DE19510102C1

DE19510102C1 - Konfokales Fluoreszenzmikroskop

Info

Publication number: DE19510102C1
Application number: DE19510102A
Authority: DE
Inventors: Rainer Dr Uhl
Original assignee: Individual
Current assignee: Till Photonics GmbH
Priority date: 1995-03-20
Filing date: 1995-03-20
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2015-03-21
Also published as: GB9605732D0; US5751417A; GB2299235A; GB2299235B

Description

Die Erfindung betrifft ein konfokales Fluoreszenzmikroskop, mit einer zu untersuchenden Probe, einer monochromatischen Anregungslichtquelle und einem Detektor für das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht, wobei das Anregungslicht auf einen Scannerspiegel und von da durch eine Objektivanordnung mit Fokus auf der Probe auf die Probe einfällt und das Fluoreszenzlicht der Probe in umgekehrter Richtung durch die Objektivanordnung und über den Scannerspiegel zu dem Detektor gelangt.

Bei der konventionellen konfokalen Fluoreszenzmikroskopie wird eine Probe punktförmig (Punktgröße in der Nähe eines Beugungsscheibchens, d. h. < 1 µm) durch ein Objektiv be leuchtet. Das von dem beleuchteten Punkt ausgehende Emissionslicht wird von dem gleichen Objektiv gesammelt, passiert eine zu der Beleuchtungsblende konjugierte Selektionsblende, welche Streulicht aus allen anderen Bereichen der Probe eliminiert, und wird dahinter von einem Photomultiplier detektiert. Durch "Scannen" des Beleuchtungspunktes in der Objekt ebene wird sequentiell ein 2D-Bild ermittelt, und durch zusätzliches Verschieben in z-Rich tung entweder des Objektivs oder der Probe selbst kann ein 3D-Bild rekonstruiert werden. Die Tatsache, daß nur der unmittelbar beleuchtete Punkt zur Bildinformation beiträgt, ist Garant für die gegenüber klassischen Aufnahmemethoden gesteigerte Auflösung, und sie ermöglicht mittels Schichtaufnahmen die 3D-Auflösung.

Bei Bildaufnahme in "Echtzeit", d. h. mit Videorate, steht bei einer gewünschten Auflösung von z. B. 480 × 640 Punkten pro beleuchtetem Bildpunkt lediglich eine Belichtungszeit von 100 ns zur Verfügung. Bei dieser kurzen Belichtungszeit kann nur dann ein meßbares Signal erzielt werden, wenn starke Laser für die Anregungsbeleuchtung benutzt werden. Hauptnach teil dieser Vorgehensweise ist, daß nur wenige Laser-Wellenlängen zur Verfügung stehen, und daß ein schnelles Umschalten zwischen Wellenlängen sehr schwierig ist. Hinzu kommt, daß Laser nicht leicht zu handhaben und zudem nicht gerade billig sind. Der daraus resultierende, hohe Komplettpreis der auf dem Markt befindlichen Systeme und ihre geringe Flexibilität stehen einer weiteren Verbreitung konfokaler Mikroskope im Wege.

Will man auf eine Laserlichtquelle verzichten und statt dessen auf eine punktförmige Weiß lichtquelle (z. B. eine Xenonlampe) zurückgreifen, würde dies bei sequentieller Abtastung auf grund der gegenüber Lasern geringeren Beleuchtungsstärke unzumutbar lange Scan-Zeiten nach sich ziehen, die sich jedoch durch Parallel-Anregung und Parallel-Registrierung wesent lich beschleunigen lassen. Eine solche Parallelabtastung ist in der als "Tandem-Scanning Microscope" bezeichneten Anordnung von Petran (D. Egger und M. Petran, 1967, Science 157, S. 305-307 und M. Petran et. al., 1968, J. Opt. Soc. Am. 58, S. 661-664) realisiert, wo eine sog. Nipkow-Scheibe, welche ein spiraliges Lochmusterraster aufweist, sich schnell um ihre Achse dreht und damit sequentiell alle Punkte des Objekts beleuchtet. Konjugierte Punkte auf der gleichen Scheibe tasten (scannen) dann das Bild ab. Die mechanischen Anforderungen an die Präzision von Scheibe und Scheibenbewegung sind jedoch so immens und die Justage ist so delikat, daß sich dieses Prinzip in der Praxis nicht durchgesetzt hat.

