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Die
Erfindung betrifft eine optische Anordnung zum spektralselektiven
Nachweis von Licht eines Lichtstrahls, insbesondere zum Nachweis
von Licht eines Detektionslichtstrahls in einem vorzugsweise konfokalen
Scanmikroskop, mit einem Mittel zur räumlich spektralen Zerlegung
des Lichtstrahls, mit Selektionsmitteln zum Selektieren eines vorgebbaren
kontinuierlichen Spektralbereichs und mit einem Detektor.
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In
der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet
und das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht
geeigneten Detektionsmitteln zugeführt. Der Beleuchtungslichtstrahl
wird mittels einer Strahlablenkeinrichtung, bei der es sich im Allgemeinen
um einen in zwei senkrecht aufeinander stehenden Richtungen kippbaren
Spiegel handelt, mäanderförmig über die
Probe geführt.
Das von der Probe ausgehende Licht wird in Abhängigkeit von der Position des
Beleuchtungslichtstrahls gemessen.
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Zum
spektralselektiven Nachweis des von der Probe ausgehenden Lichts
sind bereits optische Anordnungen der eingangs genannten Art bekannt. In
der
DE 199 02 625
A1 ist beispielsweise eine optische Anordnung offenbart,
bei der unterschiedliche Wellenlängenanteile
gleichzeitig mittels eines sog. Multibanddetektors nachgewiesen
werden können. Bei
einer derartigen Anordnung ist nachteilig, dass die eingesetzten
Multibanddetektoren sehr aufwendig und demzufolge sehr teuer sind.
Sie bieten die Möglichkeit
einer Mehrkanaldetektion, die für
viele Anwendungen jedoch nicht benötigt wird. Insoweit ist für zahlreiche
mikroskopische Untersuchungsverfahren ein Ein-Kanal-Detektionssystem
vorzuziehen.
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Optische
Anordnungen der eingangs genannten Art, bei denen Ein-Kanal-Spektraldetektoren eingesetzt
werden, sind ebenfalls bereits bekannt. In der
DE 101 56 695 A1 ist ein
Scanmikroskop offenbart, bei dem mittels zweier verstellbarer Blenden eine
untere Grenzwellenlänge
und eine obere Grenzwellenlänge
derart vorgebbar sind, dass Lichtanteile des Detektionslichts mit
Wellenlängen
kleiner als die untere Grenzwellenlänge oder mit Wellenlängen größer als
die obere Grenzwellenlänge
durch die Blenden blockiert werden. Die Position der Blenden kann
dabei beispielsweise derart eingestellt werden, dass im Detektionsstrahlengang
vorhandene Restanteile des Beleuchtungslichts blockiert werden.
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Die
bekannte Vorrichtung erweist sich insbesondere im Zusammenhang mit
Versuchen als nachteilig, bei denen eine mit mehreren Fluorochromen eingefärbte Probe
sequentiell mit unterschiedlichen Laserlinien abgerastert werden
soll. Bei der Detektion müssen
die Blenden dann zur Anpassung an den jeweiligen spektralen Detektionsbereich
und zur Ausblendung von Restanteilen des Beleuchtungslichts in schneller
Folge verschoben werden. Die maximal mögliche Geschwindigkeit, mit
der die Blenden verschoben werden können, ist jedoch allenfalls
für eine frameweise
Mehrfarbendetektion hinreichend. Soll die Probe hingegen linienweise
mit unterschiedlichen Laserlinien abgerastert werden, erweisen sich
die Blenden im Hinblick auf ihre Verschiebbarkeit als zu langsam.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, eine
optische Anordnung der eingangs genannten Art derart auszugestalten
und weiterzubilden, dass mit einfachen Mitteln sowohl eine Mehrfarbendetektion
mit sequentiellem Scan – frameweise
oder linienweise – als
auch ein λ-Scan mit
hoher Genauigkeit durchführbar
sind.
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Erfindungsgemäß wird die
voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1 gelöst. Danach
ist die in Rede stehende optische Anordnung derart ausgebildet,
dass mindestens ein Sperrelement vorgesehen ist, das zum Ausblenden eines
vorgebbaren, innerhalb des selektierten kontinuierlichen Spektralbereichs
liegenden spektralen Teilbereichs in den Lichtstrahl einbringbar
ist.
