DE1905648A1 - Process for the preparation of the dihydroxy derivatives of aromatic carboxylic acids - Google Patents

Description

DA-3171DA-3171

Beschreibung zu der Patentanmeldung der Firma Description of the company's patent application

SUN ΟΠ. COMPANY 1608 Walnut Street, Philadelphia, PA 19103, U.S.A.SUN ΟΠ. COMPANY 1608 Walnut Street, Philadelphia, PA 19103, U.S.A.

betreffendconcerning

Verfahren gun Herstellen deg Dihydroxyderivete von aromatischenProcess gun Manufacture deg Dihydroxyderivete of aromatic Carbonsäuren.Carboxylic acids.

Priorität vom 8. Febr. 1968, Nr. 703 870, V.St.v.A., 8. Jen. 1969, Nr. V.St.v.A.Priority dated February 8, 1968, No. 703 870, V.St.v.A., 8. Jen. 1969, No. V.St.v.A.

Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobiologische Hydroxylierung von unsubstituierten und substituierten Benzoesäure^ Salzen oder Estern dieser Benzoesäure^ die mindestens zwei unsubstituierte, einander benachbarte Ringkohlenstoffetome besitzen, durch die Einwirkung eines induzierten Mikroorganismus der Art Nocardie, der normalerweise nicht fähig ist, eine solche Umwandlung zu bewirken.The invention relates to microbiological hydroxylation of unsubstituted and substituted benzoic acid ^ salts or esters of this benzoic acid ^ the at least two unsubstituted, adjacent ring carbon atoms due to the action of an induced microorganism of the type Nocardia, which is normally not able to to effect such a transformation.

Die US-Patentschrift 3 383 289 beschreibt ein Verfahren zurU.S. Patent 3,383,289 describes a method for

mikrobiologischen Oxydation von metbylsütstitaierten Benzolkohlenwasserstoffen durch verschiedene Arten, v®& MocBvß±m_$ wobei unter anderem ein Gemisch aus den emcaprecüandeiv. nlehfrhydroxylierten Benzoesäuren und den entspraehentsB verbindungen dieser Benzoesäuren gebildet wird* Bau wirtschaftlich wertvollere dieser beiden orheltsnsr Produkte die Dihydroxy verbindung« Es wurden jedoch in Jadais Pail bei Bildung der Bihydroxyverbindung wesentliche Mtsile de? ent-= sprechenden nieht-hydroxylierten Verbindung issoIisTt. All® Versuche, diese nicht-hydroxyliertea Hebsaproä^te auf mite© biologischem Weg in die wertvolleren Dihydro^ssrfeonsäuren Biiwandeln, ■ erwiesen sich bisher als billig s^SOlglos^ da ä raechenderweisa die Hocardiaspeaies₈ di© sbs» BiMtsng eine© Biieches dieser beiden Produkte aus ilethylfeanzolen fähi sieh su der gewünschten Umwandlung, ausgehend ψ&η ä&n entsprechenden Benzoesäuren, nicht eigneten*microbiological oxidation of methyl-substituted benzene hydrocarbons by various types, v® & MocBvß ± m _$ whereby, among other things, a mixture of the emcaprecüandeiv. nlehfrhydroxylierten benzoic acids and benzoic acids entspraehentsB compounds of this is formed * construction cost of these two orheltsnsr products more valuable the dihydroxy compound "But we de in Jadais Pail in formation of Bihydroxyverbindung essential Mtsile? Corresponding non-hydroxylated compound issoIisTt. All® attempts these non-hydroxyliertea Hebsaproä ^ te organic to mite © way into the more valuable dihydro ^ ssrfeonsäuren Biiwandeln, ■ proved far as cheap s ^ SOlglos ^ because ä raechenderweisa the Hocardiaspeaies ₈ di © sbs "BiMtsng a © Biieches these two Products made from ilethylfeanzenes are capable of the desired conversion, starting from ψ & η ä & n corresponding benzoic acids, unsuitable *

Gemäss der Erfindung soll daher ein neues Verfahren zur Herstellung von Dihydroxybenzoesäuren, ihrer Salze oder Ester aus den entsprechenden unsubstituierten oder methyl- und/oder hslo gensubstituierten Benzoesäurederivaten, die mindestens zwei unsubstituierte, einander benachbarte Ringkohlenstoffatoms bu£ weisen, geschaffen werden. Nach dem erfindungsgemässen Vet^fahr können diese Benzoesäuren durch die Einwirkung verschiedenes? M cardia-Arten, die normalerweise zu einer solchem SsMendlung 133a fähig sind, in. die entsprechenden Dihydrosqjrde^iTS-fe werden.According to the invention, a new process for the preparation of dihydroxybenzoic acids, their salts or esters from the corresponding unsubstituted or methyl- and / or halogen-substituted benzoic acid derivatives which have at least two unsubstituted, adjacent ring carbon atoms bu £ be created. According to the method according to the invention, these benzoic acids can do different things through the action? M cardia species, which are normally capable of such a transformation, become into the corresponding dihydrosquids.

_ ρ —_ ρ -

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Gegenstand der Erfindung 1st ein Verfahren zum Herstellen der Dihyftroxyderivate von aromatischen Carbonsäuren, das dadurch gekennzeichnet ist, does ηβη in einem Nähtmedium eine Kultur einer normalerweise nicht mr Hydroxylierung von Benzoesäuren befähigten Nocardia-Spezies herstellt, auf diese Kultur unter •eroben Bedingungen ein« Verbindung einwirken lässt, welche dl« Hooerdie-Zellen ζην Hydroxylierung induziert und daneoh Benasoesäuren, Salze von Beneoesäuren oder niedere Alkylester von Bensoeeäuren, die O bis 3 Hethylreste und/oder Halogeaetooe eis Ringsubstituenten und mindestens zwei einander benachbarte uoeubstituierte fiingkohlenstoffatome aufweisen, unter 8eroben Feraentetionsbedingungen der Einwirkung der Induzierten. Nooardiezellen eussetat*The subject of the invention is a process for producing the dihyftroxy derivatives of aromatic carboxylic acids, which is characterized in that a culture of a Nocardia species normally not capable of hydroxylation of benzoic acids is produced in a sewing medium and a compound acts on this culture under conditions leaves, which induces the Hooerdie cells ζην hydroxylation and daneoh benazoic acids, salts of beneoic acids or lower alkyl esters of benzoic acids which have 0 to 3 methyl radicals and / or halogenated metal ring substituents and at least two adjacent substituted carbon atoms under the action of the ferric carbon atom Induced. Noardie cells eussetat *

Sie als Ausgangsstoffe verwendeten Benzoesäuren oder Benzoesäurederivate können, gleiche oder verschiedene Ringsubstituenten enthalten. Bevorzugte SaIbθ sind die Alkellsolse der Bensoesäuren·The benzoic acids or benzoic acid derivatives used as starting materials can contain identical or different ring substituents. Preferred SaIbθ are the alkali sols Benzoic acids

Die Verbindung, welche die Nocardiesellen zur Hydroxylierung induziert, insbesondere eine aromatische oder helogensubstituierte aromatische Verbindung, lässt man während einer eus- ^v reichenden Seit auf den Mikroorganismus einwirken, um des Enzymsyetem des Mikroorganismus für die Hydroxylierung zu. induzieren.The compound that induces Nocardiesellen for hydroxylation, and in particular an aromatic or helogensubstituierte aromatic compound is allowed during a EUS ^v reaching Since act on the microorganism to the Enzymsyetem of the microorganism for the hydroxylation. induce.

