DE1935711C3 - Wasserunlösliches Protein. Ausscheidung aus: 1908290 - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein wasserunlösliches, trägergebundenes Protein.

Grundsätzlich muß zwischen unlöslichen Proteinen und gebundenen unlöslichen Proteinen unterschieden werden.

Es ist bekannt, daß unlösliche Proteine durch Kondensations-, Kupplungs- und Polymerisationsreaktionen mit dem Protein selbst entstehen können. Die auf diese Weise erhaltenen Proteine sind Produkte unkontrollierbarer Reaktion; es lassen sich keine definierten Produkte erhalten. Ein großer Teil des Proteins wird durch die harten Reaktionsbedingungen der Polymerisation, der Kupplung mit bis-Diazo-Verbindungen und durch die für die Kondensation eingesetzten Komponenten, wie Formaldehyd, Chlor-Ameisensäureäthylesler u. a., denaturiert und dadurch biologisch inaktiviert. Er geht für die hauptsächlichen Anwendungsbereiche unlöslicher Proteine verloren.

Als unlösliche, biologisch aktive Proteine haben allein die an Trägermaterialien fixierten Proteine Bedeutung, da sie definierte Materialien darstellen, die sich universell für Enzyme, inhibitoren. Antigene bzw. Antikörper, für Eiweißstoffe allgemein anwenden lassen.

Die Bindung der Proteine an die Trägermaterialien kann heteropolar oder auch homöopolar erfolgen. Die heteropolar gebundenen Proteine sind weniger von Interesse, da sie in Abhängigkeit von lonenkonzen-Iration und pH-Wert wieder ablösbar sind.

Folgende Versuche, Proteine durch reaktive Gruppen an unlösliche Träger zu fixieren, sind bekannt:

1. Umsetzung von Cellulose mit p-Nitrobcnzylchlorid zu dem entsprechenden Cellulose-Derivat, das zur Aminovcrbindung reduziert und diazoticrt, mit Proteinen gekuppelt werden konnte.

2. Die reaktive Gruppe nach 1) wurde durcl m-Aminobenzyloxymethyl ersetzt. Später wurdei Versuche mit

3. Polyamino-polystyroi — einem vollsynthetischei Träger — unternommen.

4. dJ-p-Aminophenylalanin, d,l-Leucin u. a. Amino säuren wurden zu einem synthetischen Trägei polykondensiert, dessen diazotierte Amino· Gruppen mit Proteinen zu kuppeln vermögen

5. Nach den Methoden der Peptidchemie wurd* Carboxymethylcellulose mit Proteinen unc di-Cyclohexyl-carbodiimid als Kondensationsmittel umgesetzt.

6. Aus Carboxymethylcellulose wurde über dai Hydrazid das Azid hergestellt, das mit Proteiner zu reagieren vermag.

7. Mit Bromacetylcellu!ose werden Proteine gui gebunden.

8. Aus Isothiocyanat-Derivaten des Dextrangels »Sephadex« und der Cellulose wurden mil Proteinen wasserunlösliche Enzym-Verbindungen hergestellt.

9. Unter den Bedingungen der Acrylamid-Polymerisation lassen sich Proteine in gut quellbarem Material fixieren. Das Enzym wird dabei radikalisch an die Ketten gebunden.

10. Weiter wurden Proteine an Äthylenmaleinsäureanhydrid (EMA) und

11 Styrol-Maleinsäureanhydrid-copolymere gebunden.

Die bisher bekannten Methoden sind nicht befriedigend und nicht allgemein für Proteine anwendbar. So werden weniger als 50",, Protein bei Methode 1, 2 und 4 gebunden, ein Großteil des Proteins verliert unter diesen Bedingungen die biologische Aktivität. Methode 3 erwies sich als noch ungünstiger.

Methode 5 läßt sich nur in nichtwäßrigem Medium ausführen und darum nur zum Teil für Antikörperprobleme und niedermolekulare Inhibitoren anwenden. Nach Methode 6 werden nur etwa 10% des eingesetzten Proteins gebunden, wovon nur 10 bis 43% enzymatische Aktivität behalten.

Die Methode 7 ergibt eine hohe Ausbeute an gebundenem Protein (80 bis 90%); für viele Proteine bedeuten diese Reaktionsbedingungen aber einen Verlust der biologischen Aktivität.

Mit Methode 8 werden nur ganz wenige Prozent des eingesetzten Proteins aktiv an Gel gebunden.

