DE1806625A1 - Verfahren zur Herstellung von Chymotrypsin B - Google Patents

Description

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MONACO

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Verfahren zur Herstellung von Chymotrypsin B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Chymotrypsin B genannten Enzyms.

In der Bauchspeicheldrüse finden sich verschiedene niohtaktivierte eiweißartige Enzyme, sum Beispiel dit Chyaotrypsinogene Alpha und B. Ausgehend von diesen Sneymvorstufen konnte man je nach den angewendeten Aktivierungen methoden Chymotrypsin Alpha, Beta, Gamma oder Delta und das Chymotrypsin B erzeugen. Laakowaki und Mac Carthy haben als erste und am vollständigsten das Chymotrypsinogen B und das Chymotrypsin B untersucht. 1949 haben diese Forscher die elektrophoretischen Beweglichkeiten dieser Enzyme bestimmt. Sie fanden einen ieoelektrischen pH-Wert ( oder isoelektrischen Punkt) von 5>2 für die Vorstufe und von 4,7 für das aktive Enzym. 1951 stellten sie mit Smith und Brown die ersten Zonstanten des Chymotrypsinogens B genau fest.

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Verschiedene Autoren haben anschliessend diese Stoffe untersucht, zum Beispiel Hirs, der die Existenz von zwei Chymotrypsinogenen in der Bauchspeicheldrüse von Ochsen bestätigt hat, oder kürzlich Greene und Charles vom Laboratorium des Professors Desnuelle in Marseille. Schliesslich hat Fräulein Guy aus dem gleichen Laboratorium am 18.Oktober 1966 eine These veröffentlicht, welche Klarheit über die tatsächlichen Kenntnisse bezügl. dieser Frage verschafft. Diese These enthält insbesondere eine Studie der Aüsfällungskurven der in einem Schwefelsäureextrakt von Pankreas enthaltenen ejjzymati sehen Proteine mit Ammoniumaulfat. Die Ausfällungskurven des Chymotrypsinogens Alpha, des Trypsins und des Chymotrypsinogens B zeigen, dass die Niederschläge, welche die gleichzeitig an allen diesen drei Proteinen reichsten sind, mit Ammoniumsulfatmengen nahe dem Sättigungsgrad 0,5 des flüssigen Extrakts erhalten werden und dass bei diesem Viert der Gehalt an Chymotrypslnogen B maximal ist.

Die bekannten verschiedenen Chymotrypaine aeigen praktisch das gleiche Verhalten auf den synthetischen Substraten; das Chymotrypsin B unterscheidet sich jedoch von den anderen Chymotrypsinen Alpha, Beta, Gamma und Delta deutlich durch seine Konstitution» was Unterschiede in den jeweiligen physikalischen Eigenschaften bedingt.

Der isoelektrische Punkt von Chymotrypsin Alpha, Beta, Gamma und Delta liegt über 8. Hingegen ist dieser Wert bei Chymotrypsin B niedriger und liegt nach Mteraturangaben zwischen 4,7 und 5,2.

Ebenso sind die optischen Faktoren, das heisst die Absorption im Spektrophotometer, verschieden. Nach Professor

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Desnuelle beträgt die Absorption einer Lösung von 100 Gamma/ccm Chymotrypein Alpha im auf 280 Millimikron eingestellten Spektrophotometer 215, während eine Lösung von Chymotrypsin B mit der gleichen Konzentration eine Absorption von 180 zeigt.

Diese Eigenschaftsunterschiede, insbesondere der Wert des isoelektrischen Punkts, welcher für die Verwendung der Enzyme von grundlegender Wichtigkeit ist, zeigen, dass die Herstellung des Chymotrypsin B von Interesse ist.

Dieses letztere Enzym ist ebenso wie seine Vorstufe im Forschungslaboratorium stecken geblieben. Andererseits haben die durchgeführten Versuche zu kleinen Mengen dieser Stoffe geführt., welche getrennt nach mehrfachen Reinigungsoperationen und in sehr geringen Ausbeuten erhalten wurden.

