DE1919077A1 - Verfahren zur Diagnose und Klassifizierung von Krebs - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Diagnose und Klassifizierung von Krebs.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Anwesenheit und die Wanderung von Krebszellen und ihrer Antikörper im Lymphsystem und im Blutstrom des Patienten verwendbar sind, insbesondere dadurch, daß die Charakteristiken individueller Krebszellen und ihrer Antikörper eigenartig sind und aufgrund ihres besonderen Charakters auf die Entstehungsstelle im Körper hinweisen. Angenommen, der Patient hat Leberkrebs, dann würden Krebszellen, lebende und tote, durch den Blutstrom des Körpers zu Stellen gelangen, an denen Antikörper produziert werden.'Ferner kann unabhängig davon, an welcher

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Stelle des Körpers eine Blutprobe entnommen worden ist, der Laborant feststellen, daß diese kranken Zellen aus der leber stammen, vorausgesetzt, er kann im Blut die Antikörper feststellen.

Durch ein Verfahren, welches als Iranmno-Fluoreezenzverfahren bezeichnet werden soll, ist das erfindungsgemäß dadurch möglich, daß eine Blutprobe entnommen wird, ein. Vergleichsobjektträger mit krebsartigen Leberzellen mit

^ einem Teil des Blutserums des Patienten zusammengebracht wird, so daß das Gammaglobulin des Blutes damit reagieren und an den Vergleichszellen haften kann, worauf eine Antihumanglobulinprobe, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff verseben ist, auf den Objektträger gegeben wird und daraufhin die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet wird.

Auf diese Weise kann man indirekt und durch zwei Reaktionen, d. h. erstens durch die Reaktion des modifizierten Gammaglobulins des Patienten (den Leberzellen-

w krebsantikörpern) mit den antigenhaltigen Zellen des VergleiebsobjekttBägers und zweitens durch das gefärbte Antibumanglobulin, welches mit dem Humanglobulin reagiert, das wiederum mit dem Vergleichsobjekt reagiert, durch Waschen der entstandenen Probe vor der mikroskopischen Untersuchung durch Fluoreszenz feststellen, daß die vermutete Reaktion, d. h. die Anwesenheit von Antikörpern,

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zu der besonderen Art von Krebs, der im Blut des Patienten vorhanden ist, tatsächlich existiert.

Bisher waren die chemischen oder serologischen diagnostischen Verfahren hinsichtlich Krebs in'ihren versobledenen Arten unbefriedigend. Das üblichste Verfahren zum Diagnostizieren von Krebs für die verschiedenen Teile des Körpers ist die Biopsy, d. ta, man entnimmt einen Gewebequerscbnitt des verdächtigen Gebiets und untersucht ihn. Derartige Verfahren sind traumatischer als einfache Blutentnahmen.

In den letzten Jahren sind intensive Forschungen hinsichtlich der Ätiologie und der Arten von Krebs durchgeführt worden. Es ist eine umfangreiche Forschung damit beschäftigt gewesen, aufzuzeigen, daß in vielen Fällen Krebs durch ein Virus hervorgerufen wird. Sicher kann Krebs auch durch die Anwesenheit von Chemikalien, gegen die der Körper reagiert, hervorgerufen werden. In jedem Falle wurde gefunden, daß bei manchen Krebsarten Aiii gene, die das Aussehen von feinen Teilchen oder feinem Sand haben, wenn man sie durch ein Mikroskop betrachtet, an verschiedenen Stellen der befallenen Zelle je nach Art des Krebses vorhanden sind. Diese Antigene erzeugen Antikörper im Blutstrom, welche die Form eines modifizierten Gammaglobulins haben. Wie weiter unten ausführlich beschrieben werden wird, wird dieses modifizierte Gamma-

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globulin zur Reaktion mit den Vergleichszellen gebracht, falls dieselben Krebsarten bei dem Patienten, vorkommen, die auf dem Objektträger als Versuchszellen typisiert sind. Eine weitere Reaktion, die eine Immuno-Fluoreszenztechnik verwendet, wird durchgeführt, worauf die erste Reaktion, auf die man sich stützt, erkennbar wird.

Dieses Diagnoseverfahren ist sehr praktisch, ohne weiteres zuverlässig und kann periodisch reprodziert werden. Dies ist ein beachtlicher Fortschritt mit Bezug auf die hergebrachte Krebsdiagnose. Die bekannten Verfahren sind zytologische Untersuchungsverfahren, Scbmierversuche, das Verfahren unter Verwendung saurer Phosphate bei Prostrationskrebs, Eiweißbestimmung im Urin, Knochenmarksuntersuchungen und Untersuchungen mit Radioisotopen.