Nach Methode 9 werden nur 18 bis 20% des eingesetzten Proteins gebunden, wovon nur wenige Prozent Aktivität gegenüber Substraten entwickeln können.

Höhermolek'ilare Substrate (Hämoglobin) werden nur zu 1 bis 2"„ umgesetzt.

Derzeit ergibt Methode 10 die befriedigsten Ergebnisse. Sie findet für Antigene, Inhibitoren und Enzyme Anwendung. Die Bindungsreaklion erfolgt schonend in wäßrigem Milieu; etwa 50 bis 60% des Proteins lassen sich unter optimalen Bedingungen fixieren.

Jedoch ist das verwendete Ausgangsmalcrial sehr uneinheitlich, es hat niedermolekulare (z. T. lösliche) und höhermolekulare (unlösliche) Fraktionen, die sich weder sieben noch auf anderen Weise trennen lassen. Daher werden nur bis zu 60".'. Prolein an den

unlöslichen Träger gebunden, der Rest geht als lös- B. einem biologisch aktiven Protein durch Mischen jiches Material verloren. Aber auch das gebundene entweder in wäßriger Lösung und anschließender Protein befriedigt noch nicht. Elution mit Salzlösung oder in wäßriger Salzin der Bindung des Proteins an den Träger (EMA) lösung. hat das Protein Comonomer-Funktion; es kann nicht 5

nur an einer Stelle, sondern an mehreren (d. h. ver- Vorzugsweise liegt die einpolymerisierte Dicarbonneizt) gebunden werden. In Abhängigkeit von der säure als Anhydrid vor. Der Bestandteild), d.h. PfOteinkonzentration werden mehr oder weniger gut Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid oder/und AthylendiqueJlbare Protein-auf-Träger-Substanzen erhalten. Das acrylat, macht vorzugsweise nicht mehr als 0,45 Teile Protein liegt dabei in einem Netzwerk covalent ge- ίο im oben angegebenen Gewichtsverhältnis aus. bunden vor, so daß die Diffusion bei diesem Material Acrylamid, Ν,Ν'-Methyl-bis-acrylamid oder/und eine wesentliche Rolle spielt und es nur teilweise für Äthylendiacrylat sowie Maleinsäure bzw. Äthylen-Substrate zugänglich ist. Auch durch Zugabe von maleinsäure oderdie entsprechenden Anhydride werden Vernetzern (Hexamethylendiamin u. a.) wird dieser in Gegenwart von Radikalbildnern und Radikalbe-Nachteil nicht aufgehoben. Von dem gebundenen 15 schleunigem in den oben angegebenen Verhältnissen Protein sind daher nur noch etwa 50°,, für nieder- nach an sich bekannten Methoden polymerisiert. An molekulare Substrate erreichbar, so daß die Gesamt- sich ist es möglich, Maleinsäure- bzw. Malemsaureanaktivität nicht mehr als 30 % beträgt. Gegenüber hoch- hydridgruppen in breiten Konzentrationsbereichen einmolekularen Substraten sind nur 10% und weniger zupolymerisieren. Im Hinblick auf dieder Erfindung zugefunden worden. 20 gründe liegende Aufgabenstellung erwies sich jedoch Ein zusätzlicher Nachteil dieses Materials liegt darin, die oben näher gekennzeichnete Zusammensetzung als daß es von Protein zu Protein verschieden, auch in Bedingung für die Erzielung eines Mischpolymerisats, Abhängigkeit von der Proteinkonzentration, z. B. welches als Trägersubstanz die gewünschten gunstigen flockig, schwer filtrierbar anfällt und nicht ohne Eigenschaften aufweist. . weiteres in Säulen gepackt werden kann. a₅ Bei der Herstellung läßt sich das Mengenverhältnis Styrol-Maleinsäureanhydrid-Polymere gemäß Me- von Acrylamid zu Maleinsäure b/w. Aihylenmaiein-Ihodell lassen sich zur Entfernung von Proteinen, säure oder den entsprechenden Anhydriden in verz B. Reinigung des Trinkwassers u.a., zur Anwendung hältnismäßig weiten Bereichen variieren, ohne aau bringen Diese Träger haben ähnlich dem Polyamino- hierdurch die erforderliche Vernetzermenge wesenuicn polystyrol ausgesprochen lypophilen Charakter. Pro- 30 beeinflußt wird. So läßt sich Acrylamid mit Maleinsäure teine können nicht ohne Verlust ihrer Struktur ge- bzw. ihrem Anhydrid im GewichtsvernaUnis von bunden werden, auch könnten sie mit Proteinen bela- 3:0.1 bis 4 verwenden, ohne daß hierdurcn aas den nicht lyophilisiert werden. Verhältnis von Acrylamid m Vernetzer wesentlich Die nicht durch Protein verknüpften funktionalen beeinflußt ist. Bei der Verwendung von Atnyien-Gruppen der bekannten Trägersubstanzen tragen als 35 maleinsäure bzw ihrem Anhydrid als Comonomer NH₂- (Methode 1, 2, 3, 4) bzw. als CO₂-Gruppen sind die Grenzen hingegen enger gezogen Hier (Methode 6, 8, 10) in entsprechenden pH-Bereichen regelt der Vernetzergehali Porengroße und Festigkeit, positive bzw. negative Ladungen. Bei Methode 10 aber auch die Bindung der Athylenmalemsaure im entstehen CO₂-Gruppen zusätzlich bei der Protein- Gel. . , , bindung des cyclischen Anhydrids. Dieser polyvalente 40 Für die Fixierung von Proteinen ergaben sicn oe-Charakter der Proteinträger verursacht Adsorption sonders gute Ergebnisse bei Verwendung von Acryider Matrix, ähnlich den Ionenaustauschern, erhöhte amid und Maleinsäure bzw. Athylenmaleinsaure oaer Inaktivierung bzw. Denaturierung der Proteinstruktur den entsprechenden Anhydriden im ^üevvlcntsv"^na11"'^ und Verschiebung der pH-Optima bei gebundenen 3:0,5 bis 1,0. Be. Erhöhung der ^Kon7entratI°" °" _En7ymen 45 D.earbonsäure bis 1,5 wird das Mischpolymerisat Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines wasser- zwar spröder und weniger quellbar, ieigt jedoch immer unlöslichen, trägergebundenen Proteins, das die oben noch gute Eigenschaften als Trager, «ei' «"^enJ, *«- geschilderten Nachteile nicht oder nur vermindert hältnis von Acrylamid zu Vernetzer, d. n. rs in -. aufweist thylen-bis-acrylamid bzw. Äthylendiacrylat, von Durch die Erfindung werden die anstehenden Pro- 5° 3:0,075 bis 0,450 werden gelartige Polymerisate mit bleme gelöst. Gegenstand der Erfindung ist ein besonders bevorzugten Eigenschaften erhalleatin wasserunlösliches, trägergebundenes Protein, das da- Verhältnis von 3 : 0.075 stellt die ^^ε\°™Α™" durch gekennzeichnet ist, daß es hergestellt worden tration dar, bei der die Maleinsäure bzw^ wnyra _{ist aus} maleinsäure noch befriedigend eingeschlossen wiro

