DE1935711C3 - Wasserunlösliches Protein. Ausscheidung aus: 1908290 - Google Patents
Wasserunlösliches Protein. Ausscheidung aus: 1908290Info
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Description
Die Erfindung betrifft ein wasserunlösliches, trägergebundenes Protein.
Grundsätzlich muß zwischen unlöslichen Proteinen und gebundenen unlöslichen Proteinen unterschieden
werden.
Es ist bekannt, daß unlösliche Proteine durch Kondensations-, Kupplungs- und Polymerisationsreaktionen mit dem Protein selbst entstehen können.
Die auf diese Weise erhaltenen Proteine sind Produkte unkontrollierbarer Reaktion; es lassen sich keine
definierten Produkte erhalten. Ein großer Teil des Proteins wird durch die harten Reaktionsbedingungen
der Polymerisation, der Kupplung mit bis-Diazo-Verbindungen und durch die für die Kondensation
eingesetzten Komponenten, wie Formaldehyd, Chlor-Ameisensäureäthylesler
u. a., denaturiert und dadurch biologisch inaktiviert. Er geht für die hauptsächlichen
Anwendungsbereiche unlöslicher Proteine verloren.
Als unlösliche, biologisch aktive Proteine haben allein die an Trägermaterialien fixierten Proteine
Bedeutung, da sie definierte Materialien darstellen, die sich universell für Enzyme, inhibitoren. Antigene
bzw. Antikörper, für Eiweißstoffe allgemein anwenden lassen.
Die Bindung der Proteine an die Trägermaterialien kann heteropolar oder auch homöopolar erfolgen.
Die heteropolar gebundenen Proteine sind weniger von Interesse, da sie in Abhängigkeit von lonenkonzen-Iration
und pH-Wert wieder ablösbar sind.
Folgende Versuche, Proteine durch reaktive Gruppen an unlösliche Träger zu fixieren, sind bekannt:
1. Umsetzung von Cellulose mit p-Nitrobcnzylchlorid
zu dem entsprechenden Cellulose-Derivat, das zur Aminovcrbindung reduziert und
diazoticrt, mit Proteinen gekuppelt werden konnte.
2. Die reaktive Gruppe nach 1) wurde durcl m-Aminobenzyloxymethyl ersetzt. Später wurdei
Versuche mit
3. Polyamino-polystyroi — einem vollsynthetischei
Träger — unternommen.
4. dJ-p-Aminophenylalanin, d,l-Leucin u. a. Amino
säuren wurden zu einem synthetischen Trägei polykondensiert, dessen diazotierte Amino·
Gruppen mit Proteinen zu kuppeln vermögen
5. Nach den Methoden der Peptidchemie wurd* Carboxymethylcellulose mit Proteinen unc
di-Cyclohexyl-carbodiimid als Kondensationsmittel umgesetzt.
6. Aus Carboxymethylcellulose wurde über dai
Hydrazid das Azid hergestellt, das mit Proteiner zu reagieren vermag.
7. Mit Bromacetylcellu!ose werden Proteine gui
gebunden.
8. Aus Isothiocyanat-Derivaten des Dextrangels
»Sephadex« und der Cellulose wurden mil Proteinen wasserunlösliche Enzym-Verbindungen
hergestellt.
9. Unter den Bedingungen der Acrylamid-Polymerisation
lassen sich Proteine in gut quellbarem Material fixieren. Das Enzym wird dabei radikalisch an die Ketten gebunden.
10. Weiter wurden Proteine an Äthylenmaleinsäureanhydrid (EMA) und
11 Styrol-Maleinsäureanhydrid-copolymere gebunden.
Die bisher bekannten Methoden sind nicht befriedigend
und nicht allgemein für Proteine anwendbar. So werden weniger als 50",, Protein bei Methode 1, 2
und 4 gebunden, ein Großteil des Proteins verliert unter diesen Bedingungen die biologische Aktivität.
Methode 3 erwies sich als noch ungünstiger.
Methode 5 läßt sich nur in nichtwäßrigem Medium ausführen und darum nur zum Teil für Antikörperprobleme
und niedermolekulare Inhibitoren anwenden. Nach Methode 6 werden nur etwa 10% des eingesetzten
Proteins gebunden, wovon nur 10 bis 43% enzymatische Aktivität behalten.
Die Methode 7 ergibt eine hohe Ausbeute an gebundenem Protein (80 bis 90%); für viele Proteine
bedeuten diese Reaktionsbedingungen aber einen Verlust der biologischen Aktivität.
Mit Methode 8 werden nur ganz wenige Prozent des eingesetzten Proteins aktiv an Gel gebunden.
Nach Methode 9 werden nur 18 bis 20% des eingesetzten
Proteins gebunden, wovon nur wenige Prozent Aktivität gegenüber Substraten entwickeln können.
Höhermolek'ilare Substrate (Hämoglobin) werden nur
zu 1 bis 2"„ umgesetzt.