Die Vorteile des vorliegenden Verfahrens, weiches die Fluoreszenzantikörper verwendet, sind zahlreich. Zu allererst ist das Verfahren außerordentlich spezifisch und empfindIMi, um einen Krankbeitstumor anzuzeigen. Außerdem sind die reinen Fluoreszenzfarbstoffe, die benötigt werden, sehr gut reproduzierbar und zuverlässig. Es hat sich gezeigt, daß die Ergebnisse spezifisch sind.

Es wird angenommen, daß das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren die meisten, wenn nicht alle anderen übertreffen wird wegen der Einfachheit, mit der eine Krebserkrankung richtig und schnell erkennbar zu machen ist.

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Das Verfahren ermöglicht auch eine Massenuntersuohung der Bevölkerung einfach durch Blutprobe nentnahtne, um in einem frühen Stadium festzustellen, ob Krebsbedingungen und deren mögliche Ursachen vorliegen.

Da ßammaglobulin die Zellwände lebender Zellen nicht durchdringen kann, ist es wichtig, daß das Bezugspräparat auf dem Objektträger Zellen besitzt, die festgelegt sind, d. h. die tot sind.

Es ist natürlich bekannt, daß viele Chemikalien Krebs verursachen,und die chemischen Karzinogene gehen in die Hunderte. Es gibt sehr viele Insektizide, synthetische Kunststoffe und deren Polymere, Petroleumprodukte, chemische Verbindungen im Zigaretten- und Zigarrenrauch, polyzyklische Kohlenwasserstoffe, die Krebs hervorrufen.

In den letzten Jahren ist die Erforschung der Viren, die Krebs bilden können, ständig intensiviert worden, es sind umfangreiche Untersuchungen hinsichtlich der Effekte der Viren durchgeführt worden, die leukämie und Tumore hervorrufen. Eines der wichtigsten Mittel, die man in letzter Zeit bei der Forschung angewandt hat, beruht auf der Fähigkeit der Viren, normale Zellen in Krebszellen in vitro umzuwandeln. Derartige umgewandelte Zellen rufen einen verpflanzten Krebs hervor, wenn man sie entsprechenden Tieren einpflanzt. Außerdem hat sich gezeigt, daß derartige umgewandelte Zellen neue zellulare Antigene besitzen,

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die durch entsprechende Festlegung, zytotoxlscbe und Immuno-Pluoreszenztests festgestellt werden können. Durch die Einführung des Elektronenmikroskops konnten virusartige Teilchen in einigen Krebszellen festgestellt werden. Diese Zellen liefern aber keine infektiösen Yiren, und die Art und die Natur dieser Teilchen bleibt unbekannt. Es wird in diesem Zusammenhang verwiesen auf Journal of Bacteriology, Vol. 91, Seiten 1366 bis 1368.

Es ist somit Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Sollpräparat zu schaffen, mit welchem Krebs diagnostiziert und die Art des vorliegenden Krebses bestimmt werden kann.

Die Erfindung bezweckt ferner, ein Verfahren zur Bestimmung von Krebs zu schaffen, welches leicht durchführbar ist und lediglich für seine Durchführung eine Probe des Blutes des Patienten verlangt.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Diagnostizierung von Krebs unter Verwendung eines Objektträgers mit Vergleichszellen bekannter Krebsart und auf die Verwendung eines Irnmuno-Eluoreszenzverfahrens und einer beobachtbaren, dabei sich abspielenden Reaktion.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Verwendung der Grundlagen der Immunologie und der Antikörperproduktion, und zwar in Kombination mit der erfindungsge- ' mäßen Demonstration der Gegenkörperbildung im Krebsfalle,

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der hinsichtlich seiner Entstehungsstelle identifizierbar ist, um so aus einer Blutprobe des Patienten einen Krebszustand zu diagnostizieren, und zwar nicht nur qualitativ, sondern auch quantitativ.

Weitere Merkmale der Erfindung werden in der sich anschließenden Beschreibung erläutert.

