DE1905648A1 - Verfahren zum Herstellen der Dihydroxyderivate von aromatischen Carbonsaeuren - Google Patents
Verfahren zum Herstellen der Dihydroxyderivate von aromatischen CarbonsaeurenInfo
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Description
DA-3171
Beschreibung zu der Patentanmeldung
der Firma
SUN ΟΠ. COMPANY 1608 Walnut Street, Philadelphia, PA 19103, U.S.A.
betreffend
Priorität vom 8. Febr. 1968, Nr. 703 870, V.St.v.A.,
8. Jen. 1969, Nr. V.St.v.A.
Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobiologische Hydroxylierung
von unsubstituierten und substituierten Benzoesäure^ Salzen oder Estern dieser Benzoesäure^ die mindestens zwei
unsubstituierte, einander benachbarte Ringkohlenstoffetome
besitzen, durch die Einwirkung eines induzierten Mikroorganismus der Art Nocardie, der normalerweise nicht fähig ist,
eine solche Umwandlung zu bewirken.
Die US-Patentschrift 3 383 289 beschreibt ein Verfahren zur
mikrobiologischen Oxydation von metbylsütstitaierten Benzolkohlenwasserstoffen
durch verschiedene Arten, v®& MocBvß±m$
wobei unter anderem ein Gemisch aus den emcaprecüandeiv. nlehfrhydroxylierten
Benzoesäuren und den entspraehentsB
verbindungen dieser Benzoesäuren gebildet wird* Bau wirtschaftlich wertvollere dieser beiden orheltsnsr Produkte
die Dihydroxy verbindung« Es wurden jedoch in Jadais Pail bei
Bildung der Bihydroxyverbindung wesentliche Mtsile de? ent-=
sprechenden nieht-hydroxylierten Verbindung issoIisTt. All®
Versuche, diese nicht-hydroxyliertea Hebsaproä^te auf mite©
biologischem Weg in die wertvolleren Dihydro^ssrfeonsäuren
Biiwandeln, ■ erwiesen sich bisher als billig s^SOlglos^ da ä
raechenderweisa die Hocardiaspeaies8 di© sbs» BiMtsng eine©
Biieches dieser beiden Produkte aus ilethylfeanzolen fähi
sieh su der gewünschten Umwandlung, ausgehend ψ&η ä&n entsprechenden
Benzoesäuren, nicht eigneten*
Gemäss der Erfindung soll daher ein neues Verfahren zur Herstellung
von Dihydroxybenzoesäuren, ihrer Salze oder Ester aus
den entsprechenden unsubstituierten oder methyl- und/oder hslo
gensubstituierten Benzoesäurederivaten, die mindestens zwei
unsubstituierte, einander benachbarte Ringkohlenstoffatoms bu£
weisen, geschaffen werden. Nach dem erfindungsgemässen Vet^fahr
können diese Benzoesäuren durch die Einwirkung verschiedenes? M cardia-Arten, die normalerweise zu einer solchem SsMendlung 133a
fähig sind, in. die entsprechenden Dihydrosqjrde^iTS-fe
werden.
_ ρ —
9098 35/154?
Gegenstand der Erfindung 1st ein Verfahren zum Herstellen der
Dihyftroxyderivate von aromatischen Carbonsäuren, das dadurch
gekennzeichnet ist, does ηβη in einem Nähtmedium eine Kultur
einer normalerweise nicht mr Hydroxylierung von Benzoesäuren
befähigten Nocardia-Spezies herstellt, auf diese Kultur unter
•eroben Bedingungen ein« Verbindung einwirken lässt, welche
dl« Hooerdie-Zellen ζην Hydroxylierung induziert und daneoh
Benasoesäuren, Salze von Beneoesäuren oder niedere Alkylester
von Bensoeeäuren, die O bis 3 Hethylreste und/oder Halogeaetooe eis Ringsubstituenten und mindestens zwei einander benachbarte uoeubstituierte fiingkohlenstoffatome aufweisen, unter 8eroben Feraentetionsbedingungen der Einwirkung der Induzierten. Nooardiezellen eussetat*
Sie als Ausgangsstoffe verwendeten Benzoesäuren oder Benzoesäurederivate können, gleiche oder verschiedene Ringsubstituenten enthalten. Bevorzugte SaIbθ sind die Alkellsolse der
Bensoesäuren·
Die Verbindung, welche die Nocardiesellen zur Hydroxylierung
induziert, insbesondere eine aromatische oder helogensubstituierte aromatische Verbindung, lässt man während einer eus- v
reichenden Seit auf den Mikroorganismus einwirken, um des Enzymsyetem des Mikroorganismus für die Hydroxylierung zu.
induzieren.