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Dse erfindungsgemässe Verfahren kann bequem derart durchgeführt werden, dass man zunächst In einem Nährmedium eine Kultur von Hocerdiaaellen herstellt, die normalerweise zur Hydroxylierung von Benzoesäuren nicht fähig sind, deren Enzymsystem jedoch dözu induziert werden kenn, und dass man danach diese Zellen induziert, indem man einer Dispersion dieser Zellen eine zum Induzieren der Hydroxylierung ausreichende Menge einer nachstehend näher beschriebenen induzierenden Verbindung zusetzt. Dieser Zueetz erfolgt unter Kulturbedingungen und die Verbindung wird während einer Dauer in Berührung mit den Zellen belassen, die ausreicht, dos. Enzymsystem der Zellen für die Dihydroxylierung der genannten Benzoesäuren zu induzieren. Danech werden diese Benzoesäuren oder Benzoesäurederivate in Gegenwart eines Nährmediume unter aeroben 3?erraentetionsbedingungen der Einwirkung der induzierten Zellen.susgesetzt und das Dihydroxyderivat der entsprechenden Benzoesäure aus der Ferment θtionsbrühe isoliert. Wahlweise kann man auch die als Substrat dienende Benzoesäure gleichzeitig mit der induzierenden Verbindung dem Gärmedium zusetzen, unter diesen Bedingungen muss jedoch eine Induktionsperiode von einigen Stunden abgewartet werden, bevor die Bildung der Dihydroxyverbinduns.beobachtet wird.The method according to the invention can conveniently be carried out in this way that you first have a culture in a nutrient medium manufactured by Hocerdiaaellen, normally for hydroxylation are not capable of benzoic acids, but whose enzyme system can be induced to do so, and that one then these cells are induced by making a dispersion of these cells an amount of an inducing compound described in detail below to induce hydroxylation clogs. This Zueetz takes place under culture conditions and the Compound is left in contact with the cells for a period sufficient for the cells' enzyme system To induce dihydroxylation of the benzoic acids mentioned. Danech these benzoic acids or benzoic acid derivatives are in the presence of a nutrient medium under aerobic retention conditions the action of the induced cells Dihydroxy derivative of the corresponding benzoic acid isolated from the fermentation broth. Optionally you can also use it as a substrate Add serving benzoic acid at the same time as the inducing compound to the fermentation medium, under these conditions however, an induction period of a few hours must be waited for before the formation of the dihydroxy compounds is observed will.

Zur Herstellung einer für das erfindungsgemässe Verfahren ge-· eigneten Kocerdiespezies wird vorzugsweise eine Kulturprobe ^: von einer Agar-Schrägkultur in einen Schüttelkolben überführt,To produce a Kocerdia species suitable for the process according to the invention, a culture sample is preferably ^{: transferred} from an agar slant culture into a shake flask,

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der ein geeignetes Nähreadiua snfcli&lü, das eine Kohlanstoffquellö umfasst, auf der der Organismus wachson kann» In einigen Fällen kann die Anwesenheit Gines zusätzlichen Wachstumsstimulierenden Mittels, wie Pepton, Rindfleisehestrakt, Hefeext rakfe etc» wünschenswert sein,, wenn auch der Zusatz dieser Stoffe nicht wesentlich ist. Das Gemisch wird dann bei etwa 3O⁰O inkubiert. In Abhängigkeit von der Konzentration der Zellen gibt man die induzierende Verbindung entweder sofort oder nach einer Inkubationsdauer von etwa 24· Stunden der wachsenden Kultur zu·which contains a suitable nutrient adiua snfcli & lü, which comprises a carbon source on which the organism can grow. In some cases the presence of additional growth-stimulating agents, such as peptone, beef rakfe, yeast extract, etc., may be desirable, although the addition of these substances may not be essential is. The mixture is then incubated at about 3O ⁰ O. Depending on the concentration of the cells, the inducing compound is added to the growing culture either immediately or after an incubation period of about 24 hours.

Wie erwähnt, muss das Nährmediura, das mit dem gewählten Organismus beimpft wird, zusätzlich zu dem anorganischen Nähretoff und einer Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle enthalten, die den Organismus ausserdem mit Energie versorgt. Im allgemeinen können zwar beliebige, ©ine Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle in Kombination enthaltende organische Substanzen verwendet v/erden, wie beispielsweise Kohlehydrate, oder Fettsäuren; vorzugsweise werden jedoch Kohlenwasserstoffe verwendat, insbesondere η-Paraffine mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, wie η-Butan, n-Dodecan,oder 3ls besonders bevorzugte Verbindung n-Hexadeaan. In Abhängigkeit von dem gewählten Stamm des Mikroorganismus können stattdessen wahlweise gewisse aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, verwendet werden. Die.Kohlenstoff quelle, wie beispielsweise n-Hexadecan, kann in einem Anteil unmittelbar vor dem Beimpfen des Mediums zugesetzt werden.As mentioned, the nutrient mediura must be related to the chosen organism inoculated will contain a carbon source in addition to the inorganic nutrient and a nitrogen source, which also supplies the organism with energy. In general, any carbon and hydrogen source can be used in combination containing organic substances used, such as carbohydrates, or fatty acids; however, hydrocarbons are preferably used, in particular η-paraffins with 1 to 30 carbon atoms, such as η-butane, n-dodecane, or 3ls particularly preferred compound n-hexadean. Depending on the selected strain of the microorganism Certain aromatic hydrocarbons, such as benzene, may optionally be used instead. The. Carbon source, such as n-hexadecane, can be in one portion be added immediately before inoculating the medium.

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Vorzugsweise sollte sie jje&ooh periodisch in kleinen Anteilen wahrend des gesamten Verlaufs der Fermentation zugesetzt werden, um eine Anreicherung dieses Stoffes in dem Medium zu vermeiden, die dem Organismus gegenüber toxisch wirken wurde. Obwohl, in Abhängigkeit von dem Mikroorganismus, die zuzusetzende Menge zu jedem gegebenen Zeitpunkt unterschiedlich sein kann, ist es im allgemeinen wünschenswert, dass zu jeder beliebigen Zeit die Konzentration von n-Hexadecan in dem Ssfäss nicht mehr als etwa 3 nil pro Liter bei einer Gesamtmenge dieser Kohlenstoffquelle von etwa 10 g pro Liter in federn gegebenen Fermentationsansatz beträgt.Preferably it should jje & ooh periodically in small proportions added during the entire fermentation process, in order to avoid an accumulation of this substance in the medium, which would be toxic to the organism. Even though, depending on the microorganism, the one to be added Amount can be different at any given point in time, it is generally desirable that the concentration of n-hexadecane in the vessel is not at any given time more than about 3 nil per liter for a total of this carbon source of about 10 g per liter in feathers given fermentation batch amounts to.

Die dem Nährmedium zugesetzte Stickstoffquelle kann eine beliebige anorganische oder organische Stickstoff enthaltende Verbindung sein, die Stickstoff in einer für den Stoffwechsel des i-Ukroorganismus nutzbaren Form aufweist, wie Proteine, Aminosäuren» Amraoniuneulfat, Ammoniumphosphst, Harnstoff oder ähnliche.The nitrogen source added to the nutrient medium can be any inorganic or organic nitrogen containing Be a compound that has nitrogen in a form that can be used for the metabolism of the i-ukroorganism, such as proteins, Amino acids »ammonium sulphate, ammonium phosphate, urea or similar.

