DE1944680C3 - Verfahren zur Gewinnung hxxochreiner, hxxochmolekularer Amylose - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung hxxochreiner, hxxochmolekularer AmyloseInfo
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Description
1400
1000
1000
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von hochreiner und im wesentlichen hochmolekularer
Amylose aus Stärke.
Bekanntlich enthalten sowohl unter- wie oberirdisch gewachsene Stärken, wie solche von Süßkartoffel,
Weizen, Tapioka und Mais, stets Amylose und Amylopektin. Amylose hat ausschließlich eine λ-1,4-Glucosidbindungen
aufweisende geradkettige Struktur, wogegen in Amylopektin die geradkettigen Moleküle
mit *-l,4-Glucosidbindungen zahlreiche Verzweigungen
mit <x-!,6-Glucosidbindungen enthalten. Amylopektin
weist somit eine hochmolekulare baumartige Struktur, bestehend aus zahlreichen Zweigen mit
gerader ivM-Glyeosidkette, die durch a-l,6-Glucoside
miteinander verbunden sind, auf. Übliche Stärken bestehen aus etwa 20 bis 25% Amylose und restlich aus
Amylopektin.
Amylose hat einen Polymerisationsgrad von über und neigt daher zum Kristallisieren und außerdem
wegen ihrer Struktur, die derjenigen von Cellulose ähnlich ist, zur Filmbildung, während Amylopektin
wegen seiner baumartigen, komplizierten makromolekularen Form zum Quellen und zur Bildung gelierter
Produkte neigt; deren Lösungen haben eine hohe Viskosität und werden als Pasten verwendet.
Somit haben Stärken, die aus verschieden zusammengesetzten
Mischungen von Amylose und Amylopektin
20 40 60 80 100
Wie aus dem Diagramm zu ersehen, weist der reine Amylosefilm eine Biegefestigkeit von 1400, der 60%
Amylopektin enthaltende Film dagegen eine Biegefestigkeit von nur etwa 100 und der 80% Amylopektin
enthaltende Film sogar eine solche unter 100 auf, während der reine Amylopektinfilim so gut wie keine
Biegefestigkeit hat. Somit besteht ein sehr großer Unterschied in den (Umbildenden Eigenschaften reiner
Amylose einerseits und der Gemische von Amylose mit Amylopektin andererseits.
Aus vorgenannten Gründen sind verschiedene Methoden zur Trennung von Amylopektin und Amylose
bzw. zur Gewinnung von Reinstamylose vorgeschlagen und teilweise auch praktisch benutz); worden.
Amylopektin kann aus Naturstärken, wie klebriger Reisstärke oder wachsartiger Maisstärke, in beinahe
reiner Form erhalten werden; Amylose liegt dagegen in Naturstärken lediglich in geringen Mengen vor. Als
Ergebnis der Bemühungen zur Züchtung von Maisarten mit hohem Amylosegehalt der Stärke gewann man zwar
in USA eine Stärke mit etwa 60% Amylose; jedoch mußte diese Maisart in ganz bestimmten Gebieten in
besonderer Weise unter hohen Kosten gezüchtet werden, enthielt aber immer noch 20 bis 40%
Amylopektin und ermangelte daher einer praktischen Anwendbarkeit. In die Praxis wurde ein Verfahren
eingeführt, wonach man aus gelatinierter und mit einem anorganischen Salz behandelter Weißkartoffelstärke
die beiden Hauptbestandteile fraktioniert fällt und sie als Amylose und Amylopektin auf den Markt bringt;
jedoch hat die erhaltene Amylose nur eine Reinheit von etwa 80% und einen beträchtlichen Amylopektingehalt,
sowie infolge Abbau einen Polymerisationsgrad von lediglich 400, somit einen sehr viel niedrigeren als
Amylose in Naturstärke.
