DE1768047A1

DE1768047A1 - Verfahren zur Herstellung asparagin- und glutaminhaltiger Peptide

Info

Publication number: DE1768047A1
Application number: DE19681768047
Authority: DE
Inventors: Rolf Dipl-Chem Dr Geiger; Wolfgang Dipl-Chem Dr Koenig
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1968-03-26
Filing date: 1968-03-26
Publication date: 1971-11-18
Also published as: GB1238415A; NL168501B; CH514548A; DE1768047C3; NL6904307A; NL168501C; DE1768047B2

Description

Verfahren zur Herstellung asparagin- und glutaminhaltiger Peptide

Bei der Synthese von asparagin- und glutaminhaltigen Peptiden, bei denen die Amid funkt ionen nicht geschützt sind, treten zahlreiche Nebenreaktionen auf. Bei Asparagin- wie auch bei Glutamin-peptiden kann die Amidfunktion durch peptidbildende Reagentien zur Nitrilgruppe dehydratisiert werden, durch intermediär auftretende cyclische Imide können Isoasparagin- bzw. Isoglutarain-derivate entstehen und durch saure wie auch basische Hydrolyse kann die Amidfunktion gespalten werden (vgl. E. Schröder u. K. Lübke, The Peptides, Vol. I, Academic Press, New York und London, 1965, S. 110, 203-204 und 191). Bei N-terminalen Glutaminpeptiden. spielt auch die Pyroglutaminsäurebildung eine Rolle (vgl. Liebigs Ann. Chem. 707, 232 (1967). Um diese Nebenreaktionen zu vermeiden, wurden bereits Schutzgruppen für die Amidfunktionen entwickelt.

109847/1725

/2

So wurde z.B. durch Umsetzung von N-Carbobenzoxy-L-glutamin mit Xanthydrol in Eisessig das N^-Carbe-' benzöxy-N^-xanthyl-L-glutämiii gewonnen. DielXänthylgruppe läßt sich rait HBf- in Eisessig wieder abspalten. "Doch die Ausbeute nach" der Abspaltung" isif' gering. Ein weiterer Nachteil ist die Schwerlöslichkeit der Xanthy!verbindungen" tVgl. Bull. Chem.' Soc. Jap. 35, 1966 (1962)). -- ~_^: ' -.-: ■ - -' ν ---.--

Aus N- geschützt en Glutaminsäure- und Asparagine äure-oi- * benzylestern wurde durch Umsetzung mit Bis-(2,4-dimethoxy- -benzylamin) nach dev- Inamin*methöd€-die-entsprechenden - $-[Ris_r (:2/4—dimethoxybenzyl) }-araide- hergestellt = (vgl.

Tetrahedron Letters (London)-l&S6 _r S. 3483^r-JlXeSe--

Schutzgruppe läßt sich durch längeres Stehen in Trifiuoressigsäure/Änisol abspalten. Von Nachteil bei dieser Methode ist die unwirtschaftliche und umständliche Herstellung der amid-geschützten Asparagin- und Glutaminderivate.

Nach dem gleichen aufwendigen Verfahren wurde N-Carbobenzoxy-N°-benzhydryl-L-glutamin hergestellt (vgl. Bull. Chem. Soc. Jap. 40, 2164 (1967)). Diese Schutzgruppe wird in wasserfreiem Fluorwasserstoff abgespalten.

-Auf—der Suche narch -geergneteren Amidschutzgruppen wurde^nun überraschenderv/eise gefunden,, daß sich das 4,4'-Dimethoxybenzhydrol sowohl mit Aspai^agin bu&r - —· "Glutamin, als auch mit N-Carbobenzoxy-asparagin-oder N-Carbobenzoxy-glutaniin in Eisessig unter Protonenkatalyse zu den entsprechenden 4,4^I-Dimethoxybenzhydrylamiden umsetzt.- Der. 4.~4'--Dimethoxybenzhydrylrest fet sauer wieder leicht abspaltbar."

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Her-

109847/1725

ORIGINAL INSPECTED

567F6S047

stellung von asparagin- und glutamin-haltiger Peptide, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Asparagin und Glutamin oder deren säurestabilen Derivate.__der allgemeinen Formel (I) -

G-(A) -NH-CH-eO-tB) -OR

co

in der G Y_ . · ; ■ -r.Z^'.'r'j

Γ „_ . '" """■"'"■ '"" ^r""]| einen unter den Bedin_gürigen--d«r Her—

¹ *·~ ""^ oder ein Proton

stellung säurestabilen AcylresO/" A und B gleiche oder verschiedene Aminosäurereste oder Peptidbruchst.ücke. und R einen Alkyl-, Aralkyl- oder Arylrest oder ein Proton bedeuten, χ und y für die Zahl 0 oder eine ganze Zähl und ri für die Zahlen 1 und 2 stehen, mit- 4,4'-Dimethoxybenzhydro-1 in Eisessig -in Gegenwart saurer Katalysatoren zu djm_ Verbindungen der allgemeäjien _ _ Formel (II)