55 Für die Fixierung von Proleinen in wäßrigem

A. einem Mischpolymerisat, bestehend aus Milieu erwiesen sich auch Vernetzerkonzentrationen

a) Acrylamid, entsprechend einem Verhältnis von Acrylamid zu

b) Äthylenmaleinsäure bzw. deren Anhydrid Vernetzer von mehr als 3:045, z. H. i. υ,ο on.. , und/oder noch als gut geeignet. Bei Arbeiten mit_hohere,SWz-

c) Maleinsäure sowie 60 konzenlrationen, d.h. mehr als 0 05 M er».en

d) Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamkl oder Äthylen- sich jedoch die hierbe. erhaltenen relativ eng vernetzten diacrylat im Gewichtsverhältnis a:b:c:d Gele für die Proteinsiruktur als nachteilig.

von 3-0-5 bis 1,5:0,05 bis 4:0,075 bis 0,9, Die Herstellung der Mischpolymerisate laßt s.ch

wobei die Summe von b) und c) höchstens beispielsweise in wäßriger Lösung, ^vorzuf^sw^^{e in} 4 Verhällnisanteile beträgt, das durch Er- 65 inerter Amtosphäre, durchfuhren ^Be|fP^ie« *"^r .¹^ wärmen im Vakuum auf 80 bis 120" C oder eignete Radikalbildner bzw. Rad.kalbeschleun^r sind bei Atmosphärendruck auf 160 bis 220'C Propionsäurenitril und Ammon.umperoxyd.su fat Die cyclisiert wurde, und Polymerisation kann bei Zimmertemperatur, aber

