DE1905648A1 - Verfahren zum Herstellen der Dihydroxyderivate von aromatischen Carbonsaeuren - Google Patents

Description

DA-3171

Beschreibung zu der Patentanmeldung der Firma

SUN ΟΠ. COMPANY 1608 Walnut Street, Philadelphia, PA 19103, U.S.A.

betreffend

Verfahren gun Herstellen deg Dihydroxyderivete von aromatischen Carbonsäuren.

Priorität vom 8. Febr. 1968, Nr. 703 870, V.St.v.A., 8. Jen. 1969, Nr. V.St.v.A.

Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobiologische Hydroxylierung von unsubstituierten und substituierten Benzoesäure^ Salzen oder Estern dieser Benzoesäure^ die mindestens zwei unsubstituierte, einander benachbarte Ringkohlenstoffetome besitzen, durch die Einwirkung eines induzierten Mikroorganismus der Art Nocardie, der normalerweise nicht fähig ist, eine solche Umwandlung zu bewirken.

Die US-Patentschrift 3 383 289 beschreibt ein Verfahren zur

mikrobiologischen Oxydation von metbylsütstitaierten Benzolkohlenwasserstoffen durch verschiedene Arten, v®& MocBvß±m_$ wobei unter anderem ein Gemisch aus den emcaprecüandeiv. nlehfrhydroxylierten Benzoesäuren und den entspraehentsB verbindungen dieser Benzoesäuren gebildet wird* Bau wirtschaftlich wertvollere dieser beiden orheltsnsr Produkte die Dihydroxy verbindung« Es wurden jedoch in Jadais Pail bei Bildung der Bihydroxyverbindung wesentliche Mtsile de? ent-= sprechenden nieht-hydroxylierten Verbindung issoIisTt. All® Versuche, diese nicht-hydroxyliertea Hebsaproä^te auf mite© biologischem Weg in die wertvolleren Dihydro^ssrfeonsäuren Biiwandeln, ■ erwiesen sich bisher als billig s^SOlglos^ da ä raechenderweisa die Hocardiaspeaies₈ di© sbs» BiMtsng eine© Biieches dieser beiden Produkte aus ilethylfeanzolen fähi sieh su der gewünschten Umwandlung, ausgehend ψ&η ä&n entsprechenden Benzoesäuren, nicht eigneten*

Gemäss der Erfindung soll daher ein neues Verfahren zur Herstellung von Dihydroxybenzoesäuren, ihrer Salze oder Ester aus den entsprechenden unsubstituierten oder methyl- und/oder hslo gensubstituierten Benzoesäurederivaten, die mindestens zwei unsubstituierte, einander benachbarte Ringkohlenstoffatoms bu£ weisen, geschaffen werden. Nach dem erfindungsgemässen Vet^fahr können diese Benzoesäuren durch die Einwirkung verschiedenes? M cardia-Arten, die normalerweise zu einer solchem SsMendlung 133a fähig sind, in. die entsprechenden Dihydrosqjrde^iTS-fe werden.

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Gegenstand der Erfindung 1st ein Verfahren zum Herstellen der Dihyftroxyderivate von aromatischen Carbonsäuren, das dadurch gekennzeichnet ist, does ηβη in einem Nähtmedium eine Kultur einer normalerweise nicht mr Hydroxylierung von Benzoesäuren befähigten Nocardia-Spezies herstellt, auf diese Kultur unter •eroben Bedingungen ein« Verbindung einwirken lässt, welche dl« Hooerdie-Zellen ζην Hydroxylierung induziert und daneoh Benasoesäuren, Salze von Beneoesäuren oder niedere Alkylester von Bensoeeäuren, die O bis 3 Hethylreste und/oder Halogeaetooe eis Ringsubstituenten und mindestens zwei einander benachbarte uoeubstituierte fiingkohlenstoffatome aufweisen, unter 8eroben Feraentetionsbedingungen der Einwirkung der Induzierten. Nooardiezellen eussetat*

Sie als Ausgangsstoffe verwendeten Benzoesäuren oder Benzoesäurederivate können, gleiche oder verschiedene Ringsubstituenten enthalten. Bevorzugte SaIbθ sind die Alkellsolse der Bensoesäuren·

Die Verbindung, welche die Nocardiesellen zur Hydroxylierung induziert, insbesondere eine aromatische oder helogensubstituierte aromatische Verbindung, lässt man während einer eus- ^v reichenden Seit auf den Mikroorganismus einwirken, um des Enzymsyetem des Mikroorganismus für die Hydroxylierung zu. induzieren.

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Dse erfindungsgemässe Verfahren kann bequem derart durchgeführt werden, dass man zunächst In einem Nährmedium eine Kultur von Hocerdiaaellen herstellt, die normalerweise zur Hydroxylierung von Benzoesäuren nicht fähig sind, deren Enzymsystem jedoch dözu induziert werden kenn, und dass man danach diese Zellen induziert, indem man einer Dispersion dieser Zellen eine zum Induzieren der Hydroxylierung ausreichende Menge einer nachstehend näher beschriebenen induzierenden Verbindung zusetzt. Dieser Zueetz erfolgt unter Kulturbedingungen und die Verbindung wird während einer Dauer in Berührung mit den Zellen belassen, die ausreicht, dos. Enzymsystem der Zellen für die Dihydroxylierung der genannten Benzoesäuren zu induzieren. Danech werden diese Benzoesäuren oder Benzoesäurederivate in Gegenwart eines Nährmediume unter aeroben 3?erraentetionsbedingungen der Einwirkung der induzierten Zellen.susgesetzt und das Dihydroxyderivat der entsprechenden Benzoesäure aus der Ferment θtionsbrühe isoliert. Wahlweise kann man auch die als Substrat dienende Benzoesäure gleichzeitig mit der induzierenden Verbindung dem Gärmedium zusetzen, unter diesen Bedingungen muss jedoch eine Induktionsperiode von einigen Stunden abgewartet werden, bevor die Bildung der Dihydroxyverbinduns.beobachtet wird.

Zur Herstellung einer für das erfindungsgemässe Verfahren ge-· eigneten Kocerdiespezies wird vorzugsweise eine Kulturprobe ^: von einer Agar-Schrägkultur in einen Schüttelkolben überführt,

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der ein geeignetes Nähreadiua snfcli&lü, das eine Kohlanstoffquellö umfasst, auf der der Organismus wachson kann» In einigen Fällen kann die Anwesenheit Gines zusätzlichen Wachstumsstimulierenden Mittels, wie Pepton, Rindfleisehestrakt, Hefeext rakfe etc» wünschenswert sein,, wenn auch der Zusatz dieser Stoffe nicht wesentlich ist. Das Gemisch wird dann bei etwa 3O⁰O inkubiert. In Abhängigkeit von der Konzentration der Zellen gibt man die induzierende Verbindung entweder sofort oder nach einer Inkubationsdauer von etwa 24· Stunden der wachsenden Kultur zu·

Wie erwähnt, muss das Nährmediura, das mit dem gewählten Organismus beimpft wird, zusätzlich zu dem anorganischen Nähretoff und einer Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle enthalten, die den Organismus ausserdem mit Energie versorgt. Im allgemeinen können zwar beliebige, ©ine Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle in Kombination enthaltende organische Substanzen verwendet v/erden, wie beispielsweise Kohlehydrate, oder Fettsäuren; vorzugsweise werden jedoch Kohlenwasserstoffe verwendat, insbesondere η-Paraffine mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, wie η-Butan, n-Dodecan,oder 3ls besonders bevorzugte Verbindung n-Hexadeaan. In Abhängigkeit von dem gewählten Stamm des Mikroorganismus können stattdessen wahlweise gewisse aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, verwendet werden. Die.Kohlenstoff quelle, wie beispielsweise n-Hexadecan, kann in einem Anteil unmittelbar vor dem Beimpfen des Mediums zugesetzt werden.

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Vorzugsweise sollte sie jje&ooh periodisch in kleinen Anteilen wahrend des gesamten Verlaufs der Fermentation zugesetzt werden, um eine Anreicherung dieses Stoffes in dem Medium zu vermeiden, die dem Organismus gegenüber toxisch wirken wurde. Obwohl, in Abhängigkeit von dem Mikroorganismus, die zuzusetzende Menge zu jedem gegebenen Zeitpunkt unterschiedlich sein kann, ist es im allgemeinen wünschenswert, dass zu jeder beliebigen Zeit die Konzentration von n-Hexadecan in dem Ssfäss nicht mehr als etwa 3 nil pro Liter bei einer Gesamtmenge dieser Kohlenstoffquelle von etwa 10 g pro Liter in federn gegebenen Fermentationsansatz beträgt.

Die dem Nährmedium zugesetzte Stickstoffquelle kann eine beliebige anorganische oder organische Stickstoff enthaltende Verbindung sein, die Stickstoff in einer für den Stoffwechsel des i-Ukroorganismus nutzbaren Form aufweist, wie Proteine, Aminosäuren» Amraoniuneulfat, Ammoniumphosphst, Harnstoff oder ähnliche.

Der anorgsnische Nährstoff sollte wasserlöslich sei'n und eine geeignete Quelle für Mineralstoffe, vorzugsweise in Form ihrer Salze, darstellen, wie Eisen-, Natrium- und Phosphorverbindung· gen. Ein Beispiel eines geeigneten Nährmediums, das zusätzlich zu der Kohlenstoff enthaltenden Energiequelle verwendet wird, hat die folgende Zusammensetzung:

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Gramm pro Liter V/osBer

Hernstoff	2,0
Hefeertrakt (Difco)	0,5
Mg SO4.7H2O	0,2
He2OO5	0,1
OaOl2*2HgO	0,01
MnSO4.HgO	0,02
FeSOn-TH0O	0,005
KH2PO4	0,8
Na0HPO0	1,2

Der Sauerstoff kann dem Fermentetlonsme&ium in jeder beliebigen Form zugeführt werden, die bequem durch den Organismus assimilierbar ist. Vorzugsweise sollte Sauerstoff in Gasform entweder durch Leiten von Sauerstoff oder Luft durch das flüssige Hedium oder durch kräftiges Rühren des Mediums oder auf . beiden Wegen zugeführt werden.

Die Temperatur, bei der die Fermentation sowohl vor als euch nach der Zugabe des Substrate durchgeführt wird, kann zwischen etwa 20 und 4-5°0 variiert werden und beträgt vorzugsweise 25 55°O, um ein entsprechendes Wachstum des Organismus zu gewährleisten. Der pH-Wert des Fermentationsmediums sollte innerhalb eines Bereiches von 5»5 - 9,5 und vorzugsweise 7,0 - 8,5 gehalten werden. Im Verlauf der Fermentation sind häufig Elnstel*

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lungen erforderlich, um den pH-Wert innerhalb der bevorzugten Bereiche zu halten. Dies erfolgt im ellgemeinen durch periodische Zugebe ausreichender Mengen eines Alkalihydroxyds» Die auf des anfängliche Einführen des Substrats in des vorgebildete Pefimentetionsme&ium folgende Permentationsperiode, welche die zweite Stufe des erfinduagsgemässen Verfahrens darstellt, sollte etwe 24· bis 84 Stunden und vorzugsweise etwa J6 bis 60 Stunden dauern. .

Verbindungen, die sich eis geeignet erwiesen heben, die Enzymeysteme von Nocardie eo zu induzieren, dass diese zur Umwandlung von Benzoe3äurederiv8ten in die entsprechenden Dihydroxyverbindungen befähigt sind, sind aromatische oder halogeniert® aromatische Kohlenwasserstoffe mit mindestens einem aromatischen Ring, der nicht mehr als einen Hslogensubstituenten aufweist. Es ist wünschenswert, wenn auch nicht wesentlich, dass 'diese induzierenden Verbindungen mindestens zwei einander benachbarte unsubstituierte Ringkohlenstoff atome -enthalten« for=- zugsweis© sollten diese induzierenden .Verbindungen,-nicht flllcM-t;ig und durch den Nocardiaorganismus nicht abbaubar sein, we|öi.^; auch ä.iesö Bedingung nicht wesentlich ist. ^: :. ^ ν

Beispiele für Verbindungen, die iiocardiaselien in stellender Weise zur Hydroxylierung von BensoesättradeiiTOtÄ, induzieren sind Kohlenwasserstoffe, wie p-Xylol^ 3a~Sylol_s ■ o-Xylol, 0?oluol, Benzol, Diphenyl, Naphthalin, 2-M©thyln&pla~

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thalin und Tetralin, halogeniert© Kohlenwasserstoffe wie p-Ghlortoluol oder OhlorbenBol. Vorzugsweise werden dies© Verbindungen den wachsenden Nooardiazellen vor der Zugebe dec als Substrat dienenden Benzoesäure in einer die Hydroxylierung induzierenden Menge zugesetzt. Die Mengen werden Jedoch so gewählt, dass sie dem Mikroorganismus gegenüber nicht toxiaoh sind. Diese zugesetzten Mengen hängen von dem induzierenden Stoff und dem verwendeten Mikroorganismus ab, vorzugsweise sollte Jedoch in dem Fermentetionsmedium ein Anteil von mehr als fünf Teilen pro MIl. Teile des Mediums und vorzugsweise etwa 20 bis 200 Teile pro Mill. Teile des Mediums vorliegen. Die induzierende Verbindung v/ird vorzugsweise in einer solchen Menge zügesetzt, dass diese Konzentrationen in dem Medium bis zur vollständigen Induzierung, die in Abhängigkeit von der W8chstumsgesohwindigkeit dös Mikroorganismus etwa 1 bis 12 Stunden beträgt, aufrechterhalten werden. ·

Die au hydroxylierenden Benzoesäure-Substrate sind., wie bereits beschrieben^ Verbincluasren mit 0 bis 3 f-iethyl- und/oder Halogensubstitiienten am aromatischen Hing, die ausserdem mindestens zwei nicht-substituierte, einander benachbarte Ringkohlenstoffatome aufweisen. Beispiele für erfindungsgemäss als Substrats verwendbare Benzοβsäuren sind Verbindungen wie Benzoesäure, p-Toluylsäure, o-Toluylsäure, m-Toluylsäure, 2,5-Dimeth,,lDenzoesäure, ^,J-Dimethylbenzoesiliire, 2,3* ^-T rime thy 1-benzoesäure, 3-Methyi-4-chlorbenzoesäure, p-Ohlorbenzoesäure

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und ähnliche Verbindungen oder deren Alkalisalae oder die ■ entsprechenden ^niederen-Allylester,, die-1 bis.Ö.Kohlenstoffatome in den Alkylresten aufweisen«, Da dos■" Medium- vorzugsweise bei-einem" neutralen pH-Wart oder eine» höheren pH-Wert gehalten werden muss, liegt natürlich bei Verwendung der freien Säure selbst dies© im Rösktionsmedium in 3?orm ihres : Salzes vor. Die niederen Alkylester, die unter diesen Fermen~^:.-tationsbedingungen im wesentlichen nicht-hydrolysierbsr sind, können gewünsehtenfalls'auch verwendet werden.

Wenn man die genannten Verbindungen der.Einwirkung der induzierten Nocardisaellen aussetzt, erhält man die entsprechen·^ den Dihydroxybenzoesäuren, wie ©!hydroxybenzoesäuren 2,3-Dihydroxy~p-toluylsäure, 2,3-Dihydroxy-4,e-dimethylbenaoesäure, D±hydroxy-5»6-dimethylbenzoeßäure, 2,3-Di'hydroxy-4-ehlor-5-r methylbenzoesäure, ^jJ-Diliydroxy-p-ohlorbenzoesäure,-- 2_r3-Dihy~ droxy-p-chlorbenzoesaur¹© und 2,3-Dihydroxy-^i-_t5»6-trimethyi.b.ensoesäure, -im allgemeinen in Form ihrer Seize oder Ester.

Die als Substrat .verwendete- Benzoesäure v-ärd bevorzugt dem Feriaentationsinedium periodisch in kleinen Anteilen während dar gesamten auf die Induktionsperiode folgenden Ferraentationsperiode zugesetzt-und diese Zugabe.erfolgt-vorzugsweise in Form der wasserlöslichen Salze. Zusammen mit 'dem Substrat sollten geringe Mengen der beschriebenen Kohlenstoffquelle, wie n~fiexadecan-," zugefügt-werden. Die Menge jedes dem Medium zugesetz-

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tea Substrstsnteils liegt* iia Bilgemeinen Am Bereich von 0,2 bis 0,5 S pro Liter und beträgt vorzugsweise weniger als etwa 1 g pro Liter.

Die !^hydroxyverbindungen werden aus dem Peroeatatloneoiediüm bequem auf übliche Weise gewonnen« So können beispielsweise die Zellen durch Zentrifugieren oder Filtrieren aus der Flüssigkeit abgetrennt und die klare Flüssigkeit angesäuert und mit. einem geeigneten Lösungsmittel wie Äther, Dioacen oder Amylecetat extrahiert werden.

Erfindungsgemäss verwendbare.Wocerdiaerten sind solche, die. normalerweise nicht fähig sind, eine Benzoesäure in die ent~ sprechende Mhydroxyverbindung zu überführen, deren Enzymsysteme .jedoch wie beschrieben dazu induziert werden können« Ein erfindungsgemäss bevorzugter Mikroorganismus ist Nocardia Sslmonicolor, ATCO, Nr. 19,14-9. .

Andere, ebenfslls geeignete Hocsrdiaspeaies sind in der US-Patentschrift 5 383 289 beschrieben, die verschiedene Nqcardisspezies angibt, die zur Oxydation von Hethylbenaolen fähig sind, iis können vorteilhsft folgende weitere Nocsrdiaärteii verwendet werden, die iß Bergey^ Möftual klassifiziert und ausserdem in der Araericaa fypeöultüre Collection, Washington, B.G. niedergelegt sind,

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(1) Ein aus Erde In Alabama gewonnener Wildstamm, dessen Charafcteristik8 etwa denen in Bergey¹ β Manual für Nocardia Gorallina angegebenen entsprechen und der daher ale diese Spezies klassifiziert wurde. Eine Kultur dieses Stammes wurde

. unter der lit. ATOG 19·Ο7Ο in der American Type Culture Collection in Washington, D.O. niedergelegt. Kolonien dieses Mikroorganismus weisen eine orange Färbung auf.

(2) Eine durch ultrsviolette Bestrahlung von ATOO Wr. 19.070 erhaltene rötlich gefärbte Mutante. Die Mutente wurde eben·- : falls In der American Type Oulture .-Collection- niedergelegt und als ATGO Nr. 19.071 bezeichnet.

(3) Kin aus Pennsylvaniaerde isolierter und ebenfalls als Nocardia Oorallina klassifizierter Stamm. Dieser· Hikroorganisraus ist v/ie der zuerst genannte Wildstainm orange gefärbt_f: unterscheidet sich von diesem Jedoch durch die enzymatisehen Qxyd8tionseigenschaften. Die niedergelegte Kultur dieses ■Stammes wurde als AiGC Nr. 19.14-9 bezeichnet. ;

'(&) Ein weiterer aus Erde isolierter Stamm, in Bergeyls Mienual öle Nocardia Minima klassifiziert und mit ATGG Kr. $M bezeichnet. .-■■; · : . · '-

Zusätzlich zu den angegebenen Spezies umfasst die Erfindung die Verwendung anderer Noc8rdia-8pesies, deren Eignung für

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das ©rfindungsgemäese Verfahren mit Hilfe beschriebener Methoden auf einfache Weise routinomägsig featgeatellt werden kann. Diese Spezies sollen die konstituiven Mutenden der oben definierten Nocardiamikroorganismen umfassen. Dabei sollen unter dem Ausdruck "!Constitutive Mutenten" auegewählte Organismen verstanden, werden; die aus einer Spezies,, die normalerweise die gewünschte Umwandlung in Abwesenheit eines induzierenden Stoffes nicht bewirkt, durch Mutation zu einer Spezies entstanden sind, die diese Umwandlung ohne die swingende Anwesenheit eines induzierenden Stoffes bewirkt, Beispiele für andere Arten konstitutiver Mutanten und für Verfahren zur Herstellung .dieser Mutanten sind bekannt und beispielsweise in Bioöhim. Biophys.Acta, 90 (1964) 609-610 beschrieben.

Ausführungsformen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen genauer verdeutlicht.

Beispiel 1 '

In einem sterilen Fermenter der Nonnalkspazitat 60 1 wurden 32 1 des im folgenden beschriebenen sterilisierten kohlengtoffreien Mediums hergestellt. Zu diesem Zweck wurden 3 Ansätse von Bestandteilen getrennt im Autoklaven behandelt: eine 50 #-ige (Gewicht pro Volumen) Harnstofflösung, eine Lösung eines Phosphatgemisches und eine Lösung der übrigen Salze:

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BADORiQtNAL Gramm pro. Liter Wasser

Hernetoff	2,0
Hefeextrakt (Difco)	0,5
Mg ao4.7H2o	0,2
	0,1
OsOl2.2H2O	0,01
MnSO4.H2O	0,02
PeSO^.7Ho0	0,005
2 4	0,8
Ne2HPO4	1,2

Der Fermenter war ein mit Zwischenwand versehener Kessel aus rostfreiem Steh! mit 30,5 cm Innendurchmesser, der mit einem beschaufelten !Turbinenrad von 15*2 cm versehen war. Der Fermenter wurde bei 3O⁰O betrieben, wobei sterile Luft in einer Menge von 0,33 Volumenteilen pro Volumenteile pro Minute eingeführt und eine Rührgeschwindigkeit von 500 UPM aufrechterhalten wurde. Der Fermenter wurde mit 3 1 einer kräftigen 48 Stunden alten Kultur von ffocardie -aelmonicolor, ATCC Nr. 19.14-9 inokuliert. Diese Kultur war in einem ähnlichen Gefäss in dem gleichen Medium hergestellt worden, dem n-Hexedecan kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 5 ml pro Stunde pro Kessel während der ersten 8 Stunden und 10 ml pro Stunde pro Kessel während der 18. bis 48. Stunde zugefügt worden war. Ίη. den Fermenter wurde n-Hexadecan kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 5 "ml pro Stunde pro Kessel vom Beginn bis ζην 6,

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Stunde und 10 ml pro Stunde pro Kessel während der 6. bis 17· Stunde zugeführt. In der 17· Stunde, in der ein gemässigtes Wachstum erreicht wurde, stellte man den pH-Wert der Kultur erforderlichenfalls mit Zusätzen von 8 #-iger wässriger NaOH auf 8 ein. In der 17. Stunde wurde ausserdem begonnen, Benzol in einer solchen Rate zuzusetzen, dass der scheinbare Benzolgehelt in der Kultur im Bereich von 75 -'125 mg/1» gemäss der quantitativen Ultraviolettspektralenelyse der Isooctanextrakte der Kultur, aufrechterhalten wurde, Ausserdem wurden in der 17. Stunde der Kultur 20 g p-Toluylsäure, zusammen mit ausreichend NaOH zur Neutralisierung der Säure und zum Auflösen der Säure in Wasser als Nstriumsalz zugesetzt. Die gleichen Zusätze wurden in der 42., 53· und 62. Stunde vorgenommen, um die Konzentration an p-Toluylsäure innerhalb des Bereichs von 2,3 - 0,5 g pro Liter zu halten. Die kolorimetrische Prüfung auf 2,3-Dihydroxy-p-toluylsäure (DHFE) zeigte die Anwesenheit von 0,89 g pro Liter in der 62. Stunde und 1,0 g pro Liter in_: der 70. Stunde. Die Anwesenheit von DHPT wurde eusserdem durch das UV-Spektrum und das typische Beweglichkeitsverhelten und die Reaktion im Papierchromatogramm bestätigt. Wie im Papierchromatogramm beobachtet wurde, verringerte sich der Anteil an p-Toluylsäure im Mess der Anreicherung von DHPI. Versuche, die auf diesen fferraentationsansetZ entsprechende Weise, Jedoch ohne Benzol durchgeführt wurden, zeigten weder einen Verbrauch von p-!E©luylsäure noch Bildung von DHFD.

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Beispiel 2

Ein Fermenter, der 32 1 steriles Medium enthielt, wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, vorbereitet und beimpft* Der Fermenter wurde bei 30⁰O betrieben, wobei sterile Luft mit einer Geschwindigkeit; von 0,20 Vol. Teilen pro Volumenteil pro Minute augeführt und eine Rührgesohwindigkeit von 500 UPM aufrechterhalten wurde. n-Hexadeeen wurde während der ersten 9 Stunden nach der Inokulation kontinuierlich in einer Bote von IQ ml pro Stunde pro Kessel zugeführt. Zwischen der 19. und 22* Stunde wurden 10 g in 40 ml n-Hexedecan gelöstes Diphenyl kontinuierlich zugesetzt und eine gleiche Zugabe wurde zwischen der 57· und 59· Stunde vorgenommen. In der Stunde wurde der pH-Wert der Kultur mit 8 #-iger wässriger Lösung von NaOH suf 8,0 eingestellt und erforderlichenfsllö durch weitere NaOH-Zusätze während des gesamten Versuchs bei diesem Wert gehalten* Zwischen der 22. und 4-5· Stunde wurde eine 20 #-ige (Gev;icht pro Volumen) wässrige Lösung von p*» Toluylsäure (zusammen mit der für Neutralisation der Säure und Lösen in Wasser als Wetriumsalz ausreichenden Menge NeOB) mit einer Geschwindigkeit von 26 ml pro Stunde pro Kessel zugesetzt. Die oberhalb der Gärbrühe befindlichen Flüssigkeiten enthielten gemäss der quantitativen Ultraviolet-tspektrelena^ lyse 1,25 g pro 1 DHPT nach 45 Stunden und 2,0 pro 1 nach 6& Stünden. Die Anwesenheit von DHPT wurde durch das typisöhe-Beweglichkeitsverhalten im Papierchromatogramm und

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tionen bestätigt« Yerglelohsverauche, die ohne Verwendung von Diphenyl durchgeführt wurden, zeigten keinen Verbrauch von p-Toluylsäure, noch die Bildung von DHFT,

Beispiel 3

Eine wachsende Kultur von Nooardla wurde auf die im Beispiel 1 zur Herstellung des Impfansatzes beschriebene Welse hergestellt. Ein Anteil von 35 ^l wurde in einen 300 ml-Kulturkolben überführt, dem 4*5 ml Wasser, 0,5 ml einer wässrigen Lösung von Natrium-p-toluat (8 #, bezogen auf das Gewicht der freien Säure pro Volumen) und 0,05 ml einer 30 #-igen (Vol.-#) Tetralinlösung in n-Hexadecan zugesetzt wurden. Nach 9-stündigem Schütteln der Kultur im Kolben bei 30°ö hatten sich in der Brühe 0,05 g pro Liter DHPO? gebildet. Im Parallelversuch angesetzte Kolben, die kein Natrium-p-tolust oder Tetralin enthielten, zeigten keine DHPT.

Beispiel 4- ■

Eine wachsende Kultur von Nocardia wurde auf gleiche Weise wie in. Beispiel 1 in einem Fermenter gezüchtet und p-Xylol ausgesetzt, ohne dass jedoch p-iPoluat zugegeben wurde. Nach 7-stündigera Kontekt mit p-Xylol wurde eine Probe von 240 ml aus dem Permentar¹ entnommen, die Zellen aus der Brühe durch Zentrifugieren entfernt, einmal durch Suspendieren in 240 ml eines kohlenstoffreien I'!inerals8lzmediums gewaschen, erneut zentri-

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fügierfc und sehliesslich wieder in 240 ml des gleichen Mediums suspendiert. 35 ml diasei? ZellBuspension wurden in einen KuI-tmrkolben gegeben, dem men 0,5 ml einer wässrigen Natrium-ptfoluetlöaung (8 #, bezogen euf des Gewicht der freien Säure pro Volumen) zusetzte. Neoa 1-stündigem Schütteln der.Kolben-" kultur bei 50⁰O wurde die Anwesenheit von 0,15 g DHPT pro 1 in der Brühe festgestellt. Eine auf gleiche Weise erhaltene Kultur, aus der jedoch Natrium-p-toluat weggelassen wurde, zeigte kein DHPT. Ausserdem zeigten euf gleiche Weise, jedooii ohne Zusatz von p-Xylol, während des Wachsbumsstadiums dep Fermentation erhaltene Zellen, keine Fähigkeit, N8trium-p~ toluet in DHPT zu überführen, wenn sie auf gleiche Weise wi® die mit p-Xylol behandelten Zellen nach dem Waschen im KoI-benvepsuch geprüft viurden.

Beispiel 5

Die in Beispiel 3 beschriebenen Terfahrensschritte wurden mit der Ausnahme wiederholt, dass Tetralin durch m-Xylö'l ersetzt vnirde und der Kolben sofort mit einem Korkstopf©n verschlössen wurde. ·ίίθch 22 Stünden wurden in der Brühe 0,02 g DHPT pro 1 festgestellt. In dem Yergleiohskolben, der kein n-Xylol enthielt, wurde keine DEPS gebildet.

Beispiel 6

Die Verfahrensschritte des Beispiels 3 wurden wiederholt

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der Ausnahme, dees anstelle von Tetralin o-Xylol verwendet wurde und der Solben sofort mit einem Korkstopfen verschlossen wurde. Der verwendete Mikroorganismus war Nocardia Oorallina AiDOC Nr. 19* 14-8. Neon 22 Stunden wurde DHM in einer Konzentration von 0,04- g pro !festgestellt. In dem Vergleiohskolben wurde keine DHPI gefunden·

Beispiel 7

Die Verfahrenssohritte gemäss Beispiel 3 wurden wiederholt, wobei anstelle von Tetralin 2-Methylnaphthalin verwendet wurde. Nach 22 Stunden wurden 0,11 g DHPT pro 1 in der Brühe festgestellt, während in dem Vergleichskolben keine DHFD beobachtet werden konnte«

Beispiel 8

Beispiel 3 wurde unter Verwendung von Naphthalin anstelle von Xetralin wiederholt. JHach 22 Stunden hatten sich 0,11 g DHPO? pro 1 in der Brühe gebildet, während in dem Vergleichs-* kolben keine DHPT beobachtet wurde,

Beispiel 9

Das Verfahren gemäss Beispiel 4- wurde ait der Abänderung wiederholt, dass man anstelle von p~Xylol p-Ohldrtoluol,in dem Kulturferraenter verwendete. Als Mikroorganismus wurde

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Nocardia Minima, ATOC Kr. 19.150 verwendet. In dem Kolben, der die gewasche ZeI!suspension und p-Tolulüt enthielt, wurden neon 1-stündigem Schütteln bei 30°ö 0,11 g DHPT pro T beobachtet. . .

Beispiel 10 . -

Die Verfahrensschritte des Beispiele M- wurden wiederholt, wobei in den Kulturversuchen mit gewaschenen Zellen p-Ohlorbenzoleäure verwendet wurde. Der verwendete Mikroorganismus wer Nocardia sp., ATOO Nri 19.070. Nach 1-sttindigem Schütteln bei 30⁰O wurden 0,08 g 2_t3-Mhydro^~4~chlorbenzoeöäüre pro 1 festgestellt. - _

Beiepiel 11

Die Verfehrensacliritte des Beiapiels 4 wurden in der Weise v/iederholt, dees man in dem Kulturferment er anstelle von p-Xylol Toluol verwendete. Der verwendete Mikroorganismus war Nocardi.8 sp. A0?OG Kr. 19.071. Nach 22 Stunden wurde DHPT in einer Konzentretion von 0,04 g pro 1 festgestellt. '

Beispiel 12 .;.'.· ; " . :.

Das Verfahren gemäss Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei anstelle von Tetralin Mesitylen verwendet wurde. Das Ergebnis war negativ; es wurde keine Bildung von DHPT beobeohtet.

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Beispiel 13

Unter Verwendung von. Dus?ol anstelle voa (Tetralin wurden die Verfahrensschritte gemäss Beispiel 3 wiederholt. Das Ergebnis vrer negativ; es wurde keine Bildung von DHPQ? beobachtet.