G-(A) -NH-CH-CO-(B)-OR

CI-I) bzw»

wobei G, A, B, R_; χ, y und η die oben genannte Bedeutung haben, umsetzt, diese Derivate nach den allgemeinen Methoden der Peptidchemie in andere Derivate

109847/172 E Ofv_Glt,_At ,.. /₄

- 4 - Fw 5676 17680^

der allgemeinen Formel (Ha) , wobei sich (Ha) hinsichtlich A und/oder B und/oder χ bzw. y von den Verbindungen der Formel II unterscheidet, über-

gegebenenfalls
führt undYänschließend die 4,4'-Dimethoxybenzhydryl-

¹ I

— gruppe durch Behandeln mittels starker organischer Säuren oder mittels Mineralsäuren abspaltet.

Die zur Herstellung der Asparagin- und Glutaminpeptide der Formel (I) benötigten amidsubstituierten Asparagin- und Glutamin-derivate der Formel (II) können entweder

1) aus den N-Carbobenzoxyyerbindungen von Glutamiii und Asparagin durch" Umsetzen"mit 4.4'-Dimethoxybehzhydrol in Eisessig als Lösungsmittel unter Zusatz von sauren katalysatoren wie konz. Schwefelsäure, BF₃-Diäthylätherat, ZnCl₀"oder A1C1„ oder organischer SuIf o.ft-" säuren wie Toluolsulfonsäure in katalytischen Mengen,

■- oder

2) aus Glutamin oder Asparagin durch Umsetzung mit 4.4'-Dimethoxybenzhydrol.in Eisessig als Lösungsmittel unter Zusatz von konz. Schwefelsaure oder BF„-Diäthylätherat in molaren Mengen hergestellt v/erden.

Außerdem lassen sich die 4.4'-Dimethoxybenzhydrylreste auch nachträglich in asparagin- und glutaminhaltige Peptide einführen.

Diese Verbindungen können nun nach den allgemeinen--- _ Methoden der Peptidchemie. zur Herstellung der asparagin- und glutaminhaltigen Peptide verwendet werden. So lassen sich z.B. aus den nach Methode 1 hergestellten N-Carbobenzoxy-verbindungen in bekannter Vi'eise die aktivierten Ester, wie p-Nitrophenylester herstellen. Mit Diazo-

109847/1725

- 5 - Fv/ 5676

methan entstehen die entsprechenden Methylester, die durch Hydrierung in Eisessig/Methanol und anschließender Titration mit methanolischer Salzsäure in die Methylesterhydrochloride überführt werden können. Aus den nach Methode 2 hergestellten N⁵*¹- 4.4'-Dimethoxybenzhydryi-asparagin- und -glutamin lassen sich beispielsweise die N-Phthalyl- und N-o—Nitrosulfenyl-Verbindungen herstellen.

Aus diesen Verbindungen können in üblicher Weise, z.B. nach der Methode der gemischten Anhydride, der aktivierten Ester oder der Carbodiimid- und Inamin- .. Methode Peptide hergestellt werden, aus denen nach Freisetzung einer Carboxylgruppe, z.B. durch Verseifen eines Esters oder Freisetzen einer Aminogruppe, weitere höhere Peptide aufgebaut werden können.

Die Wahl der sonstigen, bei der Peptidsynthese verwendeten - Schutzgruppen hängt von der Differenzier- barkeit gegenüber den neuen gemäß der Erfindung ver- .. wendeten Araidschutzgruppen ab.

Die neuen Schutzgruppen sind stabil gegen alkalische Verseifung, Aamonolyse oder Hydrazinolyse," so daß z.B. in ihrer Anwesenheit Carbonsäureester in Carbonsäuren, Carbonsäureamide od.er -hydrazide überführi.^nd_.Nr:-. _₅._i^»₌..^-- Phthalylgruppen abgespalten werden können. Auch gegen andere nukleophilen Reagentien.,_ d.ie_zur Abspaltung der.. N-o-Nitrosulfenylgruppe dienen, sind die neuen Schutzgruppen resistent: Der o-Nitrosulfenyl-rest läßt sich unter milden Reaktionsbedingungen'mit oder ohne Zusatz von Indol mittels methanolischer Salzsäure selektiv abspalten. Gegen katalytische Hydrierung sind die neuen

/6 10984 7/1725

- 6 - Fw 5676

Schutzgruppen ebenfalls stabil. So kann die N-Carbobenzoxygruppe selektiv abhydriert werden.