auch bei höheren Temperaturen bis zu 100 C oder bei Solvolyse der cyclischen Anhydridgnippen erfolgt, niedrigerer Temperatur durchgeführt werden. Die Die Proteinstruktur bleibt nach erfolgter B ndung des Polymerisationsdauer ist von der gewählten Poly- Proteins erhalten, wobei Aictiv.tatsausbeuten bis zu merisationstemperatur, den gewählten Beschleunigern 100"„ (und sogar darüber durch Steigerung der bzw. Katalysatoren und der mengenmäßigen Zu- 5 Aktivität) gewonnen werden Das nicht gebundene

sammensetzung des Ansatzes abhängig. Sie liegt Protein läßt sich ohne Aktivitatsverlust zuruck-

gewöhnlich zwischen etwa 5 Minuten und mehreren gewinnen. Bei der Bindung übernimmt das Protein nicht

Stunden eine Vernetzerfunktion in der Matrix, sondern die

Nach dem Erstarren wird der polynierisie rte Ansatz erhaltenen, als »Enzymgele« za bezeichnenden trägerzur Erzielung einer für die Handhabung besonders io gebundenen Enzyme sind vollkommen einheitlich und günstigen Körnung durch ein Sieb der gewünschten weisen nicht in Abhängigkeit von der Proteinkonzen-Maschenweite gedrückt, mit Wasser gewaschen und tration unterschiedliche Festigkeit aui.
lyophilisiert. Durch die gezielte Vernetzung können die Mole-Für die Fixierung des Proteins ist es notwendig, kularsiebeigenschaften des Mischpolymerisats so eindaß die Dicarbonsäure in Form des Anhydrids 15 gestellt werden, daß Proteine nur in gewünschte vorliegt. Es müssen daher vor der Proteinverknüpfung Bereiche gelangen können. So ist es möglich, das sämtliche iSauregruppen wieder in das cyclische An- Mischpolymerisat für bestimmte Proteine so zu hydrid überfüuit werden. Dies erfolgt beispielsweise vernetzen, daß die Proteinbindung nur an der Oberdurch Erhitzen des lyophilisierten Mischpolymerisats fläche des Gelpartikeis erfolgen kann, wahlweise aber im Vakuum auf eine Temperatur von 80 bis 120°C 20 auch im gesamten Gel. Die PoJymensationsparameler oder unter Atmosphärendruck bei einer Temperatur lassen sich je nach dem wirksamen Molekülradius, von 160 bis 220, vorzugsweise 180 bis 200 C. sterischen Effekten und Ladungsverteilung variieren

Die Mischpolymerisate sind in Abhängigkeit von Die Mischpolymerisate besitzen Adsorptionseigender Vernetzerkonzentration wasserklare bis milchig- schäften, so daß in Wasser oder schwachen Puffertrübe Substanzen mit gummiartiger bis spröder as lösungen (bis etwa 0,01 M) das Eiweiß 100°/_oig am Konsistenz. Träger fixiert wird. Bis zu 85% des Eiweißes werden

Die Mischpolymerisate lassen sich leicht körnen, hierbei kovalent, der Rest heteropolar gebunden. Bei beispielsweise indem man sie durch ein Metallsieb Verwendung der Mischpolymerisate ohne vorherige drückt. Als günstig für die Zwecke der Proteinver- Cyclisierung der Säuregruppen erfolgt die Eiweißknüpfung erwiesen sich hierbei Korngrößer* von etwa 30 bindung nur adsorptiv. Es wurde gefunden, daß sich 0,35 bis 0,8 mm. Dieses Granulat quillt bei Zusatz von unter diesen Bedingungen das Protein mit Salz-Wasser nach. Die Stärke der Quellung ist vom Ver- lösungen ohne Aktivitätsverlust vom Träger eluieren netzergehalt abhängig. Je enger die erfindungsgemäßen läßt.