Derzeit ergibt Methode 10 die befriedigsten Ergebnisse. Sie findet für Antigene, Inhibitoren und Enzyme
Anwendung. Die Bindungsreaklion erfolgt schonend in wäßrigem Milieu; etwa 50 bis 60% des Proteins
lassen sich unter optimalen Bedingungen fixieren.
Jedoch ist das verwendete Ausgangsmalcrial sehr uneinheitlich, es hat niedermolekulare (z. T. lösliche)
und höhermolekulare (unlösliche) Fraktionen, die sich weder sieben noch auf anderen Weise trennen
lassen. Daher werden nur bis zu 60".'. Prolein an den
unlöslichen Träger gebunden, der Rest geht als lös- B. einem biologisch aktiven Protein durch Mischen
jiches Material verloren. Aber auch das gebundene entweder in wäßriger Lösung und anschließender
Protein befriedigt noch nicht. Elution mit Salzlösung oder in wäßriger Salzin der Bindung des Proteins an den Träger (EMA) lösung.
hat das Protein Comonomer-Funktion; es kann nicht 5
nur an einer Stelle, sondern an mehreren (d. h. ver- Vorzugsweise liegt die einpolymerisierte Dicarbonneizt)
gebunden werden. In Abhängigkeit von der säure als Anhydrid vor. Der Bestandteild), d.h.
PfOteinkonzentration werden mehr oder weniger gut Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid oder/und AthylendiqueJlbare
Protein-auf-Träger-Substanzen erhalten. Das acrylat, macht vorzugsweise nicht mehr als 0,45 Teile
Protein liegt dabei in einem Netzwerk covalent ge- ίο im oben angegebenen Gewichtsverhältnis aus.
bunden vor, so daß die Diffusion bei diesem Material Acrylamid, Ν,Ν'-Methyl-bis-acrylamid oder/und
eine wesentliche Rolle spielt und es nur teilweise für Äthylendiacrylat sowie Maleinsäure bzw. Äthylen-Substrate
zugänglich ist. Auch durch Zugabe von maleinsäure oderdie entsprechenden Anhydride werden
Vernetzern (Hexamethylendiamin u. a.) wird dieser in Gegenwart von Radikalbildnern und Radikalbe-Nachteil
nicht aufgehoben. Von dem gebundenen 15 schleunigem in den oben angegebenen Verhältnissen
Protein sind daher nur noch etwa 50°,, für nieder- nach an sich bekannten Methoden polymerisiert. An
molekulare Substrate erreichbar, so daß die Gesamt- sich ist es möglich, Maleinsäure- bzw. Malemsaureanaktivität
nicht mehr als 30 % beträgt. Gegenüber hoch- hydridgruppen in breiten Konzentrationsbereichen einmolekularen
Substraten sind nur 10% und weniger zupolymerisieren. Im Hinblick auf dieder Erfindung zugefunden
worden. 20 gründe liegende Aufgabenstellung erwies sich jedoch
Ein zusätzlicher Nachteil dieses Materials liegt darin, die oben näher gekennzeichnete Zusammensetzung als
daß es von Protein zu Protein verschieden, auch in Bedingung für die Erzielung eines Mischpolymerisats,
Abhängigkeit von der Proteinkonzentration, z. B. welches als Trägersubstanz die gewünschten gunstigen
flockig, schwer filtrierbar anfällt und nicht ohne Eigenschaften aufweist. . weiteres in Säulen gepackt werden kann. a5 Bei der Herstellung läßt sich das Mengenverhältnis
Styrol-Maleinsäureanhydrid-Polymere gemäß Me- von Acrylamid zu Maleinsäure b/w. Aihylenmaiein-Ihodell
lassen sich zur Entfernung von Proteinen, säure oder den entsprechenden Anhydriden in verz
B. Reinigung des Trinkwassers u.a., zur Anwendung hältnismäßig weiten Bereichen variieren, ohne aau
bringen Diese Träger haben ähnlich dem Polyamino- hierdurch die erforderliche Vernetzermenge wesenuicn
polystyrol ausgesprochen lypophilen Charakter. Pro- 30 beeinflußt wird. So läßt sich Acrylamid mit Maleinsäure
teine können nicht ohne Verlust ihrer Struktur ge- bzw. ihrem Anhydrid im GewichtsvernaUnis von
bunden werden, auch könnten sie mit Proteinen bela- 3:0.1 bis 4 verwenden, ohne daß hierdurcn aas
den nicht lyophilisiert werden. Verhältnis von Acrylamid m Vernetzer wesentlich
Die nicht durch Protein verknüpften funktionalen beeinflußt ist. Bei der Verwendung von Atnyien-Gruppen
der bekannten Trägersubstanzen tragen als 35 maleinsäure bzw ihrem Anhydrid als Comonomer
NH2- (Methode 1, 2, 3, 4) bzw. als CO2-Gruppen sind die Grenzen hingegen enger gezogen Hier