Als weitere Bausteine der die Asparagin- und Glutaminderivate der allgemeinen Formel (II) enthaltenden Peptide kommen für A und B alle in natürlich vorkommenden Peptiden anzutreffenden Aminosäuren in ihrer L- oder D-Form infrage. Auch der Einsatz von ß-Aminosäuren, wie z.B. ß-Alanin oder anderer nur synthetisch oder halbsynthetisch zugänglicher Aminosäuren, z.B. αί-Methylalanin, oi-Methyl-3.4-dioxy-L-phenylalanin oder ß-Chloralanin ist möglich. Y/eitere funktioneile Gruppen der Aminosäuren können oder müssen entsprechend den in der Peptidchemie üblichen Regeln geschützt werden (vgl. E. Schröder u. K. Lübke, The Peptides, New York u. London 1965, Bd. I, insbes. Seiten 3-75). Als säurestabiler· Acylrest kommt die Carbobenzoxy-f j oder auch ein Proton infrage.

Die Abspaltung der neuen Schutzgruppe gelingt erfindungsgemäß durch Behandeln mit starken organischen Säuren wie Ameisensäure und Halogencarbonsäuren vom Typ der Trifluoressigsäure, Difluorchloressigsäure oder Trichloressigsäure, die gleichzeitig als Lösungsmittel dienen können, ferner mit vorzugsweise wasserfreien Mineralsäuren wie HBr in Eisessig, wasserfreiem Fluorwasserstoff, oder mit organischen Sulfonsäuren_fin Ameisensäure als Lösungsmittel. Die Abspaltung kann bei Zimmertemperatur oder höheren Temperaturen vorgenommen werden. Zusätze die das entstehende Kation abfangen können, wie Anisol, Phenolen, Indol bzw. Indolderivaten beschleunigen die Abspaltung.

+) Phthalyl-, Trifluoracetyl-, Tosyl- und Benzoylgruppe

109847/1725

5676

Tabelle 1 gibt die Abspaltungsbedingungen und die Abspaltungszeiten wieder, die bei N^-4.4'-Dimethoxybenzhydryl-L-glutamin gewonnen wurden.

Tabelle 1

Abspaltung der Amid-Schutzgruppe von N -4.4'-Dimethoxybenzhydryl-L-glutamin unter" verschiedenen Bedingungen. (Die Abspaltungszeit wurde papierchromatographisch ermittelt)-r

Abspaltungsmedium

Abspaltungszeit

1) siedende Trifluoressigsäure

2) siedende Trifluoressigsäure/Anisol

3) Trifluoressigsäure/Anisol bei Zimmertemperatur

4) halbkonzentrierte HBr/Eisessig bei Zimmertemperatur

5) halbkonz. HBr/Eisessig/Indol bei Zimmertemperatur

6) Eisessig/BF3-Diäthylätherat bei Ziimaertemperatur

7) Ameisensäure/Anisol bei 80

8) Ameisensäure/Toluolsulfonsäure (4:1) Anisol bei S0°

9) TriChloressigsäure/Anisol bei IGO 10) Trichloressigsäure/Anisol bei

15 Minuten Minuten

2- 3 .Stunden 1- 2 Stunden 5-10 Minuten

2 Stunden 1 Stunde

5 Minuten Minuten 10-15 Minuten

Die Verfahrensprodukte können nach Abspaltung der neuen Schutzgruppe als Therapeutika Verwendung finden oder als Zwischenprodukte, wobei die Schutzgruppe auch an den Peptiden belassen werden kann, zur Herstellung anderer

109847/172 5

/s

- 8 - Fw 5676

therapeutisch wertvoller glutamin- oder asparaginhaltiger Peptide, v/ie z.B. Oxytocin, Vaspressin,
Glucagon, Secretin oder Insulin eingesetzt werden.

Durch die nachstehenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

/9

109847/1725

- 9 - Fw 5676

Beispiel 1

Herstellung von L-Tyrosyl-L-glutamin:

a) N^-4.4'-Dimethoxybenzhydryl-L-glutamin

<aO 1.45 g (10 mMol) Glutamin und 2.4 g 4.4'-Dimethbxy- j benzhydrol (10 mMol) gibt man in 50 ml Eisessig. Dazu gibt man bei Zimmertemperatur 0,54 m konz. Schwefelsäure und ruht etwa 2 Stunden. Danach gibt man 2 g wasserfreies Natriumacetat zu und .engt. ein.. Der Rückstand wird zwischen Natriumacetatlösung und Essigester verteilt. Über Nacht fällt im Eisschrank ein Niederschlag ab, der abgesaugt und mit Ytesser gewaschen wird.. Ausb* 1.145g (= 31 % d. Th.), F. P. 205-206°. kc]p² = + 7.5° (c = 2 in Eisessig)