Mischpolymerisate vernetzt sind, desto weniger quell- Die Proteinbindungskapazität des Mischpolymeri-

bar sind sie. 35 sats ist abhängig von der Zahl der vorhandenen

Die Entquellung ist z. B. mit Alkohol oder noch Anhydridgruppen und der Porengröße. Bei einem

einfacher durch Gefriertrocknung möglich. enger vernetzten Produkt ist die Bindungskapazität

In mancher Hinsicht gleichen die Teilchen der geringer als bei einem weniger eng vernetzten Produkt

erfindungsgemäß zu verwendenden Mischpolymerisate bei gleicher Anzahl an vorhandenen Anhydrid-

denen des bekannten Polyacrylamidmolekularsiebes. 40 gruppen, da das Proteinmolekül bei engerer Vernetzung

Bei Behandlung mit Pufferlösungen erfolgt eine nicht alle zur Verfügung stehenden bindungsfähigen

Schrumpfung in Abhängigkeit von der Zahl der vor- Gruppen erreichen kann.

handenen Carboxylgruppen, ähnlich wie bei den Liegen im erfindungsgemäß zu verwendenden Mischionenaustauschern auf Dextran- oder Polyacrylamid- polymerisat zu viele Ladungen vor, die nicht von basis. 45 Protein durch kovalente Bindung besetzt werden

Wenn die Carboxylgruppen durch Erhitzen auf etwa können, so erfolgt im allgemeinen eine Verschiebung 200¹C in das cyclische Anhydrid überführt werden, der pH-Optima bei den gebundenen Enzymen. Enttritt häufig eine leichte Gelbfärbung auf. Wird längere sprechend wurde bei den bekannten trägergebundenen Zeit erhitzt, so veitieft sich die Farbe von gelb bis Enzymen beobachtet, daß es bei negativ geladenen braun, und gleichzeitig nimmt die Bindungskapazität 50 Trägermateralien zu einer Verschiebung um zwei deutlich ab. Eine länger dauernde Erhitzung auf die pH-Einheiten kommt, beispielsweise bei an Äthylenerforderliche Temperatur unter Normaldiuck wird maleinsäureanhydrid gebundenem Trypsin von 7,8 daher tunlichst vermieden. auf 10,0, und bei positiv gelagerten Trägern eine

Die Porosität und die Härte des Mischpolymerisats Verschiebung in den sauren Bereich erfolgt. Bei dem im Zustand eines gequollenen Gels wird in erster 55 Mischpolymerisat ist es möglich, die bindungsfähigen Linie durch den Vernetzergehalt bestimmt. Das Gruppen maximal auszunutzen, so daß sich trägcr-Material weist Molekularsiebeigenschaften auf, ahn- gebundene Proteine erhalten lassen, die keine Verlieh wie bei den Polyacrylamidgelen, wobei die Aus- Schiebung des pH-Wert-Optimums zeigen,
schlußgrenzen beliebig durch den Vernetzergehalt Eine besonders interessante Eigenschaft der erfinfestgelegt werden können. In gequollenem Zustand 60 dungsgemäßen aul Träger gebundenen wasserunläßt sich das Mischpolymerisat leicht filtrieren oder löslichen Proteine besteht darin, daß unter Umständen zentrifugieren und zeigt als Säulenfüllung ideale höhere Michaelis-Konstanten erhalten werden als bei Eigenschaften. In Wasser- oder Pufferlösungen ge- nichtgebundenem Enzym. So wurde beispielsweise quollen und entquollen als Lyophilisat ist das gelartige gefunden, daß die Aktivität von erfindungsgernäß Mischpolymerisat uneingeschränkt haltbar. 65 gebundenem Trypsin gegenüber M-Benzoyl-1-arginin-

Das Mischpolymerisat ermöglicht eine schonende p-nitranilid erhöht wird im Vergleich zu nichtgebun-

Bindung des Proteins, weil es hydrophil und stark denem Enzym,

quellbar ist und die Proteinverknüpfung nur durch Die erfindungsgemäßen trägergebundenen Enzyme

weisen cine Fülle höchst erwünschter Eigenschaften auf und lassen sich für zahlreiche Anwendungsgebiete verwenden. So ermöglichen sie es, Substratumsätze weitaus gezielter als bisher auszuführen, da das Enzym zu jedem gewünschten Zeilpunkt aus dem Inkubationsansatz wieder entfernt werden kann. 1st der Umsatz noch nicht quantitativ, so läßt sich das gleiche Enzym erneut zusetzein. Bei Proteasen kann das zu spaltende Protein bei jeder gewünschten Hydrolyscrate isoliert werden. Die Spaltungsrcaktion läßt sich damit direkt verfolgen. Das enzymatisch aktive Protein muß nicht mehr, wie bisher, nach dem Substratumsatz ausgefällt werden — 'hierdurch wurden oftmals die Substratumsätze verändert —, sondern es läßt sich durch einfaches Filtrieren oder Abdekantieren od. dgl. entfernen.