(Methode 6, 8, 10) in entsprechenden pH-Bereichen regelt der Vernetzergehali Porengroße und Festigkeit,
positive bzw. negative Ladungen. Bei Methode 10 aber auch die Bindung der Athylenmalemsaure im
entstehen CO2-Gruppen zusätzlich bei der Protein- Gel. . , ,
bindung des cyclischen Anhydrids. Dieser polyvalente 40 Für die Fixierung von Proteinen ergaben sicn oe-Charakter
der Proteinträger verursacht Adsorption sonders gute Ergebnisse bei Verwendung von Acryider
Matrix, ähnlich den Ionenaustauschern, erhöhte amid und Maleinsäure bzw. Athylenmaleinsaure oaer
Inaktivierung bzw. Denaturierung der Proteinstruktur den entsprechenden Anhydriden im üevvlcntsv"na11"'^
und Verschiebung der pH-Optima bei gebundenen 3:0,5 bis 1,0. Be. Erhöhung der Kon7entratI°" °"
En7ymen 45 D.earbonsäure bis 1,5 wird das Mischpolymerisat
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines wasser- zwar spröder und weniger quellbar, ieigt jedoch immer
unlöslichen, trägergebundenen Proteins, das die oben noch gute Eigenschaften als Trager, «ei' «"enJ, *«-
geschilderten Nachteile nicht oder nur vermindert hältnis von Acrylamid zu Vernetzer, d. n. rs in -.
aufweist thylen-bis-acrylamid bzw. Äthylendiacrylat, von
Durch die Erfindung werden die anstehenden Pro- 5° 3:0,075 bis 0,450 werden gelartige Polymerisate mit
bleme gelöst. Gegenstand der Erfindung ist ein besonders bevorzugten Eigenschaften erhalleatin
wasserunlösliches, trägergebundenes Protein, das da- Verhältnis von 3 : 0.075 stellt die ^ε\°™Α™"
durch gekennzeichnet ist, daß es hergestellt worden tration dar, bei der die Maleinsäure bzw^ wnyra
ist aus maleinsäure noch befriedigend eingeschlossen wiro
55 Für die Fixierung von Proleinen in wäßrigem
A. einem Mischpolymerisat, bestehend aus Milieu erwiesen sich auch Vernetzerkonzentrationen
a) Acrylamid, entsprechend einem Verhältnis von Acrylamid zu
b) Äthylenmaleinsäure bzw. deren Anhydrid Vernetzer von mehr als 3:045, z. H. i. υ,ο on.. ,
und/oder noch als gut geeignet. Bei Arbeiten mit_hohere,SWz-
c) Maleinsäure sowie 60 konzenlrationen, d.h. mehr als 0 05 M er».en
d) Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamkl oder Äthylen- sich jedoch die hierbe. erhaltenen relativ eng vernetzten
diacrylat im Gewichtsverhältnis a:b:c:d Gele für die Proteinsiruktur als nachteilig.
von 3-0-5 bis 1,5:0,05 bis 4:0,075 bis 0,9, Die Herstellung der Mischpolymerisate laßt s.ch
wobei die Summe von b) und c) höchstens beispielsweise in wäßriger Lösung, vorzufsw^e in
4 Verhällnisanteile beträgt, das durch Er- 65 inerter Amtosphäre, durchfuhren Be|fPie« *"r .1^
wärmen im Vakuum auf 80 bis 120" C oder eignete Radikalbildner bzw. Rad.kalbeschleun^r sind
bei Atmosphärendruck auf 160 bis 220'C Propionsäurenitril und Ammon.umperoxyd.su fat Die
cyclisiert wurde, und Polymerisation kann bei Zimmertemperatur, aber
auch bei höheren Temperaturen bis zu 100 C oder bei Solvolyse der cyclischen Anhydridgnippen erfolgt,
niedrigerer Temperatur durchgeführt werden. Die Die Proteinstruktur bleibt nach erfolgter B ndung des
Polymerisationsdauer ist von der gewählten Poly- Proteins erhalten, wobei Aictiv.tatsausbeuten bis zu
merisationstemperatur, den gewählten Beschleunigern 100"„ (und sogar darüber durch Steigerung der
bzw. Katalysatoren und der mengenmäßigen Zu- 5 Aktivität) gewonnen werden Das nicht gebundene
sammensetzung des Ansatzes abhängig. Sie liegt Protein läßt sich ohne Aktivitatsverlust zuruck-
gewöhnlich zwischen etwa 5 Minuten und mehreren gewinnen. Bei der Bindung übernimmt das Protein nicht
Stunden eine Vernetzerfunktion in der Matrix, sondern die
Nach dem Erstarren wird der polynierisie rte Ansatz erhaltenen, als »Enzymgele« za bezeichnenden trägerzur
Erzielung einer für die Handhabung besonders io gebundenen Enzyme sind vollkommen einheitlich und
günstigen Körnung durch ein Sieb der gewünschten weisen nicht in Abhängigkeit von der Proteinkonzen-Maschenweite
gedrückt, mit Wasser gewaschen und tration unterschiedliche Festigkeit aui.