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In
erfindungsgemäßer Weise
ist zunächst
erkannt worden, dass der Einsatz von Multibanddetektoren zum spektralsensitiven
Nachweis von Licht eines Lichtstrahls die entsprechende Vorrichtung
oftmals unnötig
kompliziert im Aufbau und teuer in der Herstellung macht. Darüber hinaus
ist erkannt worden, dass ein spektralsensitiver Nachweis in überraschend
einfacher Weise mit einem Ein-Kanal-Detektor-System durchgeführt werden
kann, wenn bestimmte spektrale Teilbereiche im zu detektierenden Lichtstrahl
ausgeblendet werden. Erfindungsgemäß ist dazu mindestens ein Sperrelement
vorgesehen, das in den Lichtstrahl einbringbar ist. Das in den Lichtstrahl
eingebrachte Sperrelement ermöglicht eine
hohe Flexibilität
im Hinblick auf die spektrale Auswahl der nachzuweisenden Wellenlängenanteile und
erlaubt darüber
hinaus eine schnelle Anpassbarkeit, wie sie – wie eingangs erläutert – beispielsweise bei
einer Mehrfarbendetektion mit linienweisem sequentiellem Scan erforderlich
ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Selektionsmittel als Spaltblendenanordnung ausgeführt. Im
Konkreten kann die Spaltblendenanordnung eine erste Blende zum Ausblenden
von Lichtanteilen mit Wellenlängen
oberhalb einer oberen Grenzwellenlänge und eine zweite Blende
zum Ausblenden von Lichtanteilen mit Wellenlängen unterhalb einer unteren
Grenzwellenlänge
umfassen.
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In
vorteilhafter Weise könnten
die Positionen der Blenden relativ zum Detektor unabhängig voneinander
veränderbar
sein. Dadurch ist es möglich,
sowohl die Breite des selektierten Spektralbereichs als auch dessen
absolute Lage innerhalb des spektral aufgefächerten, zu detektierenden
Lichtstrahls frei zu wählen.
Im Rahmen einer konkreten Anwendung könnten die beiden Blenden beispielsweise
für einen λ-Scan soweit zusammengefahren
werden, dass nur ein Spektralbereich mit einer Breite von ca. 5
nm die Blendenöffnung
passieren kann. Die Blendenöffnung kann
Bild für
Bild in Schritten von wenigen nm verschoben werden. Aus dem gewonnenen
Datensatz lässt
sich für
jedes Pixel ein Spektralverlauf ermitteln. Zur Untersuchung einer
mit mehreren Fluorochromen gelabelten Probe könnten die beiden Blenden für eine Mehrfarbendetektion
mit sequentiellem Scan derart positioniert sein, dass ein Spektralbereich
mit einer Breite von ca. 50 nm die Blendenöffnung passieren kann.
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In
vorteilhafter Weise ist dem Mittel zur spektralen Zerlegung des
Lichtstrahls eine Fokussieroptik zur Erzeugung einer Fokusebene
nachgeschaltet. Im einfachsten Fall kann es sich bei der Fokussieroptik um
eine Sammellinse handeln. Sowohl die Spaltblendenanordnung als auch
die Sperrelemente könnten in
der Fokusebene positioniert sein, um auf diese Weise möglichst
scharf ausgeprägte
Ausblendkanten zu erhalten.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung sind die Positionen der Sperrelemente
im Lichtstrahl veränderbar.
Eine Positionsveränderung
kann dabei zum einen innerhalb der Aufspaltungsebene vorgesehen sein,
um unterschiedliche Spektralbereiche auszublenden. Zum anderen kann
eine Positionveränderung
im Sinne eines vollständigen
Ein- bzw. Ausfahrens in bzw. aus dem Strahlengang vor gesehen sein. So
könnte
beispielsweise die Anzahl der in den zu detektierenden Lichtstrahl
eingefahrenen Sperrelemente auf die Anzahl der unterschiedlichen
Laserlinien, mit denen das Mikroskopsystem betrieben wird, abgestimmt
sein. Bei insgesamt drei unterschiedlichen Laserlinien könnten somit
entsprechend drei Sperrelemente im Lichtstrahl vorgesehen sein.
Wird im Lichtstrahl verbleibendes Anregungslicht einer Wellenlänge bereits
mit einer der beiden Blenden der Spaltblendenanordnung ausgeblendet,
so kann es ausreichen, lediglich zwei Sperrelemente in den Lichtstrahl
einzubringen.
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Im
Hinblick auf eine besonders schnelle Anpassbarkeit der Sperrelemente
ist es von Vorteil, die Sperrelemente kippbar auszuführen. Als
Antriebsmittel zum Drehen der Sperrelemente kann bspw. ein Steppermotor,
ein Piezomotor oder ein Galvanometer vorgesehen sein. Die Sperrelemente
könnten
dabei als dünne
Stege ausgeführt
sein. Diese werden mit ihrer Breitseite im Lichtstrahl positioniert,
wenn der entsprechende Spektralbereich ausgeblendet werden soll.