In der Zeitschrift »Die Stärke«, Nr. 4/10. Jahrgang,
1958, Seiten 79 bis 85, insbesondere auf Seite 81 ist eine allgemeine Darstellung darüber enthalten, was bei der
Stärkeverzuckerung mit Enzymen vor sich geht. Bezüglich Amyloglucosidase (Amylo-l,6-<x-Glucosidase)
ist dort ausgeführt, daß diese in der Lage ist, höhermolekulare Stärkeabbauprodukte direkt bis zur
Glucose abzubauen. Selbst die nt-l,6-glucosidischen
Bindungen an den Verzweigungsstellen des Amylopektins
vermögen den Abbau nicht zu hemmen, so daß die Hydrolyse bis zu etwa 95% möglich ist, und zwar
offenbar direkt bis zur Glucose. Diesen Angaben ist nicht zu entnehmen, was zu tun ist, um hochmolekulare,
hochreine Amylose herzustellen. Aufgrund der Angaben in dieser Zeitschrift erhält der Fachmann keine
Anregungen, mittels Amyloglucosidasen zu versuchen, hochmolekulare Amylose zu erhalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist demgegenüber festgestellt worden, daß man bei Verwendung von
Stärke mit mehr als 50% Amylose und Anwendung bestimmter Enzyme nur einen Aufbruch der Verzweigungsstellen
bewirkt und daß dabei hochmolekulare Amylose entsteht
Die Gewinnung hochreiner, hochmolekularer Amylose, die kein Amylopektin enthält, w?.r bisher in
wirtschaftlich brauchbaren verschiedenen Formen nicht möglich. Die EiiLider des vorliegenden Verfahrens
haben viele Wege zur Gewinnung hochmolekularer, amylopektinfreier Amylose, welche der natürlichen
Amylose ähnlich ist, untersucht.
Der vorliegenden Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung hochreiner,
hochmolekularer Amylose unter Verwendung des Abbaus von a-l,6-Glucosidbindungen im Amylopektin
mittelsa-l,6-Glucosidasen anzugeben.
Zur Lösung dieser Aufgabe ist das Verfahren erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man
Stärke, die mehr nls 50% Amylose enthält, nämlich Amylomaisstärke oder aus Süßkartoffeln, Weißkartoffeln
oder Mais abgetrennte Amyioslarke, in bekannter
Weise durch Erhitzen gelatiniert und das Produkt mittels einer oder mehrerer Oc-1,6-Glucjsiclasen aus der
Gruppe Aerobacter-, Pseudomonas-, Lactobacillus- oder Escherichia-Enzym durch selektiven hydrolytischen
Abbau der «-1,6-Glucosidbindungen der Seitenketten der Amylopektinmoleküle unter Erhaltung des
hohen Molekulargewichts in praktisch seiter kettenfreie Amyloseprodukte überführt.
Durch die vorliegende Erfindung wurde somit gefunden, daß Naturstärken in ausschließlich eine
Amylosestruktur aufweisende Produkte tiberführbar sind, wenn man einen hohen Amylosegehalt aufweisende
Stärke nach dem üblichen Gelatinieren durch Erhitzen einem enzymatischen Abbau unterwirft, durch
welchen lediglich der verzweigte Anteil der baumartigen Struktur von Amylopektin zu einer Amyloses.ruktur
abgebaut wird, d.h., daß die a-l.ö-Gluccsidbindungen
des in Mengen von 20 bis 50% vo 'liegenden Amylopektins selektiv hydrolysiert werden.
Vorzugsweise isoliert man die Umsetzunijisprodukte
durch fraktionierte Fällung.
Nach beendeter Gelatinierung kühlt man die Stärkelösung vorzugsweise sofort auf 45 bis :i5° ab und
führt mittels einer ausreichenden Enzymrrenge den Abbau bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6 in 1 bis 2 Tagen
durch.
Bei Verwendung des Lactobacillusenzyms :rfolgt die Hydrolyse bei 55°C und bei einem pH-Wort von 6,
worauf auf 45°C abgekühlt wird.