Der anorgsnische Nährstoff sollte wasserlöslich sei'n und eine geeignete Quelle für Mineralstoffe, vorzugsweise in Form ihrer Salze, darstellen, wie Eisen-, Natrium- und Phosphorverbindung· gen. Ein Beispiel eines geeigneten Nährmediums, das zusätzlich zu der Kohlenstoff enthaltenden Energiequelle verwendet wird, hat die folgende Zusammensetzung:The inorganic nutrient should be water-soluble and one represent a suitable source of minerals, preferably in the form of their salts, such as iron, sodium and phosphorus compounds gen. An example of a suitable nutrient medium that additionally is used to the carbon-containing energy source, has the following composition:

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Gramm pro Liter V/osBerGrams per liter V / osBer

HernstoffHernia 2,02.0 Hefeertrakt (Difco)Yeast tract (Difco) 0,50.5 Mg SO₄.7H₂OMg SO ₄ .7H ₂ O 0,20.2 He₂OO₅ He ₂ OO ₅ 0,10.1 OaOl₂*2HgOOaOl ₂ * 2HgO 0,010.01 MnSO₄.HgOMnSO ₄ .HgO 0,020.02 FeSO_n-TH₀OFeSO _n -TH ₀ O 0,0050.005 KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 0,80.8 Na₀HPO₀ Na ₀ HPO ₀ 1,21.2

Der Sauerstoff kann dem Fermentetlonsme&ium in jeder beliebigen Form zugeführt werden, die bequem durch den Organismus assimilierbar ist. Vorzugsweise sollte Sauerstoff in Gasform entweder durch Leiten von Sauerstoff oder Luft durch das flüssige Hedium oder durch kräftiges Rühren des Mediums oder auf . beiden Wegen zugeführt werden.The oxygen can be supplied to the fermentation metabolism in any form that is convenient for the organism is assimilable. Preferably, oxygen should be in gaseous form either by bubbling oxygen or air through the liquid hedium or by vigorously stirring the medium or on. both ways are fed.

Die Temperatur, bei der die Fermentation sowohl vor als euch nach der Zugabe des Substrate durchgeführt wird, kann zwischen etwa 20 und 4-5°0 variiert werden und beträgt vorzugsweise 25 55°O, um ein entsprechendes Wachstum des Organismus zu gewährleisten. Der pH-Wert des Fermentationsmediums sollte innerhalb eines Bereiches von 5»5 - 9,5 und vorzugsweise 7,0 - 8,5 gehalten werden. Im Verlauf der Fermentation sind häufig Elnstel*The temperature at which the fermentation takes place both in front of you is carried out after the addition of the substrate, can be varied between about 20 and 4-5 ° O and is preferably 25 55 ° O, to ensure adequate growth of the organism. The pH of the fermentation medium should be within within a range of 5 »5 - 9.5 and preferably 7.0 - 8.5 will. In the course of the fermentation, Elnstel *

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lungen erforderlich, um den pH-Wert innerhalb der bevorzugten Bereiche zu halten. Dies erfolgt im ellgemeinen durch periodische Zugebe ausreichender Mengen eines Alkalihydroxyds» Die auf des anfängliche Einführen des Substrats in des vorgebildete Pefimentetionsme&ium folgende Permentationsperiode, welche die zweite Stufe des erfinduagsgemässen Verfahrens darstellt, sollte etwe 24· bis 84 Stunden und vorzugsweise etwa J6 bis 60 Stunden dauern. .lungs required to keep the pH within the preferred Areas to hold. This is generally done by periodically adding sufficient quantities of an alkali metal hydroxide on the initial introduction of the substrate into the preformed pefimentetionsme & ium following the permentation period, which represents the second stage of the process according to the invention, should be about 24 to 84 hours and preferably about 6 to 60 hours Take hours. .

Verbindungen, die sich eis geeignet erwiesen heben, die Enzymeysteme von Nocardie eo zu induzieren, dass diese zur Umwandlung von Benzoe3äurederiv8ten in die entsprechenden Dihydroxyverbindungen befähigt sind, sind aromatische oder halogeniert® aromatische Kohlenwasserstoffe mit mindestens einem aromatischen Ring, der nicht mehr als einen Hslogensubstituenten aufweist. Es ist wünschenswert, wenn auch nicht wesentlich, dass 'diese induzierenden Verbindungen mindestens zwei einander benachbarte unsubstituierte Ringkohlenstoff atome -enthalten« for=- zugsweis© sollten diese induzierenden .Verbindungen,-nicht flllcM-t;ig und durch den Nocardiaorganismus nicht abbaubar sein, we|öi.^; auch ä.iesö Bedingung nicht wesentlich ist. ^: :. ^ νCompounds that have been found to be suitable for inducing the enzyme systems of Nocardie eo so that they are capable of converting benzoic acid derivatives into the corresponding dihydroxy compounds are aromatic or halogenated aromatic hydrocarbons with at least one aromatic ring that does not have more than one hash substituent . It is desirable, although not essential, that these inducing compounds contain at least two adjacent unsubstituted ring carbon atoms - for = - these inducing compounds should not be full and should not be degradable by the nocardia organism, we | öi. ^; also the Ä.iesö condition is not essential. ^::. ^ ν

Beispiele für Verbindungen, die iiocardiaselien in stellender Weise zur Hydroxylierung von BensoesättradeiiTOtÄ, induzieren sind Kohlenwasserstoffe, wie p-Xylol^ 3a~Sylol_s ■ o-Xylol, 0?oluol, Benzol, Diphenyl, Naphthalin, 2-M©thyln&pla~Examples of compounds that iiocardiaselien in sites of way for the hydroxylation of BensoesättradeiiTOtÄ induce hydrocarbons, such as p-xylene ^ 3 ~ Sylol _s ■ o-xylene, 0? Oluol, benzene, diphenyl, naphthalene, 2-M © thyln & pla ~

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thalin und Tetralin, halogeniert© Kohlenwasserstoffe wie p-Ghlortoluol oder OhlorbenBol. Vorzugsweise werden dies© Verbindungen den wachsenden Nooardiazellen vor der Zugebe dec als Substrat dienenden Benzoesäure in einer die Hydroxylierung induzierenden Menge zugesetzt. Die Mengen werden Jedoch so gewählt, dass sie dem Mikroorganismus gegenüber nicht toxiaoh sind. Diese zugesetzten Mengen hängen von dem induzierenden Stoff und dem verwendeten Mikroorganismus ab, vorzugsweise sollte Jedoch in dem Fermentetionsmedium ein Anteil von mehr als fünf Teilen pro MIl. Teile des Mediums und vorzugsweise etwa 20 bis 200 Teile pro Mill. Teile des Mediums vorliegen. Die induzierende Verbindung v/ird vorzugsweise in einer solchen Menge zügesetzt, dass diese Konzentrationen in dem Medium bis zur vollständigen Induzierung, die in Abhängigkeit von der W8chstumsgesohwindigkeit dös Mikroorganismus etwa 1 bis 12 Stunden beträgt, aufrechterhalten werden. · Thalin and tetralin, halogenated © hydrocarbons such as p-chlorotoluene or OhlorbenBol. These are preferably © connections the growing Nooardia cells before adding dec Benzoic acid serving as substrate was added in an amount which induces hydroxylation. The quantities will however chosen so that they are non-toxic to the microorganism are. These amounts added depend on the inducing substance and the microorganism used, preferably should a proportion of more than five in the fermentation medium Share per ml. Parts of the medium and preferably about 20 to 200 parts per million parts of the medium are present. The inducing compound is preferably added in an amount such that that these concentrations in the medium are fully induced, which depends on the rate of growth dös microorganism is about 1 to 12 hours. ·

Die au hydroxylierenden Benzoesäure-Substrate sind., wie bereits beschrieben^ Verbincluasren mit 0 bis 3 f-iethyl- und/oder Halogensubstitiienten am aromatischen Hing, die ausserdem mindestens zwei nicht-substituierte, einander benachbarte Ringkohlenstoffatome aufweisen. Beispiele für erfindungsgemäss als Substrats verwendbare Benzοβsäuren sind Verbindungen wie Benzoesäure, p-Toluylsäure, o-Toluylsäure, m-Toluylsäure, 2,5-Dimeth,,lDenzoesäure, ^,J-Dimethylbenzoesiliire, 2,3* ^-T rime thy 1-benzoesäure, 3-Methyi-4-chlorbenzoesäure, p-OhlorbenzoesäureThe benzoic acid substrates are also hydroxylated, as already described ^ Verbincluasren with 0 to 3 f-iethyl- and / or Halogen substituents on the aromatic Hing, which are also at least two unsubstituted, adjacent ring carbon atoms exhibit. Examples of the invention as Benzoic acids that can be used as substrates are compounds such as benzoic acid, p-toluic acid, o-toluic acid, m-toluic acid, 2,5-dimeth ,, l-benzoic acid, ^, J-Dimethylbenzoesiliire, 2,3 * ^ -Trime thy 1-benzoic acid, 3-methyl-4-chlorobenzoic acid, p-chlorobenzoic acid