Eine praxisnähere und daher erfolgreichere Variante des Petran-Prinzips wurde von Xiao und Kino entwickelt (G.Q. Xiao und G.S. Kino, 1987, Proc. SPIE 809, S. 107-113). Bei dem als "Real Time Scanning Optical Microscope (RSOM)" bezeichneten Verfahren passieren Anre gungs- und Emissionsstrahlen dieselben "pinholes". Dies erfordert speziell entwickelte Nipkow-Scheiben mit extrem geringer Reflexion sowie den Einsatz gekreuzter Polarisatoren und eines λ/_4--Plättchens, um störende Rückreflexionen auszuschalten. Die Anforderungen an die Scheibe sind damit etwas reduziert, aber immer noch sehr hoch.

Beide genannte Anordnungen liefern quasi-parallele Bildinformation, die mit dem bloßen Auge oder einem Flächendetektor (z. B. CCD-Chip) registriert werden kann.

Eine neue, elegantere Version der Quasi-Parallel-Registrierung wurde von Brakenhoff et. al. eingeführt (G.J. Brakenhoff und K. Visscher, 1992, J. Microscopy 165, S. 139-146). Dabei wird ein stationäres Punktraster über einen in zwei Achsen beweglichen Scan-Spiegel auf die Probe abgebildet. Ein Kippen des Spiegels in zwei orthogonale Richtungen bewegt das Punktraster über die Probe und scannt es damit ab. Das emittierte Licht wird über den gleichen Spiegel zurückgeführt, mit Hilfe eines dichroitischen Filters vom Anregungslicht getrennt und passiert dann ein zum Anregungsblendenraster analoges Blendenraster. Licht, das diese Blende passiert, wird danach so umgelenkt, daß es auf die verspiegelte Rückseite des Scan-Spiegels fällt, was dazu führt, daß das Bild "descanned" wird, d. h. in der Bildebene entsteht nachein ander ein flächendeckendes Bild, wenn die Probe nacheinander flächendeckend beleuchtet wird. Obschon die Brakenhoff-Anordnung gute und helle Bilder produziert, vor allem wenn zur Steigerung der Intensität und damit der Scan-Geschwindigkeit kein Punktraster benutzt wird, das in zwei Dimensionen gescannt werden muß, sondern eine Serie paralleler Spalte, hat sie jedoch den entscheidenden Nachteil, daß für jede der Anregungswellenlängen ein anderer dichroitischer Strahlteiler in den Strahl eingebracht werden muß. Bei beugungslimitierten Abbildungen ist es sehr schwierig, dies so vorzunehmen, daß es dabei nicht zu einem merk lichen Strahlversatz kommt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein konfokales Fluoreszenzmikroskop zu schaffen, das keines dichroitischen Strahlteilers bedarf, und bei dem Anregungs- und Emissionswellen länge frei und unabhängig voneinander selektiert werden können.