Die vorliege!..:^? Erfindung ermöglicht nun die Herstellung · von Chymotrypsin V in verhältnismässig großen Mengen und mit verbesserter Ausbeute.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Erzielung von Chymotrypsin B, welches die fraktionierte Ausfällung bekannter Proteine in der breiförmigen Pankreasmischung, gefolgt von einer AufIosung des endgültigen Filterkuchens in kaltem V/asser im Hinblick auf seine spätere Aktivierung umfasst, kennzeichnet sich dadurch, dass die den endgültigen Filterkuchen darstellende Proteinmischung etwa 20$ des Gesamtbetrags der ausfällbaren Proteine in dem wässrigen Extrakt ausmacht, welcher der letzten Ausfällung unterworfen wird.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird als

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Pällungs- oder Ausflockungsmittel das chemisch reine Ammoniumsulfat des Handels verwendet.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die breiartige Pankreasmischung nacheinander zwei . fraktionierten Ausfällungen unterworfen. Die erste Ausfällung ermöglicht die Entfernung von Proteinen mit sehr hohem Molekulargewicht und von Verunreinigungen. Die zweite Ausfällung ergibt die Extraktion einer rohen Proteinmischung, die besonders reich an Chymotrypsinogen B ist, und ausgehend von welcher dann anschliessend in wässriger lösung die Aktivierung erfolgt.

Diese Ausfällüngen, die mittels Ammoniumsulfat in verschiedenen Konzentrationen erfolgen, ermöglichen eine Unterteilung der ausgefällten Proteine in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht . Eine solche Unterteilung wird durch die Beschaffenheit des jeweiligen Pankreas beeinflusst. Nach langwierigen Versuchen hat man jedoch festgestellt, dass man etwa 20$ der ausfällbaren Proteine des schon durch eine erste Ausfällung gereinigten wässrigen Extrakts ausfällen muss, um eine das höchstmögliche Maximum an Chymotrypsinogen.B enthaltende rohe Fraktion zu erhalten. Dieses Resultat wird erzielt, wenn das Ammoniumsulfat in Mengen zugesetzt wird, welche einem Sättigungsgrad des Extrakts zwischen etwa 0,4 und 0,5 entsprechen.

Nach der Aktivierung wird die rohe Lösung von Proteinen, welche verschiedene Enzyme und insbesondere das Chymotrypsin B enthält, das aus seiner Vorstufe, dem Chymotrypsinogen B gebildet wurde, chromatographiert. Das Chymotrypsin B

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wird dann aus der Säule mit einer väeirigen Hatriumoitrat lösung in Anwesenheit einer kleinen Menge Natriumchlorid eluiert.

Naohetehend werden die beBonderen Binitlheiten einer ersten Aueführungeform der Erfindung aueführlicher be-

1) Bauchspeicheldrüsen (inabesondere von Ochsen), die in einem kalten Raum gelagert oder gefroren waren, werden in einer 0,25 η Schwefelsäurelösung bei einer !Temperatur zwischen 0 und 5° 0 eingeweicht und anschließend gemahlen. Die so gemahlenen Drüsen werden dann unter Rühren mit etwa dem zweifachen ihres Volumens an 0,25 η Schwefelsäurelösung gemischt; die Temperatur wird zwischen 0 und 5° G gehalten. .

2) Man stellt dann einen wässrigen Extrakt her, indem

man die vorhergehende Mischung eine Stunde durohrührt, j worauf man, immer unter Rühren langsam, pulverförmiges Ammoniumsulfat bis zu einer Menge von etwa 0,2 S zugibt ( S bezeichnet die Sulfatmenge, welche die Schwefelsäure- f.< lösung lösen kann); es sind dies etwa 100 bis 120 g dieses' ; Salsee px|j Liter Flüssigkeit} alsdann wird die wässrige - .; Mischung filtert? De,r Niederschlag wird verworfen . i und der 31üssigkeiteextrakt wird auf der gleichen Temperatur, nämlich ewisehen Q und 5° O, gehalten. !

Der Zusatz von Ammonlum8ulfat in einer Menge bie iu 0,2 S bewirkt die Ausflockung der Protein« mit sehr hohem Molekulargewicht und der daran gebundenen unreinigungen.

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3) Dem vorstehend erhaltenen Plüeslgkeittextrakt \ gibt man eint zusätzlicheAmmoniumeulfatmenge zu, um etwa 20^ der Proteine auaaufallen, liaoh einer Durohrührung läset man die Miachnng 4 bit 6 Stunden bei + 5⁰C ruhen, worauf man filtriert. Die aufgefangene Flüssigkeit wird bei niedriger Temperatur-für andere Verwendungs- ' zwecke, die nicht in den Rahmen der Erfindung fallen, gelagert.

Sie zusätzliche Ammoniumsulfatmenge wird zweokmässig im Laboratorium an einer Probe des nach, der ersten Ausfällung erhaltenen Flüssigkeitsextrakts bestimmt· An dieser vorher abgetrennten Probe führt man getrennt zwei Ausfällungen mit Ammoniumsulfat durch, die eine beim Sättigungsgrad 0,8 S, die andere beim Sättigungsgrad 0,4 S.. Die nach der Filtration erhaltenen Kuchen werden getrennt wieder in wässrige Lösung gegeben und ihre Gesamtproteinkonzentration wird im Spektrophotometer geraessen, zum Beispiel im Spektrophotometer SB, welcher vorher für die Wellenlänge von 282 Millimikron auf 0 eingestellt wurde. Sie Ablesungen der Resultate ermöglichen, ausgehend von der Gesamtmenge an ausfällbaren Proteinen bei 0,8 3 die Bestimmung der zur Ausfällung 4er Traktion von 20# erforderliohen Ammoniumsulfatmenge. ^

Der nach der Filtration des durch die zusätzliche Ammoniumeulfatmenge behandelten Extrakts erhaltene Filter- ; kuchen wird in kaltem Wasser gelöst. Die so erhaltene · Lösung wird filtriert, dann zur Entfernung des darin enthaltenen Ammoniumsulfate dialy eiert,

4) In diesem Stadium wird die gereinigte Lösung des Filterkuchens durch Zugabe von Natriumhydroxyd auf einen

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pH-Wert von 7,6 gebraoht, worauf man zur ""cfclvierung eine Trypsinmenge von etwa 1/40 der durt apektrophotometerablesung bestimmte!Menge an in der LOs^: ,j; fmthaltenen Proteinen zusetzt. Zweckmässig lässt man dann 24 Stunden "bei 0° ruhen.

Die in der Lösung enthaltenen verschiedenen ,Vorstufen sind dann aktiviert und ergeben eine Mischung von Trypsin, Chymotrypsin Alpha und hauptsächlich von Chymotrypsin B.

5) Der pH-Wert der aktivierten Lösung wird durch Zugabe von Zitronensäure auf 3,9 gebracht; dann wird diese Lösung in einer mit Carboxymethylcellulose gefüllten Chromatographiersäule adsorbiert; die Carboxymethylcellulose war ausgehend von Whatman-Cellulose nach der Methode von Professor Desnuelle hergestellt worden.

Das Gewicht der Carboxymethylcellulose beträgt zweckmässig das 6 bis 7-fache des Gewichts der insgesamt einzuführenden Proteine.

Die Säule wird mit einer 0,05 molaren, auf einen pH-Wert von 3,8 eingestellten Matriumcitratlösung zur Entfernung der inaktiven Proteine und der abgebauten Proteine gewaschen. Diese Waschung wird zweckmässig so lange durchgeführt, bis der Ablauf keine Proteine mehr enthält. Vorsichtshalber wird die spezifische Aktivität der enzymatischen Proteine des Abflusses gemessen: Diese : gegen Acetyl-L-tyrosin-aethylester titrierte Aktivität zeigt, dass das gesamte aktivierte Produkt offensichtlich in der Säule geblieben ist.