lyophilisiert. Durch die gezielte Vernetzung können die Mole-Für die Fixierung des Proteins ist es notwendig, kularsiebeigenschaften des Mischpolymerisats so eindaß die Dicarbonsäure in Form des Anhydrids 15 gestellt werden, daß Proteine nur in gewünschte vorliegt. Es müssen daher vor der Proteinverknüpfung Bereiche gelangen können. So ist es möglich, das sämtliche iSauregruppen wieder in das cyclische An- Mischpolymerisat für bestimmte Proteine so zu hydrid überfüuit werden. Dies erfolgt beispielsweise vernetzen, daß die Proteinbindung nur an der Oberdurch Erhitzen des lyophilisierten Mischpolymerisats fläche des Gelpartikeis erfolgen kann, wahlweise aber im Vakuum auf eine Temperatur von 80 bis 120°C 20 auch im gesamten Gel. Die PoJymensationsparameler oder unter Atmosphärendruck bei einer Temperatur lassen sich je nach dem wirksamen Molekülradius, von 160 bis 220, vorzugsweise 180 bis 200 C. sterischen Effekten und Ladungsverteilung variieren
lyophilisiert. Durch die gezielte Vernetzung können die Mole-Für die Fixierung des Proteins ist es notwendig, kularsiebeigenschaften des Mischpolymerisats so eindaß die Dicarbonsäure in Form des Anhydrids 15 gestellt werden, daß Proteine nur in gewünschte vorliegt. Es müssen daher vor der Proteinverknüpfung Bereiche gelangen können. So ist es möglich, das sämtliche iSauregruppen wieder in das cyclische An- Mischpolymerisat für bestimmte Proteine so zu hydrid überfüuit werden. Dies erfolgt beispielsweise vernetzen, daß die Proteinbindung nur an der Oberdurch Erhitzen des lyophilisierten Mischpolymerisats fläche des Gelpartikeis erfolgen kann, wahlweise aber im Vakuum auf eine Temperatur von 80 bis 120°C 20 auch im gesamten Gel. Die PoJymensationsparameler oder unter Atmosphärendruck bei einer Temperatur lassen sich je nach dem wirksamen Molekülradius, von 160 bis 220, vorzugsweise 180 bis 200 C. sterischen Effekten und Ladungsverteilung variieren
Die Mischpolymerisate sind in Abhängigkeit von Die Mischpolymerisate besitzen Adsorptionseigender
Vernetzerkonzentration wasserklare bis milchig- schäften, so daß in Wasser oder schwachen Puffertrübe Substanzen mit gummiartiger bis spröder as lösungen (bis etwa 0,01 M) das Eiweiß 100°/oig am
Konsistenz. Träger fixiert wird. Bis zu 85% des Eiweißes werden
Die Mischpolymerisate lassen sich leicht körnen, hierbei kovalent, der Rest heteropolar gebunden. Bei
beispielsweise indem man sie durch ein Metallsieb Verwendung der Mischpolymerisate ohne vorherige
drückt. Als günstig für die Zwecke der Proteinver- Cyclisierung der Säuregruppen erfolgt die Eiweißknüpfung
erwiesen sich hierbei Korngrößer* von etwa 30 bindung nur adsorptiv. Es wurde gefunden, daß sich
0,35 bis 0,8 mm. Dieses Granulat quillt bei Zusatz von unter diesen Bedingungen das Protein mit Salz-Wasser
nach. Die Stärke der Quellung ist vom Ver- lösungen ohne Aktivitätsverlust vom Träger eluieren
netzergehalt abhängig. Je enger die erfindungsgemäßen läßt.
Mischpolymerisate vernetzt sind, desto weniger quell- Die Proteinbindungskapazität des Mischpolymeri-
bar sind sie. 35 sats ist abhängig von der Zahl der vorhandenen
Die Entquellung ist z. B. mit Alkohol oder noch Anhydridgruppen und der Porengröße. Bei einem
einfacher durch Gefriertrocknung möglich. enger vernetzten Produkt ist die Bindungskapazität
In mancher Hinsicht gleichen die Teilchen der geringer als bei einem weniger eng vernetzten Produkt
erfindungsgemäß zu verwendenden Mischpolymerisate bei gleicher Anzahl an vorhandenen Anhydrid-
denen des bekannten Polyacrylamidmolekularsiebes. 40 gruppen, da das Proteinmolekül bei engerer Vernetzung
Bei Behandlung mit Pufferlösungen erfolgt eine nicht alle zur Verfügung stehenden bindungsfähigen
Schrumpfung in Abhängigkeit von der Zahl der vor- Gruppen erreichen kann.
