DE19530556C1

DE19530556C1 - Verfahren zum Kultivieren von Zellen des menschlichen oder tierischen Körpers

Info

Publication number: DE19530556C1
Application number: DE19530556A
Authority: DE
Inventors: Will Prof Dr Minuth
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1995-08-19
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2015-08-20

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß Oberbegriff Patentanspruch 1.

Die Kultivierung, d. h. bisher die Vermehrung von Zellen auf einer Zellunterlage oder einem Zellträger ist bekannt. Bekannt ist hierbei insbesondere auch die beispielsweise in einer Kulturschale auf einem Zellträger vermehrten Zellen zusammen mit dem Zellträger in der Kammer eines Behandlungsgefäßes einzubringen, so daß die Kammer in zwei Teilkammern oder Teilräume unterteilt wird, die dann jeweils auch mit einem unterschiedlichem Medium durchströmt werden können, um hierdurch ein möglichst natürliches Milieu für die genierten Zellen zu schaffen.

Es hat sich aber gezeigt, daß trotz optimaler Vermehrung der Zellen auf dem Zellträger diese vielfach ihre natürliche Funktion nicht aufweisen und/oder der auf dem Zellträger gebildete Zellverband über längere Zeit nicht stabil ist, d. h. insbesondere auch keinen dichten Zellverband bildet.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren aufzuzeigen, welches diese Nachteile vermeidet.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist ein Verfahren erfindungsgemäß entsprechend dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruches 1 ausgeführt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Kultivierung der Zellen in zwei Stufen mit zwei unterschiedlichen Kulturmedien. In der ersten Stufe oder Phase, die nachstehend als "Vermehrungsphase" bezeichnet wird, werden die Zellen, die vorzugsweise Organzellen sind mit einem ersten Kulturmedium beaufschlagt. Durch dieses erste Kulturmedium werden die Zellen angeregt, sich möglichst schnell und damit auch so oft wie möglich zu teilen, d. h. durch dieses erste Kulturmedium wirken permanent mitogen wirkende Stimuli auf die Zellen ein. Die Elektrolytenkonzentration in dem in der Funktionsphase verwendeten zweiten Kulturmedium ist so eingestellt, daß der mitogene Streß auf die Zellen unterdrückt wird, die Zellen dann in eine postmitotische Funktions- oder Differenzierungsphase gelangen, in der sie ihr organtypisches Verhalten aufweisen. Beide Kulturmedien enthalten auch Nährstoffe, die dem Fachmann bekannt sind.

Der Erfindung, die sich auf ein Verfahren zur Zellvermehrung und organtypischen Kontaktinhibierung bezieht, liegt somit auch die Erkenntnis zugrunde, daß Zellteilung und Zelldifferenzierung nacheinander und nicht parallel ablaufende Schritte sind.

Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figur, die in vereinfachter Darstellung einen Schnitt durch eine Vorrichtung zum Vermehren und Erhalten von Zellen zeigt, näher erläutert.

In der Figur ist 1 ein Gehäuse, welches aus zwei scheibenartigen Gehäuseteilen 2 und 3 besteht, die bei geschlossenem Gehäuse 1 eine nach außen hin geschlossene Kammer 4 bilden. In der Kammer 4 ist ein ringartiger Halter 5 eingesetzt, der mit seiner Ringachse achsgleich mit der Achse der Kammer 4 liegt. Der Halter 5 besitzt im Schnitt ein winkelförmiges Profil. In den Halter 5 ist ein geeigneter Zellträger 6 eingelegt, der aus einem Zuschnitt eines geeigneten Zellunterlagenmaterials, beispielsweise aus einem Zuschnitt einer Filtermembrane, eines Netzes, eine Gewebes oder eines Vlieses hergestellt ist. Der ebenfalls scheibenförmige Zellträger 6 ist am Halter 5 durch einen zusätzlichen Haltering 7 gehalten, und zwar derart, daß der Zellträger 6 oben an dem radialen Schenkel des Profils des Halters 5 anliegt und unten gegen den Haltering 7. Durch eine Dichtung 8 ist der Zwischenraum zwischen dem Zellträger 7 und der Wandung der Kammer 4 abgedichtet, so daß letztere durch den Zellträger 6 in zwei Teilkammern unterteilt ist, und zwar in die obere Teilkammer 4′ und die untere Teilkammer 4′′. Für jede Teilkammer sind gesonderte Einlässe 11 und gesonderte Auslässe 11′ für ein die Teilkammern durchströmendes Medium vorgesehen.