Wenn hingegen der entsprechende Spektralbereich zum Detektor durchgelassen
werden soll, werden die Stege gekippt, so dass ihre Schmalseite
im Lichtstrahl steht. Im Konkreten könnte die Breite der Stege in
der Größenordnung
von 50 bis 100 μm
liegen. Bei einer spektralen Aufspaltung, bei der der sichtbare
Spektralbereich zwischen 400 und 800 nm in der Fokusebene eine räumliche
Ausdehnung von 20 mm aufweist, entspricht dies einer spektralen
Breite von 1 bis 2 nm. Die Dicke der Stege könnte dagegen in einer Größenordnung
von lediglich 10 μm
liegen, so dass die Sperrelemente in einer Stellung, in der die
Schmalseite im Lichtstrahl steht, innerhalb des Spektrums nur wenig
störend
wirken.
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Um
zu verhindern, dass der Informationsgehalt der mittels der Sperrelemente
ausgeblendeten Spektralbereiche vollständig verloren geht, können die
Sperrelemente in vorteilhafter Weise verspiegelt sein. Zusätzlich kann
ein Photodetektor vorgesehen sein, auf den die ausgeblendeten Wellenlängenanteile
mittels der verspiegelten Sperrelemente reflektierbar sind. Der
Photodetektor kann in einem festen Winkel in Bezug auf die Sperrelemente
angeordnet sein und könnte
für Kalibrationszwecke
oder für
Online-Kontrollmessungen eingesetzt werden.
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Das
Mittel zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls ist in einer bevorzugten
Ausführungsform als
dispersives Element ausgeführt.
Aufgrund der einfachen Hand habbarkeit eignet sich insbesondere der
Einsatz eines Prismas oder eines Gitters. Im Falle eines Prismas
muss die Nichtlinearität
der spektralen Aufspaltung berücksichtigt
werden, was aufgrund der individuellen Positionierbarkeit und Kippbarkeit der
Sperrelemente allerdings kein Problem darstellt.
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Aufgrund
seines äußerst guten
Zeitverhaltens wird als Detektor bevorzugt ein Photomultiplier verwendet.
Denkbar ist zudem der Einsatz anderer Detektortypen, insbesondere
der Einsatz von Avalanche-Photo-Dioden (APD). APD's sind charakterisiert durch
ihre hohe Empfindlichkeit und weisen zumeist eine kleine Detektionsfläche auf.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch
1 nachgeordneten Patentansprüche
und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit
der Erläuterung
des bevorzugten Ausführungsbeispiels
der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte
Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert.
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In
der Zeichnung zeigen
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1 in
einer schematischen Ansicht ein konfokales Scanmikroskop mit einer
erfindungsgemäßen optischen
Anordnung zum spektralselektiven Nachweis von Licht des Detektionslichtstrahls
des Scanmikroskops und
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2 in
einer vergrößerten Ansicht
die optische Anordnung aus 1.
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1 zeigt – schematisch – den prinzipiellen Aufbau
eines konfokalen Scanmikroskops 1, wobei das Scanmikroskop 1 eine
optische Anordnung 2 zum spektralselektiven Nachweis von
Licht des Detektionslichtstrahls 3 aufweist.
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Das
Scanmikroskop 1 umfasst als Lichtquelle 4 einen
Laser 5, der einen Beleuchtungslichtstrahl 6 emittiert.
Nach dem Passieren einer Anregungsblende 7 wird der Beleuchtungslichtstrahl 6 von
einem Strahlteiler 8 zum Scanmodul 9 reflektiert,
das einen kardanisch aufgehängten
Scanspiegel 10 aufweist, der den Strahl durch eine Scanoptik 11,
eine Tubusoptik 12 und eine Mikroskopoptik 13 hindurch über bzw,
durch eine Probe 14 führt.
Der von der Lichtquelle 4 kommende Beleuchtungslichtstrahl 6 ist in 1 als
durchgezogene Linie dargestellt.
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Der
von der Probe 14 ausgehende gestrichelt dargestellte Detektionslichtstrahl 3 gelangt durch
die Mikroskopoptik 13, die Tubusoptik 12, die Scanoptik 11 über das
Scanmodul 9 zum Strahlteiler 8. Nach dem Passieren
einer Detektionsblende 15 trifft der Detektionslichtstrahl 3 auf
eine erste Fokussieroptik 16, die als Linse 17 ausgeführt ist.
Danach trifft der Detektionslichtstrahl 3 auf ein Mittel 18 zur räumlich spektralen
Zerlegung, das als Prisma 19 ausgeführt ist. Mittels einer hinter
dem Prisma 19 angeordneten zweiten Fokussieroptik 20,
die als Linse 21 ausgeführt
ist, wird der spektral aufgefächerte
Detektionslichtstrahl 3 in eine Fokusebene fokussiert.