handenen Carboxylgruppen, ähnlich wie bei den Liegen im erfindungsgemäß zu verwendenden Mischionenaustauschern
auf Dextran- oder Polyacrylamid- polymerisat zu viele Ladungen vor, die nicht von
basis. 45 Protein durch kovalente Bindung besetzt werden
Wenn die Carboxylgruppen durch Erhitzen auf etwa können, so erfolgt im allgemeinen eine Verschiebung
2001C in das cyclische Anhydrid überführt werden, der pH-Optima bei den gebundenen Enzymen. Enttritt
häufig eine leichte Gelbfärbung auf. Wird längere sprechend wurde bei den bekannten trägergebundenen
Zeit erhitzt, so veitieft sich die Farbe von gelb bis Enzymen beobachtet, daß es bei negativ geladenen
braun, und gleichzeitig nimmt die Bindungskapazität 50 Trägermateralien zu einer Verschiebung um zwei
deutlich ab. Eine länger dauernde Erhitzung auf die pH-Einheiten kommt, beispielsweise bei an Äthylenerforderliche
Temperatur unter Normaldiuck wird maleinsäureanhydrid gebundenem Trypsin von 7,8
daher tunlichst vermieden. auf 10,0, und bei positiv gelagerten Trägern eine
Die Porosität und die Härte des Mischpolymerisats Verschiebung in den sauren Bereich erfolgt. Bei dem
im Zustand eines gequollenen Gels wird in erster 55 Mischpolymerisat ist es möglich, die bindungsfähigen
Linie durch den Vernetzergehalt bestimmt. Das Gruppen maximal auszunutzen, so daß sich trägcr-Material
weist Molekularsiebeigenschaften auf, ahn- gebundene Proteine erhalten lassen, die keine Verlieh
wie bei den Polyacrylamidgelen, wobei die Aus- Schiebung des pH-Wert-Optimums zeigen,
schlußgrenzen beliebig durch den Vernetzergehalt Eine besonders interessante Eigenschaft der erfinfestgelegt werden können. In gequollenem Zustand 60 dungsgemäßen aul Träger gebundenen wasserunläßt sich das Mischpolymerisat leicht filtrieren oder löslichen Proteine besteht darin, daß unter Umständen zentrifugieren und zeigt als Säulenfüllung ideale höhere Michaelis-Konstanten erhalten werden als bei Eigenschaften. In Wasser- oder Pufferlösungen ge- nichtgebundenem Enzym. So wurde beispielsweise quollen und entquollen als Lyophilisat ist das gelartige gefunden, daß die Aktivität von erfindungsgernäß Mischpolymerisat uneingeschränkt haltbar. 65 gebundenem Trypsin gegenüber M-Benzoyl-1-arginin-
schlußgrenzen beliebig durch den Vernetzergehalt Eine besonders interessante Eigenschaft der erfinfestgelegt werden können. In gequollenem Zustand 60 dungsgemäßen aul Träger gebundenen wasserunläßt sich das Mischpolymerisat leicht filtrieren oder löslichen Proteine besteht darin, daß unter Umständen zentrifugieren und zeigt als Säulenfüllung ideale höhere Michaelis-Konstanten erhalten werden als bei Eigenschaften. In Wasser- oder Pufferlösungen ge- nichtgebundenem Enzym. So wurde beispielsweise quollen und entquollen als Lyophilisat ist das gelartige gefunden, daß die Aktivität von erfindungsgernäß Mischpolymerisat uneingeschränkt haltbar. 65 gebundenem Trypsin gegenüber M-Benzoyl-1-arginin-
Das Mischpolymerisat ermöglicht eine schonende p-nitranilid erhöht wird im Vergleich zu nichtgebun-
Bindung des Proteins, weil es hydrophil und stark denem Enzym,
quellbar ist und die Proteinverknüpfung nur durch Die erfindungsgemäßen trägergebundenen Enzyme
weisen cine Fülle höchst erwünschter Eigenschaften auf
und lassen sich für zahlreiche Anwendungsgebiete verwenden. So ermöglichen sie es, Substratumsätze
weitaus gezielter als bisher auszuführen, da das Enzym zu jedem gewünschten Zeilpunkt aus dem
Inkubationsansatz wieder entfernt werden kann. 1st der Umsatz noch nicht quantitativ, so läßt sich das
gleiche Enzym erneut zusetzein. Bei Proteasen kann das zu spaltende Protein bei jeder gewünschten Hydrolyscrate
isoliert werden. Die Spaltungsrcaktion läßt sich damit direkt verfolgen. Das enzymatisch aktive
Protein muß nicht mehr, wie bisher, nach dem Substratumsatz
ausgefällt werden — 'hierdurch wurden oftmals die Substratumsätze verändert —, sondern es läßt sich
durch einfaches Filtrieren oder Abdekantieren od. dgl. entfernen.