Der jeweilige Zellträger 6 ist so ausgewählt, daß die zunächst in einer Vermehrungsphase vermehrten und später in einer Funktionsphase im Zustand der Zelldifferenzierung gehaltenen Zellen 10 sich am Zellträger 6 sich optimal vermehren und verankern können und in der Lage sind, in der Funktionsphase im Zellverband ihre natürliche Funktion zu übernehmen.

Sind die Zellen 10 Epihtelzellen, wie sie in allen Organen des menschlichen oder tierischen Körpers vorkommen, so bedeutet dies, daß diese Zellen nach Abschluß der Vermehrungsphase auf dem Zellträger 6 einen dichten Zellverband bilden und dann in der Funktionsphase entsprechend den Epithelzellen im menschlichen oder tierischen Körper eine Barriere zwischen den beiden mit unterschiedlichen Medien durchströmten Teilräumen 4′ und 4′′ bilden und hierbei in natürlicher Weise unterscheiden, ob und/oder welche Stoffe zwischen den Teilräumen ausgetauscht werden.

Die Zellen 10 können weiterhin Nervenzellen oder aber auch Zellen von menschlichen oder tierischen Organen sein, beispielsweise Leberzellen, Nierenzellen usw.

Nachfolgend wird als Beispiel das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von Nierenzellen aus neugeborenen Kaninchen beschrieben, wobei es für den Fachmann aber ersichtlich ist, daß dieses Verfahren auch bei anderen Organ-Zellen des tierischen sowie des menschlichen Körpers angewandt werden kann.

Am Beginn der Vermehrungsphase wird bei geöffnetem Gehäuse 1 auf bzw. in den Zellträger 6 Nierenzellen aus neugeborenen Kaninchen aufgebracht bzw. eingebracht. Unter Verwendung eines die Kammer 4 bzw. die beiden Teilräume 4′ durchströmenden Kulturmedium erfolgt zunächst in der Vermehrungsphase das Vermehren dieser Nierenzellen in der Weise, daß sie auf den Zellträger einen dichten Zellenverband bilden. Als Kulturmedium wird ein erstes Medium verwendet, welches z. B. im Handel unter der Bezeichnung "IMDM" erhältlich ist und welches ein besonders wachstums- und teilungsfreundliches Milieu für die Vermehrungsphase schafft, wobei dieses Milieu hauptsächlich durch folgende Parameter bestimmt ist:

pH, pCO₂, pO₂, Na⁺, K⁺, Cl⁻, Ca²⁺, Osmolarität

Die Zusammensetzung dieses Serums und insbesondere auch der Anteil an den Elektrolyt-Parametern Cl⁻, Na⁺ in der wäßrigen Lösung und die Größe des Osmolaritätswertes Osm sind in der Fig. 2 wiedergegeben. Das Kulturmedium enthält zudem auch Nährstoffe.

