalisiertes Rezeptorteil, das im Zellinneren ein Signal auslösen kann, umfaßt, wobei die Zelle wenigstens ein weiteres Genkonstrukt enthält, das einen Steuerbereich aufweist, der mit dem von dem Hybridrezeptor ausgesandten Signal interagieren kann und dadurch die Expression eines mit diesem Steuerbereich verbundenen Transgens steuern kann.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Teil des Hybridrezeptors, der an der Außenseite der Zelle lokalisiert und für ein bestimmtes Signalmolekül spezifisch ist, um einen Antigenrezeptor, der ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus Fragmenten von Antikörpern, die für bestimmte Antigene oder Haptene spezifisch sind, wobei der an der Außenseite der Zelle lokalisierte Teil des Hybridrezeptors auch einen Abstandsbereich (Spacer) umfassen kann.

Bei dem Teil des Hybridrezeptors, der an der Innenseite der Zelle lokalisiert ist und im Zellinneren ein Signal auslösen kann, handelt es sich bevorzugt um einen Rezeptorteil, der ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus den intrazellulären und/oder Transmembranbereichen von T-Zell-Anti­ genrezeptoren und B-Zellrezeptoren.

Die erfindungsgemäßen Zellen weisen auch ein Genkonstrukt auf, das mit Hilfe gentechnologischer Methoden in die Zielzellen eingebracht wurde. In bevorzugter Ausführungsform handelt es sich bei dem Steuerbereich des weiteren Genkonstruktes, der mit dem von dem Hybridrezeptor ausgelösten Signal interagieren kann, um zelleigene oder zellfremde Promotoren oder Repressoren.

Das zusätzlich in die Zelle eingeführte Genkonstrukt weist auch wenigstens ein beliebiges Transgen auf. Bevorzugt ist das Transgen ausgewählt aus Genen, die für Genprodukte kodieren, wie Zytokine, insbesondere G-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, Interferone, Erythropoietin oder Insulin. Bei dem Transgen kann es sich auch um Transkriptionsfaktoren handeln, die bei der Repression von Genen eine Rolle spielen können.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Hybridrezeptoren können grundsätzlich bei allen eukaryotischen Zellen, wie tierischen Zellen, verwendet werden.

In bevorzugter Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäß eingesetzten Zellen um menschliche Zellen, wobei besonders bevorzugt solche Zellen sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Lymphozyten, hematopoetischen Stammzellen, Fibroblasten oder Tumorzellen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Zellen wird die Zielzelle transfiziert, wodurch die genetische Information für wenigstens einen Hybridrezeptor und wenigstens ein Genkonstrukt in die Zielzelle eingebracht wird. Die Transfektion erfolgt dabei durch an sich bekannte Verfahren, wobei die Elektroporation besonders bevorzugt ist.

Die genetische Information für Hybridrezeptor und Genkonstrukt kann auf einem Vektor lokalisiert oder auf zwei Vektoren verteilt sein.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Zellen in der Gentherapie verwendet, wobei die jeweils erforderlichen Genprodukte im Körper exprimiert werden können, und zwar unter Kontrolle des für den Hybridrezeptor spezifischen Signals. Ein spezieller Anwendungsbereich ist die Tumortherapie oder -diagnose. Wenn eine Tumorzelle mit einem spezifischen Tumorantigen von einer Zelle, die einen varianten Antigenrezeptor gegen ebendieses Tumorantigen trägt, erkannt wird, können drei Reaktionen erreicht werden, eine abtötende, wenn nach Tumorkontakt ein zytotoxisches Zytokin wie TNF sezerniert wird oder eine immunstimulierende durch Sekretion von IL-2 oder eine rein diagnostische durch Sekretion von G-CSF. Dieser letztgenannte, diagnostische Aspekt ist deshalb interessant, weil man damit im Organismus vereinzelte Tumorzellen biologisch nachweisen kann, weil eben der Antigen-Rezeptorkontakt zur Bildung von G-CSF führt. G-CSF erhöht die Leukozytenzahl, daran erkennt man, daß noch Tumorzellen vorhanden sind. Dies ist insbesondere für Resttumoren eine elegante Art der Diagnose.