Bei Verwendung des Pseudomonasenzyms | Isoamylase) erfolgt die Hydrolyse bei einem pH-Wert von 4,5 bis
5,5.
Als <%-l,6-Glucosid; en können folgende Enzyme
angewandt werden:
a) Pullulanasc, gewonnen gemäß
Patent (P 17 67 654.9);
a) Pullulanasc, gewonnen gemäß
Patent (P 17 67 654.9);
b) Isoamylase, gewonnen mittels Pseudomonas gemäß
Patent(P17 67 653S);
c) Enzyme, gewonnen mittels Lactobacillus gemäß
Patent(P19 16 7405)
Patent(P19 16 7405)
d) Enzyme, gewonnen mittels Escherichia gemäß
Patent (K 63 946 IVa/6a)
Patent (K 63 946 IVa/6a)
Diese Enzyme unterscheiden sich zwar hinsichtlich pH-Optimum, Temperaturoptimum und der einwirkenden
Substrate mehr oder weniger voneinander, jedoch zeichnen sie sich alle dadurch aus, daß sie die
«-1,6-GIucosidbindungen jeglicher Stärke selektiv hydrolysieren.
Prfindungsgemäß wird vorzugsweise gereinigte Amylomaisstärke in Form ihrer wäßrigen Suspensionen
in bekannter Weise durch Erhitzen hinreichend dispergiert und nach Einstellung des pH und der
Temperatur mit einem der genannten Enzyme versetzt, um die verzweigte Amylopektin-Struktur durch Abbau
x bzw. Hydrolyse in gcradkcttige Amylosesisrkc umzuwandeln.
Zur Stärkegelatinierung ist eine möglichst niedrige Temperatur und die Durchführung der Erhitzung in
einem Inertgas wie Stickstoff vorzuziehen, da laut
2Ί Schriftumsangaben das Molekulargewicht dir Amylose-Moleküle
während de. Abspaltung der langkettigen Amylosemoleküle durch die Hochtemperaturbehandlung
oder durch Einwirkung von Luftsauerstoff bei hol en-η Temperaturen erniedrigt wird. Selbstredend ist
i" die Gelatinierung bei niedriger Stärkekonzentration
einfacher; bei einer Konzentration über 15% ist nämlich die Gelatinierung bei etwa 100° C bereits oft schwierig.
Zu der sofort nach beendeter Gelatinierung auf 45 bis 55° C abgekühlten Stärkelösung setzt man eine geeigne-
ü te Enzymmenge zu und führt die Umsetzung beim pH 43 bis 6 in I bis 2 Tagen durch. Bei Anwendung eires
verhältnismäßig hitzestabilen Lactobacillus-Enzyms erfolgt die Hydrolyse bei 55°C und beim.;H 6, worauf auf
45°C abgekühlt wird; beim Pseudomonas-Enzym
ι» (Isoamylase) ist ein pH von 4,5 bis 5,5 vorzuziehen.
Im Laufe der Enzymbehandlung fällt der Anteil an langkettiger Amylose aus; dieser wird anschließend
abgeschleudert, mit einer geringen Wassermenge gewaschen und getrocknet. Aus der abgetrennten
i'· Flüssigkeit gewinnt man durch Eindicken und Kühlen
den größeren Teil der Amylose; das Eindicken kann im Vakuum bis auf '/3 bis 1A des Volumens erfolgen. Durch
das fraktionierte Fällen erhält man Amylosen mit unterschiedlichen Eigenschaften. Der Polymerisations-
■>(> grad der erhaltenen Amyloseprodukte wird durch
Perjodatoxydation für das erste Produkt zu über 500 bis zu über 700, für das zweite Produkt im Durchschnitt zu
200 bis 100 ermittelt. Bei Anwendung der Bestimmung des Verzweigungsgrades nach Smith (vgl. J. Am.