Substratumsätze lassen sich mit derartigen trägergebundenen enzymatisch aktiven Proteinen auch über Säulen ausführen. In ein käfigarliges Gefäß gepackte erfindungsgemäße Trägerenzyme lassen sich ähnlich wie ein Tee-Ei zu einem Inkubationsansatz geben und jederzeit wieder daraus entfernen.

Mit proteolytisch wirksamen trägergebundenen Enzymen lassen sich auf einfache Weise Inhibitoren isolieren. Die Stabilität der Proteasen wird dabei durch die Bindung an das Trägermaterial wesentlich erhöht.

da die Proteasen keine Autolysereaktion mehr unterliegen.

Mit erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteaseinhibitoren lassen sich Proteasen einfach, schnell und ganz spezifisch isolieren. Mit ihrer Hilfe ist es auch möglich, Proteasen enthaltende Proleinlösungen von den Proteasen zu reinigen und damit zu stabilisieren. Durch crlindungsgemäße auf Träger fixierte Antigene bzw. Antikörper läßt sich eine einfache Isolierung ίο von Antigenen bzw. Antikörpern durchführen. Mit derartigen trägergebundenen Enzymantikörpern kann eine besonders einfache und wirksame Enzymisolierung durchgeführt werden.

Die erfindungsgemäßen gebundenen Proteine lassen sich ganz allgemein wiederholt benutzen und zeigen zum Teil auch bei verlängertem Gebrauch keinerlei Aktivitätsschwund.

Auf Grund der Molcktilarsiebeigenschaften der Mischpolymerisate lassen sich die trägergebundenen Proleine auch zur Substrattrennung einsetzen.

Die Mischpolymerisate sind hinsichtlich ihrer Eignung zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen den bisher bekannten, für gleiche Zwecke verwendeten Trägermaterialien in hohem Ausmaße überlegen, wie die in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßten Ergebnisse zeigen.

Trägermaterial	Einheitlichkeit des Materials	Träger: Protein	Ausbeute geb. Protein in "„	Aktivität1) niedcrmolck. Substrate in o/„	Ausbeute Aktivität von eingesetztem in %
PAAD1) CMC-HYDRAZ1D (ENZYME)2) ... EMA3) erfindungsgemäß ...	einheitlich einheitlich nicht einheitlich einheitlich	20: ι 10: 0,5 bis 1 5:1 beliebig 1:2	15 bis 18 25 bis 30 40 bis 45 bis 80	905) bis 40") 60 bis 707) bis lOO8)	10 bis 13 bis 14 bis 30 bis 80

') Polyacrylamid.

*) Carboxymethylcellulosehydrazid. ¹I Äthylenmaleinsäureanhydnd. ') Trypsin-Aktivität.

Die Überlegenheit der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen, trägergebundenen Proteine liegt nicht nur in ihrer überlegenen Ausbeute und Aktivität, sondern auch in dem weitaus vorteilhafteren zulässigen Verhältnis von Träger zu Protein.

Die erfindungsgemäßen wasserunlöslichen, trägergebunden» Mischpolymerisate können Proteine sehr unterschiedlicher Molekülgröße und Eigenschaften enthalten, da sich die Eigenschaften dieses Trägermaterial* ohne weiteres je nach den Erfordernissen des ta bindenden Proteins einstellen lassen. Wenn z. B da» Protein ein besonders großes Molekül aufweiM, so kann durch Verringerung dts Vernetzungsgrade* in weitern Umfange noch ein Eindringen des Protein* in die Matrix und Bindung in derselben bewirkt werden. Bei Proteinmolekülen, die so groß sind, daß auch durch eine Vernetzung im geringstmöglichen Ausmaß ihr Eindringen in die Matrix wesentlich erschweren wird, ist es auch möglich, eine Fixierung des Pfwrifw lediglich an der Oberfläche der Teilchen voT/unchmcn, wobei in diesem Falle das Mischpolymerisat vorzugsweise so fein gekörnt wird, daß eine sehr große Oberflactie erhalten wird, wobei die dann allein an der Oberfläche stattfindende Fixierung des Proteins zu einem völlig ausreichenden Fixierungsgrad führt.

^s) alle niedermolekularen Aminosäuren-Substrate. '■) Chymoirypsin-Aktivitat. ') am Stickstoff geschützte Aminosäure-Ester. *) N-Bcnzoyl-1 -arginin-p-nitranilid.