■ - 3 -
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Dse erfindungsgemässe Verfahren kann bequem derart durchgeführt
werden, dass man zunächst In einem Nährmedium eine Kultur
von Hocerdiaaellen herstellt, die normalerweise zur Hydroxylierung
von Benzoesäuren nicht fähig sind, deren Enzymsystem jedoch dözu induziert werden kenn, und dass man danach
diese Zellen induziert, indem man einer Dispersion dieser Zellen
eine zum Induzieren der Hydroxylierung ausreichende Menge einer nachstehend näher beschriebenen induzierenden Verbindung
zusetzt. Dieser Zueetz erfolgt unter Kulturbedingungen und die
Verbindung wird während einer Dauer in Berührung mit den Zellen belassen, die ausreicht, dos. Enzymsystem der Zellen für die
Dihydroxylierung der genannten Benzoesäuren zu induzieren. Danech
werden diese Benzoesäuren oder Benzoesäurederivate in Gegenwart
eines Nährmediume unter aeroben 3?erraentetionsbedingungen
der Einwirkung der induzierten Zellen.susgesetzt und das
Dihydroxyderivat der entsprechenden Benzoesäure aus der Ferment θtionsbrühe isoliert. Wahlweise kann man auch die als Substrat
dienende Benzoesäure gleichzeitig mit der induzierenden Verbindung dem Gärmedium zusetzen, unter diesen Bedingungen
muss jedoch eine Induktionsperiode von einigen Stunden abgewartet werden, bevor die Bildung der Dihydroxyverbinduns.beobachtet
wird.
Zur Herstellung einer für das erfindungsgemässe Verfahren ge-·
eigneten Kocerdiespezies wird vorzugsweise eine Kulturprobe :
von einer Agar-Schrägkultur in einen Schüttelkolben überführt,
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der ein geeignetes Nähreadiua snfcli&lü, das eine Kohlanstoffquellö
umfasst, auf der der Organismus wachson kann» In einigen
Fällen kann die Anwesenheit Gines zusätzlichen Wachstumsstimulierenden Mittels, wie Pepton, Rindfleisehestrakt, Hefeext
rakfe etc» wünschenswert sein,, wenn auch der Zusatz dieser
Stoffe nicht wesentlich ist. Das Gemisch wird dann bei etwa 3O0O inkubiert. In Abhängigkeit von der Konzentration der Zellen
gibt man die induzierende Verbindung entweder sofort oder nach einer Inkubationsdauer von etwa 24· Stunden der wachsenden
Kultur zu·
Wie erwähnt, muss das Nährmediura, das mit dem gewählten Organismus
beimpft wird, zusätzlich zu dem anorganischen Nähretoff und einer Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle enthalten,
die den Organismus ausserdem mit Energie versorgt. Im allgemeinen können zwar beliebige, ©ine Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle
in Kombination enthaltende organische Substanzen verwendet v/erden, wie beispielsweise Kohlehydrate, oder Fettsäuren;
vorzugsweise werden jedoch Kohlenwasserstoffe verwendat,
insbesondere η-Paraffine mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen,
wie η-Butan, n-Dodecan,oder 3ls besonders bevorzugte Verbindung
n-Hexadeaan. In Abhängigkeit von dem gewählten Stamm des Mikroorganismus
können stattdessen wahlweise gewisse aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, verwendet werden. Die.Kohlenstoff
quelle, wie beispielsweise n-Hexadecan, kann in einem Anteil
unmittelbar vor dem Beimpfen des Mediums zugesetzt werden.
— 5 —
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Vorzugsweise sollte sie jje&ooh periodisch in kleinen Anteilen
wahrend des gesamten Verlaufs der Fermentation zugesetzt werden,
um eine Anreicherung dieses Stoffes in dem Medium zu vermeiden,
die dem Organismus gegenüber toxisch wirken wurde. Obwohl,
in Abhängigkeit von dem Mikroorganismus, die zuzusetzende
Menge zu jedem gegebenen Zeitpunkt unterschiedlich sein kann,
ist es im allgemeinen wünschenswert, dass zu jeder beliebigen Zeit die Konzentration von n-Hexadecan in dem Ssfäss nicht
mehr als etwa 3 nil pro Liter bei einer Gesamtmenge dieser Kohlenstoffquelle
von etwa 10 g pro Liter in federn gegebenen Fermentationsansatz
beträgt.
Die dem Nährmedium zugesetzte Stickstoffquelle kann eine beliebige
anorganische oder organische Stickstoff enthaltende
Verbindung sein, die Stickstoff in einer für den Stoffwechsel des i-Ukroorganismus nutzbaren Form aufweist, wie Proteine,
Aminosäuren» Amraoniuneulfat, Ammoniumphosphst, Harnstoff oder
ähnliche.