Die Regulation zellulärer Gene ist ein Prozeß, der über viele Zwischenstufen hinweg von der Zelloberfläche (dem Liganden) hin bis zum Zellkern (dem regulierten Gen) reicht. Kommt es auf diesem Weg zu Fehlern, kann das zu nachhaltigen Problemen für die Zelle und den ganzen Organismus führen. Ein Aktivierungssignal, das nicht mehr abgeschaltet werden kann, könnte deshalb zur Zellentartung und damit zu ungeregeltem Wachstum führen, dies wird allgemein als Krebs bezeichnet. Durch die vorliegende Erfindung werden Zellen bereitgestellt, die ein bestimmtes Genprodukt exprimieren, und zwar auf Anregung durch ein bestimmtes Signalmolekül, das sich in der Umgebung der Zelle befindet.

Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Hybridrezeptoren handelt es sich um solche Konstrukte, die die extrazelluläre Domäne eines bestimmten Rezeptors (A) gekoppelt an die Transmembran- und intrazelluläre Domäne eines anderen Rezeptors (B) aufweisen. Die Transmembrandomäne könnte selbstverständlich auch von dem Rezeptor A herstammen. In diesem Fall wird das zellinterne Signal durch die Zugabe eines Liganden für (A) ausgelöst. Unter Ligand wird hier dasjenige spezifische Molekül verstanden, das mit der extrazellulären Domäne des Rezeptors (A) interagieren kann. Die Folge dieser Interaktion ist aber nicht, daß die Signale in der Zelle ausgelöst werden, die auf den Rezeptor (A) zurückzuführen wären, sondern es werden in der Zelle diejenigen Signale erzeugt, die unter Kontrolle des Rezeptors (B) stehen. Grundsätzlich können im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Rezeptoren und deren Bestandteile verwendet werden. Als Liganden werden diejenigen Moleküle oder Verbindungen eingesetzt, die mit der extrazellulären Domäne des Hybridrezeptors in Wechselwirkung treten können. Diese Liganden können entweder in freier Form oder gebunden an einen Träger oder an Zellen vorliegen.

Rezeptoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendet werden, sind die Antigenrezeptoren. Auch diese Rezeptoren bestehen aus verschiedenen Domänen. Häufig sind diese Rezeptoren kompliziert strukturiert und bestehen aus mehreren assoziierten Proteinketten, die über Disulfidbrücken kovalent verbunden sind. Diese Ketten werden allgemein als "leichte" und "schwere" Ketten wegen ihrer unterschiedlichen Längen bezeichnet. Auf diesen Ketten selbst werden wieder einzelne Abschnitte definiert als konstante oder variable Regionen. Das Zusammenspiel der richtigen variablen und konstanten Regionen von schwerer und leichter Kette ermöglicht die hochspezifische Erkennung und Bindung eines Antigens oder Haptens. Diese von Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern herstammenden Regionen können mit Hilfe gentechnologischer Methoden mit anderen Bereichen eines Rezeptors verbunden werden und dadurch können Antigenrezeptoren bereitgestellt werden, die im extrazellulären Bereich mit einem speziellen Liganden (hier Antigen oder Hapten) binden und ein Signal in das Innere der Zelle abgeben.

Die erfindungsgemäßen Zellen weisen nun neben dem Hybridrezeptor noch wenigstens ein weiteres Genkonstrukt auf, das mit Hilfe gentechnologischer Methoden in die Zelle eingebracht wurde. Dieses Genkonstrukt besitzt einen steuerbereich, also einen Promotor oder Repressor, der mit dem von dem Hybridrezeptor ausgesandten Signal interagieren kann. Das Signal schaltet dann das hinter dem Promotor angeordnete Transgen an oder, falls es sich um einen Repressor handelt, wird das Transgen durch das Signal abgeschaltet.

Das durch den Hybridrezeptor in das Zellinnere abgegebene Signal interagiert normalerweise auch mit einem in der Zelle vorhandenen Steuerungsbereich. Wenn also beispielsweise durch den Rezeptor das Signal zur Aktivierung eines Interleukin-2-Gens in die Zelle eingebracht wird, schaltet der Rezeptor das Interleukin-2-Gen an und Interleukin-2 wird exprimiert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt nun in der Zelle auch ein Genkonstrukt vor, das - um beim vorigen Beispiel zu bleiben - den Promotor für Interleukin-2 besitzt und an diesen Promotor ist ein Transgen angeschlossen. Wenn durch den Hybridrezeptor das Signal zur Aktivierung des Interleukin-2-Promotors in die Zelle eingebracht wird, dann wird nicht nur das Transgen, sondern auch Interleukin-2 exprimiert.