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In
der Fokusebene ist eine Spaltblendenanordnung 22 positioniert,
die aus zwei Blenden 23, 24 gebildet ist. Zwischen
den beiden Blenden 23, 24 sind insgesamt drei
Sperrelemente 25, 26, 27 angeordnet.
Beim Passieren der Spaltblendenanordnung 22 sowie der Sperrelemente 25, 26, 27 werden
bestimmte vorgebbare Spektralbereiche aus dem Detektionslichtstrahl 3 ausgeblendet,
wie unten unter Bezugnahme auf 2 im Detail
ausgeführt
wird. Die nach Passieren der Spaltblendenanordnung 22 sowie
der Sperrelemente 25, 26, 27 im Detektionslichtstrahl 3 verbleibenden
Wellenlängenanteile
werden im Detektor 28, der als Photomultiplier 29 ausgeführt ist,
nachgewiesen.
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2 zeigt – schematisch – den prinzipiellen Vorgang
des Ausblendens bestimmter Wellenlängenanteile aus dem Detektionslichtstrahl 3 mittels der
Blenden 23, 24 und der Sperrelemente 25, 26, 27 in
größerem Detail.
Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche Bauteile wie in 1.
Wie bereits oben erläutert,
wird der Detektionslichtstrahl 3 nach Passieren des Prismas 19 durch
die Linse 21 in eine Fokusebene fokussiert. In der Fokusebene
sind die beiden Blenden 23, 24 angeordnet, mit
denen ein vorgebbarer kontinuierlicher Spektralbereich selektiert werden
kann. Dabei blockiert Blende 23 Lichtanteile mit Wellenlängen größer als
eine obere Grenzwellenlänge,
welche durch die Position der Blende 23 definiert wird.
Analog blockiert Blende 24 Lichtanteile mit Wellenlängen kleiner
als eine untere Grenzwellenlänge,
die ebenfalls durch die Position der Blende 24 bestimmt
wird. Zum Verändern
der oberen und der unteren Grenzwellenlänge können die Blenden 23, 24 – wie in 1 durch
die beiden Doppelpfeile angedeutet – verschoben werden.
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Zwischen
den Blenden 23, 24 sind drei Sperrelemente 25, 26, 27 angeordnet,
mit denen vorgebbare, innerhalb des durch die Blenden 23, 24 selektierten
Spektralbereichs liegende spektrale Teilbereiche aus dem Detektionslichtstrahl 3 ausblendbar sind.
Die Sperrelemente 25, 26, 27 sind als
dünne Stege
mit einer Breite von ca. 50 bis 100 μm und einer Dicke von ca. 10 μm ausgebildet.
Mittels eines nicht dargestellten Galvanometers können die
Stege um ihre durch die Doppelpfeile angezeigte Achse gekippt werden.
Ist ein Sperrelement 25, 26, 27 mit seiner
Schmalseite zum Photomultiplier 29 ausgerichtet, so wird
der Detektionslichtstrahl 3 nahezu nicht beeinflusst. Für den Fall,
dass ein bestimmter Spektralbereich ausgeblendet werden soll, wird
das entsprechende Sperrelement 25, 26, 27 – bspw.
um 90° – gekippt;
so dass es mit seiner Breitseite zum Detektionslichtstrahl 3 ausgerichtet
ist.
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In
dem in 2 dargestellten Ausführungsbeispiel ist zwischen
der Spaltblendenanordnung 22 und dem Detektor 28 eine
Linse 31 angeordnet. Die Linse 31 bündelt das
Detektionslicht, so dass dieses auch auf Detektoren mit kleinerer
aktiver Detektionsfläche – wie z.B.
APD's – abgebildet
werden kann.
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Um
die Anordnung flexibel sowohl an unterschiedliche Versuchsparameter
als auch an unterschiedliche Mikroskopsysteme mit beispielsweise unterschiedlichen
Beleuchtungslaserlinien anzupassen, können die Sperrelemente 25, 26, 27 in
Richtung der Fokusebene verschoben werden, so dass jeweils unterschiedliche
Spektralbereiche ausblendbar sind. Darüber hinaus können die
Sperrelemente von Anwendung zu Anwendung auch ausgetauscht und beispielsweise
gegen schmalere oder breitere Sperrelemente ersetzt werden.
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Sperrelement 27 ist
verspiegelt ausgeführt. Die
von dem Sperrelement 27 reflektierten Wellenlängenanteile
des Detektionslichtstrahls 3 treffen auf einen unter einem
entsprechenden Winkel positionierten Photodetektor 30 und
werden dort zu Kalibrationszwecken oder zu Online-Kontrollmessungen
detektiert.
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Abschließend sei
ganz besonders darauf hingewiesen, dass das voranstehend erörterte Ausführungsbeispiel
lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dient, diese
jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel
einschränkt.