Der anorgsnische Nährstoff sollte wasserlöslich sei'n und eine
geeignete Quelle für Mineralstoffe, vorzugsweise in Form ihrer Salze, darstellen, wie Eisen-, Natrium- und Phosphorverbindung·
gen. Ein Beispiel eines geeigneten Nährmediums, das zusätzlich
zu der Kohlenstoff enthaltenden Energiequelle verwendet wird,
hat die folgende Zusammensetzung:
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Gramm pro Liter V/osBer
Hernstoff | 2,0 |
Hefeertrakt (Difco) | 0,5 |
Mg SO4.7H2O | 0,2 |
He2OO5 | 0,1 |
OaOl2*2HgO | 0,01 |
MnSO4.HgO | 0,02 |
FeSOn-TH0O | 0,005 |
KH2PO4 | 0,8 |
Na0HPO0 | 1,2 |
Der Sauerstoff kann dem Fermentetlonsme&ium in jeder beliebigen Form zugeführt werden, die bequem durch den Organismus
assimilierbar ist. Vorzugsweise sollte Sauerstoff in Gasform entweder durch Leiten von Sauerstoff oder Luft durch das flüssige Hedium oder durch kräftiges Rühren des Mediums oder auf .
beiden Wegen zugeführt werden.
Die Temperatur, bei der die Fermentation sowohl vor als euch
nach der Zugabe des Substrate durchgeführt wird, kann zwischen etwa 20 und 4-5°0 variiert werden und beträgt vorzugsweise 25 55°O,
um ein entsprechendes Wachstum des Organismus zu gewährleisten. Der pH-Wert des Fermentationsmediums sollte innerhalb
eines Bereiches von 5»5 - 9,5 und vorzugsweise 7,0 - 8,5 gehalten
werden. Im Verlauf der Fermentation sind häufig Elnstel*
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lungen erforderlich, um den pH-Wert innerhalb der bevorzugten
Bereiche zu halten. Dies erfolgt im ellgemeinen durch periodische Zugebe ausreichender Mengen eines Alkalihydroxyds» Die
auf des anfängliche Einführen des Substrats in des vorgebildete Pefimentetionsme&ium folgende Permentationsperiode, welche
die zweite Stufe des erfinduagsgemässen Verfahrens darstellt,
sollte etwe 24· bis 84 Stunden und vorzugsweise etwa J6 bis 60
Stunden dauern. .
Verbindungen, die sich eis geeignet erwiesen heben, die Enzymeysteme
von Nocardie eo zu induzieren, dass diese zur Umwandlung von Benzoe3äurederiv8ten in die entsprechenden Dihydroxyverbindungen
befähigt sind, sind aromatische oder halogeniert® aromatische Kohlenwasserstoffe mit mindestens einem aromatischen Ring, der nicht mehr als einen Hslogensubstituenten aufweist.
Es ist wünschenswert, wenn auch nicht wesentlich, dass
'diese induzierenden Verbindungen mindestens zwei einander benachbarte
unsubstituierte Ringkohlenstoff atome -enthalten« for=- zugsweis© sollten diese induzierenden .Verbindungen,-nicht flllcM-t;ig
und durch den Nocardiaorganismus nicht abbaubar sein, we|öi.;
auch ä.iesö Bedingung nicht wesentlich ist. : :. ^ ν
Beispiele für Verbindungen, die iiocardiaselien in
stellender Weise zur Hydroxylierung von BensoesättradeiiTOtÄ,
induzieren sind Kohlenwasserstoffe, wie p-Xylol^ 3a~Sylols ■
o-Xylol, 0?oluol, Benzol, Diphenyl, Naphthalin, 2-M©thyln&pla~
■- β - - ■
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thalin und Tetralin, halogeniert© Kohlenwasserstoffe wie p-Ghlortoluol
oder OhlorbenBol. Vorzugsweise werden dies© Verbindungen
den wachsenden Nooardiazellen vor der Zugebe dec
als Substrat dienenden Benzoesäure in einer die Hydroxylierung induzierenden Menge zugesetzt. Die Mengen werden Jedoch
so gewählt, dass sie dem Mikroorganismus gegenüber nicht toxiaoh
sind. Diese zugesetzten Mengen hängen von dem induzierenden Stoff
und dem verwendeten Mikroorganismus ab, vorzugsweise sollte Jedoch
in dem Fermentetionsmedium ein Anteil von mehr als fünf
Teilen pro MIl. Teile des Mediums und vorzugsweise etwa 20 bis
200 Teile pro Mill. Teile des Mediums vorliegen. Die induzierende Verbindung v/ird vorzugsweise in einer solchen Menge zügesetzt,
dass diese Konzentrationen in dem Medium bis zur vollständigen Induzierung, die in Abhängigkeit von der W8chstumsgesohwindigkeit
dös Mikroorganismus etwa 1 bis 12 Stunden beträgt, aufrechterhalten werden. ·
Die au hydroxylierenden Benzoesäure-Substrate sind., wie bereits
beschrieben^ Verbincluasren mit 0 bis 3 f-iethyl- und/oder
Halogensubstitiienten am aromatischen Hing, die ausserdem mindestens
zwei nicht-substituierte, einander benachbarte Ringkohlenstoffatome
aufweisen. Beispiele für erfindungsgemäss als
Substrats verwendbare Benzοβsäuren sind Verbindungen wie Benzoesäure,
p-Toluylsäure, o-Toluylsäure, m-Toluylsäure, 2,5-Dimeth,,lDenzoesäure,
^,J-Dimethylbenzoesiliire, 2,3* ^-T rime thy 1-benzoesäure,
3-Methyi-4-chlorbenzoesäure, p-Ohlorbenzoesäure
.. 9—
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BAD ORIGINAL
■'. ■.:.;■. ■■■■■■: .'■■ 1» :.■■-■ : .; ; : "
und ähnliche Verbindungen oder deren Alkalisalae oder die
■ entsprechenden ^niederen-Allylester,, die-1 bis.Ö.Kohlenstoffatome
in den Alkylresten aufweisen«, Da dos■" Medium- vorzugsweise
bei-einem" neutralen pH-Wart oder eine» höheren pH-Wert
gehalten werden muss, liegt natürlich bei Verwendung der
freien Säure selbst dies© im Rösktionsmedium in 3?orm ihres :
Salzes vor. Die niederen Alkylester, die unter diesen Fermen~:.-tationsbedingungen
im wesentlichen nicht-hydrolysierbsr sind,
können gewünsehtenfalls'auch verwendet werden.