Diese Aufgabe wird bei der vorliegenden Erfindung dadurch gelöst, daß

- im Anregungslichtweg zwei identische Prismenspektrometer angebracht sind, von denen dem ersten Prismenspektrometer eine Streifenblende mit einer Mehrzahl von Parallelspalten vorgeschaltet und dem zweiten Prismenspektrometer eine zu der ersten Streifenblende identisch ausgebildete und konfokal zu der Objektivanordnung angeordnete, zweite Strei fenblende nachgeschaltet ist,
- wobei das erste Prismenspektrometer das aus der ersten Streifenblende austretende Anre gungslicht auffächert und in eine Zwischenbildebene fokussiert, von wo aus das aufgefä cherte Anregungslicht in das zweite Prismenspektrometer einfällt, von diesem zusammen geführt und auf die zweite Streifenblende fokussiert wird,
- und wobei das zweite Prismenspektrometer das aus der zweiten Streifenblende in Detektor richtung austretende Fluoreszenzlicht auffächert und in die Zwischenbildebene fokussiert, von wo aus das aufgefächerte Fluoreszenzlicht in ein identisch zu dem ersten und zweiten Prismenspektrometer ausgebildetes, drittes Prismenspektrometer einfällt und von diesem zusammengeführt und auf den Detektor fokussiert wird,
- und daß in der Zwischenbildebene eine Selektionsblende angeordnet ist, welche das Fluo reszenzlicht von dem Anregungslicht abtrennt und hierzu als Streifenblende mit einer Mehrzahl von Parallelspalten, mit dazwischenliegenden reflektierenden Stegen ausgebildet ist, welche parallel zu den Spalten der ersten und zweiten Streifenblende ausgerichtet und diesen in Lage und Abmessung dahingehend angepaßt sind, daß entweder die Stege das An regungslicht zur Probe hin reflektieren und das Fluoreszenzlicht geradlinig durch die Spalte der Selektionsblende zum Detektor fällt, oder daß umgekehrt das Anregungslicht geradlinig durch die Spalte der Selektionsblende zu der Probe fällt und die Stege das Fluoreszenzlicht zum Detektor hin reflektieren,
- wobei die Selektionsblende zwecks Einstellung auf eine gewünschte Fluoreszenzwellen länge senkrecht zur Längsrichtung ihrer Spalte verschiebbar ist.

Das hier beschriebene Konzept weist den maßgeblichen Vorteil auf, daß kein dichroitischer Strahlteiler erforderlich ist, welcher ausgewechselt werden muß, wenn ein Wechsel der Anre gungswellenlänge vorgenommen werden soll, d. h. wenn die von der monochromatischen An regungslichtquelle emittierte Wellenlänge geändert wird, z. B. durch entsprechende Ansteue rung eines mit einer Weißlichtquelle ausgestatteten Monochromators, vorzugsweise eines Mo nochromators, der aus DE 42 28 366 A1 bekannten Art. In einem solchen Fall lassen sich die Vorteile einer Weißlichtquelle gegenüber einem Laser - es lassen sich ohne großen Aufwand beliebig viele Anregungswellenlängen realisieren - erst richtig nutzbar machen: Es ist eine freie Wahl von Anregungs- und Emissionswellenlänge sowie deren schneller und unabhängi ger Wechsel möglich. Dies ist insbesondere dann außerordentlich wichtig, wenn "Vielfarben aufnahmen" gewünscht sind, d. h. wenn Proben, die mit mehreren Fluorochromen markiert sind, vermessen werden sollen. In diesem Fall müssen sequentiell mehrere Bilder bei unter schiedlichen Anregungswellenlängen aufgezeichnet und später übereinanderprojiziert werden. Da bei der erfindungsgemäßen Anordnung für den Wechsel zwischen Anregungswellenlängen kein Umbau der Meßanordnung erforderlich ist, kommt es zu keinem Strahlversatz zwischen den Einzelbildern. Ferner genügen bereits die mit Weißlichtquellen erzielbaren Leuchtdichten, so daß sich ohne großen Aufwand beliebig viele Anregungswellenlängen realisieren lassen.

Darüber hinaus erlaubt die vorgeschlagene Anordnung sowohl einen Anregungs- als auch einen Emissionswellenlängen-Scan sowie Durchlichtaufnahmen in Monochrom und in Farbe.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Wenn der Detektor als Flächendetektor ausgebildet ist, kann das Fluoreszenzmikroskop ferner mit einem synchron zu dem Scannerspiegel bewegten Descannerspiegel versehen sein, welcher die zur Fluoreszenz angeregten Probenbereiche auf den Detektor abbildet.