Es ist bekannt, daß verschiedene Zustände und Substanzen die Zellen des Körpers beeinträchtigen und fremde Substanzen oder Antigene in den einzelnen Zellstrukturen erzeugen. Es ist eine umfangreiche Krebsforschung im Gange, und einige Forscher haben vermutet, daß gewisse Krebsarten durch Viren verursaoht werden, die entweder Antigene in einzelnen Zellen bilden oder werden.

Die Erfindung befaßt sich mit einem neuen Konzept, durch das chirurgische Maßnahmen zur Gewinnung einer Probe eines verdächtigen, infizierten Teiles vermieden werden und demgegenüber lediglich eine Probe des Blutes des Patienten erforderlich ist, das durch Reaktion mit einem Sollpräparat, wie oben beschrieben, einen Hinweis liefert hinsichtlich der Art und der Quelle der in Rede stehenden Erkrankung.

Zunächst wird eine Anzahl von zur Diagnose erforderliohen Sollpräparaten hergestellt. Ein solches Präparat enthält Krebszellen der Leber, ein anderes Blutkrebszellen, ein weiteres Darmkrebszellen, ein anderes Gehirnkrebszellen

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usw. Diese einzelnen Präparate werden zu Vergleichs- oder Prüfversueben verwandt und vorzugsweise aus bekannten. Krebsgeweben hergestellt.

Wenn nun bei einem Patienten der Verdacht auf Leberkrebs oder eine andere Krebsart besteht, wird ein Präparat ausgewählt, welches dieser Krebsart entspricht, beispielsweise Leberkrebszellen umfaßt, die auf einem Objektträger befestigt sind. Sodann wird dem Patienten eine Blutprobe entnommen und das Blutserum daraus entfernt« Eine Grunde Voraussetzung dabei ist, daß eine Krankheit, die eine Veränderung der Zellenzusammensetzung verursacht, die Produktion von Antikörpern stimuliert. Im Falle von Krebs wird das Antigen als ein Fremdstoff identifiziert, der z.B. in dem Material der Tumorzellen enthalten ist. Die Produktion von Antikörpern im Blut bewirkt eine Immunität, die sieb in einer diskreten Veränderung des Gammaglobulins des Blutes zeigt, das für den spezifischen vorhandenen Krebs ganz eigenartig ist. Somit wird das Gammaglobulin eines Patienten, der eine bestimmte Krankheit besitzt und das dadurch modifiziert ist, in einer immunen und spezifischen Art reaktiv, um der Anwesenheit der Fremdsubstanz, welche die Krankheit hervorgerufen hat, entgegenzuwirken.

In dem nächsten Verfahrensschritt wird das Anti- gammaglobulin gewonnen. Es ist bekannt, daß man durch

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Injektion, von Humanglobulin aus einer menschlichen Probe in ein Tier, beispielsweise eine Ziege, ein Kaninoben oder Pferd, das tierische Globulin modifiziert zu einem Globulin, das man als Antihumanglobulin bezeichnet. Das Tier entwickelt auf diese Weise eine Immunität gegen das Humanglobulin, und diese Immunität zeigt sich in dem erzeugten Antihumangammaglobulin. Blutproben, die man dem Tier entnimmt, enthalten somit bekanntlich Antifaumanglo-"bulin. ·

Der nächste Terfahrensschritt besteht darin, dieses Antibumanglobulin, welches man auf diese Weise" erhält, zu trennen und zu kennzeichnen. Mit Kennzeichnung soll hier die Zugabe eines Fluoreszenzfarbstoffes, beispielsweise die Zugabe von Pluoreszeinisozyanat oder Natriumisozyanat oder auch Rboäamin B, gemeint sein.

Derart gefärbtes Antihumanglobulin ist im Handel erhältlich. .

Sodann wird das Serum des Blutes des Patienten mit den Sollpräpa'ratzellen des Objektträgers für eine Inkubationszeit von etwa 30 Minuten reagieren gelassen. Daraufhin wird das Präparat gewaschen. Wenn der Patient mit derselben Krankheit, die durch die Zellen des Sollpräparats dargestellt wird, infiziert ist, reagiert das immune Gammaglobulin des Patienten, wenn es mit dem Präparat zusammengebracht wird und bfeibt an den auf dem Objektträger liegenden Zellen haften. Diese Reaktion kann jedoch nioht