Wenn man die genannten Verbindungen der.Einwirkung der induzierten Nocardisaellen aussetzt, erhält man die entsprechen·^
den Dihydroxybenzoesäuren, wie ©!hydroxybenzoesäuren 2,3-Dihydroxy~p-toluylsäure,
2,3-Dihydroxy-4,e-dimethylbenaoesäure,
D±hydroxy-5»6-dimethylbenzoeßäure, 2,3-Di'hydroxy-4-ehlor-5-r
methylbenzoesäure, ^jJ-Diliydroxy-p-ohlorbenzoesäure,-- 2r3-Dihy~
droxy-p-chlorbenzoesaur1© und 2,3-Dihydroxy-^i-t5»6-trimethyi.b.ensoesäure,
-im allgemeinen in Form ihrer Seize oder Ester.
Die als Substrat .verwendete- Benzoesäure v-ärd bevorzugt dem
Feriaentationsinedium periodisch in kleinen Anteilen während dar
gesamten auf die Induktionsperiode folgenden Ferraentationsperiode
zugesetzt-und diese Zugabe.erfolgt-vorzugsweise in Form
der wasserlöslichen Salze. Zusammen mit 'dem Substrat sollten geringe
Mengen der beschriebenen Kohlenstoffquelle, wie n~fiexadecan-,"
zugefügt-werden. Die Menge jedes dem Medium zugesetz-
- IC -
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tea Substrstsnteils liegt* iia Bilgemeinen Am Bereich von 0,2
bis 0,5 S pro Liter und beträgt vorzugsweise weniger als
etwa 1 g pro Liter.
Die !^hydroxyverbindungen werden aus dem Peroeatatloneoiediüm
bequem auf übliche Weise gewonnen« So können beispielsweise
die Zellen durch Zentrifugieren oder Filtrieren aus der Flüssigkeit abgetrennt und die klare Flüssigkeit angesäuert und
mit. einem geeigneten Lösungsmittel wie Äther, Dioacen oder
Amylecetat extrahiert werden.
Erfindungsgemäss verwendbare.Wocerdiaerten sind solche, die.
normalerweise nicht fähig sind, eine Benzoesäure in die ent~
sprechende Mhydroxyverbindung zu überführen, deren Enzymsysteme
.jedoch wie beschrieben dazu induziert werden können« Ein erfindungsgemäss bevorzugter Mikroorganismus ist Nocardia
Sslmonicolor, ATCO, Nr. 19,14-9. .
Andere, ebenfslls geeignete Hocsrdiaspeaies sind in der US-Patentschrift
5 383 289 beschrieben, die verschiedene Nqcardisspezies
angibt, die zur Oxydation von Hethylbenaolen fähig
sind, iis können vorteilhsft folgende weitere Nocsrdiaärteii
verwendet werden, die iß Bergey^ Möftual klassifiziert und
ausserdem in der Araericaa fypeöultüre Collection, Washington, B.G. niedergelegt sind,
- ii -'-■; . "■■
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(1) Ein aus Erde In Alabama gewonnener Wildstamm, dessen Charafcteristik8
etwa denen in Bergey1 β Manual für Nocardia Gorallina angegebenen entsprechen und der daher ale diese Spezies klassifiziert wurde. Eine Kultur dieses Stammes wurde
. unter der lit. ATOG 19·Ο7Ο in der American Type Culture Collection in Washington, D.O. niedergelegt. Kolonien dieses Mikroorganismus
weisen eine orange Färbung auf.
(2) Eine durch ultrsviolette Bestrahlung von ATOO Wr. 19.070
erhaltene rötlich gefärbte Mutante. Die Mutente wurde eben·- :
falls In der American Type Oulture .-Collection- niedergelegt
und als ATGO Nr. 19.071 bezeichnet.