ß) Die Verbindung kann auch wie &lgt erhalten werden:

5.1 g (1OmT₁IoI) N-Carbobenzoxy-M^lö-4.4'-dimethoxy- '

benzhydryl-L-glutamin (hergestellt nach b) werden ™

in einer Mischung aus Eisessig und Methanol (1:1) gelöst. Dazu gibt man Palladiumkatalysator und leitet so lange Y/asserstof f ein bis kein. CO₂ mehr entweicht. Der Katalysator wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und getrocknet. Ausb. 3.65 g (= 98 % d.Th.)· Nach Umkristallisation aus Wasser: Ausb. 2.81 g (= 75.5 % d.Th.), F.P. 205-206°.

b) N-Carbobenzoxy-N -4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-glutamin oO 23 g Carbobenzoxy-L-glutamin (0.1 JIoI) und 24 g

109847/1725 /io

4.4'-Dimethoxybenzhydrol (0.1 Mol) werden in 250 ml Eisessig gelöst. Dazu gibt man bei Zimmertemperatur 0. 5 ml konzentrierte Schv/ef elsäure. Man läßt über Nacht stehen und gießt dann in 750 ml Wasser. Es scheidet sich ein Öl aus, das bald kristallisiert. Der Kristallbrei wird abgesaugt und in Essigester warn gelöst. Die Essigesterlösung wird mit Tfasser ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt. Ausb.~45,8 g (= 90 % d.Th.), F. P. 117-120° [oC]Z = -6,75 (c = 2, in Dimethylformamid)

ß) Andere Herstellungsweise:

Nach der üblichen Methode der Carbobenzoxylierung erhält man aus N -4.4'-Dimethoxybenzhydroyl-L-gutamin in 80 % Ausbeute N-Carbobenzoxy-N'^-4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-glutamin. F.P. 117-120 .

c) N-Carbobenzoxy-N -4.4'-dinethoxybenzhydryl-L-glutamin-methylester

5,1 g N-Carbobenzoxy-N^c0-4. 4'-dimethoxybenzhydryl-L-glutamin werden in Tetrahydrofuran gelöst. Bei Zimmertemperatur wird ätherische Diazomethanlösung bis zur bleibenden Gelbfärbung zugetropft. Überschüssiges Diazomethan wird mit ein paar Tropfen Eisessig zerstört. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgezogen und der Rückstand mit Petroläther verriben. Ausb. 5.2 g (= 100 % d.Th.), F. P. 146-150° ² - -10.8° (c = 2 in Dimethylformamid)

/11 109847/1725

d) N^-4.4^f-Dimethoxybenzhydryl~L-glutaminmethylester-hydrochlorid

23 g N-Carbobenzoxy-N -4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-glutaminmethylester werden in einer Mischung aus Eisessig/Methanol· (1:1) gelöst und mit Pd-Katalysator hydriert, +)und die Lösung gegen Thymolblau mit methanolischer Salzsäure titriert. Im Vakuum wird das Lösungsmittelgemisch abdestilliert. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und an einer neutralen AlgOo-Säule chromatographiert. Ausb. 11,8 g (= 70 % d.Th.) Umkristallisierbar aus Methanol/Äther, F.P. 182-183° UIp² * + 21,4° (c = 2, in Methanol).

e) N-Carbobenzoxy-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-N -4.4¹-dimethoxybenzhydryl-L-glutamin-methylester

5,6 g N-Carbobenzoxy-O-tert.-butyl-L-tyrosindicyclohexylamin-salz werden durch Verrühren bei 0° mit 2n Zitronensäure und Essigester in die freie Säure überführt. Der Essigesterrückstand wird in 40 ml Methylencialorid gelöst. Dazu gibt man 4,2 g N^w-4.4'-DimethOxybenzhydryl-L-glutaninmethylesterhydrochlorid, kühlt auf -10 ab und gibt 1,4 ml Triäthylamin zu. Man läßt 10 Minuten rühren und gibt eine Lösung von 2.2 g Dicyclohexylcarbodiimid in wenig Methylenchlorid zu. Man rührt nun noch einige Stunden bei 0 , stellt den Ansatz über Nacht in den Eisschrank und destilliert anderntags das Methylenchlorid ab. Der Rückstand wird mit Dimethylformamid verrührt, von Unlöslichem

+) Nach Beendigung der CO₉-Entwicklung wird der Katalysator., abfiltriert ^Δ /

109847/172 5

wird abgesaugt und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Methanol aufgekocht, gekühlt und abgesaugt. Ausb. 5,9 g (80%d.Th.) F. P. 181-183°. Nach Umkristallisieren aus Methanol:" F. P. 190-192°

22 ο
[oCJ_D ⁼ -12,1 (c = 2, in Dimethylformamid)

f) O-tert.-Butyl-L-tyrosy1-1^-4.4'-dimethoxybenzfe hydryl-L-glutamin

6 g N-Carbobenzoxy-O-tert.-butyl-L-tyroxyl-N^- 4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-glutamin-methylester werden in ca. 40 ml Dioxan suspendiert. Dazu gibt man 8.1 ml In NaOH und rührt etwa 2 Stunden bei Zimmertemperatur. Man neutralisiert mit ein paar Tropfen 2n Zitronensäure und engt ein. Der Rückstand wird zwischen Essigester und 2n Zitronensäure verteilt. Der Essigesterphase wird mit Wasser ein mal ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in Eisessig/Methanol (1:1) gelöst und katalytisch

P hydriert. Nachdem die Hydrierung beendet ist, wird

der Katalysator abfiltriert, das Filtrat im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Essigester verrührt und abgesaugt. Ausb. 4.6 g (= 95 % d.Th.). Läßt sich aus 70 %igem Alkohol Umkristallisieren. Es kristallisiert als Hemihydrat aus. F.P. 174-177°

99

[<X]jJ = + 19.85 (c = 2, in Eisessig)

Die Substanz ist papierchromatographisch (Schleicher u. Sehüll Nr. 2043 b) einheitlich : R_f = 0.949 in n-Butanol/Eisessig/Pyridin/Vt'asser (375:75:250:300); R_f = 0.876 in n-Butanol/Eisessig/ttasser (4:1:5).

. ■' ' /13

109847/1725

g) L-Tyrosy1-L-glutamin

2 g 0-tert.-Butyl-Lr-tyrosyl-N^lp-4.4^t-dimeth.oxybenzhydry 1--L-glutamin werden mit 2.5 ml Anisol und 20 ml Trifluoressigsäure 5 Minuten im Rückfluß erhitzt. Anschließend wird die Trifluoressigsäure i. Vaku. eingeengt und der Rückstand zwischen Wasser und Äther verteilt. Die wässrige Phase wird mit Lewatit IR 45 (Acetat-Form) gerührt, bis sich ein pH von 4 eingestellt hat. Der Austauscher wird abfiltriert und das wässrige Filtrat einge.engt. Ausb. 1 g (=95 % d.Th.). Die Substanz ist papierchromatographiscn rein.· R_f = 0.471 in n-Butanol/Eisessig/Pyridin/Wasser (375/75/250/300)
R_f = 0.091 in n-Butanol/Eisessig/Wasser (4:1:5)

Beispiel 2

N-Carbobenzoxy- L- vaJji-L-glutaminyl-L- phenylalanin- methylester

a) N-Carbobenzoxy-N^w-4.4^t-dimethoxybenzhydryl-L-glutaminp-n=itrophenylester

cd) 5.1 g (10 mMol) N-Carbobenzoxy-l·^^u>-4. 4' -dimethoxybenzhydryl-L-glutamin und 1.7 g p-Nitrophenol werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Zu der auf 0° abgekühlten Lösung gibt man 22 g Dicyclohexylcarbodiimid und läßt 2 Std. bei 0° und 1 Std. bei Zimmertemperatur stehen, saugt den Niederschlag ab und versetzt das Filtrat mit ca. 40 ml

/14 1 0 9847/1 72.5

567^768047

Wasser. Die sich ausscheidenden Kristalle werden abgesaugt und aus Alkohol umkristallisiert. Ausb. 3.85 g (= 61 % d.Th.), F. P. 177-178° [cdρ² = -10,8 (c = 1, in Dimethylformamid)

ß) 2 g (5 mMol) N-Carbobenzoxy-L-glutamin-p-nitrophenylester werden in 25 ml Eisessig gelöst. Dazu gibt man 1,2 g 4.4'-Dimethoxybenzhydrol und 1 Tropfen konz. Schwefelsäure. Man läßt über Nacht bei Zimmertemperatur stehen, wobei sich Kristalle abscheiden. Man verdünnt anderntags

mit etwa 30 ml Wasser und saugt den Kristallbrei

ab. Die Kristalle werden mit Alkohol aufgekocht und abgesaugt. Ausb. 2,8 g (= 90 % d.Th.), F.P. 175-178°.

b) N-Carbobenzoxy-N^L<2-4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-glutaminyl-L-pheny!alanin-methylester

2.2 g (5 mSIol) N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-phenylalaninmethylester werden in 25 ml Eisessig gelöst. Dazu gibt man 1.2 g 4.4'-Dimethoxybenzhydrol und 1 Tropfen konz. Schwefelsäure. Man läßt über

^Beispiel 2 Nacht stehen und arbeitet wie unterVä) ß) auf. Ausb.

2.7 g (= 81 % d.Th.), F. P. 200-204°

22
Ip(Jj₃ = -7.3 (c= 1, in Dimethylformamid)

Herstellung des als Ausgangsstoff verwendeten N^-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-phenylalaninmethylesters:

10,8 g L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid werden in 100 ml Tetrahydrofuran suspendiert. Man kühlt auf

1 09847/1725 ^/15

- 15 - Fw 567

0° und versetzt mit 6,8 ml Triäthylamin. Man rührt 10 Minuten und gibt dann eine Lösung von 20,1 g N -Carbobenzoxy-L-glutaiain-'l-nitrophenylester in 100 ml Tetrahydrofuran/Dimethylformamid (9:1) zu. Nach 3 Tagen Stehen bei Zimmertemperatur wird eingeengt und der Rückstand zwischen Essigester und Wasser verteilt. Die Essigesterphase wird mit 2n Salzsäure, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen.und eingeengt. Der Rückstand wird aus Methanol/Wasser ™ (1:1) umkristallisiert. Ausb. 14.25 g (= 65 % d.Th.), F.P. 181-182°
[cC]_D = -10.45° (c = 2 in Dimethylformamid) ■ ·.- ·

ß) 2.4 g L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid gibt man in 20 ml Dimethylformamid. Dazu läßt man unter Rühren 1.4 ml Triäthylamin zutropfen. Man rührt 10 Minuten bei Zimmertemperatur und gibt dann eine Lösung von 6.3 g (10 mMol) N-Carbobenzoxy-N^w-4.4^I-dimethoxybenzhydryl-L-glutamin-p-nitrophenylester in Dimethylformamid zu und läßt mehrere Tage bei Zimmertemperatur stehen. Der Niederschlag wird ab- J

gesaugt und das FiI tr-at eingeengt. Der Rückstand wird mit Methanol aufgekocht, gekühlt und abgesaugt. Ausb.: 5.05 g (= 76 % d.Th.), F.P. 201-204°.

c) N-Carbobenzoxy-lr-valyl-]S-4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-glutaminyl-L-phenylalanin-methylester

2.16 g (4 mMol) N-Carbobenzoxy-L-valyl-L-glutaminyl-L-phenyl-alaninmethylester werden in 20 ml Eisessig gelöst. Dazu gibt man 1 Tropfen konz. Schwefelsäure und läßt über Nacht bei Zimmertemperatur stehen. Anderntags wird wie bei Beispiel 2 a) ß) aufgearbeitet.

■ 109847/1725 ^/16

- 16 - Fw 5676

Ausb. 2.65 g (= 86.4 % d.Th.), F. P. 242-245°, [oC]" = -8,0 (c = 1, in Dimethylformamid)

Herstellung des als Ausgangsstoff verwendeten N -Carbobenzoxy-L-valyl-L-glutaminyl-L-phenylalanin-methylesters:

8.8 g N=⁴- Carbobenzoxy-L-glutaminyl-l-phenylalanin-methylester werden in 30 ml Eisessig gelöst. Dazu gibt man 30 ml HBr/Eisessig und läßt 1 Std. bei Zimmertemperatur stehen. Mit Äther wird ein Öl gefällt, das mit Äther verrieben wird und am Hochvakuum getrocknet wird..Die entstandene amorphe Masse gibt man in Methylenchlorid und versetä bei 0° mit 2.8 ml Triäthylamin und einer Lösung von N-Carbobenzoxy-L-valin-anhydrid (hergestellt aus 10 g Carbobenzoxy-1-valin und Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid). Man läßt über Nacht im Eisschrank stehen und saugt den ausgefallenen Niederschlag ab. Mit Methylenchlorid wird nachgewaschen. Der Niederschlag wird aus Methanol umkristallisiert. Ausb. 2,9 g.F.P. 235-236°

= -4 (c = 1 in Dimethylformanid)

d) N-Carbobenzoxy-L-valyl-Ir-glutaminyl-L-phenylalaninmethylester

385 mg (0,5 mMol) N-Carbobenzoxy-L-valyl-N^o3-4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-glutaminyl-L-phenylalaninmethylester werden mit 0,3 ml Anisol in 3 ml Trifluoressigsäure gelöst. Man läßt 3 Std. bei Zimmertemperatur stehen und engt bei Zimmertemperatur i.Vak. ein. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, abge-

/17 109847/1725

17 - · Fw 5676

saugt und gut mit Äther gewaschen. Ausb. 265 mg

98
22

(= 98 % d.Th. ), F. P-. 238-239°

_D = -4.0 (c = 1 in Dimethylformamid) Beispiel 3

N-Carbobenzoxy-L-asparaginyl-L-tyrosin-methylester

a) N-Carbobenzoxy-N^vP-4. 4'-dimethoxybenzhydryl-L-asparaginy1-0-tert.-butyl-L-tyrosin-methylester

24.5 g (50 mMol) N-Carbobenzoxy-1^-4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-asparagin werden in 150 ml Dimethylformamid gelöst. Dazu gibt man 14.5 g O-tert.-Butyl-L-

o tyrosin-methylester-hydrochlorid, kühlt auf -10 ab, gibt 6.8 ml Triäthylamin unter Rühren zu, beläßt 10 Minuten bei dieser Temperatur und gibt zum Schluß eine Lösung von 11 g Dicyclohexylca.i~bodiimid in wenig Dimethylformamid zur Reaktionsmischung. Man läßt einige Stunden bei Eiskühlung rühren und stellt über Nacht in den Eisschrank. Anderntags wird der Niederschlag abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Methanol aufgekocht, gekühlt und abgesaugt.

Ausbeute: 28,05 g (= 77 % d.Th.), F.P. 203-209°

22
[o6]_D = + 3.65 (c = 2, in Dimethylformamid)

b) N-Carbobenzoxy-L-asparaginyl-L-tyrosin-methylester

1.45 g (2,02 mMol) N-Carbobenzoxy-Ν^Λ-4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-asparaginy 1-0- tert. -butyl- L- ty rosinmethylester werden mit 1 ml Anisol in 10 ml Trifluor-

/18 109847/1725

- 18 - Fv/ 5676

asparagins:

essigsaure gelöst. Nach dreistündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird bei Zimmertemperatur im Vakuum eingeengt und der Rückstand gut mit Äther verrieben, abgesaugt und mit Äther gewaschen. Ausb. 846 mg (= 94 % d.Th.) F. P. 197-199° iödß² = + 7.75° (c = 1 in Dimethylformamid)

Herstellung des als Ausgangsstoff verwendeten N-Carbobenzoxy-N -4.4'-dimethoxybenzhydryi-L-

27 g N-Carbobenzoxy-L-asparagin (0.1 Mol) werden in 300 ml Eisessig heiß gelöst und wie bei Beispiel 1 b) oC) umgesetzt. Ausb. 47.5 g (= 96,5 % d.Th.), F.P. 176-130°
[oUß - + 2,425 (c = 2, in Dimethylformamid)

Beispiel 4

N^-4.4'-Dimethoxybenzhydryl-L-asparagin-methylester-hydrochlorid

a) N^-4.4^f-Dimethoxybenzhydryl-L-asparagin

1,3 g Asparagin (10 mMol) und 2.4 g 4.4'-Dimethoxybenzhydrol (10 mMol) gibt man in 50 irfl Eisessig. Dazu gibt man bei Zimmertemperatur 0.54 ml konz. Schwefelsäure und rührt bis alles gelöst ist (etwa 2 Stunden). Danach gibt man 2 g wasserfreies Natriumacetat zu und engt ein. Der Rückstand wird zwischen Natriumacetatlösung und Essigester verteilt. Es fällt ein gallertiger

/19 109847/1725

Niederschlag aus, der abgesaugt und mit T/asser und Essigester gewaschen wird. Der gallertige Rückstand wird aus Vfasser umkristallisiert. Ausb. 2.1 g (= 58,6 % d. Th.)

99 η

= + 9.75 (c - 2, in Eisessig) F.P. 226-230

b) 49,2 g N-Carbobenzoxy-1^-4,4'-dimethoxybenzhydryl-L-asparagin werden in 400 ml Eisessig suspendiert und

mit Pd-Katalysator versetzt. In die Suspension wird ^

unter rühren so lange Viasserstoff eingeleitet bis alles gelöst ist und kein CO₀ mehr entsteht. Der Katalysator wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Natriumacetatlösung verrieben,' absaugt, gut mit Wasser gewaschen und über P₀Oi- getrocknet. Ausb. 33,6 g (= 94 % d.Th.)

c) N-Carbobenzoxy-Ν^υ3-4. 4'-dimethoxybenzhydryl-L-asparaginmethylester .

4,05 g N-Carbobenzo:cy-N^l^-4. 4'-dir.iethoxybenzhydryl-L-asparagin werden wie bei Beispiel 1 c) mit Diazomethan verestert. Ausb. nach ümkristallisation aus Essigester/ ™ Petroläther: 3,4 g (= 82 % d.Th.) F.P. 188-190° [oÜp² = -4.35° (c = 2 in Dimethylformamid)

d) N^u-4.4'-Dimethoxybenzhydryl-L-asparagin-methylesterhydrochlorid

\P
15.3 g N-Carbobenzoxy-N -4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-asparagin-methylester werden wie bei Beispiel 1 d) hydriert. Ausb. 10 g (= 81 %) F.P. 186-188° 99