Das Verhältnis von homöopolar zu adsorptiv bzw. heteropolar am Träger gebundenen Enzym läßt sich beeinflussen durch die Art der Herstellung der Bindung zwischen Protein und Träger. Wird beispielsweise das Protein vorgelegt in relativ hoher Pufferkonzentration und langsam das nichtgequollene Gel zugegeben, so ist die Ausbeute an homöopolar gebundenem Enzym sehr hoch und praktisch kein adsorptiv gebundenes Enzym nachzuweisen. Wird andererseits mit niedriger Pufferkonzentration gearbeitet and Träger und Enzym rasch zusammengegeben, so ist zwar die Ausbeute an gebundenem Protein höher, von diesem an den Träger gegangenen Protein läßt sich jedoch mit hohen Pufferkonzentrationen wieder ein erheblicher Anteil eluieren, der also nicht homöcpclar gebunden gewesen sein kann. Wird beispielsweise wie oben angegeben mit hoher Pufferkonzentration und langsamer Trägeizugabe gearbeitet, so gehen etwa 80 "„ des vorgelegten Enzyms an den Träger, and es läßt sich dann nichts mehr davon eluieren. Das Enzym ist also annähernd vollständig homöopolar gebunden, und seine Aktivität wird lediglich noch durch die Zugänglichkeit für das Substrat bestimmt. Im zweiten Fall hingegen bei niedriger Pufferkonzentration und rascher Zugabe werden zwar 100°;, des vorgelegten Proteins am Träger absorbiert. Hiervon lassen sich

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aber bis 35% wieder mit hohen Salz- oder Puffer- werden mit Ig Träger in 15ml eiskaltem Wasser,

kon/cntraiionen eluieren, waren also nicht homöopo- pH = 5,2, eingerührt und bei 40"'C 15 Stunden im

lar gebunden. Kühlraum reagieren gelassen. Anschließend wird das

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung Produkt in eine Säule gepackt.

weiter. 5 Das heteropolar gebundene Protein wurde mit

Herstellung des Mischpolymerisats ⁶⁵J¹¹' Waschwasser eluiert Mit 0,2 M Phosphatpuffer,

pH = 7,8, konnte danach kein weiteres Protein mehr

A. 3 g Acrylamid (AAD), 0,3 g Ν,Ν'-Methylen- eluiert werden.

bis-acrylamid (bis-AAD) werden mit Ig Äthylen- Heteropolar gebundes Protein 31. %

maleinsäureanhydrid (EMA) in 23 ml 0,05 M Phos- io bei pH 7 0 8 5 10 20'"

phatpuffcr pH 7,6 suspendiert und unter starkem Rot-Aktivität,' bezoccn ' auf' nichtge-

Rühren in Stickstoffalmosphäre bei Raumtemperatur bundes Trypsin " 50°'

mit je 1 ml 5^th/_oigem Propionsäurcnilril und 5°/_oigem '"

Ammoniumperoxydisulfat versetzt. Nach 10 bis . .

15 Minuten erstarrt die Masse zu einem gelartigen 15 Beispiel ^

Block. Dieser wird 60 Minuten bei Raumtemperatur Als Träger wird das Produkt von E. verwendet.

stehengelassen und dann durch ein Metallsieb mit Der Träger wird wie in A. beschrieben mit 100 mg

einer lichten Maschenweile von 0,5 mm gedrückt. Trypsin reagieren gelassen.

Das erhaltene Granulat wird mit etwa 5 1 destilliertem Nichtgebundenes Protein 30°/

Wasser gewaschen. Das Naßgewicht beträgt nun 20 Aktivität des gebundenen Proteins'"'

38,2 g. „»«■,, · ., ^vor Behandlung mit 0,2 M Puffer 100 %

Das so erhaltene gequollene Mischpolymerisat w.rd _{nach Behandlung mit 0 2 M} p_{uffer 5()}o

zum Entquellen gefriergetrocknet. In getrocknetem

Zustand beträgt das Gewicht (Ausbeute) 5,4 g.