Substratumsätze lassen sich mit derartigen trägergebundenen enzymatisch aktiven Proteinen auch über
Säulen ausführen. In ein käfigarliges Gefäß gepackte erfindungsgemäße Trägerenzyme lassen sich ähnlich
wie ein Tee-Ei zu einem Inkubationsansatz geben und jederzeit wieder daraus entfernen.
Mit proteolytisch wirksamen trägergebundenen Enzymen lassen sich auf einfache Weise Inhibitoren
isolieren. Die Stabilität der Proteasen wird dabei durch die Bindung an das Trägermaterial wesentlich erhöht.
da die Proteasen keine Autolysereaktion mehr unterliegen.
Mit erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteaseinhibitoren
lassen sich Proteasen einfach, schnell und ganz spezifisch isolieren. Mit ihrer Hilfe ist es auch
möglich, Proteasen enthaltende Proleinlösungen von den Proteasen zu reinigen und damit zu stabilisieren.
Durch crlindungsgemäße auf Träger fixierte Antigene bzw. Antikörper läßt sich eine einfache Isolierung
ίο von Antigenen bzw. Antikörpern durchführen. Mit
derartigen trägergebundenen Enzymantikörpern kann eine besonders einfache und wirksame Enzymisolierung
durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen gebundenen Proteine lassen sich ganz allgemein wiederholt benutzen und zeigen
zum Teil auch bei verlängertem Gebrauch keinerlei Aktivitätsschwund.
Auf Grund der Molcktilarsiebeigenschaften der
Mischpolymerisate lassen sich die trägergebundenen Proleine auch zur Substrattrennung einsetzen.
Die Mischpolymerisate sind hinsichtlich ihrer Eignung zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen
den bisher bekannten, für gleiche Zwecke verwendeten Trägermaterialien in hohem Ausmaße überlegen,
wie die in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßten Ergebnisse zeigen.
Trägermaterial |
Einheitlichkeit
des Materials |
Träger: Protein |
Ausbeute
geb. Protein in "„ |
Aktivität1)
niedcrmolck. Substrate in o/„ |
Ausbeute Aktivität
von eingesetztem in % |
PAAD1) CMC-HYDRAZ1D (ENZYME)2) ... EMA3) erfindungsgemäß ... |
einheitlich einheitlich nicht einheitlich einheitlich |
20: ι 10: 0,5 bis 1 5:1 beliebig 1:2 |
15 bis 18 25 bis 30 40 bis 45 bis 80 |
905) bis 40") 60 bis 707) bis lOO8) |
10 bis 13 bis 14 bis 30 bis 80 |
') Polyacrylamid.
*) Carboxymethylcellulosehydrazid.
1I Äthylenmaleinsäureanhydnd.
') Trypsin-Aktivität.
Die Überlegenheit der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen,
trägergebundenen Proteine liegt nicht nur in ihrer überlegenen Ausbeute und Aktivität, sondern
auch in dem weitaus vorteilhafteren zulässigen Verhältnis von Träger zu Protein.
Die erfindungsgemäßen wasserunlöslichen, trägergebunden»
Mischpolymerisate können Proteine sehr unterschiedlicher Molekülgröße und Eigenschaften
enthalten, da sich die Eigenschaften dieses Trägermaterial*
ohne weiteres je nach den Erfordernissen des ta bindenden Proteins einstellen lassen. Wenn
z. B da» Protein ein besonders großes Molekül aufweiM,
so kann durch Verringerung dts Vernetzungsgrade* in weitern Umfange noch ein Eindringen des
Protein* in die Matrix und Bindung in derselben bewirkt werden. Bei Proteinmolekülen, die so groß sind,
daß auch durch eine Vernetzung im geringstmöglichen Ausmaß ihr Eindringen in die Matrix wesentlich erschweren
wird, ist es auch möglich, eine Fixierung des Pfwrifw lediglich an der Oberfläche der Teilchen
voT/unchmcn, wobei in diesem Falle das Mischpolymerisat
vorzugsweise so fein gekörnt wird, daß eine sehr große Oberflactie erhalten wird, wobei die
dann allein an der Oberfläche stattfindende Fixierung des Proteins zu einem völlig ausreichenden Fixierungsgrad führt.
s) alle niedermolekularen Aminosäuren-Substrate.
'■) Chymoirypsin-Aktivitat.
') am Stickstoff geschützte Aminosäure-Ester.
*) N-Bcnzoyl-1 -arginin-p-nitranilid.
