DE1643274C3 - Neue Peptide mit ACTH-Wirkung - Google Patents

Description

säure oder Asparaginsäure, aufweisen.

Die neuen Verbindungen haben eine wesentlich 65 stärkere und/oder längere adrenocorticotrope Wirkung

Das Hauptpatent 14 93 559 betrifft neue ACTH- al? die bisher bekannten Peptide, wie sich in-vivorksame Peptide mit erhöhter bzw. verlängerter Tests, z. B. durch Bestimmung der Plasma-Corticorkung, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie steronwerte hypophysektomierter Ratten zeigen läßt.

So weist beispielsweise das;D-Seri-Gly*-Lys". »/?>-*<- _{gruppej oder} ^besondere des tert.-Butyloxycarbonyl-Corticotropin eine un Vergleich zum natürlichen restes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanido-Corticotropin mindestens lOmal erhöhte und min- gruppierung des Arginins ist die Nitrogrupps geeignet; destens 3mal verlängerte Wirkung auf. _d;_e genannte Aminogruppe des Arginins muß aber bei

Die neuen Peptide werden nach den für die Her- 5 der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die stellung von Peptiden mit großer Kettenlänge be- Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzylkannten Methoden hergestellt. Dabei werden die oder Tritylrest geschützt werden
Aminosäuren, unter Anwendung geeigneter Schutz- Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder

gruppen, in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Übernach vorheriger ["«lung kleinerer Peptideinheiten io führung einer funktionell abgewandelten Carboxylverknupft. Am ischluU der Synthese werden die Schutz- gruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des gruppen in einer einzigen oder gegebenenfalls in meh- Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden reren Stufen abgespalten. _durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. redu-

Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher dadurch zierenden Mitteln.

gekennzeichnet, daß man aus Peptiden, die sich von i₅ Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, ,daß man ACTH-wirksamen Peptiden mit mindesten= zum das die ersten 3 Araiuosäuren H-D-Ser-Tyr-Glv-OH N-Terniinus hm vollständiger Sequenz der natür- enthaltende Tripeptid (die abgekürzte Schreibweise liehen adrenocorticotropen Hormone dadurch unter- bezieht sich auf L-Aminosäuren, wenn das D- nicht scheiden, daß sie als erste Aminosäure D-Serin, als besonders bezeichnet ist) oder das außerdem, die dritte Aminosäure Glycin und als 17- und 18-ständige 20 4-Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit dem Hepta-Aminosäuren L-Lysin aufweisen, und in denen min- peptid bzw.Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis destens die «-Aminogruppe und die Seitenketten- zur Aminosäure 10 kondensiert und dann das Dekapepaminogruppen sowie die terminale Carboxylgruppe tid mit der ganzen restlichen Peptidsequenz, also z. B. bei und gegebenenfalls vorhandene Seitenkettencarboxyl- Herstellung des Oktadekapeptidamids mit dem Oktogruppen geschützt sind, die Schutzgruppen abspaltet 25 peptidamid der Aminosäuren 11—18, beim Nonaund, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in dekapeptid mit dem Nonapeptid der Aminosäuren ihre Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe 11—19, beim Eikosapeptid mit dem Dekapeptid der überführt. Die Verknüpfung der Amino- und/oder Aminosäuren 11—20, beim Dokosapeptid mit dem Peptideinheiten erfolgt in der Weise, daß man eine Dodekapeptid der Aminosäuren 11—22, beim Tri-Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Amino- 30 kosapeptidamid mit dem Tridekapeptidamid der gruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit Aminosäuren 11—23, beim Tetrakosapeptidamid mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier dem Tetradekapeptidamid der Aminosäuren 11—24, oi-Aminogruppe und freier oder geschützter, z. B. ver- beim Pentakosapeptid mit dem Pcntadekapeptidamid esterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, der Aminosäuren 11—25, beim Oktakosapeptid mit umsetzt oder daß man eine Aminosäure oder ein Peptid 35 dem Oktadekapeptid der Aminosäuren 11—28, beim mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter termi- Nonatriakontapeptid mit dem Nonakosapeptid der naler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder Aminosäuren 11—39 kondensiert. Bei dieser Konder.-einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe sation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die und geschützter a-Aminogruppe umsetzt. Die Carb- Carbodiimidmethode oder die Methode der akiivierten oxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung 40 Ester, vor allem mittels des p-Nitrophenylesters, verin ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid, wendet. Im letzten Fall braucht der p-Nitrophenyl- -isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyan- ester des Dekapeptids nichts als solcher isoliert zu methylester, Carboxymethylester, p-Nitrophenylester, werden, sondern kann auch in der Kondensationsoder durch Reaktion mittels eines Carbodiimide stufe selbst aus dem Dekapeptid mit freier Carboxyl-(gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccin- 45 gruppe, p-Nitrophenol und Dicyclohexylearbodiimid imid) oder Ν,Ν'-Carbonyl-diimidazols aktiviert wer- gebildet werden.

den, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion Als N-terminales Peptidbruchstück kann man aber

mit einem Phosphatamid aktiviert werden. Als £e- auch statt des Dekapeptids irgendein anderes Peptid, bräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbo- z. B. das die N-tennina!en Aminosäuren enthaltende diimidmethode, die Azidmethode, die Methode der 50 Tetrapeptid, Pentapcptid, Hexapeptid, Heptapeptid, aktivierten Ester und die Anhydridmethsde, Hervor- Oktapeptid, Nonapeptid, mit der ganzen restlichen zuheben ist auch die sogenannte Feststoffträger- Peptidsequenz kondensieren. Falls das N-terminale synthese, bei der das Peptid vom Carboxylende, das Bruchstück weder Glycin noch Prolin als C-ständige esterartig an ein Polymeres gebunden ist, aufgebaut Aminosäure aufweist, wählt man für die Kondensatior wird, indem man die Aminosäuren der Reihe nach 55 vorzugsweise die Carbodiimid-Hydroxysuccinimid ankondensiert. methode, (W e y g a η d, Z. Naturforschg. 21 b, 426—

An der Reaktion nicht beteiligt, freie, funktioneile 428 [1966]) oder die Azidmethode.
Gruppen werden zweckmäßigerweise geschützt, ins- Die «-Aminogruppe des N-terminalen Bruchstücke!

besondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion und sämtliche Settenkettenaminogruppen werden vor leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vor- 60 zugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgiuppe, dii zugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, Seitenkettencarboxylgruppen durch die tert.-Butyl tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, estergruppe geschützt. Auch die terminale Carboxyl oder Amidbildung, die Aminogruppe beispielsweise gruppe des C-terminalen Bruchstückes liegt, falls si durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Formyl-, Tri- nicht amidiert ist, vorzugsweise als tert.-Butylestei fluoracetyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Phthalyl- oder 65 gruppe vor. Am Schluß der Synthese können die: tert Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, Butyloxycarbonylgruppen und tert.-Butylestergrüppe wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und gleichzeitig durch saure Hydrolyse, beispielsweise m der D - (r/ - Methoxyphenylazo) - beazyloxycarbonyl- Trifluoressigsäure, abgespalten werden.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Ver- einer organischen Base, wie Triäthylamin, Procain, bindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus Dibenzylamin, oder anderen tertiären Stickstoffbasen. den Salzen können in an sich bekannter Weise die Die Polymeren sind bekannt oder können nach beBasen gewonnen werden. Von letzteren wiederum kannten Verfahren hei gestellt werden, beispielsweise lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur 5 nach dem von M. I d e 1 s ο η et al., J. Am. Chem. Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet Soc. 80, 4631 et seq. (1958) beschriebenen Verfahren, sind, Salze gewinnen, wie z. B. solche mit anorga- So kann man z. B. Glulaminsäure-a-carboxyanhydridnischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, bei- y - benzylester oder -tert. - butylester in Dioxan mit spielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoifsäure, Per- Ammoniak oder einem Amin in einem bestimmten chl»;*äure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwe- 10 Molverhältnis, z. B. 100:1 (je nach dem gewünschten fei·» oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, Polymerisationsgrad), reagieren lassen und nach bewie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykol- endeter Polymerisation die Schutzgruppen abspalten, säure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, z. B. die Benzyloxygruppe mit Bromwasserstoff in Eis-Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumar- essig, die tert.-Butyloxygruppe mit Trifluoressigsäure. säure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascor- 15 Zwecks Herstellung von Polymeren mit einheitlicher, binsäure, Hydroxymaleinsäure.Dihydroxymaleinsäure, definierter Kettenlänge kann man die Polymeren auch Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, durch Synthese nach den in der Peptidchemie be-4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, kannten Verfahren (Carbodiimidmethode, Azidme-Mandeisäure, Salicylsäure, 4-Amino-saJicylsäure, thode etc.) aufbauen.

2 - Phenoxybenzoesäure, 2 - Acetoxybenzoesäure, Me- 20 Die Konzentration des Polymeren in den pharma-

thansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthan- zeutischen Präparaten hängt von der Löslichkeit des

sulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, betreffenden Salzes und von der Viskosität ab. Das

Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure. Polymere soll in den Präparaten in gelöster Form

Die verfahrensgemäß erhaltenen Peptide können in vorliegen können und injizierbar sein.

Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung 25 Die Konzentration des adrenocorticotrop wirksamen

finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit Peptides beträgt beispielsweise 0,1 bis 5 mg/ml.

einem für die enterale oder parenterale Applikation Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen

geeigneten pharmazeutischen, organischen oder an- beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden

organischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen angegeben.

solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht 30 Die dünnschichtchromatographischen Systeme wer-

reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Glukose, den wie folgt bezeichnet:
Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylen-

glykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte System 40:

Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate 35 n-Butanol-Äthanol-Wasser (40: 40: 20)

können z. B. als Lyonhilisat oder in flüssiger Form Sy.«tern 43A:

als Lösurgen, Suspensionen oder Emulsionen vor- tert.-AmylalkohoI-Isopropanol -Wasser (67: 26: 7)

liegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. System 45·

oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungs-, _sek.-Butanol-3 % Ammoniak (70:30)

Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie kon- 40

nen auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe system ^52: .

enthalten n-Butanol-Eisessig-Wasser (100:10: 30)

So kann man sie vor allem auch mit den in der System 52A:

ACTH-Therapie üblichen Zusätzen zur Verlängerung n-Butanol-Eisessig-Wasser (67: 10: 23)

der Wirkung, wie z. B. Gelatine, Polyphloretinphos- 45 System 54:

phat, Carboxymethylcellulose, oder den oben er- sek.-Butanol-Isopropanol-9 %ige wässerige Mono-

wähnten schwerlöslichen Metallverbindungen, ins- chloressigsäure (58: 8 : 34)

besondere Phosphaten, Pyrophosphaten und/oder System 96:

Hydroxyden des Zinks, kombinieren. sek.-Butanol-Eisessig-Wasser (67:10: 23)

Weiter kann man zur Verlängerung der Wirksam- 50 · _vstem joq.

keil die neuen Peptide in ihre Komplexe mit Polymer.- " Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6:11)

säten oder Copolymensaten von Aminosäuren, ins- '

besondere solchen, die einen überwiegenden Anteil a ystem IUl:

an sauren «-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder n-Butanol-Pyndm-Eisessig-Wasser (30:20:6:24)

Asparaginsäure der L-, D- oder D,L-Konfiguration, 55 System 101E:

aufweisen, überführen. Die genannten Polymerisate n-Butanol-Pyridin-Eiiessig-Wasser (42:24:2:30)

und Copolymerisate weisen in den Seitenketten freie System 104:

Carboxylgruppen auf, während die terminale Carb- Chloroform-Methanol-17% Ammoniak (41:41:18)

oxylgruppe frei oder funktionelle abgewandelt sein, System 112 A:

z. B. als Estergruppe oder als eine unsubstituierte 60 n-Butanol-Pyridin-Ameisensäure-Wasser

oder durch Kohlenwasserstoffreste, vor allem niedere (42 : 24: 4: 20)

Alkylgruppen, substituierte Amidgruppe vorliegen c , 11">F·

kann. Das Molekulargewicht der Polymerisate kann „.Butanol-Pyridin-Amcisensäure-Wasser

zwischen 10 000 und 100 000 liegen, vorzugsweise ,,, _{94 9} J_n-.

beträgt es 200 000-80 000. Man verwendet für die 6₅ ^^aL^TZun^ werden verwendet:

Herstellung der Präparate zweckmäßig ein wasserlos-

liches, physiologisch verträgliches Salz, z. B. das BOC = tert.-Butyloxycarbonyl

Natrium- oder Ammoniumsalz, oder ein Salz mit tBu = tert.-Butvl.