Eine weitere Möglichkeit, für ein flächendeckendes Bild zu sorgen, besteht darin, den Detektor als Zeilendetektor auszubilden und den Descanvorgang auf elektronischem Wege vorzuneh men, d. h. die Zeilen nach jedem Verschieben des Scannerspiegels neu auszulesen, und die 2D-Bildinformation rechnerisch zu rekonstruieren. Da diese Methode ein mechanisch bewegtes Teil sowie die Synchronisation seiner Bewegung mit der des Scannerspiegels erspart, ist sie als die elegantere und praktikablere anzusehen. Ferner sollte erwähnt werden, daß auch ein Flächendetektor durch ein geeignetes elektronisches Ausleseprotokoll wie ein "Vielzeilen detektor" genutzt werden kann.

Um eine optimale Konfokal-Wirkung zu erzielen, kann anstelle der konfokalen zweiten Strei fenblende eine konfokale Punktblende vorgesehen sein, wobei zusätzliche Scanner- und De scanneranordnungen zum Scannen bzw. Descannen senkrecht zu der Scanrichtung des Scan nerspiegels vorhanden sind. In diesem Fall kann die zusätzliche Scanneranordnung einen Piezokristall zum Verschieben der Objektivanordnung senkrecht zu ihrer Ebene und senkrecht zu der Scanrichtung des Scannerspiegels aufweisen.

Alternativ dazu kann im Anregungsstrahlengang anstelle der ersten Streifenblende eine paral lel zu den Spalten der Wellenlängen-Selektionsblende bewegbare Punktblende vorgesehen sein. In diesem Fall kann der Detektor so ausgelegt sein, daß er nur das Fluoreszenzlicht ver wertet, das durch diese Punktblende erzeugt wird, d. h. daß nur die dem Punktraster der Punktblende korrespondierenden Bildinformationen verwertet werden, wodurch sich Verfäl schungen durch rückreflektiertes Anregungslicht minimieren lassen.

In weiterer Ausgestaltung der Erfindung kann eine zusätzliche Lichtquelle für weißes Beob achtungslicht vorgesehen sein, um die Probe wahlweise im Durchlichtverfahren zu beleuchten.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen im Detail beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 den Aufbau einer Anordnung zur konfokalen Fluoreszenzmikroskopie gemäß der vorliegenden Erfindung,

Fig. 2 eine Abwandlung des in Fig. 1 gezeigten Aufbaus,

Fig. 3 eine Streifenblende zum Gebrauch mit einer der in den Fig. 1 und 2 gezeigten Anord nungen,

Fig. 4 eine Punktblende zum Gebrauch mit einer der in den Fig. 1 und 2 gezeigten Anord nungen,

Fig. 5 eine detaillierte Ansicht einer Wellenlängen-Selektionsblende zum Gebrauch mit der in Fig. 1 gezeigten Anordnung, und

Fig. 6 eine detaillierte Ansicht einer modifizierten Wellenlängen-Selektionsblende zum Gebrauch mit der in Fig. 1 gezeigten Anordnung.

Zur Vereinfachung der Beschreibung ist das Meßprinzip anhand einer Anordnung zur konfo kalen Fluoreszenzmikroskopie mit spaltartigen Blenden und eindimensionaler Scan-Richtung erläutert.

Unter Bezugnahme auf Fig. 1 wird eine in eine Objektebene 8 eingebrachte Probe 10 mittels einer Objektivanordnung 12, die ein unendlich-korrigiertes Objektiv oder ein Objektiv und eine korrespondierende Telanlinse aufweist, ins Unendliche abgebildet, und mittels einer Tubuslinse 14 wird die Probe 10 in einer Bildebene 16 abgebildet. In der Bildebene 16 der Tubuslinse 14 steht eine konfokal zu der Objektivanordnung 12 angeordnete Streifenblende 18, die z. B. 32 parallele, streifenförmige Durchgangsöffnungen aufweist. Die horizontale Dimension der Streifen entspricht der gewünschten Bildbreite (z. B. 200 µm), und die vertikale Ausdehnung entspricht der eines beugungslimitierten Streifens (z. B. 0,4 µm). Der Abstand zwischen den parallelen Streifen ist so gewählt, daß Streulichtbeträge von benachbarten Strei fen vernachlässigt werden können. Im gezeigten Beispiel beträgt er das Sechzehnfache der Streifendicke. Zwischen der Objektivanordnung 12 und der Tubuslinse 14 ist ein auf einem Scanner montierter Umlenkspiegel 20 angeordnet, dessen Funktion später beschrieben wird.