Auch andere Promotoren, z. B. der CMV-Promotor, können eingesetzt werden, solange eine spezifische Aktivierung des Promotors zur Transgen-Expression führt.

Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, solche Zielzellinien zu verwenden, bei denen das unter der Kontrolle des mit dem Signal interagierenden Promotors stehende Gen nur schwach oder gar nicht exprimiert wird. Dadurch kann eine wirksame Regulation des Transgens bewirkt werden und die Expression von möglicherweise unerwünschten Genprodukten wird verhindert.

Ein anderer Typus von Rezeptoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sind Zytokinrezeptoren.

Die Zytokine fungieren als äußere Botenstoffe und treten in Wechselwirkung mit den Zytokinrezeptoren. Im allgemeinen bestehen Zytokinrezeptoren aus wenigstens drei Bereichen (Domänen). Der extrazelluläre Bereich ist für die Bindung des spezifischen Liganden verantwortlich. Bei den Liganden handelt es sich um das jeweilige Zytokin. An den extrazellulären Bereich schließt sich der Transmembranbereich an, also der Bereich, der sich durch die Zytoplasmamembran erstreckt und der oft für eine Oligomerisierung des Rezeptormoleküls (Homo- und Heteropolymere) verantwortlich ist. Im Inneren der Zelle befindet sich der intrazelluläre Bereich, der für die Weitergabe des Signals ins Zellinnere notwendig ist. Diese Signalweitergabe kann auf verschiedene Art und Weise vor sich gehen. Beispiel hierfür wären eine molekülinhärente Kinaseaktivität oder eine Weiterleitung des Signals an assoziierte zytoplasmatische Moleküle.

Wenn das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Genkonstrukt als Steuerungsbereich einen Repressor aufweist, kann durch den Hybridrezeptor der Repressor aktiviert werden, welcher dann zellintern seine Zielsequenz inhibiert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wäre es auch denkbar, in die Zelle ein Genkonstrukt einzuführen, das aus einem steuerungsbereich (Promotor) besteht, der mit dem vom Hybridrezeptor in das Zellinnere abgegebene Signal interagiert und, der als Transgen einen Repressor aufweist. Wenn also der Hybridrezeptor durch ein Signalmolekül außerhalb der Zelle aktiviert wird, dann wird ein Signal ins Zellinnere übertragen und dadurch der Repressor exprimiert. Dieser Repressor kann dann mit einem natürlich vorkommenden Gen in der Zelle interagieren und dessen Expression reprimieren.

Ein konkretes Beispiel der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die gezielt zur Insulinproduktion angeregt werden kann. Diese Zelle weist daher einen Hybridrezeptor auf, der im extrazellulären Bereich, also als antigenspezifische Bindungsstelle, spezifisch mit Glukose als aktivierendem Liganden interagieren kann. Wenn im Blut eine hinreichend hohe Glukosekonzentration erreicht ist, daß eine Bindung der Glukose an den Hybridrezeptor stattfindet, wird dieser Hybridrezeptor sein Aktivierungssignal in das Innere der Zelle weitergeben, und zwar mit Hilfe des von einem anderen Rezeptor, beispielsweise T-Zell-Antigenrezeptor stammenden Bereichs. Im Zellinneren wird nun ein Signal ausgelöst, das beispielsweise mit dem Promotor für Interleukin-2 interagieren und diesen Promotor anschalten kann.

Da die Zelle ein Genkonstrukt enthält, das als Transgen das Gen für Insulin enthält und unter der Kontrolle des IL-2-Pro­ motors steht, wird auf diese Art und Weise die Produktion von Insulin angeschaltet, und zwar in Abhängigkeit von der im extrazellulären Bereich vorhandenen Glucose.

Im Rahmen der vorliegenden Experimente wurde ein Hybridrezeptor verwendet, der in Fig. 1 schematisch dargestellt ist. Im extrazellulären Bereich des Hybridrezeptors befindet sich eine Region, die spezifisch ist für ein bestimmtes Hapten, nämlich 4-Hydroxy-5-Iodo-3-Ni­ trophenylacetat (im folgenden NIP). Dieses Hapten wird von einem spezifischen B-Zell-Rezeptor erkannt und der Antigenrezeptor selbst besteht aus zwei Ketten, nämlich einer schweren (langen) und einer leichten (kurzen), welche von zwei verschiedenen cDNA′s im Zellkern kodiert wird. Die beiden Ketten selbst bestehen wiederum aus verschiedenen Domänen, nämlich den variablen und konstanten Bereichen. Der Rezeptor ist so gebaut, daß die schwere Kette mit der leichten Kette über Disulfidbrücken chemisch verbunden wird und dann an der Zelloberfläche exponiert wird, wobei die Verankerung in der Zellmembran über die schwere Kette erfolgt. Der extrazelluläre Teil des Rezeptors, der dann spezifisch das Antigen erkennen kann, besteht somit aus der leichten Kette, gebunden an den variablen Teil und einem kurzen Abschnitt des konstanten Teils der schweren Kette. Im varianten Antigenrezeptor wurden diese Bereiche auf einer cDNA zusammengefaßt.