Es hat sich nun gezeigt, daß mit diesem für die Vermehrungsphase günstigen ersten Kulturmedium die natürliche Funktion der Nierenzellen nicht erreichen läßt, d. h. der gezüchtete Zellverband nicht in eine nierentypische Funktionsphase gebracht werden kann. Zur Einleitung der Funktionsphase und zur Aufrechterhaltung dieser Funktionsphase bzw. der Zellen 10 ist es vielmehr erforderlich, den Anteil an Cl und Na im Kulturmedium wesentlich zu erhöhen. Dies erfolgt beispielsweise in zwei Schritten, und zwar zunächst durch Zugabe von 12 mMol NaCl zu 75 mMol des Kulturmediums IMDM, womit bereits eine Erhöhung des Anteils an Cl auf 89,8 mMol/l und Na auf 124 mMol/l erreicht wird (Fig. 3). Anschließend wird diesem modifizierten Kulturmedium noch 17 mMol Na-Glukonat zugegeben, womit die in der Fig. 4 wiedergegebene Zusammensetzung eines geänderten zweiten Kulturmediums erreicht wird, in welchem der Anteil an Cl 98,5 mMol/l und der Anteil an Na 136,9 mMol/l betragen und der Osmolaritätswert 289 mOsm beträgt.

Die Einstellung der Elektrolyten-Zusammensetzung des geänderten zweiten Kulturmediums kann mit geeigneten Analyse-Geräte erfolgen bzw. überwacht werden. Es eignet sich hierfür beispielsweise ein Blutgasanalysator, der von der Firma Nova Biomedical, Rödermark unter der Bezeichnung "Stat Profile 9 Plus" angeboten wird.

Mit der Beaufschlagung der Teilräume 4′ und/oder 4′′ mit diesem zweiten Kulturmedium wird die Funktionsphase eingeleitet, in der die vermehrten Zellen 10 in ihrer Inter- oder Differenzierungsphase verweilen, in welcher sich die Zellen nicht ständig teilen, sondern in einer Kontaktinhibierung verweilen, die Monate oder Jahre andauern kann, wie dies z. B. bei Nervenzellen, Leberzellen, bei Zellen des Bindegewebes sowie bei den als Beispiel gewählten Nierenzellen der Fall ist.

Erst in dieser Interphase stehen die typischen Organfunktionen der Zelle zur Verfügung, d. h. die als Beispiel gewählten Nierenzellen 10 weisen in dieser Inter- oder Funktionsphase dann die typischen Funktionen einer Nierenzelle auf und ermöglichen das Ausscheiden von Stoffen beispielsweise aus der Teilkammer 4′′ in die Teilkammer 4′, wobei dann die Versorgung der Zellen 10 über das die Teilkammer 4′′ durchströmende Kulturmedium erfolgt und die ausgeschiedenen Stoffe mit einem die Teilkammer 4′ durchströmenden Medium abgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert also darauf, durch Entzug oder Zugabe von mitogenen Stimuli, d. h. durch entsprechende Änderung der Elektrolytzusammensetzung und der Osmolarität das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung der Zellen in der Zellkultur dem jeweiligen natürlichen Proliferationszyklus in der Funktionsphase anzupassen, und zwar durch entsprechenden Entzug und/oder entsprechende Zugabe von mitogenen Stimuli, insbesondere durch Erhöhung des Cl- und Na-Gehaltes und Reduzierung des K-Gehaltes im Kulturmedium.

Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet völlig neue Möglichkeiten für ein organ typisches Tissueengineering, wie beispielsweise den Bau einer künstlichen Leber oder einer künstlichen Niere, und/oder für Untersuchungen zur chronischen Intoxikation.

So ist es beispielsweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, ein klar definiertes Epithel aus dem Sammelrohrepithel der Säugetiere mit den unterschiedlichen Zelltypen zu genieren und in der organtypischen Kontaktinhibierung über Wochen und Monate zu halten. Hiermit werden z. B. erstmals Versuche zum chronischen Nierenversagen unter Kulturbedingungen möglich. Weiterhin ist es möglich, profilierendes mikrovaskuläres Endothel der Säugetiere unter Kulturbedingungen am Leben zu erhalten. Dadurch können wachstumsfördernde bzw. wachstumshemmende Einflüsse bei der Entstehung des renalen Gefäßsystems in vitro und unter organtypischen Bedingungen untersucht werden.

