DE1817652C3 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung geringer Mengen von Bacitracin - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Bestimmung geringer Mengen von BacitracinInfo
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Description
40
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung geringer Mengen von Bacitracin und
dessen Salzen in Futterstoffen für Tiere, bei dem der Futterstoff gegebenenfalls mit Azeton behandelt wird,
falls der Feuchtigkeits- und Fettgehalt 8 bzw. 2% Übersteigt, dann der Futterstoff bei pH 2 einer
Säurebehandlung unterzogen wird und anschließend ein Von unerwünschten und ungelösten Proteinen und
Futterstoffbestandteilen freier Extrakt hergestellt wird, der mit Phosphatpuffer verdünnt einer mikrobiologi-Sehen
Analyse unterworfen wird.
Bactracin und seine Salze werden als wachstumsfördernde Mittel viel als Zusatz in Tierfuttermitteln
verwendet. Zur Kontrolle, ob der Bacitracingehalt in dem Futter mit dem angegebenen Wert übereinstimmt,
benötigt man genaue Analysemethoden, auch wenn die Wirksubstanz nur in sehr geringen Mengen vorliegt.
Der Ausdruck Bacitracin, wie er hier verwendet wird, Schließt dessen Salze, Zinkbacitracin, Manganbacitracin,
tiacitracinmethylendisalicylpräparate usw. ein. Aus der r>o US-PS 33 06 827 ist es bekannt, Bacitracin in Futterstoffen
durch Entfernen von Fett und Feuchtigkeit mit Azeton (oder anderen ähnlichen dehydratisierenden
und fettlösenden Substanzen), anschließende Extraktion des Bacitracins nach Zugabe von verdünnter Salzsäure fts
mit einer Pyridinlösung, Abtrennen der Feststoffe von dem Extrakt mittels Zentrifugation, Eindampfen der
Extraktionslösung und Auflösen des Eindampfrückstandes, Einstellen des pH-Wertes auf etwa 2,0 und
anschließende mikrobiologische Analyse zu bestimmen. Diese Methode ist langwierig und umständlich und wird
noch dadurch erschwert, daß die erhaltenen Werte nicht zuverlässig sind, wenn der Extrakt mehr als 1% Pyridin
enthält Enthalten die Analysenproben weniger als 20 ppm Bacitracin, muß darüber hinaus gegen einen
Blindwert gemessen werden. Weiter ist Pyridin giftig, und es dürfen in der Luft im Labor nicht mehr als 5 ppm
Pyridin vorhanden sein. Daher ist für die Untersuchungsräume ein hochwirksames und konstspieliges
Entlüftungssystem erforderlich.
Es wurde nun gefunden, daß diese Nachteile nicht auftreten, wenn die Säui ebehandlung mit angesäuertem
Methanol durchgeführt wird, darauf Phosphatpuffer von pH 6,5 zugegeben und anschließend zentrifugiert
wird und der so erhaltene Extrakt mit Phosphatpuffer bis zu einer Bacitracinkonzentration von 0,01 bis 1 I E/ml
verdünnt wird.
Die Futterstoffe lassen sich in zwei Gruppen einteilen: solche, die mehr als 50 ppm Bacitracin
enthalten und solche mit weniger als 50 ppm. Die erste Gruppe wird nach der »kurzen Methanolmethode«, die
zweite nach der »langen Methanolmethode« analysiert.
Die kurze Methanolmethode umfaßt folgende Schritte: Der Futterstoff wird mit Azeton benandelt, wodurch
Feuchtigkeit und Fettstoffe aus dein Futter entfernt wird. Diese Azetonbehandlung kann allerdings entfallen,
wenn der Futterstoff weniger als 2% Fettstoffe und weniger als 8% Feuchtigkeit enthält. Nach der
Azetonbehandlung wird das Futter getrocknet und das Bacitracin aus dem Futter mit Methanol/HCI extrahiert.
Nach Zusatz von Methanol/HCI soll der pH-Wert 2 oder weniger betragen. Ist dies nicht der Fall, wird
1 n-HCl zugesetzt, bis der pH 2 ist. Ein entsprechendes
Volumen 5%igen Phosphatpuffers pH 6,5 wird zugegeben und das Gemisch etwa 15 — 25 Min. geschüttelt.