Der Antigenrezeptor ist mit dem CD8^α-Bereich, dem Transmembranteil ζ und dem CD3ζ-Molekül verbunden. Im vorliegenden Fall wurde also statt des natürlich vorkommenden Transmembran-/Intrazelluläranteils ein neuer Teil als cDNA an die cDNA fusioniert, die den Antigen-bindenden Anteil kodiert. Dieser neue Anteil entstammt dem CD3-Bereich des T-Zellrezeptorkomplexes und hat normalerweise die Funktion, die Signalübertragung vom T-Zellrezeptor ins Zellinnere zu gewährleisten.

Dieses cDNA-Konstrukt wurde in ein Plasmid kloniert (Expressionsvektor) und dieses rekombinante Plasmid wurde zur Transfektion verschiedener Lymphozyten verwendet. Damit exprimieren diese Lymphozyten einen varianten Antigenrezeptor, der spezifisch NIP erkennt, insbesondere wenn dieses NIP an Rinderserum Albumin gekoppelt ist, und, der über die CD3ζ-Domäne Signale ins Zellinnere, also beispielsweise an den IL-2-Promotor überträgt. Anstelle eines Plasmid-Vektors können auch andere geeignete Vektoren, wie beispielsweise auf retroviralen Elementen basierende Vektoren, verwendet werden.

Durch die erfindungsgemäß bereitgestellten Zellen können auf vorteilhafte Weise durch beliebig gewählte Signale andere, auch beliebig ausgewählte Gene an- oder abgeschaltet werden. Bei den Signalen, auf die die Hybridrezeptoren reagieren, kann es sich entweder um körpereigene Signale handeln, beispielsweise Tumorantigen oder ähnliches, oder um andere Signale, die beispielsweise gezielt im Rahmen der Gentherapie in den Körper eingebracht werden.

Als Transgen kann praktisch jedes gewünschte Gen an das Genkonstrukt angefügt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ein Beispiel zur Bestätigung des Prinzips der vorliegenden Erfindung durchgeführt.

Beispiel 1

Zur Testung, ob ein endogenes Antigen einen zelleigenen Promotor mit einem dahintergeschalteten Transgen über einen varianten Antigenrezeptor regulieren kann, wurde auf ein System T-Zelle + IL-2-Promotor zurückgegriffen.

Als T-Zellinie wurde die bereits seit langem bekannte Jurkat Linie verwendet (entstanden aus einer humanen akuten T-Zell-Leu­ kämie), welche verschiedentlich käuflich erwerbbar ist, siehe z. B. American Tissue Culture Collection ATCC. Diese Linie hat zwar noch die Möglichkeit, den IL-2-Promotor zu regulieren, bildet allgemein aber nur sehr geringe IL-2-Mengen, die kaum nachweisbar sind.

Diese Linie wurde mit dem varianten Antigenrezeptor-Plasmid durch Elektroporation transfiziert, anschließend wurden Klone mit stabil integrierter DNA durch Selektion mit 2000 µg/ml Neomycin angezüchtet. Dies ergibt die Zellinie CR16s + NP8Z. Der variante Antigenrezeptor selbst hat die in Fig. 1 dargestellte Struktur.

Bei dem Versuch sollte gezeigt werden, daß Zellen, die den varianten Antigenrezeptor tragen, durch Stimulierung mit NIP ein Signal ins Zellinnere übertragen können und daß dieses Signal im Zellinneren einen Promotor aktivieren kann. Dieser Promotor treibt ein zellfremdes Gen, hier als Markergen Luziferase, und das Entstehen dieses Produkts kann nachgewiesen werden. Zusätzlich soll gezeigt werden, daß die steigenden NIP-Konzentrationen bei der Stimulierung eine gesteigerte Transgen-Expression mit sich führen.