">'> Chem. Soc. 78/1956, 5907, und »Methods in arbohydrate
chemistry«, V 251/1965, Academic Press) zeigte sich, daß das erstere Produkt eine seitenkettenfreie geradkettige
Struktur aufweist; das zweite Produkt hat einen Kennwert nahe 1, der andeutet, daß lediglich eine
geringe Zahl Seitenketten verblieben sind. Durch Behandlung der verdünnten Lösung mit /J-Amylase
bildet sich 100%ig Maltose; dieser Tatbestand legt ebenfalls nahe, daß die gewonnenen Produkte fast ganz
aus geradkettiger Amylose bestehen.
Somit erhält man aus mehr als 50% Amylose enthaltende Stärken mit «I,6-Glucosidasen reine
Arnylosen, die hauptsächlich hochmolekular wie Natur
amylose sind und keine ix-l,6-Glucosidbindungen
enthalten, & h. keine verzweigte Struktur aufweisen. Die
gewonnenen reinen Amylosen sind zur Gewinnung reiner Amylosederivate oder von Produkten, welche die
Eigenschaften reiner Amylose nutzbar machen, geeignet D · · 1 ,
Beispiel 1.
Reine Amylomaisstärke wird in Form ihrer 5%igen
wäßrigen Suspension bei pH 6,0 unter Rühren auf 100° C, dann im Stickstoffstrom auf 130° C erhitzt und
20 min gerührt, hierauf schnell auf 45° C abgekühlt Nach ι ο
schnellem Einstellen auf den pH-Wert 4,5 gibt man ein Pseudomonas-Enzym, das durch Aussalzen gereinigt
und aus Äthanol gefällt war, in einer Menge von 50 Einheiten (E) je g Stärke zu. Die Umsetzung erfolgt bei
45° C unter Rühren im Laufe von 1,5 Tagen, wobei sich die Fällungen in Laufe der Behandlung vermehren.
36 h später werden die Amylosefällungen abgeschleudert,
in der gleichen Menge warmem Wasser aufgeschleimt, dann erneut geschleudert und bei Raumtemperatur
im Vakuum getrocknet (Produkt A). Die erhaltene ju
Flüssigkeit dampft man unter Unterdruck auf 'h
Volumen ein und läßt 12 h bei 5 bis 0°C stehen; die erhaltenen Fällungen werden abgeschieden, mit warmem
Wasser gewaschen und getrocknet (Produkt B).
Die Ausbeute an A betrug 40%, an B 30% (bezogen r> auf trockne Ausgangsstärke), der Polymerisationsgrad
von A 780, von B 130. Die Bestimmung nach Smith zeigte, daß A seitenkettenfrei war und B durchschnittlich
1 Seitenkette je Molekül hatte. Die bei einer Konzentration von 03%, einem pH 6,0 und 55° C in 12 h «ι
durchgeführte Hydrolyse mit /?-Amylase ergab aur A 100%ig und aus B zu 85% Maltose.
Zu Amylomaisstärke, die gemäß Beispiel 1 im :. Stickstoffstrom gelatiniert und nach Abkühlen auf pH
5,5 eingestellt war, setzt man bei 60° C unter Rühren ein mit Ammoniumsulfat ausgesalzenes Lactobacillus-Enzym
in einer Menge von 50 E/g Stärke zu, kühlt während der Einwirkung das Gemisch auf 450C und gibt
20 E/g Stärke Aerobacter-Pullulanase zu. Die Umsetzung
erfolgt bei 45° C unter Rühren in insgesamt 40 h. Dann wird die Reaktionsflüssigkeit im Vakuum auf </j
Volumen eingedampft und über Nacht bei 5 bis 0°C gekühlt Die gefällten Anteile suspendiert man in der
dreifachen Menge kaltem Wasser und trocknet nach Abschleudern durch Belüftung bei 40° C. Die Ausbeute
beträgt 82% (bezogen auf trockene Ausgangsstärke), der durchschnittliche Polymerisationsgrad 520.
Eine 3%ige wäßrige Suspension einer gründlich mit Wasser gewaschenen und gesiebten Amylomaisstärke
wird bei 100° C unter Rühren bis zu fast vollständiger
Gelatinierung drucklos und dann noch 30 min unter einem Druck von 1,5 at erhitzt, die erhaltene Lösung
schnell auf 60°C abgekühlt auf pH 5,5 eingestellt und mit einer wäßrigen Lösung eines ausgesalzenen
Lactobacillus-Enzyms in einer Mi-nge von 50 E/g Stärke
versetzt Nun kühlt man unter starkem Rühren innerhalb 1,5 h auf 45° C ab und führt die Umsetzung
unter Rühren in 35 h durch, schleudert dann die Fällungen ab, wäscht sie einmal mit einer geringen
Weisermenge und erhält nach erneutem Abschleudern und Trocknen weiße Amylose (Produkt A) in einer
Ausbeute von 43%, bezogen auf trockne Ausgangsstärke. Aus der abgetrennten Flüssigkeit werden nach
Eindampfen und Kühlen zusätzlich .50% weiße Amylose (Produkt Bj erhalten.
Der Polymerisationsgrad wurde für A mit 580, für B mit 160 ermittelt; die Smith-Bestimmung ergab bei A
keine Seitenketten, bei B etwa 1 Seitenkette je Molekül, die Hydrolyse mit /)-Amylase aus A zu 99%, aus B zu
80% Maltose. Die Stickstoffbestimmung zeigte einen Proteingehalt von unter 0,1%; der Gli'ihrückstand
betrug 0,09%. Es ist somit zu folgern, daß die gewonnene Amylose insgesamt eine senr hohfi Reinheit
besitzt.
Claims (5)
1. Verfahren zur Gewinnung hochreiner, hochmolekularer Amylose unter Verwendung des Abbaus
von «-l.ö-Glucosidbindungen im Amylopektin mittels a-l.ö-Glucosidasen, dadurch gekennzeichnet, daß man Stärke, die mehr als 50%
Amylose enthält, nämlich Amylomaisstärke oder aus
Süßkartoffeln, Weißkartoffeln oder Mais abgetrennte Amylosestärke, in bekannter Weise durch
Erhitzen gelatiniert und das Produkt mittels einer oder mehrerer <x-l,6-Glucosidasen aus der Gruppen
Aerobacter-, Pseudomonas-, Lactobacillus- oder Escherichia-Enzym durch selektiven hydrolytischen
Abbau der <x-l,6-Glucosidbindungen der Seitenketten der Amylopektinmolekfile unter Erhaltung des
hohen Molekulargewichts in praktisch seitenkettenfreie Amyloseprodukte überführt.
2. Verfahren nach Anspruch !, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Umsetzungsprodukte durch fraktionierte Fällung isoliert
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man nach beendeter Gelatinierung
die Stärkelösung sofort auf 45 bis 55" abkühlt und mittels einer ausreichenden Enzymmenge den
Abbau bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6 in ein bis zwei Tagen durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung des Lactobacillusenzyms
die Hydrolyse bei 55"C und bei einem pH-Wert von 6 erfolgt, worauf auf 45° C abgekühlt
wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung des Pseudomonasenzyms
(Isoamylase) die Hydrolyse bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5 erfolgt.
bestehen, einander unähnliche Eigenschaften; dank der Unterschiede zwischen dem Charakter der beiden
Bestandteile und deren Mischungsverhältnis sind gleichartige Eigenschaften nicht leicht zu erhalten.
Daher können die spezifischen Eigenschaften von Amylose oder von Amlyopektin in Naturstärken nicht
ausgewertet werden.
Das nachfolgende Diagramm, auf welchem die senkrechte Achse die Biegefestigkeitswerte (in Schop-
per-Doppelfaltungseinheiten) und die waagerechte
Achse den prozentualen Amylop.ektingehalt angibt, zeigt den Einfluß der Amyiopektinmenge, die im
Amylosefilm vorliegt, auf die Filmbiegsamkeit:
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