Die Bildebene 16 mit der darin befindlichen Streifenblende 18 bildet die Eintrittsspaltebene einer Spektrometeranordnung 22, die als abbildende Elemente zwei beugungslimitierte, achromatische Linsen 24, 26 und als dispergierendes Element ein Beugungsprisma 28 von außerordentlich geringer Dispersion aufweist. Die Dispersion ist so gewählt, daß eine in die Objektebene 8 eingebrachte, weiß leuchtende Probe in der Austrittsspaltebene 30 der Spektro meteranordnung 22 eine Serie "spektral verwischter" Streifen ergeben würde, bei denen sich die Spektren gerade nicht überlappen. In der Austrittsspalt- oder Zwischenbildebene 30 ist eine Wellenlängen-Selektionsblende 32 angeordnet. Die Blende 32 ist auf der der Spektrometer anordnung 22 zugewandten Seite verspiegelt, und sie weist entsprechend der konfokalen Strei fenblende 18 ebenfalls 32 Spalte auf. Die Wellenlängen-Selektionsblende 32 kann mittels eines Piezomotors (nicht gezeigt) in einer zu den Spalten lotrechten Richtung verschoben wer den, so daß die Spalte lediglich einen gewünschten Wellenlängenbereich durchlassen. Mittels einer zu der Spektrometeranordnung 22 komplementären Spektrometeranordnung 34 mit sub traktiver Dispersion wird das durch die Spalte der Wellenlängen-Selektionsblende 32 trans mittierte, wellenlängenselektierte Licht in einer Bildebene 36 wieder zu einer Folge beu gungslimitierter Spalte vereint, deren Helligkeitsverteilung mit Hilfe eines Detektors 38 ge messen werden kann. Mittels eines geeigneten mechanischen "Descan"-Verfahrens können flächige Intensitätsprofile erzeugt und mit Flächendetektoren aufgezeichnet werden. Ist der Detektor 38 als Zeilendetektor ausgebildet, so erfolgt das "Descannen" elektronisch, d. h. im Rechner. Dazu werden nach jeder Bewegung des Scannerspiegels alle Zeilen neu belichtet und ausgelesen. Aus den nacheinander ausgelesenen Zeilen wird dann im Nachhinein das 2D-Bild rekonstruiert.

Für die Anregung der in der Objektebene 8 befindlichen Probe wird über die Wellen längen-Selektionsblende 32 Anregungslicht eingekoppelt. Das Anregungslicht wird von einer mono chromatischen Lichtquelle 40 erzeugt, vorzugsweise von einer Monochromatoranordnung, wie sie aus DE 42 28 366 A1 bekannt ist. Mit dem monochromatischen Licht wird eine Streifen blende 42 beleuchtet, die identisch zu der Streifenblende 18 ist. Da wie oben erwähnt, für die Streifenblende 18 eine Blende mit 32 Spalten gewählt wurde, werden mittels der Streifen blende 42 ebenfalls 32 parallele, rechteckige, monochromatische Lichtstreifen erzeugt, die mittels einer Spektrometeranordnung 44, die zu den beiden bereits beschriebenen Spektro meteranordnungen 22, 34 identisch ist, gebrochen und in die Zwischenbildebene 30 projiziert werden.