Dazu wurden Jurkat-Zellen (CR16s: ohne varianten Antigenrezeptor; CR16s + NP8Z: mit varianten ζ-Ketten-Re­ zeptor) elektroporiert, wobei folgende Schritte durchlaufen wurden:

• - 5×10⁶ Zellen in 500 µl Puffer in 0,4 cm Elektroporations­ küvette (Biorad) geben,
• - 10 µg pIL-2/1 + Luc (Luziferase-Konstrukt mit murinem IL-2-Promotor zugeben,
• - 10 min auf Eis stellen,
• - Elektroporation mit GenePulser (Biorad) bei 280 V, 950 µF (20-30 ms Puls),
• - 10 min auf Eis stellen,
• - einmal mit Puffer waschen, Zellen auf 5×10⁵/ml Medium einstellen,
• - in 24 well Loch über Nacht mit und ohne Induktion bebrüten, Induktion mit 0, 2, 10, 40 µg/ml NIP-BSA.

Am nächsten Tag wurden die Zellen entsprechend dem Protokoll der Fa. Promega lysiert und die synthetisierte Luziferase mittels Luziferin (Promega) quantitativ nachgewiesen. Alle Experimente wurden in Quadrupliketten durchgeführt und waren reproduzierbar.

Ergebnisse

Folgende Tabelle gibt die Luziferase-Mengen wieder, die in den einzelnen Versuchen gemessen wurden (Mittelwert aus 4 Messungen).

Tabelle 1

Wie aus obiger Tabelle 1 und der Graphik der Fig. 2 ersichtlich ist, hat NIP-BSA nur einen marginalen Effekt auf die Luziferase Expression (Steigerung maximal 30%), während der Einfluß der stimulierten ζ-Kette nach NIP-Kontakt stark ausgeprägt ist (Steigerung maximal 300%). Außerdem ist eine gute Abhängigkeit der Expression von der Menge an zugesetztem NIP-BSA ersichtlich.

Beispiel 2

Versuchsaufbau wie in Beispiel 1, allerdings wurde ein Plasmid verwendet, das Luziferase unter Kontrolle des humanen CMV-Promotors exprimiert.

Verwendete Zellen: CR16s + NP8Z

Ergebnisse

Die Induktion ist etwa 2,3fach. Da der CMV Promotor von sich aus schon ein sehr starker Promotor ist, war keine besonders starke Induktion erwartet worden. Dieses Experiment dient nur der Bestätigung des ersten, um die allgemeine Anwendbarkeit des Systems zu belegen.

Beispiel 3 Konstruktion eines Hybridrezeptors

Die Konstruktion eines chimären einzelkettigen Antigen-Hy­ bridrezeptors wird nachfolgend beschrieben. Dieser Hybridrezeptor hat die laborinterne Bezeichnung "pANP8Zn" erhalten.

Der Vektor wurde zusammengestellt aus einem Vorläuferkonstrukt mit der laborinternen Bezeichnung "pFvCD8-5-OM". Dieses Vorläuferkonstrukt enthält die Resistenzgene für Ampicillin und Neomycin, den humanen β-Actin Promoter sowie den kodierenden Bereich folgender Bestandteile des single-chain Rezeptors: CD8^αhinge region, TM und die cytoplasmatische Sequenz der TCR-ζ-Kette (T-Zell-Anti­ genrezeptor). Die für die Amplifikation dieser Sequenzen notwendigen Primer sowie die Herkunft der Templates sind in Brocker et al. (Eur. J. Immunol. (1993) 23, S. 1435-1439) publiziert.

Das oben genannte Vorläuferkonstrukt wurde nun um ein sc-Fv Fragment des B1-8 Antikörpers, welches das Hapten 3-Hydroxy- 4-Phenylacetyl (NP) bindet, erweitert. Die Amplifikation der VH und VL Sequenzen eines monoklonalen Antikörpers, die notwendigen Primer sowie der Gly/Ser-Linker sind in Hoogenboom et al., Nucleic Acids Research (1991) 19, S. 4133-4137); Clackson et al., Nature (1991) 352, S. 624-628 und Huston et al., Proc. Acad. Sci. (1988) 85, S. 5879-5883 beschrieben.