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mikroskopisch bestimmt oder erkannt werden. Wenn man Indessen gefärbtes Antibumangaiamaglobulin verwendet, kann seine Gegenwart bestimmt werden. Somit wird das gefärbte Antihumangammaglobulin zunächst für eine Inkubationszeit von etwa 30 Minuten mit dem Präparat, das bereits mit dem Gammaglobulin des Patienten vorher zusammengebracht worden war, reagieren gelassen. Das gefärbte Antiimmangammaglobulin reagiert nun mit dem modifizierten Gammagiotralin, welches an den Präparatzellen haftet, so daß der PlEoreszenzfarbstoff auf dem Objektträger haften bleibt. Beraufhin wird das Präparat ein zweites Mal gewaschen und unter einem Mikroskop betrachtet. Die Fluoreszenz des Farbstoffes ist leicht erkennbar und zeigt das Torbandensein einer Reaktion zwischen einer zweistufigen Reaktion, d. h. einer Reaktion zwischen dem gefärbten AntihuisangaBesglobulin und dem modifizierten Globulin des Patleaten und zwisien dem Gammaglobulin des P_atienten und den Zellen des Sollpräparats. Dieses Verfahren bezeichnet man als eine indirekte Immuno-Pluoreszenzreaktion*

Ist der Patient nicht an dieser Art Krebs, welche geprüft wird, erkrankt, d. h. nicht an jenem Krebs, dem die Sollzellen auf dem Objektträger entstammen, dann haftet das Gammaglobulin an den Zellen des Präparats nicht, wenn das Gammaglobulin des Patienten mit diesen in Berührung gebracht wird, weil keine Reaktion stattfindet. Polglich,

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wenn das Präparat anschließend gewaschen wird, verbleibt kein Gaomaglobulin des Patienten auf den Zellen zurück, und folglich kann, wenn das gefärbte Antibumanganmiaglobulin auf den Objektträger gegeben wird, kein gefärbtes Gamraaglobulin haften bleiben, weil kein Humangammaglobulin vorhanden ist. Somit wird nach dem erneuten Waschen kein gefärbtes Garansaglobulin. zurückbleiben, so daß keine Fluoreszenz auf dem gewaschenen Präparat zu erkennen ist.

Erfindungsgemäß wurde definitiv festgestellt durch umfangreiche Experimente, daß das oben beschriebene Verfahren befriedigend arbeitet bei der Identifizierung von wenigstens einer Krebsart, nämlich Malignant-Melanoma, Weitere Untersuchungen im Bereiche des Krebses der Leber, des Darmes und des Gehirns haben sich außerordentlich günstig und positiv erwiesen» Das erfindungsgemäße Verfahren stellt einen fundamentalen Beitrag zur Krebsdiagnose und zur Isolierung der Krebsquellen der Malignancy dar.

Die Erfindung kann so ausgeübt werden, daß mit ihr die Diagnose für Krebserkrankungen de Leber, der Lunge, des Darms, des Gehirns, der Brust, der Gebärmutter, der Lymphknoten, der Haut usw. stellbar ist.

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Claims (6)

1. Patentansprüche

   ( 1./Verfahren zur Diagnose und Klassifizierung von Krebs, dadurch gekennzeichnet, daß ein Versuchsob;jektträger hergestellt wird, der ein Sollpräparat von bekannten Krebszellen trägt, Serum aus dem Slut eines Patienten entnimmt und dieses Serum mit den Sollkrebszellen zur Reaktion bringt, worauf gefärbtes Antibumanglobulin auf diese Sollkrebszellen gebracht wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Sollpräparat, naohdem es mit dem Serum des Patienten zusammengebracht worden ist, gewaschen wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurob gekennzeichnet, daß das Präparat ein zweites Mal gewaschen wird, wenn es mit. dem gefärbtem Antihumanglobulin zusammengebracht worden ist.
4. 4·. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, daduxfa gekennzeichnet, daß das gefärbte Antibumanglobulin, welches auf die Sollkrebszellen aufgebracht wird, fluoreszenzgefärbtes Antihumangammaglobulin ist. .-._■'■
5. 5. Verfahren nach Anepruob 1 bis 4_r dadurob gekennzeichnet, daß naoh der Aufbringung des geiärbttn Antihutaanglobuline

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   auf die Sollkrebszellen diese durch ein Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4» dadurob gekennzeichnet, daß das Blutserum des Patienten mit den Sollpräparatkrebszellen als auch das gefärbte Antihumanglobulin mit den Sollpräparatkrebszellen ;je*?eils für eine Inkubationszeit von etwa 30 Minuten reagieren gelassen werden.

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