Das Verhältnis von homöopolar zu adsorptiv bzw. heteropolar am Träger gebundenen Enzym läßt sich
beeinflussen durch die Art der Herstellung der Bindung zwischen Protein und Träger. Wird beispielsweise
das Protein vorgelegt in relativ hoher Pufferkonzentration und langsam das nichtgequollene Gel zugegeben,
so ist die Ausbeute an homöopolar gebundenem Enzym sehr hoch und praktisch kein adsorptiv
gebundenes Enzym nachzuweisen. Wird andererseits mit niedriger Pufferkonzentration gearbeitet and
Träger und Enzym rasch zusammengegeben, so ist zwar die Ausbeute an gebundenem Protein höher, von
diesem an den Träger gegangenen Protein läßt sich jedoch mit hohen Pufferkonzentrationen wieder ein
erheblicher Anteil eluieren, der also nicht homöcpclar gebunden gewesen sein kann. Wird beispielsweise
wie oben angegeben mit hoher Pufferkonzentration und langsamer Trägeizugabe gearbeitet, so gehen etwa
80 "„ des vorgelegten Enzyms an den Träger, and es läßt sich dann nichts mehr davon eluieren. Das
Enzym ist also annähernd vollständig homöopolar gebunden, und seine Aktivität wird lediglich noch durch
die Zugänglichkeit für das Substrat bestimmt. Im zweiten Fall hingegen bei niedriger Pufferkonzentration
und rascher Zugabe werden zwar 100°;, des vorgelegten
Proteins am Träger absorbiert. Hiervon lassen sich
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aber bis 35% wieder mit hohen Salz- oder Puffer- werden mit Ig Träger in 15ml eiskaltem Wasser,
kon/cntraiionen eluieren, waren also nicht homöopo- pH = 5,2, eingerührt und bei 40"'C 15 Stunden im
lar gebunden. Kühlraum reagieren gelassen. Anschließend wird das
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung Produkt in eine Säule gepackt.
weiter. 5 Das heteropolar gebundene Protein wurde mit
Herstellung des Mischpolymerisats 65J11' Waschwasser eluiert Mit 0,2 M Phosphatpuffer,
pH = 7,8, konnte danach kein weiteres Protein mehr
A. 3 g Acrylamid (AAD), 0,3 g Ν,Ν'-Methylen- eluiert werden.
bis-acrylamid (bis-AAD) werden mit Ig Äthylen- Heteropolar gebundes Protein 31. %
maleinsäureanhydrid (EMA) in 23 ml 0,05 M Phos- io bei pH 7 0 8 5 10 20'"
phatpuffcr pH 7,6 suspendiert und unter starkem Rot-Aktivität,' bezoccn ' auf' nichtge-
Rühren in Stickstoffalmosphäre bei Raumtemperatur bundes Trypsin " 50°'
mit je 1 ml 5th/oigem Propionsäurcnilril und 5°/oigem '"
Ammoniumperoxydisulfat versetzt. Nach 10 bis . .
15 Minuten erstarrt die Masse zu einem gelartigen 15 Beispiel ^
Block. Dieser wird 60 Minuten bei Raumtemperatur Als Träger wird das Produkt von E. verwendet.
stehengelassen und dann durch ein Metallsieb mit Der Träger wird wie in A. beschrieben mit 100 mg
einer lichten Maschenweile von 0,5 mm gedrückt. Trypsin reagieren gelassen.
Das erhaltene Granulat wird mit etwa 5 1 destilliertem Nichtgebundenes Protein 30°/
Wasser gewaschen. Das Naßgewicht beträgt nun 20 Aktivität des gebundenen Proteins'"'
38,2 g. „»«■,, · ., vor Behandlung mit 0,2 M Puffer 100 %
Das so erhaltene gequollene Mischpolymerisat w.rd nach Behandlung mit 0 2 M puffer 5()o
zum Entquellen gefriergetrocknet. In getrocknetem
Zustand beträgt das Gewicht (Ausbeute) 5,4 g.
Zur Cyclisierung zum Säureanhydrid wird anschlie- 25 p
ßend 1,5 bis 2 Stunden bei 200 C im Trockenschrank Es wird der gleiche Träger wie in Beispiel 1 ver-
erhjt/t. wendet. 100 mg Träger und 200 mg Trypsin werden
B. 3 g Acrylamid, 0.075 g Äthylendiacrylat und wie in A. beschrieben reagieren gelassen.
I g Maleinsäure werden wie in A. beschrieben misch- Nichtgebundenes Protein . 50°
polymerisiert. Die Polymerisalionsdauer beträgt 30 Aktivität des gebundenen Proteins
15 Stunden. . vor Behandlung mit 0,2 M Puffer 100°„
Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in A. nach Behandlung mit 0,2 M Puffer 48"'
beschrieben. Die Ausbeute an Lyophihsat beträgt
2,3 g. Nach der Cyclisierung beträgt das Gewicht des B e i s η i e 1 4
Produktes 2.05 g. 35 F
C. 3 c Acrylamid, 0,3 g Ν,Ν'-Methylen-bis-Acryl- Es wird das Produkt von C. als Träger verwendet,
amid und 1 g Maleinsäure"werden wie in A. beschrie- 100 mg Rinderserumalbumin werden mit 1 g Träger
ben mischpoivmerisiert. Die Polymcrisationsdauer wie in A. beschrieben reagieren gelassen.