Im zahntechnischen Bereich kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren z. B. Mundschleimhaut vor einer geplanten großflächigen Operation entnommen, vermehrt sowie unter Perfusionskulturbedingungen konserviert werden. Die in der Perfusionskultur konservierte Schleimhaut kann dann zum eigentlichen Operationstermin zur zusätzlichen Abdeckung von Wundflächen implantiert werden.

Weiterhin ist es im Zahnbereich möglich, in der Kammer 4 realitätsnahe Untersuchungen zur Verträglichkeit von Medikamenten in der Zahnbehandlung durchzuführen. Hierzu werden jeweils auf einer Seite eines von einer Dentinscheibe gebildeten Zellträgers Mesenchymzellen kultiviert, und zwar in der Wachstums- oder Vermehrungsphase. In der Funktionsphase werden dann auf der anderen Seite des Zellträgers zu untersuchende Behandlungs- und Füllmaterialien aufgetragen. Sterben die Mesenchymzellen ab, so hat die jeweilige Testsubstanz die Bioverträglichkeitsprüfung nicht bestanden.

Weiterhin ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch möglich, gewebetypisches Bindegewebe, gewebetypische Knorpel oder Knochen für chirurgische Implantationszwecke zu genieren und in der Funktionsphase am Leben zu erhalten bzw. zu konservieren, bis dieser gewebetypische Knorpel oder Knochen verwendet wird. Zum Beispiel besteht dabei aus dem Patienten isolierte und in dem Verfahren genierte Knorpelgewebe aus den typischen Chondronen und extrazellulären Matrixproteinen, z. B. dem unveränderten Kollagen Typ II. Da bei all diesen Verfahren patienteneigene Zellen verwendet werden, sind Abstoßungs- und Entzündungsvorgänge nach Implantation auf ein Minimum reduziert.

Bezugszeichenliste

1 Kulturgefäß
2, 3 Gehäuseteil
4 Kammer
4, 4′ Teilkammer
5 Halter
6 Zellträger
7 Fixierring
8 Dichtung
10 Zelle
11 Einlaß
11′ Auslaß

Claims

1. Verfahren zur Kultivierung von Epithelzellen, Nervenzellen, Organzellen oder von gewebetypischen Bindegewebe, gewebetypischen Knochen oder Knorpel des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei die Zellen unter Verwendung eines ersten flüssigen Kulturmediums, welches durch den Anteil zumindest an Cl⁻ und Na⁺ in wäßriger Lösung sowie durch seine Osmolarität ein für die Vermehrung optimales Milieu bildet, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen (10) nach der Vermehrung in der Vermehrungsphase in einer anschließenden Funktionsphase zur Einleitung und/oder Aufrechterhaltung von Organfunktionen mit einem zweiten Kulturmedium als Funktionsmedium versorgt werden, bei dem der Anteil an Cl⁻ und Na⁺ in der wäßrigen Lösung höher liegt als der entsprechende Anteil bei dem ersten Kulturmedium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrolytenkonzentration von Cl und Na des zweiten Kulturmediums durch Zugabe von NaCl zum ersten Kulturmedium eingestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrolytenkonzentration von Cl und Na im zweiten Kulturmedium durch Zugabe von Na-Glukonat zum ersten Kulturmedium eingestellt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Kulturmedium Ca, K, Cl, Na in folgender Zusammensetzung aufweist: Ca²⁺ 1,0 mMol/l
K⁺ 4,25 mMol/l
Cl⁻ 88,5 mMol/l
Na⁺ 112 mMol/l

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Kulturmedium die Komponenten Ca, K, Cl, Na in folgender Zusammensetzung aufweist: Ca²⁺ 0,98-1,66 mMol/l
K⁺ 4,24-6,06 mMol/l
Cl⁻ 89,5-99 mMol/l
Na⁺ 136-137 mMol/l.