Die Abtrennung des Chymotrypsins B von den anderen in

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der Säule gebliebenen ,Enzymen erfolgt dann duroh eine Eluierung mit einer auf einen pH-Wert von 4,85 eingestellten ' Lösung, die 0,05 molar an Natriumeitrat und 0,05 molar an

• Natriumchlorid ist.

• 6) Das Chymotrypsin B wird aus dem Eluat durch Zusatz von Ammonumsulfat ausgefällt und dann abfiltriert. Der erhaltene Filterkuchen wird in dem 11/2-fachen Volumen j^ Schwefelsäurelösung gelöst, dialyslert und dann lyophili-

f siert. -

Die praktische Anwendung der vorstehenden Verfahrensregeln wird durch die nachstehenden nicht beschränkenden Zahlenbeispiele erläutert.

Beispiel 1

100 kg gefrorene Bauchspeicheldrüsen von Ochsen werden in eine 0,25 η wässrige Schwefelsäurelösung mit 0° C eingebracht. Nach dem Einweichen werden die Drüsen zerkleinert.

Dem erhaltenen Zerkleinerungsgut gibt man 200 1 einer geeisten Lösung von 0,25 η Schwefelsäure zu. Die Mischung wird eine Stunde durchgerührt, worauf man sie unter ständigem Rühren zur Vermeidung von Spitzenausfällungen langsam mit 36 kg pulverförmiger! Ammoniumsulfat vermischt. Diese Mischung wird dann in die Filterpresse gegeben.

Die Filterpresse und die darin zurückgehaltenen unlös-* liehen Teile werden mit 25 Liter 0,25 η geeister Schwefelsäurelösung durchgespült, welche dem vorher erhaltenen Filtrat zugesetzt werden. Man erhält so 260 Liter einer

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klaren. Löaung, die auf einer Temperatur zwischen O und 5° C ge
-worfen.

5° C gehalten wird. Die unlöalichen Anteile werden ver-

Dieser Lösung von 260 Litern gi"bt man langsam und unter Rühren 46,8 kg pulverförmigea Ammoniumsulfat zu, worauf raari 4 Stunden bei + 5⁰O ruhen läaat. Die Ammoniumaulfatmenge war vorher durch Laboratoriumaverauche beatimmt worden. Nach der erforderlichen Zeit filtriert man im Vakuum durch einen Büchnertrichter.

Das Filtrat wird für andere Verarbeitungszwecke beiseite gestellt. Der auf dem Filter erhaltene Kuchen wird in etwa dem 2-fachen Volumen kaltem Wasser, d.h. in etwa zwei Liter in Lösung gebracht. Das Gewicht der in dieser Lösung enthaltenen Proteine wird spektrophotometrisch bestimmt: Gefundenes Gewicht: 150 g. Dann wird das durch den Filterkuchen eingebrachte Ammoniumsulfat durch 48-Btündige Dialyse der Lösung entfernt.

Zur Aktivierung wird der pH-Wert der so gereinigten Lösung auf 7,6 gebracht und man gibt 3 g Trypsin zu.. Die Aktivierung erfolgt während 24 Stunden bei 0° C, worauf die enzymatische Aktivität der Lösung gegen Aoetyl-L-tyrosinaethylester titriert wird. Man findet eine auf die Proteine bezogene spezifische Aktivität von 180.

Darauf wird die Lösung, deren pH-Wert durch Zugabe von Zitronensäure auf 3,9 gebracht wurde, langsam durch eine Carboxymethylcellulosesäule gegeben, welche etwa die zur Zurückhaltung der Proteine erforderliche Menge enthält,

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Die Säule wird mit einer 10,5 g Natriumeitrat (0,05 molar) enthaltenden Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3,8 gewaschen» Diese Waschung wird abgebrochen, sobald praktisch keine Proteine mehr austreten. Die spezifische Aktivität der aufgefangenen Waschwässer wird kontrolliert: Man erhält mit Acetyl-L-tyrosin-aethylester eine Aktivität unter 30; daa bedeutet, dass praktisch das gesamte aktivierte Produkt in der Säule adsorbiert geblieben ist.

Die Eluierung des in der Säule adsorbierten Chymotrypeins B erfolgt mittels einer Natriumeitrat und Natriumchlorid in gleicher Konzentration, d.h. 0,05 molar, enthaltenden Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,8. Diese Eluierung wird abgebrochen, wenn praktisch keine Proteine mehr aus~ treten. Das in den Eluaten aufgefangene Chymotrypsin B wird quantitativ bestimmt: Man findet 60 g und seine spezifische Aktivität auf Acetyl-L-tyrosin-aethylester beträgt 300. ■

Das in den Eluaten enthaltene Chymotrypsin B wird durch Zugabe von 23,1 g Ammoniumsulfat auf 100 ecm lösung ausgefällt. Man filtriert, und bringt die Ausfällung in dem li/2~fachen Volumen j^q Schwefelsäurelösung in Lösung. Dann dialysiert man 48 Stunden zur Entfernung des Ammoniumsulfats, filtriert zur Abtrennung der mit ausgefällten restlichen Verunreinigungen und entwässert dann die Endlösung durch Lyophilisierung. (Gefriertrocknung)

Schliesslich erhält man 25 g pulverförmiges Chymotrypsin B, mit einer spezifischen Aktivität von 390 gegenüber Acety-L-tyrosin-aethyleater und einem durch Elektrophorese bestimmten isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert von etwa 5.

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^B*D ORIGINAL

Die vorstehend beschriebene Methode ist gegenüber den - bekannten Iaboratoriumsmethoden vorteilhaft vereinfacht, indem die Aktivierung in einer rohen enzymatisehen Mischung und die Abtrennung des Chyraotrypsins B durch eine einzige Chromatographie erfolgen. Diese erfindungsgemässe Methode bedingt eine gute Ausbeute.

Das Chymotrypsin B besitzt die gleichen enzymatisehen Eigenschaften wie die anderen Chymotrypsine; insbesondere kann es die aromatischen Bindungen hydrolysieren. Infolge seines anderen isoelektrischen Punktes kann das Chymotrypsin B jedoch in einem Milieu wirksam werden, in welchem die anderen Chymotrypsine inaktiv sind; infolgedessen kann es zur technischen Herstellung bestimmter chemischer Produkte dienen.

Die Fällung des· Pankreasextrakts mit Ammoniumsulfat bei einer Konzentration von 0,4 bis 0,5 S nach der vorstehend beschriebenen Methode nimmt das gesamte Chymotrypsinogen B mit, jedoch ausserdem noch etwa 20$ des in der Ausgangslösung befindlichen Chymotrypsinogens A. Zur Erhöhung der Reinheit des Ghymotrypsinogens B kann zweckmässig die folgende Methode angewandt werden: Man führt eine erste Ausfällung bei 0,5 S durch, durch welche etwas mehr als 20$ der Proteine ( 25 bis 30 % etwa) unlöslich werden. Der erhaltene Filterkuchen wird erneut in zwei Volumina kaltem Wasser gelöst und bei 0,4 - 0,5 S wieder gefällt, was die erneute Ausfällung des gesamten Chymotrypsinogens B ermöglicht und den Hauptteil des in dem ersten Filterkuchen enthaltenen Chymotrypsinogens A in Lösung lässt. Die Reinheit des Chymotrypsinogens B wird somit durch diese Ausführungsform des erfindungegemässen Verfahrens wesentlich verbessert.