[ jJ = + 23.1 (c = 2 in Methanol)

/20

109847/1725

Beispiel 5

o-Nitrosulfenyl-N^v^-4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-asparagincyclohexylamin-salz

33.6 g N^jD-4.4^t-Dimethoxybenzhydryl-Ir-asparagin werden in 46 ml 2n Natronlauge und 116 ml Dioxan gelöst. Unter Einhaltung von pH 8 gibt man portionsweise 19,6 g o-Nitrosulfenylchlorid und 46 ml 2n Natronlauge zu. Anschließend wird mit 930 ml Wasser verdünnt, mit Zitronensäure angesäuert (pH 3) und mit Essigester die wässrige Phase zwei mal ausgeschüttelt. Der Essigester wird mit Natrium- . sulfat getrocknet und mit Cyclohexylamin"versetzt. Es fällt ein gelber Kristallbrei aus, der abgesaugt und mit Essigester gewaschen wird. Ausbeute 47,5 g (84.6 % d.Th.), F. P. 182-184°

Beispiel 6

N-Carbobenzoxy-N^vli-4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-glutaminyl-L-leucin-methylester

5,1 g N-Carbobenzoxy-N^uJ-4.4'-dimethoxybenzhydryl-L-glutamin werden in 30 ml absoluten Tetrahydrofuran gelöst. Dazu gibt man 1,7 g L-Leucinnethylester-hydrochlorid und unter Rühren 1,4 ml Triäthylamin. Innerhalb einer Stunde läßt man bei Zimmertemperatur unter Rühren 1,2 g Methyläthinyldiäthylainin, gelöst in 10 ml Tetrahydrofuran zutropfen. Es entsteht bald ein dicker Brei, der mit Tetrahydrofuran verdünnt vird. Nachdem alles eingetropft ist, läßt man 30 Minuten nachrühren, engt ein, verteilt den Rückstand zwischen Wasser und viel warmen Essigester, schüttelt die Essigesterphase mit 2n Zitronensäure, Natriumbicarbonatlösung und Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat und engt ein. Der Rückstand.

109847/1725

¹ /21

- 21 - Pw 5676

wird mit Petroläther verrieben. Ausb. 5,5 g (=87 % d.Th.), F.P. 169-171°. Nach Ümkristallisation aus
Essigester/Petroläther: Ausb. 4.4 g (= 70 % d.Th.), F.P. 174-178° *

[eö]_D = -10,0 (c = 1, in Dimethylformamid).

/22

109847/1725

Claims

P a t e η t a η S P r U C h e I I

Π Verfahren zur Herstellung von asparagin- und glutamin-haltiger Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß man Asparagin und
Glutamin oder deren säurestabilen Derivate der
allgemeinen Formel (I)

G- (A)_x-NH-CH-CO- (B) -OR

■2'n

(0H₀) CO

(D

. .. . . ._^ einen unter den Bedingungen der Her-

%— —<■..- . ·—■ ■ '■■» «Qder ein Proton

stellung säurestabilen Acylrest*y<£* und B gleiche oder verschiedene Aminosäurereste oder Peptidbruchstücke und R einen Alkyl-, Aralkyl- oder Arylrest oder ein Proton bedeuten, χ und y für die Zahl 0 oder eine ganze Zahl und η für die Zahlen 1 und 2 stehen, mit 4,4'-Dimethoxybenzhydrol in Eisessig in Gegenwart saurer Katalysatoren zu den Verbindungen der allgemeinen
Formel (II)

G- (A)-NH-CH-CO- (B)-OR
χ i y

^H3^C0\\

(II) bzw. (Ha)

109847/1725

/23

- 23 - Fw 5676

wobei G, A, B, R, χ, y und η die oben genannte Bedeutung haben, umsetzt, diese Derivate nach den allgemeinen Methoden der Peptidchemie in andere Derivate der allgemeinen Formel '(1'Ia), wobei sich (Ha) hinsichtlich A und/oder B und/oder χ bzw. y von den Verbindungen der Formel II unterscheidet,' überführt und gegebenenfalls anschließend die 4,4'-Dimethoxybenzhydrylgruppe durch Behandeln mittels starker organischer Säuren oder mittels Llineralsäuren abspaltet.

2) Verbindungen der allgemeinen Formel

NHR₁
:-NH-CO- (CH₀) -CH-COOR

NHR₁

I ¹ i_o) -CH-CC

in der η die Zahlen 1 oder 2, R Y/asserstoff oder die Methylgruppe und R₁ Wasserstoff oder den Carbobenzoxyrest bedeuten, ,Yv'obei, falls R₁ Vi'asserstoff und R die Methylgruppe bedeuten, die Verbindungen in Form ihrer Salze mit starken Säuren vorliegen.

109.847/1.725