Das scFv Fragment wurde hinter die Leader-Sequenz des B1-8 Antikörpers (Bothwell et al., Cell (1981) 24, S. 625-637) kloniert und dieses Fragment im Leseraster mit der CD8^αhinge Region fusioniert. Die für die Klonierung dieser Fragmente relevanten Restriktionsschnittstellen wurden mittels geeigneter synthetischer Linker-Fragmente eingeführt. Das im vorliegenden Experiment verwendete Sc-Fv Fragment des B1-8 Antikörpers bindet auch das Hapten 4-Hydroxy-5-Jodo-3-Nitro­ phenylacetat (NIP), wobei durch die vorhandene Jodgruppe die Affinität etwa um den Faktor 10 erhöht werden kann.

Die Fig. 3 stellt eine schematische Darstellung der einzelnen Fragmente des Konstruktes dar.

Fig. 4-A-4-C betreffen die Nucleotidsequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz des Konstruktes.

Erläuterung der Figuren

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Hybridrezeptors mit der CD3-ζ-Kette.

Fig. 2 zeigt in graphischer Darstellung die gemäß Beispiel 2 erhaltenen Ergebnisse, wobei die Abkürzung CR16s bedeutet, daß es sich um Zellen handelt, die keinen Hybridrezeptor aufweisen, aber ein Genkonstrukt mit Luziferase als Transgen.

Die Abkürzung "CR16s + NP8Z" bedeutet, daß es sich um Zellen handelt, die ein Genkonstrukt mit Luziferase als Transgen aufweisen und zusätzlich einen Hybridrezeptor, der in Fig. 1 schematisch dargestellt ist.

Fig. 3 ist eine schematische Darstellung eines Konstruktes, das die cytoplasmatische Sequenz der TCR-ζ Kette aufweist und ein sc-Fv Fragment eines Antikörpers, das das Hapten NP bzw. NIP bindet.

Fig. 4 ist die Darstellung der Nucleotidsequenz sowie der Aminosäuresequenz des in Beispiel 3 näher erläuterten Konstrukts.

Claims (11)

1. Eukaryotische Zelle mit einem Hybridrezeptor, der einen an der Außenseite der Zelle lokalisierten, für ein bestimmtes Signalmolekül spezifischen Rezeptorteil und ein von einem anderen Rezeptor stammendes, im Inneren der Zelle lokalisiertes Rezeptorteil, das im Zellinneren ein Signal auslösen kann, umfaßt, wobei die Zelle wenigstens ein weiteres Genkonstrukt enthält, das einen Steuerbereich aufweist, der mit dem von dem Hybridrezeptor ausgesandten Signal interagieren kann und dadurch die Expression eines mit diesem Steuerbereich verbundenen Transgens steuern kann.

2. Zelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Hybridrezeptors, der an der Außenseite der Zelle lokalisiert und für ein bestimmtes Signalmolekül spezifisch ist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenrezeptoren, die für bestimmte Antigene oder Haptene spezifisch sind, wobei der an der Außenseite der Zelle lokalisierte Teil des Hybridrezeptors auch einen Abstandsbereich umfassen kann.

3. Zelle nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Hybridrezeptors, der an der Innenseite der Zelle lokalisiert ist und im Zellinneren ein Signal auslösen kann, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den intrazellulären und/oder Transmembranbereichen von T-Zellen-Antigenrezeptoren und B-Zellrezeptoren.

4. Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Steuerbereich des weiteren Genkonstruktes, der mit dem von dem Hybridrezeptor ausgelösten Signal interagieren kann, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Promotoren und Repressoren.

5. Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Transgen des weiteren Genkonstruktes ausgewählt ist aus Genen, die für Genprodukte, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zytokinen, insbesondere G-CSF, TL-2, IL-3, IL-4, IL-6, Interferone, Erythropoietin und Insulin oder für Transkriptionsfaktoren kodieren.

6. Zellen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen menschliche Zellen, insbesondere Lymphozyten, hematopoetischen Stammzellen, Fibroblasten oder Tumorzellen sind.

7. Verfahren zur Herstellung von Zellen nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzelle transfiziert wird, wodurch die genetische Information für wenigstens einen Hybridrezeptor und wenigstens ein Genkonstrukt in die Zielzelle eingebracht wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Information für Hybridrezeptor und Genkonstrukt auf einem Vektor lokalisiert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Information für Hybridrezeptor und Genkonstrukt auf zwei Vektoren verteilt ist.

10. Verwendung von Zellen nach den Ansprüchen 1 bis 6 in der Gentherapie.

11. Verwendung von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Therapie von Tumoren.