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Beispiel 2 '

Wie bei dem vorhergehenden Beispiel wird das aus 100 kg tiefgefrorener Ochsen-Bauchspeicheldrüsen erhaltene zerkleinerte Produkt in 200 1 geeister 0,25 η Schwefelsäurelösung aufgenommen. Nach einstündigem Rühren gibt man 36 kg pulverförmiges Ammoniumsuliat zu und rührt bis zur vollständigen Auflösung des Salzes. Diese Mischung wird in die Filterpresse gegeben. Man erhält 260 1 einer klären Lösung, die auf 0 bis 5° 0 gehalten wird* Biese Lösung versetzt man langsam und unter Rühren mit 55 kg pulverförmigen Ammoniumsulfat, worauf man 4 Stunden bei 5° 0 ruhen lässt. Man filtriert durch einen Büchnertrichter, und nimmt den Filterkuchen in 2 Volumina kaltem Wasser, d.h. in etwa 2,5 Liter auf. Bas Gewicht der in dieser Lösung enthaltenen Proteine wird spektrophotometrisch bestimmt: Gefundenes Gewicht 220 g. Bann gibt man unter Rühren 700 g Ammoniumsulfat zu (280 g/l)· Man lässt die Ausfällung 4 Stunden vor sich gehen, worauf man den Niederschlag im Vakuum abfiltriert. Er wird In. 2 Tolumlna kaltem Wasser ( 2 Liter) gelöst, worauf man die Proteine spektrophotometrisch bestimmt: Gefundenes Göwlcht 150 g.

Die Lösung wird dann wie in dem vorhergehenden Beispiel behandelt, d.h. sie wird aktiviert¹ und man lässt sie durch die Ohromatographiesäule laufen- SchliesslicJi er- I hält man nach Lyophilisierung 28 g Chymotrypsin B mit einer spezifischen Aktivität von 400 auf Acetyl-L-^tyrosiniaethylester. Durch Elektrophorese ermittelt mam, dass offenbar ein wesentlicher Anteil seinen isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert von etwa 5 besitzt»

Patentansprüchef

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Claims (6)

Patentansprüche . .

1. Verfahren zur Gewinnung von Chymotrypsin B,wobei in einer breiförmigen Pankreasmischung fraktionierte Proteinausfällungen gefolgt von einer Auflösung des endgültigen Filterkuchens in kaltem Wasser zur Aktivierung durchgeführt werden, dadurch gekennzeichnet, dass eine den endgültigen Filterkuchen bildende Proteinmischung verwendet wird, die etwa 20 # der in dem der letzten Ausfällung unterworfenen wässrigem Extrakt insgesamt enthaltenen ausfällbaren Proteine enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1,-dadurch gekennzeichnet, dass als Fällungsmittel chemisch reines -Ammoniumsulfat verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die dem Extrakt zugesetzte Ammoniumsulfatmenge eiriem Sättigungsgrad des Extrakts zwischen etwa 0,4 und 0,5 entspricht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die waserige Lösung des Filterkuchens aus rohen, ausgefällten Proteinen zur Entfernung des Ammoniumsulfats dialysiert und dann durch Zugabe von Trypsin aktiviert -

wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4ι dadurch gekennzeichnet, dass die zugesetzte Trypsinmenge etwa einem Vierzigstel der

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ausgefällten Proteinmengen entspricht.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das in der aktivierten Lösung enthaltene Chymotrypsin B von den anderen Enzymen und Proteinen durch Chromatographie an einer einzigen mit Carboxymethylcellulose gefüllten Säule abgetrennt wird.

7t Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die aktivierte Lösung durch Zugabe von Zitronensäure vor ihrer Adsorption in der Säule auf einen pH-Wert von 3,9 eingestellt wird.

8, Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromatographiesäule anschllessend mit einer auf einen pH-Wert von 3,8 eingestellten o,05 molaren Fatriumcitratlösung ausgewaschen wird.

9» Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Chymotrypsin B mit einer o,05 molaren Hatriumcitrat-1Ösung in Anwesenheit von Natriumchlorid eluiert wird, " wobei der ρΉ-Wert der Lösung auf 4,35 eingestellt wird.

10, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach Ausfällung des Proteinkuchens durch Zusatz von Aramoniumsulfat dieser Kuchen durch Zusatz von kaltem Wasser erneut in Lösung gebracht und anschließsend wieder mit Amminoumsulfat ausgefällt wird.

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