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und ähnliche Verbindungen oder deren Alkalisalae oder die ■ entsprechenden ^niederen-Allylester,, die-1 bis.Ö.Kohlenstoffatome in den Alkylresten aufweisen«, Da dos■" Medium- vorzugsweise bei-einem" neutralen pH-Wart oder eine» höheren pH-Wert gehalten werden muss, liegt natürlich bei Verwendung der freien Säure selbst dies© im Rösktionsmedium in 3?orm ihres : Salzes vor. Die niederen Alkylester, die unter diesen Fermen~^:.-tationsbedingungen im wesentlichen nicht-hydrolysierbsr sind, können gewünsehtenfalls'auch verwendet werden.and similar compounds or their alkali metal or the corresponding lower allyl esters, which have 1 to 0 carbon atoms in the alkyl radicals, because the medium is preferably at a neutral pH or a higher pH Value must be maintained, when using the free acid itself this is of course in 3? Form of its salt in the dissolution medium. The lower alkyl esters, which under these Fermen ^{~:.-Tationsbedingungen} are substantially non-hydrolysierbsr, can be used gewünsehtenfalls'auch.

Wenn man die genannten Verbindungen der.Einwirkung der induzierten Nocardisaellen aussetzt, erhält man die entsprechen·^ den Dihydroxybenzoesäuren, wie ©!hydroxybenzoesäuren 2,3-Dihydroxy~p-toluylsäure, 2,3-Dihydroxy-4,e-dimethylbenaoesäure, D±hydroxy-5»6-dimethylbenzoeßäure, 2,3-Di'hydroxy-4-ehlor-5-r methylbenzoesäure, ^jJ-Diliydroxy-p-ohlorbenzoesäure,-- 2_r3-Dihy~ droxy-p-chlorbenzoesaur¹© und 2,3-Dihydroxy-^i-_t5»6-trimethyi.b.ensoesäure, -im allgemeinen in Form ihrer Seize oder Ester.If the compounds mentioned are exposed to the action of the induced Nocardi cells, the corresponding dihydroxybenzoic acids, such as 2,3-dihydroxybenzoic acids 2,3-dihydroxyp-toluic acid, 2,3-dihydroxy-4, e-dimethylbenzoic acid, are obtained hydroxy-5 '6-dimethylbenzoeßäure, 2,3-Di'hydroxy-4-ehlor-5-methylbenzoic r, ^ JJ-Diliydroxy-p-ohlorbenzoesäure, - _r 2 3-dihydroergotamine ~ droxy-p-chlorbenzoesaur ¹ © and 2,3-Dihydroxy- ^ i- _t 5 »6-trimethyi.b.ensoic acid, -generally in the form of its seize or ester.

Die als Substrat .verwendete- Benzoesäure v-ärd bevorzugt dem Feriaentationsinedium periodisch in kleinen Anteilen während dar gesamten auf die Induktionsperiode folgenden Ferraentationsperiode zugesetzt-und diese Zugabe.erfolgt-vorzugsweise in Form der wasserlöslichen Salze. Zusammen mit 'dem Substrat sollten geringe Mengen der beschriebenen Kohlenstoffquelle, wie n~fiexadecan-," zugefügt-werden. Die Menge jedes dem Medium zugesetz-The benzoic acid used as a substrate is preferred to the Feriaentation medium periodically in small proportions during total fermentation period following the induction period added - and this addition takes place - preferably in the form of the water-soluble salts. Along with 'the substrate should be low Amounts of the carbon source described, such as n ~ fiexadecan-, " to be added. The amount of each added to the medium

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tea Substrstsnteils liegt* iia Bilgemeinen Am Bereich von 0,2 bis 0,5 S pro Liter und beträgt vorzugsweise weniger als etwa 1 g pro Liter.The substrate part lies * iia Bilgemeinen Am range of 0.2 to 0.5 S per liter and is preferably less than about 1 g per liter.

Die !^hydroxyverbindungen werden aus dem Peroeatatloneoiediüm bequem auf übliche Weise gewonnen« So können beispielsweise die Zellen durch Zentrifugieren oder Filtrieren aus der Flüssigkeit abgetrennt und die klare Flüssigkeit angesäuert und mit. einem geeigneten Lösungsmittel wie Äther, Dioacen oder Amylecetat extrahiert werden.The! ^ Hydroxy compounds are derived from the Peroeatatloneoiediüm conveniently obtained in the usual way «For example the cells are separated from the liquid by centrifugation or filtration and the clear liquid is acidified and with. a suitable solvent such as ether, dioacene or Amyl acetate can be extracted.

Erfindungsgemäss verwendbare.Wocerdiaerten sind solche, die. normalerweise nicht fähig sind, eine Benzoesäure in die ent~ sprechende Mhydroxyverbindung zu überführen, deren Enzymsysteme .jedoch wie beschrieben dazu induziert werden können« Ein erfindungsgemäss bevorzugter Mikroorganismus ist Nocardia Sslmonicolor, ATCO, Nr. 19,14-9. .According to the invention, usable.Wocerdiaerten are those which. are not normally able to convert a benzoic acid into the ent ~ to convert the speaking mhydroxy compound, their enzyme systems . However, as described, it can be induced to do so. A microorganism preferred according to the invention is Nocardia Sslmonicolor, ATCO, No. 19, 14-9. .

Andere, ebenfslls geeignete Hocsrdiaspeaies sind in der US-Patentschrift 5 383 289 beschrieben, die verschiedene Nqcardisspezies angibt, die zur Oxydation von Hethylbenaolen fähig sind, iis können vorteilhsft folgende weitere Nocsrdiaärteii verwendet werden, die iß Bergey^ Möftual klassifiziert und ausserdem in der Araericaa fypeöultüre Collection, Washington, B.G. niedergelegt sind, Other equally suitable high standards are described in the US patent 5,383,289 describes the various Nqcardis species indicates which are capable of the oxidation of Hethylbenaolen are, iis can benefit the following additional Nocsrdiaärtii be used, the iß Bergey ^ Möftual classified and also in the Araericaa fypeöultüre Collection, Washington, B.G. are laid down,

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(1) Ein aus Erde In Alabama gewonnener Wildstamm, dessen Charafcteristik8 etwa denen in Bergey¹ β Manual für Nocardia Gorallina angegebenen entsprechen und der daher ale diese Spezies klassifiziert wurde. Eine Kultur dieses Stammes wurde (1) A wild strain obtained from soil in Alabama, whose characteristics8 correspond roughly to those given in Bergey ¹ β Manual for Nocardia Gorallina and which has therefore been classified as all of these species. A culture of this tribe became

. unter der lit. ATOG 19·Ο7Ο in der American Type Culture Collection in Washington, D.O. niedergelegt. Kolonien dieses Mikroorganismus weisen eine orange Färbung auf.. under the lit.ATOG 19 · Ο7Ο in the American Type Culture Collection in Washington, D.O. laid down. Colonies of this microorganism are orange in color.

(2) Eine durch ultrsviolette Bestrahlung von ATOO Wr. 19.070 erhaltene rötlich gefärbte Mutante. Die Mutente wurde eben·- : falls In der American Type Oulture .-Collection- niedergelegt und als ATGO Nr. 19.071 bezeichnet.(2) An ultraviolet irradiation of ATOO Wr. 19,070 preserved reddish colored mutant. The Mutente just became -: if deposited in the American Type Oulture. -Collection- and designated ATGO No. 19,071.

(3) Kin aus Pennsylvaniaerde isolierter und ebenfalls als Nocardia Oorallina klassifizierter Stamm. Dieser· Hikroorganisraus ist v/ie der zuerst genannte Wildstainm orange gefärbt_f: unterscheidet sich von diesem Jedoch durch die enzymatisehen Qxyd8tionseigenschaften. Die niedergelegte Kultur dieses ■Stammes wurde als AiGC Nr. 19.14-9 bezeichnet. ;(3) Kin isolated from Pennsylvania soil and also classified as Nocardia Oorallina. This · Hikroorganisraus v / ie the former Wildstainm orange colored _f: different from this, but by the enzymatisehen Qxyd8tionseigenschaften. The deposited culture of this ■ strain was designated AiGC No. 19.14-9. ;

'(&) Ein weiterer aus Erde isolierter Stamm, in Bergeyls Mienual öle Nocardia Minima klassifiziert und mit ATGG Kr. $M bezeichnet. .-■■; · : . · '-'(&) Another strain isolated from soil, classified in Bergeyl's Mienual oils Nocardia Minima and designated ATGG Kr. $ M. .- ■■; ·:. · '-

Zusätzlich zu den angegebenen Spezies umfasst die Erfindung die Verwendung anderer Noc8rdia-8pesies, deren Eignung fürIn addition to the specified species, the invention encompasses the use of other Noc8rdia-8pesies whose suitability for

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909835/1547 ;°909835/1547; °

das ©rfindungsgemäese Verfahren mit Hilfe beschriebener Methoden auf einfache Weise routinomägsig featgeatellt werden kann. Diese Spezies sollen die konstituiven Mutenden der oben definierten Nocardiamikroorganismen umfassen. Dabei sollen unter dem Ausdruck "!Constitutive Mutenten" auegewählte Organismen verstanden, werden; die aus einer Spezies,, die normalerweise die gewünschte Umwandlung in Abwesenheit eines induzierenden Stoffes nicht bewirkt, durch Mutation zu einer Spezies entstanden sind, die diese Umwandlung ohne die swingende Anwesenheit eines induzierenden Stoffes bewirkt, Beispiele für andere Arten konstitutiver Mutanten und für Verfahren zur Herstellung .dieser Mutanten sind bekannt und beispielsweise in Bioöhim. Biophys.Acta, 90 (1964) 609-610 beschrieben. the method according to the invention using the methods described be featured in a simple and routine manner can. These species are said to be the constituent mutants of the include nocardia microorganisms defined above. Included should be chosen under the expression "! Constitutive Mutenten" Organisms are understood; those of a species, the normally the desired conversion is not effected in the absence of an inducing substance by mutation to one Species have emerged which effect this conversion without the swinging presence of an inducing substance, examples of other types of constitutive mutants and of processes for the production of these mutants are known and for example in Bioöhim. Biophys. Acta, 90 (1964) 609-610.

Ausführungsformen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen genauer verdeutlicht.Embodiments of the invention are illustrated in more detail in the following examples.

Beispiel 1 ' Example 1 '

In einem sterilen Fermenter der Nonnalkspazitat 60 1 wurden 32 1 des im folgenden beschriebenen sterilisierten kohlengtoffreien Mediums hergestellt. Zu diesem Zweck wurden 3 Ansätse von Bestandteilen getrennt im Autoklaven behandelt: eine 50 #-ige (Gewicht pro Volumen) Harnstofflösung, eine Lösung eines Phosphatgemisches und eine Lösung der übrigen Salze:In a sterile fermenter the normal capacity 60 1 were 32 1 of the sterilized carbon dioxide-free described below Medium produced. For this purpose 3 approaches were made Treated separately from components in the autoclave: a 50 # (weight per volume) urea solution, a solution of a phosphate mixture and a solution of the remaining salts:

909835/ 15 4 7909835/15 4 7

BADORiQtNALBADORiQtNAL Gramm pro. Liter WasserGrams per. litre water

HernetoffHernetoff 2,02.0 Hefeextrakt (Difco)Yeast extract (Difco) 0,50.5 Mg ao₄.7H₂oMg ao ₄ .7H ₂ o 0,20.2 0,10.1 OsOl₂.2H₂OOsOl ₂ .2H ₂ O 0,010.01 MnSO₄.H₂OMnSO ₄ .H ₂ O 0,020.02 PeSO^.7H_o0PeSO ^ .7H _o 0 0,0050.005 2 42 4 0,80.8 Ne₂HPO₄ Ne ₂ HPO ₄ 1,21.2

Der Fermenter war ein mit Zwischenwand versehener Kessel aus rostfreiem Steh! mit 30,5 cm Innendurchmesser, der mit einem beschaufelten !Turbinenrad von 15*2 cm versehen war. Der Fermenter wurde bei 3O⁰O betrieben, wobei sterile Luft in einer Menge von 0,33 Volumenteilen pro Volumenteile pro Minute eingeführt und eine Rührgeschwindigkeit von 500 UPM aufrechterhalten wurde. Der Fermenter wurde mit 3 1 einer kräftigen 48 Stunden alten Kultur von ffocardie -aelmonicolor, ATCC Nr. 19.14-9 inokuliert. Diese Kultur war in einem ähnlichen Gefäss in dem gleichen Medium hergestellt worden, dem n-Hexedecan kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 5 ml pro Stunde pro Kessel während der ersten 8 Stunden und 10 ml pro Stunde pro Kessel während der 18. bis 48. Stunde zugefügt worden war. Ίη. den Fermenter wurde n-Hexadecan kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 5 "ml pro Stunde pro Kessel vom Beginn bis ζην 6,The fermenter was a standing stainless steel kettle with a partition! with an inner diameter of 30.5 cm, which was provided with a bladed turbine wheel of 15 * 2 cm. The fermenter was operated at 30 ⁰ O with sterile air being introduced in an amount of 0.33 parts by volume per part by volume per minute and a stirring speed of 500 rpm being maintained. The fermenter was inoculated with 3 liters of a vigorous 48 hour old culture of ffocardie -aelmonicolor, ATCC No. 19.14-9. This culture was made in a similar vessel in the same medium to which n-hexedecane was continuously added at a rate of 5 ml per hour per kettle for the first 8 hours and 10 ml per hour per kettle for the 18th to 48th hours had been. Ίη. the fermenter was n-hexadecane continuously at a rate of 5 "ml per hour per boiler from the beginning to ζην 6,

- 14 - -■■■"- 14 - - ■■■ "

909 835/1547909 835/1547

Stunde und 10 ml pro Stunde pro Kessel während der 6. bis 17· Stunde zugeführt. In der 17· Stunde, in der ein gemässigtes Wachstum erreicht wurde, stellte man den pH-Wert der Kultur erforderlichenfalls mit Zusätzen von 8 #-iger wässriger NaOH auf 8 ein. In der 17. Stunde wurde ausserdem begonnen, Benzol in einer solchen Rate zuzusetzen, dass der scheinbare Benzolgehelt in der Kultur im Bereich von 75 -'125 mg/1» gemäss der quantitativen Ultraviolettspektralenelyse der Isooctanextrakte der Kultur, aufrechterhalten wurde, Ausserdem wurden in der 17. Stunde der Kultur 20 g p-Toluylsäure, zusammen mit ausreichend NaOH zur Neutralisierung der Säure und zum Auflösen der Säure in Wasser als Nstriumsalz zugesetzt. Die gleichen Zusätze wurden in der 42., 53· und 62. Stunde vorgenommen, um die Konzentration an p-Toluylsäure innerhalb des Bereichs von 2,3 - 0,5 g pro Liter zu halten. Die kolorimetrische Prüfung auf 2,3-Dihydroxy-p-toluylsäure (DHFE) zeigte die Anwesenheit von 0,89 g pro Liter in der 62. Stunde und 1,0 g pro Liter in_: der 70. Stunde. Die Anwesenheit von DHPT wurde eusserdem durch das UV-Spektrum und das typische Beweglichkeitsverhelten und die Reaktion im Papierchromatogramm bestätigt. Wie im Papierchromatogramm beobachtet wurde, verringerte sich der Anteil an p-Toluylsäure im Mess der Anreicherung von DHPI. Versuche, die auf diesen fferraentationsansetZ entsprechende Weise, Jedoch ohne Benzol durchgeführt wurden, zeigten weder einen Verbrauch von p-!E©luylsäure noch Bildung von DHFD.Hour and 10 ml per hour per kettle during the 6th to 17th hour. In the 17 · hour in which moderate growth was achieved, the pH of the culture was adjusted to 8 with additions of 8 # aqueous NaOH, if necessary. In the 17th hour, benzene was also started to be added at such a rate that the apparent benzene content in the culture was maintained in the range of 75-125 mg / l according to the quantitative ultraviolet spectral lysis of the isooctane extracts of the culture 17th hour of culture 20 g of p-toluic acid, together with sufficient NaOH to neutralize the acid and to dissolve the acid in water, added as the sodium salt. The same additions were made at the 42nd, 53rd and 62nd hours to maintain the concentration of p-toluic acid within the range of 2.3-0.5 grams per liter. The colorimetric test for 2,3-dihydroxy-p-toluic acid (DHFE) showed the presence of 0.89 g per liter after 62 hours and 1.0 g per liter _in: the 70th hour. The presence of DHPT was also confirmed by the UV spectrum and the typical mobility ratio and the reaction in the paper chromatogram. As was observed in the paper chromatogram, the proportion of p-toluic acid decreased in the measurement of the accumulation of DHPI. Experiments which were carried out in this way, but without benzene, showed neither consumption of p-luic acid nor formation of DHFD.

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909835/15 47909835/15 47

SO5648SO5648

Beispiel 2Example 2

Ein Fermenter, der 32 1 steriles Medium enthielt, wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, vorbereitet und beimpft* Der Fermenter wurde bei 30⁰O betrieben, wobei sterile Luft mit einer Geschwindigkeit; von 0,20 Vol. Teilen pro Volumenteil pro Minute augeführt und eine Rührgesohwindigkeit von 500 UPM aufrechterhalten wurde. n-Hexadeeen wurde während der ersten 9 Stunden nach der Inokulation kontinuierlich in einer Bote von IQ ml pro Stunde pro Kessel zugeführt. Zwischen der 19. und 22* Stunde wurden 10 g in 40 ml n-Hexedecan gelöstes Diphenyl kontinuierlich zugesetzt und eine gleiche Zugabe wurde zwischen der 57· und 59· Stunde vorgenommen. In der Stunde wurde der pH-Wert der Kultur mit 8 #-iger wässriger Lösung von NaOH suf 8,0 eingestellt und erforderlichenfsllö durch weitere NaOH-Zusätze während des gesamten Versuchs bei diesem Wert gehalten* Zwischen der 22. und 4-5· Stunde wurde eine 20 #-ige (Gev;icht pro Volumen) wässrige Lösung von p*» Toluylsäure (zusammen mit der für Neutralisation der Säure und Lösen in Wasser als Wetriumsalz ausreichenden Menge NeOB) mit einer Geschwindigkeit von 26 ml pro Stunde pro Kessel zugesetzt. Die oberhalb der Gärbrühe befindlichen Flüssigkeiten enthielten gemäss der quantitativen Ultraviolet-tspektrelena^ lyse 1,25 g pro 1 DHPT nach 45 Stunden und 2,0 pro 1 nach 6& Stünden. Die Anwesenheit von DHPT wurde durch das typisöhe-Beweglichkeitsverhalten im Papierchromatogramm undA fermenter containing 32 l of sterile medium was prepared and inoculated as described in Example 1 * The fermenter was operated at 30 ⁰ O, with sterile air at a speed; of 0.20 parts by volume per part by volume per minute and a stirring speed of 500 RPM was maintained. During the first 9 hours after the inoculation, n-Hexadeeen was continuously supplied in a delivery of 1Q ml per hour per vessel. Between the 19th and 22nd hours, 10 g of diphenyl dissolved in 40 ml of n-hexedecane were added continuously and an equal addition was made between the 57th and 59th hour. During the hour, the pH of the culture was adjusted to 8.0 with an 8 # aqueous solution of NaOH and, if necessary, kept at this value by further additions of NaOH throughout the experiment * between the 22nd and 4-5 hours A 20% (weight per volume) aqueous solution of p * »toluic acid (together with the amount of NeOB sufficient for neutralization of the acid and dissolving in water as the wetrium salt) was added at a rate of 26 ml per hour per vessel. The liquids located above the fermentation broth contained, according to the quantitative ultraviolet spectrum analysis, 1.25 g per 1 DHPT after 45 hours and 2.0 per 1 after 6 hours. The presence of DHPT was confirmed by the typisöhe mobility behavior in the paper chromatogram and

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909835/15*909835/15 *

tionen bestätigt« Yerglelohsverauche, die ohne Verwendung von Diphenyl durchgeführt wurden, zeigten keinen Verbrauch von p-Toluylsäure, noch die Bildung von DHFT,tions confirmed «Yerglelohsverauche, which without the use of Diphenyl carried out showed no consumption of p-toluic acid, nor the formation of DHFT,

Beispiel 3Example 3

Eine wachsende Kultur von Nooardla wurde auf die im Beispiel 1 zur Herstellung des Impfansatzes beschriebene Welse hergestellt. Ein Anteil von 35 ^l wurde in einen 300 ml-Kulturkolben überführt, dem 4*5 ml Wasser, 0,5 ml einer wässrigen Lösung von Natrium-p-toluat (8 #, bezogen auf das Gewicht der freien Säure pro Volumen) und 0,05 ml einer 30 #-igen (Vol.-#) Tetralinlösung in n-Hexadecan zugesetzt wurden. Nach 9-stündigem Schütteln der Kultur im Kolben bei 30°ö hatten sich in der Brühe 0,05 g pro Liter DHPO? gebildet. Im Parallelversuch angesetzte Kolben, die kein Natrium-p-tolust oder Tetralin enthielten, zeigten keine DHPT.A growing culture of Nooardla was based on the example 1 prepared catfish described for the preparation of the vaccination. A 35 ^ l portion was placed in a 300 ml culture flask transferred, the 4 * 5 ml of water, 0.5 ml of an aqueous Solution of sodium p-toluate (8 #, based on weight of the free acid per volume) and 0.05 ml of a 30 # (Vol .- #) tetralin solution in n-hexadecane were added. To Shaking the culture in the flask at 30 ° for 9 hours resulted in 0.05 g per liter of DHPO? educated. In a parallel experiment attached flasks that do not contain sodium p-tolust or tetralin did not show DHPT.

Beispiel 4- ■ Example 4- ■

Eine wachsende Kultur von Nocardia wurde auf gleiche Weise wie in. Beispiel 1 in einem Fermenter gezüchtet und p-Xylol ausgesetzt, ohne dass jedoch p-iPoluat zugegeben wurde. Nach 7-stündigera Kontekt mit p-Xylol wurde eine Probe von 240 ml aus dem Permentar¹ entnommen, die Zellen aus der Brühe durch Zentrifugieren entfernt, einmal durch Suspendieren in 240 ml eines kohlenstoffreien I'!inerals8lzmediums gewaschen, erneut zentri-A growing culture of Nocardia was grown in a fermenter and exposed to p-xylene in the same manner as in Example 1, but without adding p-ipoluate. After contact with p-xylene for 7 hours, a sample of 240 ml was taken from Permentary ¹ , the cells were removed from the broth by centrifugation, washed once by suspending in 240 ml of a carbon-free mineral oil, centrifuged again.

' ~ ^1? "" 909 835/1547'~ ^1? "" 909 835/1547

fügierfc und sehliesslich wieder in 240 ml des gleichen Mediums suspendiert. 35 ml diasei? ZellBuspension wurden in einen KuI-tmrkolben gegeben, dem men 0,5 ml einer wässrigen Natrium-ptfoluetlöaung (8 #, bezogen euf des Gewicht der freien Säure pro Volumen) zusetzte. Neoa 1-stündigem Schütteln der.Kolben-" kultur bei 50⁰O wurde die Anwesenheit von 0,15 g DHPT pro 1 in der Brühe festgestellt. Eine auf gleiche Weise erhaltene Kultur, aus der jedoch Natrium-p-toluat weggelassen wurde, zeigte kein DHPT. Ausserdem zeigten euf gleiche Weise, jedooii ohne Zusatz von p-Xylol, während des Wachsbumsstadiums dep Fermentation erhaltene Zellen, keine Fähigkeit, N8trium-p~ toluet in DHPT zu überführen, wenn sie auf gleiche Weise wi® die mit p-Xylol behandelten Zellen nach dem Waschen im KoI-benvepsuch geprüft viurden.added and finally resuspended in 240 ml of the same medium. 35 ml diasei? Cell suspension was placed in a cooling flask, to which 0.5 ml of an aqueous sodium ptfoluet solution (8 #, based on the weight of the free acid per volume) was added. NeoA 1 hour shaking der.Kolben- "culture at 50 ⁰ O the presence of 0.15 g per 1 DHPT in the broth was found. A culture obtained in the same manner, however, was omitted from the sodium-p-toluate, showed no DHPT.In addition, cells obtained without the addition of p-xylene during the growth stage of fermentation showed no ability to convert N8trium p-toluene into DHPT when they were in the same way as those with p-xylene treated cells were tested after washing in the KoI benvepsuch.

Beispiel 5Example 5

Die in Beispiel 3 beschriebenen Terfahrensschritte wurden mit der Ausnahme wiederholt, dass Tetralin durch m-Xylö'l ersetzt vnirde und der Kolben sofort mit einem Korkstopf©n verschlössen wurde. ·ίίθch 22 Stünden wurden in der Brühe 0,02 g DHPT pro 1 festgestellt. In dem Yergleiohskolben, der kein n-Xylol enthielt, wurde keine DEPS gebildet.The method steps described in Example 3 were carried out using the exception repeated that tetralin was replaced by m-xylene oil vnirde and immediately close the flask with a cork stopper became. · Ίίθch 22 hours were 0.02 g DHPT in the broth per 1 noted. In the Yergleioh flask, which is not n-xylene contained, no DEPS was formed.

Beispiel 6Example 6

Die Verfahrensschritte des Beispiels 3 wurden wiederholtThe process steps of Example 3 were repeated

- 18 -- 18 -

909835/15Λ7909835 / 15Λ7

der Ausnahme, dees anstelle von Tetralin o-Xylol verwendet wurde und der Solben sofort mit einem Korkstopfen verschlossen wurde. Der verwendete Mikroorganismus war Nocardia Oorallina AiDOC Nr. 19* 14-8. Neon 22 Stunden wurde DHM in einer Konzentration von 0,04- g pro !festgestellt. In dem Vergleiohskolben wurde keine DHPI gefunden·the exception is that it uses o-xylene instead of tetralin and the solvent was immediately closed with a cork stopper became. The microorganism used was Nocardia Oorallina AiDOC No. 19 * 14-8. Neon 22 hours became DHM in one concentration of 0.04 g per! In the comparison flask no DHPI was found

Beispiel 7Example 7

Die Verfahrenssohritte gemäss Beispiel 3 wurden wiederholt, wobei anstelle von Tetralin 2-Methylnaphthalin verwendet wurde. Nach 22 Stunden wurden 0,11 g DHPT pro 1 in der Brühe festgestellt, während in dem Vergleichskolben keine DHFD beobachtet werden konnte« The process steps according to Example 3 were repeated, 2-methylnaphthalene was used instead of tetralin. After 22 hours there was 0.11 g of DHPT per liter in the broth found, while no DHFD could be observed in the comparison flask «

Beispiel 8Example 8

Beispiel 3 wurde unter Verwendung von Naphthalin anstelle von Xetralin wiederholt. JHach 22 Stunden hatten sich 0,11 g DHPO? pro 1 in der Brühe gebildet, während in dem Vergleichs-* kolben keine DHPT beobachtet wurde,Example 3 was repeated using naphthalene in place of xetralin. After 22 hours had 0.11 g DHPO? per 1 formed in the broth, while no DHPT was observed in the control * flask,

Beispiel 9Example 9

Das Verfahren gemäss Beispiel 4- wurde ait der Abänderung wiederholt, dass man anstelle von p~Xylol p-Ohldrtoluol,in dem Kulturferraenter verwendete. Als Mikroorganismus wurdeThe procedure according to Example 4- was followed by the modification repeats that instead of p ~ xylene, p-Ohldrtoluene, in the culture retainer used. As a microorganism was

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9 0 9 8 3 5/ 1 5 k79 0 9 8 3 5/1 5 k 7

Nocardia Minima, ATOC Kr. 19.150 verwendet. In dem Kolben, der die gewasche ZeI!suspension und p-Tolulüt enthielt, wurden neon 1-stündigem Schütteln bei 30°ö 0,11 g DHPT pro T beobachtet. . .Nocardia Minima, ATOC Kr.19.150 used. In the piston which contained the washed cell suspension and p-toluene, were neon shaking for 1 hour at 30 ° ö 0.11 g DHPT per day observed. . .

Beispiel 10 . - Example 10 . -

Die Verfahrensschritte des Beispiele M- wurden wiederholt, wobei in den Kulturversuchen mit gewaschenen Zellen p-Ohlorbenzoleäure verwendet wurde. Der verwendete Mikroorganismus wer Nocardia sp., ATOO Nri 19.070. Nach 1-sttindigem Schütteln bei 30⁰O wurden 0,08 g 2_t3-Mhydro^~4~chlorbenzoeöäüre pro 1 festgestellt. - _The process steps of Example M- were repeated, except that p-chlorobenzenic acid was used in the culture experiments with washed cells. The microorganism used was Nocardia sp., ATOO No. 19.070. After 1 hour of shaking at 30 ^{0 0} 0.08 g of 2 _{tons of} 3-Mhydro ^ ~ 4 ~ chlorobenzoeic acids per liter were found. - _

Beiepiel 11Example 11

Die Verfehrensacliritte des Beiapiels 4 wurden in der Weise v/iederholt, dees man in dem Kulturferment er anstelle von p-Xylol Toluol verwendete. Der verwendete Mikroorganismus war Nocardi.8 sp. A0?OG Kr. 19.071. Nach 22 Stunden wurde DHPT in einer Konzentretion von 0,04 g pro 1 festgestellt. 'The practices of Example 4 were made in the manner v / repetitions, dees one in the culture ferment he instead of p-xylene used toluene. The microorganism used was Nocardi.8 sp. A0? OG Kr. 19.071. After 22 hours, DHPT found at a concentration of 0.04 g per liter. '

Beispiel 12 .;.'.· ; " . :. Example 12.;. '. ·; ". :.

Das Verfahren gemäss Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei anstelle von Tetralin Mesitylen verwendet wurde. Das Ergebnis war negativ; es wurde keine Bildung von DHPT beobeohtet.The process according to Example 3 was repeated using mesitylene instead of tetralin. The result was negative; no formation of DHPT was observed.

909835/1547909835/1547

Beispiel 13 Example 13

Unter Verwendung von. Dus?ol anstelle voa (Tetralin wurden die Verfahrensschritte gemäss Beispiel 3 wiederholt. Das Ergebnis vrer negativ; es wurde keine Bildung von DHPQ? beobachtet. Under the use of. Dus? Ol instead of voa (tetralin were the Process steps according to Example 3 are repeated. The result is negative; there was no formation of DHPQ? observed.

Beispielexample

Die Verfahrensschritte gemäsa Beispiel 3 wurden unter Vervrendung von p-Diohlorbenzol anstelle von Tetralin wiederholt* Das Ergebnis vjst negativ; es wurde keine Bildung von DHPT beobachtet.The process steps according to Example 3 were repeated using p-diochlorobenzene instead of tetralin * The result was mostly negative; no formation of DHPT was observed.

Diese Beispiels veranschaulichen besonders die Herstellung von 2,3~Dihydroxy~p-toluylsäure unter Verwendung von p-Toluylsäure als Ausgangsstoff· Fermentationen, die mit anderen der· genannten Benzoesäurederivate durchgeführt werden, ergeben jedoch ana-"loge Ergebnisse. Diese Ergebnisse werden unabhängig von der gewählten induzierenden Verbindung erhalten«This example particularly illustrate the preparation of 2,3 ~ Dihydroxy ~ p-toluic acid using p-toluic acid as the starting material · fermentations are performed with the other of · said benzoic acid derivatives, however, there ana- "loge results. These results are independent of of the chosen inducing compound «

Die erfindungsgemäss hergestellten Dihydroxybenzoesäuren sind · .wertvolle Produkte, die sich für verschiedene, wirtschaftlich interessante Anwendungsswecke eignen, insbesondere als Chelatbildner, Metalldesaktivatoren und Zwischenprodukte für Farbstoffe, . . . -The dihydroxybenzoic acids prepared according to the invention are .valous products that can be used for different, economical interesting uses, especially as chelating agents, Metal deactivators and intermediates for dyes, . . . -

PatentansprücheClaims

²¹ V 909835/1547 ²¹ V 909835/1547

Claims (1)

P...8. "fc- Q fV t. e η s ρ r ü" c. h e P ... 8. "fc- Q fV t. e η s ρ r ü" c. hey 1» Verfahren 2um Herstellen der Dihydroxyderivate von aromatischen Carbonsäuren, dadurch g e k e η η ζ e i c h - . net, dass man in einem Nohrmedium eine Kultur einer normelerweise nicht zur Hydroxylierung von Benzoesäuren befähigten Nocardiaspezies herstellt, auf diese Kultur unter aeroben Bedingungen eine Verbindung einwirken lässt, welche die Nocsrdiazellen. aur Hydroxylierung induziert und danach Banzoesäuren, Salze von Benzoesäuren oder niedere Alkylester von Benzoeseuren, die 0-3 Methylreate und/oder Halogenatome als Eingsubstituenten und mindestens 2swei einander benachbarte unsubstituierte Singkohlenstoffatome aufweisen» unter aeroben Sermentationabedingimgen der Einiiirkung der induzierten Nocardiezellen aüasetzt.1 »Process 2 to produce the dihydroxy derivatives of aromatic carboxylic acids, thereby geke η η ζ calibrated -. net that a culture of a nocardia species which is normally not capable of hydroxylation of benzoic acids is produced in a nutrient medium and a compound is allowed to act on this culture under aerobic conditions, which the nocardia cells. Induced for hydroxylation and then benzoic acids, salts of benzoic acids or lower alkyl esters of benzoic acids, which have 0-3 methylreates and / or halogen atoms as single substituents and at least two adjacent unsubstituted single carbon atoms under aerobic sermentation conditions of the influence of the induced nocardia cells. 2» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Verbindung zum Induzieren der Nocardiazellen einen aromatischen Kohlenwasserstoff oder halogenierten aromatischen Kohlenwesserstoff verwendet, der mindestens einen aromatischen Ring mit nicht mehr als einem Halogensubstituent.en auf v/eist.2 »The method according to claim 1, characterized in that as a compound for inducing the nocardial cells an aromatic hydrocarbon or halogenated aromatic hydrocarbon used, which is at least an aromatic ring with no more than one halogen substituent on v / eist. 3. Verfahren nach. Anspruch 1 oder 2, dadurch -g θ k e η η .-ze i c hast, dass dia sum Induzieren der Nöcaraias©!·» len Y3::-;3iidets Verbindung ainde.T-;3Ss. 3«si einjnCLor v.r^ch-3. Procedure according to. Claim 1 or 2, characterized in -g θ k e η η. -Ze i c have that dia sum inducing the Nöcaraias ©! · » len Y3 :: -; 3iidets connection ainde.T-; 3Ss. 3 «si einjnCLor v.r ^ ch- 9 098 35I % B £7· \9 098 35 I% B £ 7 · \ BAD ORIGINALBATH ORIGINAL barte unsubstituierte Kohlenstoffatome Im erometisehen Ring besitzt.Bare unsubstituted carbon atoms in the erometisehen Ring owns. ί 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch g e *T ■ kennzeichnet, dass men zum Induzieren der NO-cardiazellen p-Xylol, m-Xylol, o-Xylol, Benzol, Toluol, Diphenyl, Naphthalin, 2-Hethyln8phthelin, Tetralin oderί 4. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized g e * T ■ indicates that men are used to induce NO cardiac cells p-xylene, m-xylene, o-xylene, benzene, toluene, Diphenyl, naphthalene, 2-methyln8phtheline, tetralin or ι ■ - ■ ■ ■ι ■ - ■ ■ ■ p-Ohlortoluol verwendet.p-Ohlortoluene used. .{■ 5· Verfahren neon einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gele e nnzeich ne-t, dess man die Fermentation bei einem pH-Wert von etwa 5j5 bis 9i5 durchführt.. {■ 5 · method neon one of claims 1 to 4, thereby gel A nsigns which fermentation is to be carried out at a pH of about 5.5 to 9.5. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5« dadurch g e kennzeic h η e t, dass man als induzierte Nocardiaspezies BFocardia Coralljjia, Nocardia Sslmonicolor oder No-6. The method according to any one of claims 1 to 5 «thereby g e characteristic h η e t that one as induced Nocardia species BFocardia Coralljjia, Nocardia Sslmonicolor or No- ceraia Minima verwendet. ^: ceraia minima used. ^: 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g e * kennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der Bezeichnung.- ATOO Nr. 19.070, ATOO Nr. 19.071, ATOÖ Nr. 19.148, A^fJ?GO Nr. 19.149 oder 19.150 verwendet*7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that a microorganism of the designation ATOO No. 19.070, ATOO No. 19.071, ATOÖ No. 19.148, A ^f J? GO No. 19.149 or 19.150 is used * 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, dass man zur Überführung von p~ Toluylsäure in 2_i,5-I)ihydro3qy*-p~töluylsäure als induzierten8. The method according to any one of claims 1 to 7 »characterized in that for the conversion of p ~ toluic acid in 2 _i , 5-I) ihydro3qy * -p ~ toluic acid as induced - 23 -- 23 - ' ORIGINAL INS^CTED 9 0 9 8 3 5/1547'ORIGINAL INS ^ CTED 9 0 9 8 3 5/1547 19066481906648 Mikroorganismus Nooardie Salmonieoloi?, ATÖÖ Nj?« X9_e149 verwendet.Microorganism Nooardie Salmonieoloi ?, ATÖÖ Nj? «X9 _e 149 used. 9. Verfahren zum Herstellen des Dihydroxyderivete9. Process for preparing the dihydroxy derivative Osrbonsäuren, dadujcoh g eke ώ η ε β i ο h η θ t, men Benzoesöuren, Salse von Benzoeeäupenodej? niedere Älkylester von Beneoesäupen, die O - 5 Metnylpeste und/ oder Halogens tome als Ringeubetituenten und Etindestens zwei einander benachbarte unsubstituierte Hingkonlenetoffatome eufweisen, uater aeroben Fermentationgbedingungen dep Einwirkung einer konstitutiven Mutarite eines Mikroorganismus der Spezies Nocardia suesetst* Osrboxylic acids, dadujcoh g eke ώ η ε β i ο h η θ t, men Benzoesöuren, Salse von Benzoeeäupenodej? lower alkyl esters of beneoic acids which have O - 5 methyl pests and / or halogen atoms as ring substituents and at least two adjacent unsubstituted halogenated atoms, other aerobic fermentation conditions depending on the action of a constitutive mutarite of a microorganism of the species Nocardia suesetst * 9098 35/15 A 79098 35/15 A 7