Beispiel

Die Verfahrensschritte gemäsa Beispiel 3 wurden unter Vervrendung von p-Diohlorbenzol anstelle von Tetralin wiederholt* Das Ergebnis vjst negativ; es wurde keine Bildung von DHPT beobachtet.

Diese Beispiels veranschaulichen besonders die Herstellung von 2,3~Dihydroxy~p-toluylsäure unter Verwendung von p-Toluylsäure als Ausgangsstoff· Fermentationen, die mit anderen der· genannten Benzoesäurederivate durchgeführt werden, ergeben jedoch ana-"loge Ergebnisse. Diese Ergebnisse werden unabhängig von der gewählten induzierenden Verbindung erhalten«

Die erfindungsgemäss hergestellten Dihydroxybenzoesäuren sind · .wertvolle Produkte, die sich für verschiedene, wirtschaftlich interessante Anwendungsswecke eignen, insbesondere als Chelatbildner, Metalldesaktivatoren und Zwischenprodukte für Farbstoffe, . . . -

Patentansprüche

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Claims (1)

1. P...8. "fc- Q fV t. e η s ρ r ü" c. h e

   1» Verfahren 2um Herstellen der Dihydroxyderivate von aromatischen Carbonsäuren, dadurch g e k e η η ζ e i c h - . net, dass man in einem Nohrmedium eine Kultur einer normelerweise nicht zur Hydroxylierung von Benzoesäuren befähigten Nocardiaspezies herstellt, auf diese Kultur unter aeroben Bedingungen eine Verbindung einwirken lässt, welche die Nocsrdiazellen. aur Hydroxylierung induziert und danach Banzoesäuren, Salze von Benzoesäuren oder niedere Alkylester von Benzoeseuren, die 0-3 Methylreate und/oder Halogenatome als Eingsubstituenten und mindestens 2swei einander benachbarte unsubstituierte Singkohlenstoffatome aufweisen» unter aeroben Sermentationabedingimgen der Einiiirkung der induzierten Nocardiezellen aüasetzt.

   2» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Verbindung zum Induzieren der Nocardiazellen einen aromatischen Kohlenwasserstoff oder halogenierten aromatischen Kohlenwesserstoff verwendet, der mindestens einen aromatischen Ring mit nicht mehr als einem Halogensubstituent.en auf v/eist.

   3. Verfahren nach. Anspruch 1 oder 2, dadurch -g θ k e η η .-ze i c hast, dass dia sum Induzieren der Nöcaraias©!·» len Y3::-;3iidets Verbindung ainde.T-;3Ss. 3«si einjnCLor v.r^ch-

   9 098 35I % B £7· \

   BAD ORIGINAL

   barte unsubstituierte Kohlenstoffatome Im erometisehen Ring besitzt.

   ί 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch g e *T ■ kennzeichnet, dass men zum Induzieren der NO-cardiazellen p-Xylol, m-Xylol, o-Xylol, Benzol, Toluol, Diphenyl, Naphthalin, 2-Hethyln8phthelin, Tetralin oder

   ι ■ - ■ ■ ■

   p-Ohlortoluol verwendet.

   .{■ 5· Verfahren neon einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gele e nnzeich ne-t, dess man die Fermentation bei einem pH-Wert von etwa 5j5 bis 9i5 durchführt.

   6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5« dadurch g e kennzeic h η e t, dass man als induzierte Nocardiaspezies BFocardia Coralljjia, Nocardia Sslmonicolor oder No-

   ceraia Minima verwendet. ^:

   7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g e * kennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der Bezeichnung.- ATOO Nr. 19.070, ATOO Nr. 19.071, ATOÖ Nr. 19.148, A^fJ?GO Nr. 19.149 oder 19.150 verwendet*

   8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, dass man zur Überführung von p~ Toluylsäure in 2_i,5-I)ihydro3qy*-p~töluylsäure als induzierten

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   ' ORIGINAL INS^CTED 9 0 9 8 3 5/1547

   1906648

   Mikroorganismus Nooardie Salmonieoloi?, ATÖÖ Nj?« X9_e149 verwendet.

   9. Verfahren zum Herstellen des Dihydroxyderivete

   Osrbonsäuren, dadujcoh g eke ώ η ε β i ο h η θ t, men Benzoesöuren, Salse von Benzoeeäupenodej? niedere Älkylester von Beneoesäupen, die O - 5 Metnylpeste und/ oder Halogens tome als Ringeubetituenten und Etindestens zwei einander benachbarte unsubstituierte Hingkonlenetoffatome eufweisen, uater aeroben Fermentationgbedingungen dep Einwirkung einer konstitutiven Mutarite eines Mikroorganismus der Spezies Nocardia suesetst*

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