Die verspiegelten Stege der in der Zwischenbildebene 30 angeordneten Wellenlängen-Selek tionsblende 32 reflektieren die aus der Streifenblende 42 austretenden Lichtstreifen, und diese durchlaufen die Spektrometeranordnung 22 rückwärts, wobei die durch die Spektrometer anordnung 44 bewirkte Brechung rückgängig gemacht wird, d. h. sie werden zurückgebrochen. Nach dem Durchtritt durch die konfokale Streifenblende 18 und die Tubuslinse 14 werden die Anregungslichtstreifen durch die Objektivanordnung 12 als monochromatisches Streifen muster auf die Probe 10 projiziert. Dabei gestattet der drehbare Scannerspiegel 20, das Strei fenmuster über die Probe 10 wandern zu lassen und somit das Bild abzutasten ("zu scannen").

Durch sorgfältige Justage der Streifenblende 42 relativ zu der konfokalen Streifenblende 18 wird sichergestellt, daß alles Anregungslicht die Blende 18 passiert und auf die Probe 10 gelangt. Gleichzeitig bedeutet dies, daß kein Anregungslicht zurückreflektiert wird und die schwachen Emissionslinien der Probe 10 verfälscht.

In Fig. 2 ist ein alternativer Aufbau der in Fig. 1 beschriebenen Anordnung veranschaulicht. Die bei dieser Ausführungsform benutzten Elemente sind bis auf die Wellenlängen-Selek tionsblende 32 alle gleich jenen, die bei der ersten Ausführungsform benutzt wurden. Hier er folgt die Einkopplung des Anregungslichtes jedoch nicht wie bei der ersten Ausführungsform über die reflektierenden Stege der Wellenlängen-Selektionsblende 32, sondern über die nicht verspiegelten Spalte. Zu diesem Zweck ist die Wellenlängen-Selektionsblende 32 komplemen tär zu jener der ersten Ausführungsform ausgelegt, d. h. anstelle von Spaltöffnungen sind ver spiegelte Streifen und anstelle von verspiegelten Streifen sind Spaltöffnungen vorgesehen. Ob das in Fig. 1 oder das in Fig. 2 gezeigte Konzept gewählt wird, hängt davon ab, auf welche Weise Störungen durch rückreflektiertes Anregungslicht - die konzeptbedingt viel geringer als bei bekannten Anordnungen sind - minimiert werden können.

Soll die beschriebene Anordnung auf ein Gerät mit optimaler Konfokal-Wirkung aufgerüstet werden, wird die Streifenblende 18 (Fig. 3) durch eine Punktblende (Fig. 4) ersetzt. Dabei sollte sich bereits bei relativ kleinen Punktabständen d eine optimale Konfokalität ergeben. Ein System mit Punktraster benötigt eine zweite, zur ersten Scanrichtung, d. h. zur Scanrichtung des Scannerspiegels 20, orthogonale Scanrichtung. Man realisiert sie bevorzugt durch Ver schiebung der Objektivanordnung 12 mit Hilfe eines Piezokristalls. Es wäre auch möglich, die Probe selbst z. B. mittels eines Piezokristalls in einer zweiten Scanrichtung zu verschieben. Es versteht sich, daß empfängerseitig eine entsprechende Möglichkeit zum "Descannen" des Bildes vorgesehen wird.

Alternativ kann im Anregungsstrahlengang anstelle der Streifenblende 42 eine parallel zu der Wellenlängen-Selektionsblende bewegbare Punktblende vorgesehen werden. Die konfokale Unterdrückung von Licht aus "unerwünschten" Regionen erfolgt dann vorzugsweise ohne Descannen auf dem Zeilen- oder Flächendetektor, welcher nach jedem Verschieben der Punkt blende neu ausgelesen wird, wobei nur die zu dem Punktraster korrespondierende Bildinfor mation verwertet wird. Bei dieser Vorgehensweise können die Blenden 18 und 32 ohne Quali tätsverlust weiterhin als Streifenblenden ausgebildet sein, was den Umbau von Streifen- zu Punktbeleuchtung drastisch vereinfacht. Diese Variation ist nicht nur die am bequemsten zu implementierende, sondern sie ist auch die, welche die geringste Verfälschung durch rück reflektiertes Anregungslicht verspricht.