beträgt 15 Stunden. Die Weiterverarbeitung erfolgt Nichtgebundenes Protein 32%
ebenfalls wie in A. beschrieben. Die Ausbeute an 40 fa '«
Lyophilisat betraut 2,67 g. Nach Cyclisierung beträgt Weder mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH = 7,8, noch
das Gewicht des Produktes 2.45 g. mit 0,2 M Glycinpuffer, pH - 1,8, kann Protein vom
D. Wie in A. beschrieben werden 3 g Acrylamid, Träger eluiert werden. Die Ausbeute an homöopolar
0,6" N.N'-Methylen-bis-acrylamid und Ig Malein- gebundenem Protein beträgt 68%, bezogen auf eingesäure
m'ischpolymerisiert. Die Polymerisalionsdauer 45 setztes Protein, und 100%, bezogen auf gebundenes
beträgt 5 Standen. Die Weiterverarbeitung erfolgt Protein.
ebenfalls wie in A. beschrieben. Die Ausbeute an Bei Verwendung von Humanscrumalburnin an
Lyophilisat beträgt 2,8 e. Nach der Cyclisierung werden Stelle von Rinderserumalbumin wird das gleiche
2,6 g Endprodukt erhalten. Ergebnis erhalten.
fc. Wie in A. beschrieben werden 3 g Acrylamid, 5°
0,3 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 0,1 g Malein- Beispiel 5
säure 5 Stunden mischpolymerisiert. Die Weiterverarbeitung
erfolgt ebenfalls wie in A. beschrieben. Es wird das Produkt von C. als Träger verwendet.
Das Naßgewicht des gequollenen Produktes beträgt 1 g Träger wird portionsweise innerhalb von 60 Mi-53
5 g Nach der Lyophilisierung wird ein Trocken- 55 nuten zu 200 mg Trypsin gelöst in 18 ml Phosphatgewicht
von 4,8 g erhalten. Die Cyclisierung führt zu puffer (0,1 M. pH - 7.8) gegeben und 18 Stunden bei
einem Endprodukt in einer Ausbeute von 3.1g. 4 C reagieren gelassen.
Nichtgebundenes Protein 50%
B e i s ρ i e 1 1 Aktivität des gebundenen Proteins,
Herstellung <lcs trägergebundenen Proteins ° bezogen auf eingesetzte Aktivität ... 40",;
Es wird ein cyclisicrles Mischpolymerisst aus 3 g Mit 0,2, 0,33 bzw. 0,5 M Phosphatpuffer kann kein
Acrylamid, 0.15 g N^N'-Methylen-bis-acrylamid und Protein und keine Aktivität vom Träger eluiert
1 g Maleinsäure als Träger verwendet. 100 mg Trypsin werden.
Claims (1)
- Patentanspruch:Wasserunlösliches, trägergebundenes Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es hergestellt worden ist ausA. einem Mischpolymeiisat, bestehend ausa) Acrylamid,b) Äthylenmaleinsäure bzw, deren Anhydrid und/oder.c) Maleinsäure sowied) N.N'-Methylen-bis-acrylamid oder Äthy-Itendiacrylat im Gewichtsverhältnis a:b:c:d von 3:0,5 bis 1,5:0,05 bis 4:0,075 bis 0,9, wobei die Summe von b) und c) höchstens 4 Verhältnisanteile beträgt, das durch Erwärmen im Vakuum auf 80 bis 1200C oder Atmosphärendruck auf 160 bis 2200C cyclisiert wurde, undB. einem biologisch aktiven Protein durch Mischen entweder in wäßriger Lösung und anschließender Elution mit Salzlösung oder in wäßriger Salzlösung.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1935711*A DE1935711C3 (de) | 1969-02-19 | 1969-02-19 | Wasserunlösliches Protein. Ausscheidung aus: 1908290 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE1935711*A DE1935711C3 (de) | 1969-02-19 | 1969-02-19 | Wasserunlösliches Protein. Ausscheidung aus: 1908290 |
DE1908290A DE1908290C3 (de) | 1969-02-19 | 1969-02-19 | Acrylamid-mischpolymerisat |
Publications (3)
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DE1935711A1 DE1935711A1 (de) | 1970-08-20 |
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Family Applications (1)
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DE1935711*A Expired DE1935711C3 (de) | 1969-02-19 | 1969-02-19 | Wasserunlösliches Protein. Ausscheidung aus: 1908290 |
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Families Citing this family (2)
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---|---|---|---|---|
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EP1657298A1 (de) * | 2004-11-12 | 2006-05-17 | Cognis IP Management GmbH | Feste Zubereitungen |
-
1969
- 1969-02-19 DE DE1935711*A patent/DE1935711C3/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
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DE1935711A1 (de) | 1970-08-20 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |