DE1930059A1 - Stabilisierte enzymatische Test-Reagenzien - Google Patents

Stabilisierte enzymatische Test-Reagenzien

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Description

Int. Nr. 1628
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH. Mannheim Stabilisierte enzymatische Test-Reagentien
Die Erfindung betrifft stabiliserte enzymatische Test-Reagentien sowie das Verfahren zu ihrer Herstellung.
Eür enzymatische Untersuchungen, insbesondere im Rahmen diagnostischer Zwecke, ist es von großer Bedeutung, daß die für die enzymatischen Reaktionen erforderlichen Stoffe wie Substrate, Enzyme, Coenzyme, Puffersubstanzen usw. gebrauchsfertig und im richtigen Verhältnis zur Verfügung stehen. Durch kombinierte Präparate, welche alle für die Reaktionen notwendigen Stoffe bereits enthalten, können bestimmte Tests auch von weniger geschulten Personen leicht und sicher durchgeführt werden. Die Schaffung solcher kombinierter Präparate begegnete bisher jedoch außerordentlichen Schwierigkeiten. Es stellte sich nämlich heraus, daß häufig die benötigten Substanzen, welche in reiner Form relativ stabil sind, durch die Gegenwart der anderen Kom-
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ponenten der Test-Präparate instabil werden und deshalb im Laufe der Lagerung einen so starken Aktivitäts- bzw. Könzentrationsverlust zeigen, daß der praktische Wert der kombinierten Präparate zweifelhaft wird. Dies gilt besonders bei kombinierten Präparaten, welche Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD/NADH), Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (NADP/NADPH) in reduzierter oder oxydierter Form sowie Purin- oder Pyrimidinnucleotide enthalten.
Es ist bekannt, zur Stabilisierung derartiger kombinierter enzymatischer Test-Reagentien SH-Gruppen-haltige Substanzen zu verwenden, insbesondere Glutathion, Die Verwendung derartiger Substanzen erwies sich jedoch als nicht ganz zufriedenstellend, da festgestellt wurde, daß bestimmte Enzyme hierdurch gehemmt werden können und die bisher zu diesen Zwecken als brauchbar festgestellten SH-Reagentien, insbesondere Glutathion, oxydationsempfindlich und überdies vielfach zu teuer sind. Schließlich war auch die Stabilisierungswirkung selbst nicht immer zufriedenstellend.
Nunmehr wurde gefunden, daß die geschilderten Schwierigkeiten durch einen Zusatz von Polyvinylpyrrolidon überwunden werden können.
Das erfindungsgemäße stabilisierte kombinierte enzymatische Test-Reagens, welches Nicotinamid-adenin-dinucleotid oder bzw.
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und Mcotinamid-adenin-dinucleotidphosphat In reduzierter oder oxydierter Form enthält, ist daher gekennzeichnet durch einen Gehalt an Polyvinylpyrrolidon als Stabilisator.
Ea ist zwar bereits bekannt, Polyvinylpyrrolidon zu verwenden, um das Absublimieren anorganischer Bestandteile bei der Gefriertrocknung empfindlicher Substanzen zu verhindern. Diese bekannte Wirkung als Gefriertrocknungshilfsmittel unterscheidet sich jedoch grundsätzlich von der nunmehr aufgefundenen Stabilisierungswirkung bei kombinierten enzymatisehen Test-Reagentien, von der die Erfindung Gebrauch macht, und konnte vom !Fachmann auch nicht vorhergesehen werden.
Die erfindungsgemäßen Reagentien-Kombinationen enthalten außer Polyvinylpyrrolidon und NAD/NADH bzw. NADP/ NADPH zweckmäßig alle für die Durchführung der Reaktion erforderlichen Stoffe, wie Enzyme, Coenzyme, Substrate, Puffersubstanzen, Hilfsstoffe und gegebenenfalls Füllstoffe.
Beispiele für geeignete Enzyme sind Hexokinase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Lactat-Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase f Glycerophosphat-Dehydrogenase, Triosephosphat-Isomerase, Pyruvat-Kinase, Sorbit-Dehydrogenase, Aldolase, Glutamat-Qxalacetat-Transaminase, Glycerinaldehyd-5-phosphat-Dehydrogenäse und Phosphoglycerat-Kinase. Es können jedoch auch zahlreiche andere Enzyme verwendet werden.
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Beispiele für geeignete Coenzyme sind Adenosin-triphosphat, Phosphoadenylsäuresulfat, Adenosylmethionin, Uridindiphosphat, Cytidlndiphosphat, Coenzym A, Tetrahydrofölsäure, Biothin, Thiaminpyrophosphat, Pyridoxalphosphat, Nicotinamid-mononucleotid, Flavin-mononucleotid, Flavin-adenin-dinucleotid, Zellhämine und BJ,2~Coenz7m* Außerdem gehören hierher die bereits erwähnten, obligat vorhandenen Wasserstoff-übertragenden Coenzyme NAD/WADE fc und NADP/NADPH.
Beispiele für Substrate der durchzuführenden enzymatischen Reaktionen sind z.B. Aminosäuren wie Alanin, Ketosäuren wie a-Ketoglutarat, Zucker wie Glucose, Zuckerphosphate wie Fructose-1,6-diphosphat, Phosphorsäureester wie Phosphorenolpyruvat und Creatinphosphat, SH-G-ruppen-haltige Verbindungen wie Glutathion und dgl. .
Beispiele für Puffersubstanzen sind z.B. die verschiedenen Alkalisalze der Phosphorsäure bzw. Mischungen davon, Salze der Essigsäure, Borsäure, Phthalsäure mit starken Alkalien, organische Verbindungen wie tris-Hydroxymethylaminomethan und dgl., wie sie normalerweise bei biochemischen Reaktionen verwendet werden. Unter Füllstoffen werden im Rahmen der Erfindung solche nichtionogenen organischen Verbindungen verstanden, welche den Lyophilisierungsvorgang erleichtern. Beispiele hierfür sind Gelatine, Albumine und ähnliche Substanzen. Hilfsstoffe schließlich sind sonstige für die jeweils beabsichtigte biochemische Reaktion er-
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forderliche oder erwünschte Substanzen, wie z.B. Salze bestimmter Ionen, Aktivierungsmittel (beispielsweise reduziertes Glutathion für die Hexokinase) u. dgl.
Die erforderliche Zusammensetzung ist im allgemeinen dem Fachmann bekannt. Die ohne Störung oder Beeinflussung der gewünschten Test-Reaktion erforderliche Menge des erfindungsgemäßen Stabilisators Polyvinylpyrrolidon läßt sich durch einen einfachen Vorversuch ohne weiteres feststellen.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Test-Reagentlen-Kombinationen wird folgendermaßen durchgeführt:
1) Alle für die Durchführung der bezweckten Reaktion erforderlichen Stoffe (Hllfsenzyme, Coenzyme, Substrate, Puffersubstanzen, Hilfsstoffe und gegebenenfalls Füllstoffe) werden mit Polyvinylpyrrolidon in dem für den Ablauf dieser Reaktion optimalen Verhältnis mit Wasser zu einer lösung gemischt, deren Volumen und pH-Wert in gewünschter Weise fixiert sind;
2) Diese Lösung wird entsprechend der jeweils gewünschten Einheitsmenge auf geeignete Behälter aufgeteilt j
3) Der Inhalt dieser Behälter wird lyophilislert und sofort unter Verschluß gebracht.
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Die erfindungsgemäßen Test-Reagentien-Kombinationen sind in Wasser leicht lösliche poröse Pulver, die im geschlossenen Behälter aufbewahrt jahrelang haltbar sind. Sie stellen einen erheblichen Fortschritt auf dem Gebiet der Reagentien-Zusammenatellungen für enzymatIsche Untersuchungen dar. Der Praktiker •hat nunmehr .weiter nichts zu tun, als den Inhalt des betreffenden Behälters in einer bestimmten Menge Wasser zu lösen, die zu w untersuchende Substanz (z.B. Serum) hinzuzugeben und gemäß beigefügter Vorschrift zu messen (z.B. Messung der Extinktion in einem Photometer), ·
Der erfindungsgemäße Stabilisator ist gegen Oxydation vollkommen beständig, ergibt eine sehr gute Stabilisierungswirkung, istbillig und ohne Einfluß auf die Aktivität der verwendeten Enzyme.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und zeigen die ) Zusammensetzung erfindungsgemäßer Test-Reagentien sowie ihre Anwendung.
Beispiel 1 Präparat zur Bestimmung der G-lutamat-Pyruvat-Transamlnase (GPT)
2,43 g Wa2HPO4.H2O
0,21 g NaH2PO4.2 H2O
2,05 g DL-Alanin
0,35 g a-Ketoglutarat
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1 g Polyvinylpyrrolidon
0,30 g Serumalbumin 0,05 g NADH
0,0015 g Lactat-Dehydrogenase
werden in 90 ml bidest. Wasser gelöst und der pH-Wert mit verdünnter Natronlauge auf 7»6 eingestellt. Dann wird die lösung mit bidest. Wasser auf 100 ml aufgefüllt, anschließend eingefroren und gefriergetrocknet.