(3) Kin aus Pennsylvaniaerde isolierter und ebenfalls als
Nocardia Oorallina klassifizierter Stamm. Dieser· Hikroorganisraus
ist v/ie der zuerst genannte Wildstainm orange gefärbtf:
unterscheidet sich von diesem Jedoch durch die enzymatisehen
Qxyd8tionseigenschaften. Die niedergelegte Kultur dieses ■Stammes
wurde als AiGC Nr. 19.14-9 bezeichnet. ;
'(&) Ein weiterer aus Erde isolierter Stamm, in Bergeyls
Mienual öle Nocardia Minima klassifiziert und mit ATGG Kr.
$M bezeichnet. .-■■; · : . · '-
Zusätzlich zu den angegebenen Spezies umfasst die Erfindung
die Verwendung anderer Noc8rdia-8pesies, deren Eignung für
- ■ '' ■■ - 12— ';■ ■'"■ ■'■■ ■':, - ■■;."-·■■■'
909835/1547 ;°
das ©rfindungsgemäese Verfahren mit Hilfe beschriebener Methoden
auf einfache Weise routinomägsig featgeatellt werden
kann. Diese Spezies sollen die konstituiven Mutenden der
oben definierten Nocardiamikroorganismen umfassen. Dabei
sollen unter dem Ausdruck "!Constitutive Mutenten" auegewählte
Organismen verstanden, werden; die aus einer Spezies,, die
normalerweise die gewünschte Umwandlung in Abwesenheit eines induzierenden Stoffes nicht bewirkt, durch Mutation zu einer
Spezies entstanden sind, die diese Umwandlung ohne die swingende Anwesenheit eines induzierenden Stoffes bewirkt, Beispiele für andere Arten konstitutiver Mutanten und für Verfahren
zur Herstellung .dieser Mutanten sind bekannt und beispielsweise in Bioöhim. Biophys.Acta, 90 (1964) 609-610 beschrieben.
Ausführungsformen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen genauer verdeutlicht.
In einem sterilen Fermenter der Nonnalkspazitat 60 1 wurden
32 1 des im folgenden beschriebenen sterilisierten kohlengtoffreien
Mediums hergestellt. Zu diesem Zweck wurden 3 Ansätse
von Bestandteilen getrennt im Autoklaven behandelt: eine 50 #-ige (Gewicht pro Volumen) Harnstofflösung, eine Lösung
eines Phosphatgemisches und eine Lösung der übrigen Salze:
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Hernetoff | 2,0 |
Hefeextrakt (Difco) | 0,5 |
Mg ao4.7H2o | 0,2 |
0,1 | |
OsOl2.2H2O | 0,01 |
MnSO4.H2O | 0,02 |
PeSO^.7Ho0 | 0,005 |
2 4 | 0,8 |
Ne2HPO4 | 1,2 |
Der Fermenter war ein mit Zwischenwand versehener Kessel aus
rostfreiem Steh! mit 30,5 cm Innendurchmesser, der mit einem
beschaufelten !Turbinenrad von 15*2 cm versehen war. Der Fermenter wurde bei 3O0O betrieben, wobei sterile Luft in einer
Menge von 0,33 Volumenteilen pro Volumenteile pro Minute eingeführt und eine Rührgeschwindigkeit von 500 UPM aufrechterhalten
wurde. Der Fermenter wurde mit 3 1 einer kräftigen 48
Stunden alten Kultur von ffocardie -aelmonicolor, ATCC Nr. 19.14-9
inokuliert. Diese Kultur war in einem ähnlichen Gefäss in dem
gleichen Medium hergestellt worden, dem n-Hexedecan kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 5 ml pro Stunde pro Kessel
während der ersten 8 Stunden und 10 ml pro Stunde pro Kessel während der 18. bis 48. Stunde zugefügt worden war. Ίη. den
Fermenter wurde n-Hexadecan kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit
von 5 "ml pro Stunde pro Kessel vom Beginn bis ζην 6,
- 14 - -■■■"
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Stunde und 10 ml pro Stunde pro Kessel während der 6. bis 17·
Stunde zugeführt. In der 17· Stunde, in der ein gemässigtes
Wachstum erreicht wurde, stellte man den pH-Wert der Kultur
erforderlichenfalls mit Zusätzen von 8 #-iger wässriger NaOH
auf 8 ein. In der 17. Stunde wurde ausserdem begonnen, Benzol
in einer solchen Rate zuzusetzen, dass der scheinbare Benzolgehelt
in der Kultur im Bereich von 75 -'125 mg/1» gemäss der
quantitativen Ultraviolettspektralenelyse der Isooctanextrakte
der Kultur, aufrechterhalten wurde, Ausserdem wurden in der 17. Stunde der Kultur 20 g p-Toluylsäure, zusammen mit ausreichend
NaOH zur Neutralisierung der Säure und zum Auflösen
der Säure in Wasser als Nstriumsalz zugesetzt. Die gleichen
Zusätze wurden in der 42., 53· und 62. Stunde vorgenommen, um
die Konzentration an p-Toluylsäure innerhalb des Bereichs von 2,3 - 0,5 g pro Liter zu halten. Die kolorimetrische Prüfung
auf 2,3-Dihydroxy-p-toluylsäure (DHFE) zeigte die Anwesenheit
von 0,89 g pro Liter in der 62. Stunde und 1,0 g pro Liter in:
der 70. Stunde. Die Anwesenheit von DHPT wurde eusserdem durch
das UV-Spektrum und das typische Beweglichkeitsverhelten und
die Reaktion im Papierchromatogramm bestätigt. Wie im Papierchromatogramm
beobachtet wurde, verringerte sich der Anteil an p-Toluylsäure im Mess der Anreicherung von DHPI. Versuche,
die auf diesen fferraentationsansetZ entsprechende Weise, Jedoch
ohne Benzol durchgeführt wurden, zeigten weder einen Verbrauch
von p-!E©luylsäure noch Bildung von DHFD.
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SO5648
Ein Fermenter, der 32 1 steriles Medium enthielt, wurde wie
in Beispiel 1 beschrieben, vorbereitet und beimpft* Der Fermenter wurde bei 300O betrieben, wobei sterile Luft mit einer
Geschwindigkeit; von 0,20 Vol. Teilen pro Volumenteil pro Minute augeführt und eine Rührgesohwindigkeit von 500 UPM aufrechterhalten wurde. n-Hexadeeen wurde während der ersten 9
Stunden nach der Inokulation kontinuierlich in einer Bote
von IQ ml pro Stunde pro Kessel zugeführt. Zwischen der 19.
und 22* Stunde wurden 10 g in 40 ml n-Hexedecan gelöstes
Diphenyl kontinuierlich zugesetzt und eine gleiche Zugabe
wurde zwischen der 57· und 59· Stunde vorgenommen. In der
Stunde wurde der pH-Wert der Kultur mit 8 #-iger wässriger
Lösung von NaOH suf 8,0 eingestellt und erforderlichenfsllö
durch weitere NaOH-Zusätze während des gesamten Versuchs bei
diesem Wert gehalten* Zwischen der 22. und 4-5· Stunde wurde
eine 20 #-ige (Gev;icht pro Volumen) wässrige Lösung von p*»
Toluylsäure (zusammen mit der für Neutralisation der Säure
und Lösen in Wasser als Wetriumsalz ausreichenden Menge NeOB)
mit einer Geschwindigkeit von 26 ml pro Stunde pro Kessel zugesetzt. Die oberhalb der Gärbrühe befindlichen Flüssigkeiten
enthielten gemäss der quantitativen Ultraviolet-tspektrelena^
lyse 1,25 g pro 1 DHPT nach 45 Stunden und 2,0 pro 1 nach 6&
Stünden. Die Anwesenheit von DHPT wurde durch das typisöhe-Beweglichkeitsverhalten
im Papierchromatogramm und
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tionen bestätigt« Yerglelohsverauche, die ohne Verwendung von
Diphenyl durchgeführt wurden, zeigten keinen Verbrauch von
p-Toluylsäure, noch die Bildung von DHFT,
Eine wachsende Kultur von Nooardla wurde auf die im Beispiel
1 zur Herstellung des Impfansatzes beschriebene Welse hergestellt.
Ein Anteil von 35 ^l wurde in einen 300 ml-Kulturkolben
überführt, dem 4*5 ml Wasser, 0,5 ml einer wässrigen
Lösung von Natrium-p-toluat (8 #, bezogen auf das Gewicht
der freien Säure pro Volumen) und 0,05 ml einer 30 #-igen
(Vol.-#) Tetralinlösung in n-Hexadecan zugesetzt wurden. Nach
9-stündigem Schütteln der Kultur im Kolben bei 30°ö hatten sich in der Brühe 0,05 g pro Liter DHPO? gebildet. Im Parallelversuch
angesetzte Kolben, die kein Natrium-p-tolust oder Tetralin
enthielten, zeigten keine DHPT.
Beispiel 4- ■
Eine wachsende Kultur von Nocardia wurde auf gleiche Weise wie
in. Beispiel 1 in einem Fermenter gezüchtet und p-Xylol ausgesetzt,
ohne dass jedoch p-iPoluat zugegeben wurde. Nach 7-stündigera
Kontekt mit p-Xylol wurde eine Probe von 240 ml aus dem Permentar1 entnommen, die Zellen aus der Brühe durch Zentrifugieren
entfernt, einmal durch Suspendieren in 240 ml eines kohlenstoffreien I'!inerals8lzmediums gewaschen, erneut zentri-
' ~ 1? "" 909 835/1547
fügierfc und sehliesslich wieder in 240 ml des gleichen Mediums
suspendiert. 35 ml diasei? ZellBuspension wurden in einen KuI-tmrkolben
gegeben, dem men 0,5 ml einer wässrigen Natrium-ptfoluetlöaung
(8 #, bezogen euf des Gewicht der freien Säure
pro Volumen) zusetzte. Neoa 1-stündigem Schütteln der.Kolben-"
kultur bei 500O wurde die Anwesenheit von 0,15 g DHPT pro 1
in der Brühe festgestellt. Eine auf gleiche Weise erhaltene
Kultur, aus der jedoch Natrium-p-toluat weggelassen wurde,
zeigte kein DHPT. Ausserdem zeigten euf gleiche Weise, jedooii
ohne Zusatz von p-Xylol, während des Wachsbumsstadiums dep
Fermentation erhaltene Zellen, keine Fähigkeit, N8trium-p~
toluet in DHPT zu überführen, wenn sie auf gleiche Weise wi®
die mit p-Xylol behandelten Zellen nach dem Waschen im KoI-benvepsuch
geprüft viurden.
Die in Beispiel 3 beschriebenen Terfahrensschritte wurden mit
der Ausnahme wiederholt, dass Tetralin durch m-Xylö'l ersetzt
vnirde und der Kolben sofort mit einem Korkstopf©n verschlössen
wurde. ·ίίθch 22 Stünden wurden in der Brühe 0,02 g DHPT
pro 1 festgestellt. In dem Yergleiohskolben, der kein n-Xylol
enthielt, wurde keine DEPS gebildet.
Die Verfahrensschritte des Beispiels 3 wurden wiederholt
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der Ausnahme, dees anstelle von Tetralin o-Xylol verwendet
wurde und der Solben sofort mit einem Korkstopfen verschlossen
wurde. Der verwendete Mikroorganismus war Nocardia Oorallina
AiDOC Nr. 19* 14-8. Neon 22 Stunden wurde DHM in einer Konzentration
von 0,04- g pro !festgestellt. In dem Vergleiohskolben
wurde keine DHPI gefunden·
Die Verfahrenssohritte gemäss Beispiel 3 wurden wiederholt,
wobei anstelle von Tetralin 2-Methylnaphthalin verwendet wurde.
Nach 22 Stunden wurden 0,11 g DHPT pro 1 in der Brühe
festgestellt, während in dem Vergleichskolben keine DHFD beobachtet werden konnte«
Beispiel 3 wurde unter Verwendung von Naphthalin anstelle
von Xetralin wiederholt. JHach 22 Stunden hatten sich 0,11 g
DHPO? pro 1 in der Brühe gebildet, während in dem Vergleichs-*
kolben keine DHPT beobachtet wurde,
Das Verfahren gemäss Beispiel 4- wurde ait der Abänderung
wiederholt, dass man anstelle von p~Xylol p-Ohldrtoluol,in
dem Kulturferraenter verwendete. Als Mikroorganismus wurde
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Nocardia Minima, ATOC Kr. 19.150 verwendet. In dem Kolben,
der die gewasche ZeI!suspension und p-Tolulüt enthielt, wurden
neon 1-stündigem Schütteln bei 30°ö 0,11 g DHPT pro T
beobachtet. . .
Beispiel 10 . -
Die Verfahrensschritte des Beispiele M- wurden wiederholt,
wobei in den Kulturversuchen mit gewaschenen Zellen p-Ohlorbenzoleäure
verwendet wurde. Der verwendete Mikroorganismus wer Nocardia sp., ATOO Nri 19.070. Nach 1-sttindigem Schütteln bei 300O wurden 0,08 g 2t3-Mhydro^~4~chlorbenzoeöäüre
pro 1 festgestellt. - _
Beiepiel 11
Die Verfehrensacliritte des Beiapiels 4 wurden in der Weise
v/iederholt, dees man in dem Kulturferment er anstelle von
p-Xylol Toluol verwendete. Der verwendete Mikroorganismus
war Nocardi.8 sp. A0?OG Kr. 19.071. Nach 22 Stunden wurde DHPT
in einer Konzentretion von 0,04 g pro 1 festgestellt. '
Beispiel 12 .;.'.· ; " . :.
Das Verfahren gemäss Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei anstelle von Tetralin Mesitylen verwendet wurde. Das Ergebnis
war negativ; es wurde keine Bildung von DHPT beobeohtet.
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Unter Verwendung von. Dus?ol anstelle voa (Tetralin wurden die
Verfahrensschritte gemäss Beispiel 3 wiederholt. Das Ergebnis vrer negativ; es wurde keine Bildung von DHPQ? beobachtet.
Die Verfahrensschritte gemäsa Beispiel 3 wurden unter Vervrendung
von p-Diohlorbenzol anstelle von Tetralin wiederholt* Das
Ergebnis vjst negativ; es wurde keine Bildung von DHPT beobachtet.
Diese Beispiels veranschaulichen besonders die Herstellung von
2,3~Dihydroxy~p-toluylsäure unter Verwendung von p-Toluylsäure
als Ausgangsstoff· Fermentationen, die mit anderen der· genannten
Benzoesäurederivate durchgeführt werden, ergeben jedoch ana-"loge
Ergebnisse. Diese Ergebnisse werden unabhängig von der gewählten
induzierenden Verbindung erhalten«
Die erfindungsgemäss hergestellten Dihydroxybenzoesäuren sind ·
.wertvolle Produkte, die sich für verschiedene, wirtschaftlich
interessante Anwendungsswecke eignen, insbesondere als Chelatbildner,
Metalldesaktivatoren und Zwischenprodukte für Farbstoffe,
. . . -
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Claims (1)
- P...8. "fc- Q fV t. e η s ρ r ü" c. h e1» Verfahren 2um Herstellen der Dihydroxyderivate von aromatischen Carbonsäuren, dadurch g e k e η η ζ e i c h - . net, dass man in einem Nohrmedium eine Kultur einer normelerweise nicht zur Hydroxylierung von Benzoesäuren befähigten Nocardiaspezies herstellt, auf diese Kultur unter aeroben Bedingungen eine Verbindung einwirken lässt, welche die Nocsrdiazellen. aur Hydroxylierung induziert und danach Banzoesäuren, Salze von Benzoesäuren oder niedere Alkylester von Benzoeseuren, die 0-3 Methylreate und/oder Halogenatome als Eingsubstituenten und mindestens 2swei einander benachbarte unsubstituierte Singkohlenstoffatome aufweisen» unter aeroben Sermentationabedingimgen der Einiiirkung der induzierten Nocardiezellen aüasetzt.2» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Verbindung zum Induzieren der Nocardiazellen einen aromatischen Kohlenwasserstoff oder halogenierten aromatischen Kohlenwesserstoff verwendet, der mindestens einen aromatischen Ring mit nicht mehr als einem Halogensubstituent.en auf v/eist.3. Verfahren nach. Anspruch 1 oder 2, dadurch -g θ k e η η .-ze i c hast, dass dia sum Induzieren der Nöcaraias©!·» len Y3::-;3iidets Verbindung ainde.T-;3Ss. 3«si einjnCLor v.r^ch-9 098 35I % B £7· \BAD ORIGINALbarte unsubstituierte Kohlenstoffatome Im erometisehen Ring besitzt.ί 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch g e *T ■ kennzeichnet, dass men zum Induzieren der NO-cardiazellen p-Xylol, m-Xylol, o-Xylol, Benzol, Toluol, Diphenyl, Naphthalin, 2-Hethyln8phthelin, Tetralin oderι ■ - ■ ■ ■p-Ohlortoluol verwendet..{■ 5· Verfahren neon einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gele e nnzeich ne-t, dess man die Fermentation bei einem pH-Wert von etwa 5j5 bis 9i5 durchführt.6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5« dadurch g e kennzeic h η e t, dass man als induzierte Nocardiaspezies BFocardia Coralljjia, Nocardia Sslmonicolor oder No-ceraia Minima verwendet. :7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g e * kennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der Bezeichnung.- ATOO Nr. 19.070, ATOO Nr. 19.071, ATOÖ Nr. 19.148, AfJ?GO Nr. 19.149 oder 19.150 verwendet*8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, dass man zur Überführung von p~ Toluylsäure in 2i,5-I)ihydro3qy*-p~töluylsäure als induzierten- 23 -' ORIGINAL INS^CTED 9 0 9 8 3 5/15471906648Mikroorganismus Nooardie Salmonieoloi?, ATÖÖ Nj?« X9e149 verwendet.9. Verfahren zum Herstellen des DihydroxyderiveteOsrbonsäuren, dadujcoh g eke ώ η ε β i ο h η θ t, men Benzoesöuren, Salse von Benzoeeäupenodej? niedere Älkylester von Beneoesäupen, die O - 5 Metnylpeste und/ oder Halogens tome als Ringeubetituenten und Etindestens zwei einander benachbarte unsubstituierte Hingkonlenetoffatome eufweisen, uater aeroben Fermentationgbedingungen dep Einwirkung einer konstitutiven Mutarite eines Mikroorganismus der Spezies Nocardia suesetst*9098 35/15 A 7
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993013214A1 (de) * | 1991-12-24 | 1993-07-08 | Basf Aktiengesellschaft | Hydroxylierung von alkylcarbonsäuren mit hilfe von pilzen |
Families Citing this family (1)
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FR3114608B1 (fr) * | 2020-09-29 | 2023-06-09 | Safran Aircraft Engines | Procédé de commande d’une turbomachine visant à éviter les survitesses |
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- 1969-02-07 BE BE728140D patent/BE728140A/xx unknown
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993013214A1 (de) * | 1991-12-24 | 1993-07-08 | Basf Aktiengesellschaft | Hydroxylierung von alkylcarbonsäuren mit hilfe von pilzen |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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GB1244401A (en) | 1971-09-02 |
NL6901952A (de) | 1969-08-12 |
CH509405A (de) | 1971-06-30 |
FR2001545A1 (de) | 1969-09-26 |
BE728140A (de) | 1969-08-07 |
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