Um das Anregungslicht rückwärts in den Meßstrahl einkoppeln zu können, darf die Wellen längen-Selektionsblende 32 nicht senkrecht zur Strahlrichtung ausgerichtet sein, sondern sie muß um einen (kleinen) Winkel gekippt sein. Dadurch bedingt müssen auch die Linsen um einen entsprechenden Winkel gekippt sein, was u. U. ihre Abbildungseigenschaften verschlech tert. Es könnte daher von Vorteil sein, anstelle einer planen Wellenlängen-Selektionsblende (Fig. 5) eine sägezahnartige Wellenlängen-Selektionsblende (Fig. 6) zu wählen. Bei der in Fig. 6 gezeigten Wellenlängen-Selektionsblende sind die reflektierenden (verspiegelten) Stege 50 so angeschrägt, daß bei einem Strahlengang gemäß Fig. 1 bei senkrechter Anordnung der Blende zum Strahlengang das Emissionslicht senkrecht auf die Spalte auftrifft und das von den Stegen 50 reflektierte Anregungslicht parallel zu dem Emissionslicht gerichtet ist. Bei der Ausführungsform gemaß Fig. 2 kann eine analoge Wellenlängen-Selektionsblende benutzt werden, wobei in diesem Fall das Anregungslicht senkrecht auf die Spalte auftrifft und trans mittiert wird, während das von der Probe 10 ausgehende Emissionslicht von den angeschräg ten Stegen 50 in Richtung auf den Detektor 38 reflektiert wird.

Wie eingangs beschrieben, kann durch Verschiebung in z-Richtung, d. h. in einer Richtung parallel zu der Richtung des Strahlengangs, entweder der Objektivanordnung oder der Probe selbst ein 3D-Bild rekonstruiert werden. Es versteht sich, daß in diesem Fall die Detektor anordnung so ausgebildet sein muß, daß sie die zwischen Bewegungen der Objektivanordnung bzw. der Probe in z-Richtung erfaßten Bildinformationen sequentiell verarbeitet.

Bemerkenswert ist ferner, daß die vorgeschlagene Anordnung auch im Durchlicht eingesetzt werden kann. Unter erneuter Bezugnahme auf Fig. 1 wird zu diesem Zweck eine zusätzliche Quelle 48 für weißes Beobachtungslicht vorgesehen. Von der Quelle 48 ausgehendes, die Probe durchleuchtendes Licht wird durch die Spektrometeranordnung 22 spektral zerlegt, und durch 3faches Verschieben der Wellenlängen-Selektionsblende 32 können sogar farbige (RGB)-Bilder aufgezeichnet werden.

Eine weitere Abwandlung der beschriebenen Anordnung besteht darin, das Beugungsprisma 28 bereits zwischen der Objektivanordnung 12 und der Tubuslinse 14 zu plazieren, d. h. in den Bereich, in welchem die Probe 10 ins Unendliche abgebildet ist. Die Trennung von Anre gungs- und Emissionslicht erfolgt dann bereits in der Bildebene 16. Statt einer gemeinsamen konfokalen Blende für Anregungs- und Emissionslicht gibt es dann zwei, was zusätzliche Möglichkeiten der chromatischen Korrektur ergibt.

Claims

1. Konfokales Fluoreszenzmikroskop, mit einer zu untersuchenden Probe (10), einer mono chromatischen Anregungslichtquelle (40) und einem Detektor (38) für das von der Probe (10) emittierte Fluoreszenzlicht, wobei das Anregungslicht auf einen Scannerspiegel (20) und von da durch eine Objektivanordnung (12) mit Fokus auf der Probe (10) auf die Probe (10) einfällt und das Fluoreszenzlicht der Probe (10) in umgekehrter Richtung durch die Objektivanordnung (12) und über den Scannerspiegel (20) zu dem Detektor (38) gelangt, dadurch gekennzeichnet, daß
im Anregungslichtweg zwei identische Prismenspektrometer (44, 22) angebracht sind, von denen dem ersten Prismenspektrometer (44) eine Streifenblende (42) mit einer Mehrzahl von Parallelspalten vorgeschaltet und dem zweiten Prismenspektrometer (22) eine zu der ersten Streifenblende (42) identisch ausgebildete und konfokal zu der Objek tivanordnung (12) angeordnete, zweite Streifenblende (18) nachgeschaltet ist,
wobei das erste Prismenspektrometer (44) das aus der ersten Streifenblende (42) austre tende Anregungslicht auffächert und in eine Zwischenbildebene (30) fokussiert, von wo aus das aufgefächerte Anregungslicht in das zweite Prismenspektrometer (22) einfällt, von diesem zusammengeführt und auf die zweite Streifenblende (18) fokussiert wird,
und wobei das zweite Prismenspektrometer (22) das aus der zweiten Streifenblende (18) in Detektorrichtung austretende Fluoreszenzlicht auffächert und in die Zwischenbild ebene (30) fokussiert, von wo aus das aufgefächerte Fluoreszenzlicht in ein identisch zu dem ersten (44) und zweiten (22) Prismenspektrometer ausgebildetes, drittes Prismen spektrometer (34) einfällt und von diesem zusammengeführt und auf den Detektor (38) fokussiert wird,
und daß in der Zwischenbildebene (30) eine Selektionsblende (32) angeordnet ist, wel che das Fluoreszenzlicht von dem Anregungslicht abtrennt und hierzu als Streifenblende mit einer Mehrzahl von Parallelspalten, mit dazwischenliegenden reflektierenden Stegen (50) ausgebildet ist, welche parallel zu den Spalten der ersten (42) und zweiten (18) Streifenblende ausgerichtet und diesen in Lage und Abmessung dahingehend angepaßt sind, daß entweder die Stege (50) das Anregungslicht zur Probe hin reflektieren und das Fluoreszenzlicht geradlinig durch die Spalte der Selektionsblende (32) zum Detektor (38) fällt, oder daß umgekehrt das Anregungslicht geradlinig durch die Spalte der Selek tionsblende (32) zu der Probe fällt und die Stege (50) das Fluoreszenzlicht zum Detektor (38) hin reflektieren,
wobei die Selektionsblende (32) zwecks Einstellung auf eine gewünschte Fluoreszenz wellenlänge senkrecht zur Längsrichtung ihrer Spalte verschiebbar ist.

2. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (38) als Flächendetektor ausgebildet ist und daß ein synchron zu dem Scannerspiegel (20) bewegter Descannerspiegel vorgesehen ist, welcher die zur Fluoreszenz angeregten Pro benbereiche auf den Detektor (38) abbildet.

3. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (38) als Zeilendetektor ausgebildet ist und daß der erforderliche Descanvorgang elektronisch erfolgt.

4. Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß anstatt der konfokalen, zweiten Streifenblende (18) eine konfokale Punktblende (46) vorgesehen ist, und daß eine zusätzliche Scanneranordnung und eine zusätzliche, zuge hörige Descanneranordnung zum Scannen und Descannen senkrecht zu der Scanrichtung des Scannerspiegels (20) vorhanden ist.

5. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Scanneranordnung einen Piezokristall zum Verschieben der Objektivanordnung (12) senkrecht zu ihrer Ebene und senkrecht zu der Scanrichtung des Scannerspiegels (20) aufweist.

6. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß im Anregungsstrahlengang anstatt der ersten Streifenblende (42) eine parallel zu den Spalten der Selektionsblende (32) bewegbare Punktblende vorgesehen ist und daß der Detektor (38) nur das Fluoreszenzlicht verwertet, das durch diese Punktblende erzeugt wird.

7. Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine zusätzliche Lichtquelle (48) für weißes Beobachtungslicht zum Beleuchten der Probe (10) im Durchlichtverfahren vorhanden ist.

8. Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die verspiegelten Stege (50) der Selektionsblende (32) bezüglich der Ebene der Spalte um einen vorgegebenen Winkel geneigt sind.