Beispiel 2 Präparat zur Bestimmung von Glucose
0,050 g Triäthanolamin-nydroclilorid 0,025 g Natriumcarbonat 0,050 g NADP
0,050 g Adenosin-5'-triph.osphat 1,0 g Polyvinylpyrrolidon 0,005 g Hexokinase
0,005 g Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase 0,300 g Serumalbumin
Aufbereitung wie im Beispiel 1 angegeben.
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Beispiel 3 Präparat zur Bestimmung von Aldolase
2,43 g Na2HPO4.H2O 0,21 g NaH5PO..2 H9O 0,14 g Fructose-1,6-diphosphat 0,005 g Jodacetat 1,0 g Polyvinylpyrrolidon ^ 0,30 g Serumalbumin 0,05 g NADH
0,0015 g Glycerophosphat-Dehydrogenase 0,0015 g Triosephosphat-Isomerase
Aufbereitung wie im Beispiel 1 angegeben.
Beispiel 4 Präparat zur Bestimmung der Pyruvat-Kinase
2,100 g Triäthanolamin-hydrochlorid ) . 0,700 g KCl
0,300 g Magnesiumsulfat 0,040 g Äthylendiamin-Ietraacetat 0,250 g Natriumcarbonat 0,050 g NADH j- ' '
. 0,190 g Adenosin-5-diphospliat J0 0,001 g Lactat-Dehydrogenase
cn 0,300 g Serumalburain ^ 1,000 g Polyvinylpyrrolidon ^ 0,100 g Phosplioenol-pyruvat •-α
Aufbereitung wie im Beispiel 1 angegeben.
Beispiel 5 Präparat zur Bestimmung der Creatinkinase
2,100 g Triäthanolamin-hydrochlorid. 0,250 g Natriumcarbonat 0,100 g Adenosin-5'-diphosphat
1,000 g Adenosin-S'-moÄ'phosphat 0,250 g Magnesiumacetat 0,100 g FADP
0,100 g Glucose 15,000 g Creatinphosphat 0,800 g Glutathion, red. 0,500 g Hexokinase 0,500 g Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase 0,300 g Serumalbumin 1,000 g Polyvinylpyrrolidon
Aufbereitung wie im Beispiel 1 angegeben, jedoch unter Einhaltung eines pH-Wertes von 7,0.
Beispiel 6 Präparat zur Bestimmung der Glutathion-Reduktase
2,43 g Na2HPO4.2 H2O
0,21 g NaH2PO4.2 H2O
1,00 g Polyvinylpyrrolidon 0,300 g Serumalbumin 0,100 g NADPH
0,250 g Glutathion, oxyd.
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Aufbereitung wie im Beispiel 1 angegeben, jedoch unter Ein- , haltung eines pH-Wertes von 7,0,
Beispiel 7 - Präparat zur Bestimmung von Äthylalkohol
3,300 g Natriumpyrophosphat.10 HpO 0,700 g Semicarbazid-hydrochlorid 0,200 g Glycin
0,050 g Alkohol-Dehydrogenase 0,100 g NAD
0,300 g Serumalbumin 1,000 g Polyvinylpyrrolidon
Aufbereitung wie im Beispiel 1 angegeben, jedoch unter Einhaltung eines pH-Wertes von 8,6.
Beispiel 8 Präparat zur Bestimmung der Q-lutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT)
2,43 g Na2HPO4.2 H2O
0,21 g NaH2PO4,2 H2O
1,50 g 1-Aspartat 0,35 g a-Ketoglutarat 1,00 g Polyvinylpyrrolidon 0,30 g Serumalbumin 0,05 g NADH
0,0015 g Lactat-Dehydrogenase 0,0015 g Malat-Dehydrogenase
Aufbereitung wie im Beispiel 1 angegeben.
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Claims (3)

  1. Patentansprüche
    Stabilisiertes kombiniertes enzymatisches Test-Reagens, welches Nicotinamid-adenin-dinucleotid oder / bzw. und Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat in reduzierter oder oxydierter Form enthält, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Polyvinylpyrrolidon als Stabilisator.
  2. 2. Test-Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
    es ein oder mehrere Enzyme, Puffersubstanzen, Substrate, Coenzyme, Hilfsstoffe oder/und Füllstoffe einzeln oder in Kombination enthält.
  3. 3. Verfahren zur Herstellung des Test-Reagens gemäße Anspruch 1 oder 2t dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Lösung herstellt, die alle für die Durchführung der enzymatischen Reaktion erforderlichen Stoffe und Polyvinylpyrrolidon enthält und die erhaltene Lösung lyophilisiert.
    0 0 9 8 5 ? / 1 1 U 7 ORIGtNAL JNSPECTED
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