Zur Cyclisierung zum Säureanhydrid wird anschlie- 25 ^p

ßend 1,5 bis 2 Stunden bei 200 C im Trockenschrank Es wird der gleiche Träger wie in Beispiel 1 ver-

_erhjt/t. wendet. 100 mg Träger und 200 mg Trypsin werden

B. 3 g Acrylamid, 0.075 g Äthylendiacrylat und wie in A. beschrieben reagieren gelassen.

I g Maleinsäure werden wie in A. beschrieben misch- Nichtgebundenes Protein . 50°

polymerisiert. Die Polymerisalionsdauer beträgt 30 Aktivität des gebundenen Proteins

15 Stunden. . vor Behandlung mit 0,2 M Puffer 100°„

Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in A. _nach Behandlung mit 0,2 M Puffer 48"' beschrieben. Die Ausbeute an Lyophihsat beträgt

2,3 g. Nach der Cyclisierung beträgt das Gewicht des B e i s η i e 1 4

Produktes 2.05 g. 35 ^F

C. 3 c Acrylamid, 0,3 g Ν,Ν'-Methylen-bis-Acryl- Es wird das Produkt von C. als Träger verwendet, amid und 1 g Maleinsäure"werden wie in A. beschrie- 100 mg Rinderserumalbumin werden mit 1 g Träger ben mischpoivmerisiert. Die Polymcrisationsdauer wie in A. beschrieben reagieren gelassen.

beträgt 15 Stunden. Die Weiterverarbeitung erfolgt Nichtgebundenes Protein 32%

ebenfalls wie in A. beschrieben. Die Ausbeute an 40 ^fa '«

Lyophilisat betraut 2,67 g. Nach Cyclisierung beträgt Weder mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH = 7,8, noch

das Gewicht des Produktes 2.45 g. mit 0,2 M Glycinpuffer, pH - 1,8, kann Protein vom

D. Wie in A. beschrieben werden 3 g Acrylamid, Träger eluiert werden. Die Ausbeute an homöopolar 0,6" N.N'-Methylen-bis-acrylamid und Ig Malein- gebundenem Protein beträgt 68%, bezogen auf eingesäure m'ischpolymerisiert. Die Polymerisalionsdauer 45 setztes Protein, und 100%, bezogen auf gebundenes beträgt 5 Standen. Die Weiterverarbeitung erfolgt Protein.

ebenfalls wie in A. beschrieben. Die Ausbeute an Bei Verwendung von Humanscrumalburnin an

Lyophilisat beträgt 2,8 e. Nach der Cyclisierung werden Stelle von Rinderserumalbumin wird das gleiche

2,6 g Endprodukt erhalten. Ergebnis erhalten.

fc. Wie in A. beschrieben werden 3 g Acrylamid, 5°

0,3 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 0,1 g Malein- Beispiel 5 säure 5 Stunden mischpolymerisiert. Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in A. beschrieben. Es wird das Produkt von C. als Träger verwendet. Das Naßgewicht des gequollenen Produktes beträgt 1 g Träger wird portionsweise innerhalb von 60 Mi-53 5 g Nach der Lyophilisierung wird ein Trocken- 55 nuten zu 200 mg Trypsin gelöst in 18 ml Phosphatgewicht von 4,8 g erhalten. Die Cyclisierung führt zu puffer (0,1 M. pH - 7.8) gegeben und 18 Stunden bei einem Endprodukt in einer Ausbeute von 3.1g. 4 C reagieren gelassen.

Nichtgebundenes Protein 50%

B e i s ρ i e 1 1 Aktivität des gebundenen Proteins,

Herstellung <lcs trägergebundenen Proteins ° bezogen auf eingesetzte Aktivität ... 40",;

Es wird ein cyclisicrles Mischpolymerisst aus 3 g Mit 0,2, 0,33 bzw. 0,5 M Phosphatpuffer kann kein

Acrylamid, 0.15 g N^N'-Methylen-bis-acrylamid und Protein und keine Aktivität vom Träger eluiert

1 g Maleinsäure als Träger verwendet. 100 mg Trypsin werden.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Wasserunlösliches, trägergebundenes Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es hergestellt worden ist aus

   A. einem Mischpolymeiisat, bestehend aus

   a) Acrylamid,

   b) Äthylenmaleinsäure bzw, deren Anhydrid und/oder.

   c) Maleinsäure sowie

   d) N.N'-Methylen-bis-acrylamid oder Äthy-Itendiacrylat im Gewichtsverhältnis a:b:c:d von 3:0,5 bis 1,5:0,05 bis 4:0,075 bis 0,9, wobei die Summe von b) und c) höchstens 4 Verhältnisanteile beträgt, das durch Erwärmen im Vakuum auf 80 bis 120⁰C oder Atmosphärendruck auf 160 bis 220⁰C cyclisiert wurde, und

   B. einem biologisch aktiven Protein durch Mischen entweder in wäßriger Lösung und anschließender Elution mit Salzlösung oder in wäßriger Salzlösung.