Nach Trennen der Feststoffe vom Extrakt durch Zentrifugieren wird der Extrakt mit Phosphatpuffer bis
zu einer geeigneten Bacitracinkonzentration (von 0,01 bis I ΙΕ/ml, vorzugsweise 0,1 ΙΕ/ml) verdünnt. Der
Extrakt wird anschließend mikrobiologisch auf seinen Inhalt von Bacitracin analysiert, wobei jede beliebige
geeignete mikrobiologische Analysiermethode in Betracht kommen kann, wie z. B. die in »Assay methods of
Antibiotics, A Laboratory Manuals, 1355, D. C. Grove
und W. A. Randall und im US-Patent 33 06 827 beschriebene Agardiffusionsmethode. Bei unseren Untersuchungen
hat sich ergeben, daß die Methanolkonzentration im zu analysierenden Extrakt nicht 18%
überschreiten soll, da eine höhere Konzentration die mikrobiologische Analyse stören würde.
Die lange Methanolmethode umfaßt eine Azetonbehandlung nebst Extrahieren mit Methanol/HCI und
Phosphatpuffer, wie oben beschrieben. Nach dem Zentrifugieren wird der pH-Wert, beispielsweise in
10-20ml des Extrakts mittels 1 n-NaOH und einem Indikator, z. B. Bromkresolpurpur, auf 6,5 eingestellt.
Danach wird etwa die Hälfte der Extraktionsmittel in einem rotierenden Vakuumeindampfer eingedampft
und der Eindampfrest in Phosphatpuffer aufgelöst, worauf der Bacitracingehalt des Extrakts wie oben
erwähnt mikrobiologisch analysiert wird.
Es geht hervor, daß die Zahl der Reaktionsschritte, insbesondere bei der kurzen, aber auch bei der langen
Methanolmethode geringer als bei der Pyridinmethode ist. Gemäß der Erfindung kann man die Analysenkapazität
mit der kurzen Methanolmethode zumindest
vervierfachen (das Ausfällen der Proteine aus dem Extrakt, das Eindampfen und die pH-Einstellung können
entfallen) und mit der langen Methanolmethode zumindest verdoppeln (weil das Ausfällen der Proteine
in\ Extrakt entfallen kann und das Eindampfen des Extrakts nicht quantitativ sein muß).
Bei der Pyridinmethode muß man ölindwertextrakte
für die mikrobiologische Probe beim Analysieren von weniger als 20 ppm Bacitracin enthaltenden Futterstoffen
verwenden. Die Herstellung eines Blindwertextrak- ln
tes ist sehr zeitraubend. Nach unseren Erfahrungen war es in keinem einzigen Falle erforderlich, bei Verwendung
der Methanolmethoden mit einem Blindwenextrakt zu vergleichen. Die Analysieraibeit wird auch
dadurch erleichtert und preiswerter gemacht, daß das bei der Arbeit mit Methanol erforderliche Emlüftungssyaem
weitaus einfacher und preiswerter als das bei der Arbeit mit Pyridin erforderliche ist.
Wir haben Analysen mit 27 Futtergemischen mit
Bacitracinkonzentrationen von 3—300 ppm (siehe Tabelle 1) vorgenommen. Ir. der Tabelle I ist ein Auszug
dieser Analysen wiedergegeben.
Futter | Futtertyp | Ergebnis bei | Meihanol- | Ergebnis bei |
Nr. | analyse in pp | >m | Pyridinanaiyse | |
Bacitracin | ppm Bacitracin | |||
lange | kurze | |||
Methode | Methode | |||
1 | Norw. Schweinefutter | 5,1 | 5,1 | |
2 | Dänisches Kükenfb.ter | 5.2 | 4,5 | |
3 | Norw. Schweinefutter | 2! | 2) | |
- | lugoslawisches Schweinefutter | 21 | _ | 18 |
5 | desgl. | 22 | _ | 24 |
6 | Norw. Schweinefuner | _ | 51 | 50 |
7 | desgl. | 37 | 36 | |
8 | desgl. | _ | 42 | 41 |
9 | desgl. | _ | 233 | 221 |
10 | desgl. | 222 | 213 |
Sämtliche Werte in der Tabelle geben den Mittelwert zuminJcst dreier Parallel-Analysen an.
Beispiel 1
(kurze Methanolmethode)
(kurze Methanolmethode)
4 Proben ä 10 g eines Futters, dem 50 g Bacitracin je t
zugesetzt waren, werden in je einen Mörser gegeben. Jede Probe wird 2 Minuten mit 25 ml Methanol, dem 2%
konzentrierte Salzsäure zugesetzt sind, gerieben. Das so erhaltene Gemisch wird zusamme·! mit 25 ml Phosphatpuffer
pH 6,5 in einen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben
gegeben und 20 Minuten geschüttelt. Anschließend wird das Gemisch 5 Minuten bei 4000 I Imdrehungen/Minute
zentrifugiert und der Überwand mit 5°/oigetn Phosphatpuffer
pH 6,5 auf 1:10 verdünnt. Die 4 verdünnten Extrakte werden gemäß der in US-PS 33 06 827 und von
D. C. Grove und W. A. R a η d a', 1 in »Assay
Methods of Antibiotics^, 1955 beschriebenen Methode auf ihren Bacitraeingehalt geprüft. Diese Prüfung
geschieht wie folgt:
In 24 Petriichalen (Durchmesser 9 cm) werden je 10 ml Agar gegeben,der mit Micrococcus flavus beimpft
ist. Auf jede Schale werden auf den Agar 6 Stahlzylinder (Durchmesser 7 mm) gesetzt. Es werden Baeuracin-Standardlösungen
mit 0,02,0.04 und 0.1 IE/ml Bacitracin
in 5°/oigem Phosphatpuffer pH 6.5 hergestellt (1 mg
Bacitracin = 42 Internationale Einheiten [IE]). Auf 4
Agarscheiben werden die Zylinder abwechselnd mit den Standardlösungen, die 0,02 und 0,04 IE/ml Bacitracin
enthalten, gefüllt. Auf 4 anderen Agarscheiben werden die Zylinder abwechselnd mit den Standardlösungen, die
0,04 und 0.1 IE/ml Bacitracin enthalten, gefüllt. Die
Zylinder von jeweils 4 weiteren Agarscheiben werden abwechselnd mit einem Futterstoffextrakt und der
Standardlösung mit 0,04 IE/ml Bacitracin gefüllt. An schließend werden die Scheiben 16—18 Stunden bei
32 — 35' C inkubiert. Die Durchmesser der ein/einen
Hemmungszonen werden gemessen und die Mittelwer te für die verschiedenen Lösungen sowie die Differen/
der Mittelwerte ermittelt. Die Tabelle 11 zeigt die
so erhaltenen Ergebnisse:
Lösung | Mittelwert der | Mittelwert der | Differenz | I E/ml ge |
Durchmesser tier | Durchmesser für | mäl5 Stan- | ||
Hctnmutigs/oncn | 0,04 IE/ml | dardkurvi- | ||
0,02 I E/ml | 15.04 mm | 16.82 mm | -1,78 mm | |
0,1 I E/ml | 19.30 mm | 16,90 mm | + 2.40 mm | _ |
Probe 1 | 16.85 mrn | 16,75 mm | + 0,10 mm | 0,041 5 |
Probe 2 | 16.90 mm | 16,85 mm | + 0.06 mm | 0.0410 |
Probe 3 | 16,85 mm | 16,80 mm | + 0,05 mm | 0,0410 |
Probe 4 | 16.8'i mm | 16.68 mm | + 0.17 mm | 0.0425 |
Nun wird eine Standardkurve gezeichnet, indem man auf halblogarithmischem Papier den Logarithmus IE/ml
auf der Abszisse und den Durchmesser der Hemmungszonen in mm auf der Ordinate einzeichnet. Mit Hilfe des
obenstehenden Mittelunterschiedes zwischen den Hemmimwsznnen
für 0,04 IE/ml und 0,02 ΙΕ/ml, und des Mittelunlerschiedes zwischen den Hemmungszonen für
0,04 und 0,1 IE/ml kann man nun 3 Punkte eintragen, und
die beste, gerade Linie zwischen diesen Punkten ist die Standardkurve (siehe Figur).
Mittels der Mittelunterschiede zwischen den Hemmungszonen für jeden Phosphatextrakt und für
0,04 IE/ml kann man auf der Standardkurve den Bacilracininhalt in jeder einzelnen der vier Proben
ablesen. Diese Werte sind in der Tabelle III wiederge-
Anzahl IE/ml · 10 (ml) · 50 (ml) · 1000
Π (ml)'· 42 (IE/ml) · KMg)""
(Bei der Ausrechnung wurde berücksichtigt, daß 1 mg Bacitracin = 42 intern. Einheiten sind.)
Tubelle III Das Ergebnis der in der Tabelle Beispiele ist: |
Mittelwert | I E/ml | Il angegebenen |
Probe Nr. | 0,0415 0,0410 0,0410 0,0425 |
ppm Bacitracin | |
1 2 3 4 |
:49,4 ppm Bacitracin. | 49,5 48,8 48,8 50,5 |
|
Beispiel Il | |||
(Lange Methanolmethode) |
IS
Vier Proben ä 10 g Futterstoff, denen 5 g ppm Bacitracin zugesetzt sind, werden in vier Mörsern
abgewogen. Jede Probe wird folgendermaßen behandelt:
Die Probe wird 2 Min. mit 50 ml Azeton verrieben. Das Azeton wird hierauf in ein Zenlrifugenglas
dekantiert. Azeton und die im Azeton aufgeschlemniten ben. Wenn man die im Futterstoffextrakt enthaltene
Anzahl IE Bacitracin/ml gefunden hat, läßt sich der Futtergehalt an Bacitracin folgendermaßen ausrechnen:
= ppm Bacitracin im Futterstoff
Futterstoffreste werden 5 Min. bei 4000 Umdr./Min. zentrifugiert. Das Azeton wird dekantiert und weggeworfen.
Das Futter im Mörser und die Futterstoffreste im Zenlrifugenglas werden getrocknet (gegebenenfalls
im Wärmeschrank bei 40"C). Mit 25 ml Methanol, welches 2% konzentrierte Salzsäure enthält, werden die
Futterstoffe im Zentrifugenglas quantitativ zu dem Futter im Mörser gespült. Das Gemisch wird 2 Min.
gerieben und dann mittels 25 ml 5%igem Phosphatpuffer pH 6,5 quantitativ in einen 250 ml Erlenmeyerkolben
überführt. Das Gemisch wird 20 Min. geschüttelt, worauf es 5 Min. bei 4000 Umdr./Min. zentrifugiert wird.
20 ml des Überstandes werden in einen 250ml
Rundkolben mit Schliff überführt und mit 1 ml 0,04 Bromkresolpurpui auflösung versetzt. Hierauf wird
1 n-NaOH tropfenweise bis zum Umschlag des Indikators (pH 6,5) zugegeben. Der Inhalt des Rundkolbens
wird dann mit einem Rotationsverdampfer bei 30° C auf wenigstens die Hälfte seines Volumens eingedampft.
Der Eindampfrest wird in 5%igem Phosphatpuffer mit pH 6,5 aufgelöst und quantitativ in einen 20-ml-Meßkolben
übertragen, der bis zur Anzeige gefüllt wird. Die vier Futterstoffextrakle werden nun nach der Agardiffusionsmethode,
wie im Beispiel I beschrieben, auf ihren Bacitracingehalt geprüft, und die Anzahl ppm Bacitracin
wird wie folgt ausgerechnet:
20 · 50 · 1000 _ . . . ^ ——]n~ ,.,
= ppm Bacitracin im Futterstoff
Der Mittelwert der vier Parallelanalysen war im Beispiel 4,9 ppm Bacitracin.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
5
Claims (4)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung geringer Mengen von Bacitracin und dessen Salzen
in Futterstoffen für Tiere, bei dem der Futterstoff gegebenenfalls mit Azeton behandelt wird, falls der
Feuchtigkeits- und Fettgehalt 8 bzw. 2% übersteigt, dann der Futterstoff bei pH 2 einer Säurebehandlung
unterzogen wird und anschließend ein von ι ο
unerwünschten und ungelösten Proteinen und Futterstoffbestandteilen freier Extrakt hergestellt
wird, der mit Phosphatpuffer verdünnt einer mikrobiologischen Analyse unterworfen wird, d a durch
gekennzeichnet, daß die Säurebehandlung mit angesäuertem Methanol durchgeführt
wird, darauf Phosphatpuffer von pH 6,5 zugegeben und anschließend zentrifugiert wird und der
erhaltene Extrakt mit Phosphatpuffer bis zu einer Bacitracinkon^entration von 0,01 bis 1 ΙΕ/ml verdünnt
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung des Bacitracingehaltes in Futterstoffen, wo dieser
Gehalt unter 50 ppm ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Methanol vor der mikrobiologischen
Analyse aus dem Extrakt entfernt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Extraktes mit NaOH
auf 6,5 eingestellt wird, darauf das Methanol entfernt und schließlich der Eindampfrest mit Phosphatpuffer
bis auf eint Bacitracinkonzentration innerhalb des Gebietes 0,01 — 1 ΙΕ/ml verdünnt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß die Methanolkonzentration im
Extrakt vor der mikrobiologischen Analyse auf weniger als 18% gebracht wird.
Applications Claiming Priority (2)
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Publications (3)
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DE1817652A1 DE1817652A1 (de) | 1969-12-04 |
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