Beispiel 1

Rf	(101)	= 0,42
Rf	(52A)	= 0,25
Rf	(112A)	= 0,48

H-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glii-His-Phe-Arg-Try-

Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-

Lys-Val-Tyr-Pro-OH (D-Ser^!-Gly³-Lys¹⁷·¹⁸-/?'-²'-

Corlicotropin)

270 mg BOC-D-Ser-Tyr-GIy-Met-GIu(OlBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys-(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-Otßu werden in 13 ml 90%iger Trifiuoressigsäure gelöst und während 30 Minuten bei 22' stehen gelassen. Man engt dann die Lösung auf ca. 2 ml ein, verdünnt mit 10 ml Wasser, konzentriert wiederum auf ein Volumen von 3—4 ml und lyophilisiert. Das so erhaltene Trifluoracetat des freien Tetrakosapeptides wird zur Umwandlung in das Acetat in 5 ml Wasser gelöst und durch eine Säule (0 = 15 mm; / = 15 cm) von schwach basischem Ionenaustauscher (Merck No. II) in der Acetatform filtriert. Das Elual wird unter Zusatz von einigen ml n-Butanol auf ca. 4 ml eingeengt und lyophilisiert. Man erhält 230 mg chromatoeraphisch und elektrophoretisch einheitliches Acetat des D-Scr¹-Gly³-Lys^I7-¹⁸-/?^I-^M-Corticotropins als amorphes, gut wasserlösliches Pulver. Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Aluminiumoxyd (DA) und auf Cellulose (DC) folgende Rf-Werte auf:

DA:

DC:

Bei der Papierelektrophorese (Pyridinacetatpuffer, pH 6,1, 16 Volt/cm) wandert die Verbindung in 2 Stunden 8,6 cm gegen die Kathode.

Die Verbindung besitzt im Vergleich zu /3'-²⁴-Corticotropin eine stark erhöhte und verlängerte corticotrope Wirkung.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Tetrakosapeptidderivat kann wie folgt hergestellt werden:

1. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH

5,7 g (10 mMol) BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-NH-NH., (hergestellt wie im belgischen Patent 6 68 250 beschrieben) werden in 50 ml Dimethylformamid suspendiert und unter Rühren bei -15° mit 12,5 ml einer 2-n. Lösung von Chlorwasserstoff in Essigester und dann mit 1,13 g (11 mMol) tert.-Butylnitrit versetzt Man rührt noch 10 Minuten bei -15° und fügt dann 3,5 ml (25 mMol) Triäthylamin zu der Lösung des BOC-Tetrapeptidazids. Die so erhaltene Lösung gibt man tropfenweise zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 7,1g (8 mMol) H-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH in 150 ml Dimethylformamid und 7,5 ml Wasser, rührt das Reaktionsgemisch 15 Stunden bei 0° und versetzt dann mit 50OmI Wasser. Das ausgeschiedene amorphe Produkt wird abgenutscht und mit Dimethylformamid-Wasser (1:5) und Acetonitril gewaschen. Nach Reinigung durch Umfallen aus wässerigem Acetonitril und Äquilibrierung mit Luftfeuchtigkeit erhält man 8,62 g (73 %) reines BOC-Dekapeptid-tetrahydrat vom F. 230—240°. [*]? = —15° -j- 2° (c = 0,5 in Pyridin-Wasser 1:1). Die Substanz ist gemäß Dünnschichtchromatogramm auf Silikagel einheitlich; Rf 52 = 0,3; Rf 101 = 0,6.

2. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-GIy-Lys-
(BOC)-Lys( BOC)-Ly s( BOC)-Lys( BOC)-PrO-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

ίο 326 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-GluiOtBiO-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH und 350 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gry-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu (s. Nr. C40617 IVb/12qu, Case 5805/5503/1+ 2) werden in einer Mischung von 3,2 ml Pyridin, 0,1 ml Wasser und 0,25 ml 1-n. Salzsäure suspendiert. Man gibt 112 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt das teilweise unlösliche Gemisch während 3'/₂ Stunden bei 50\ gibt dann nochmals eine gleich große Menge Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt während weiteren 4 Stunden bei 50°. Zuletzt engt man auf ein Volumen von ca. 2 ml ein und fällt die Peptide durch Zugabe von 40 ml Wasser aus. Der gallertig-flockige Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, und dann zur Abtrennung von Dicyclohexylharnstoff und anderer, lipophiler Verunreinigungen in heißem Methanol gelöst und mit einem Bcnzol-Petroläther-Gemisch gefällt. Das so gewonnene Rohprodukt wird zur endgültigen Reinigung im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (30:3:5:4) [Puffer = 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in 960 ml Wasser] einer Craig-Verteilung über 290 Stufen mit Phasenvolumina von je 10 ml unterworfen. Aus den Verteilungselementen Nr. 74—97 (r_mBn = 85; K= 0,42) werden durch Einengen zur Trockene und Wegsublimieren des Ammoniumacetats bei 45° im Hochvakuum 295 mg geschütztes Tetrakosapeptidacetat in chromatographisch einheitlicher Form als weißes, amorphes Pulver vom unscharfen Zersetzungspunkt ca. 205° gewonnen. Es weist auf Silicagel-Dünnschichtplatten folgende Ri-Werte auf:

Rf (100) = 0,61

Rf (Chloroform-Methanol = 75 : 25) = 0,40

Beispiel 2

H-D-Ser-Tyr-GIy-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys · NH₂

Lys¹⁸-amid)

270 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOQ-Pro-Va!-Gly-Lys(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-NH₂ werden in 13 ml 90 %iger Trifluoressigsäure gelöst, während 30 Minuten bei 22° stehengelassen, und dann auf ca. 2 ml eingeengt. Man verdünnt mit 10 ml Wasser, konzentriert wie derum auf ein Volumen von 3—4 ml lyophili ie t. Das so erhaltene Trifluoracetat des freien Oktadekapepti- des wird zur Umwandlung in das Acetat in 5 ml Wasser gelöst und durch eine Säule (0 = 15 mm; / = 15 cm) von schwach basischen Ionenaustauscher (Merck Nr. II) in der Acetatform filtriert Das Eluat wird unter Zusatz von einigen ml n-Butanol auf ca. 4 ml eingeengt und lyophilisiert. Man erhält 241 mg chromatographisch und elektrophoretisch einheitliches Acetat des D-Ser'-Gly^Lys^-^-Corticotropin-Lys^-amids als amorphes, wasserlösliches Pulver. Es weist im Dünn-

709 611/40

Rf (52A)	=r 0,15
Rf(IO!)	= 0,33
Rf (104)	= 0,17
Rf (112A)	= 0,26

scliichtcliromatogramm auf Aluminiumoxyd (DA) Raumtemperatur während 30 Minuten stehen ge- und auf Cellulose folgende Rf-Werte auf: lassen. Man engt dann im Rotationsverdampfer bei

30° Badtemperatur auf ein Volumen von ca. 3 ml ein,

1 .1 „,, gibt 15 ml Wasser zu, engt nochmals ein und lyophili-

5 siert. Dabei wird das Trifiuoracetat des freien Tctrakosapeptids erhalten, das zur Umwandlung in das

DC: Rf (112A) = 0,26 Acetat in ca. 4 ml Wasser gelöst und durch eine Säule

(0 - 12mm; / 22cm) von schwach basischem

Bei der Papierelektrophorese (Pyridinacetatpuffer, Ionenaustauscher (z. B. Merck Nr. II) in der AcetatpH 6,1, 16 Volt/cm) wandert die Verbindung in 2 Stun- ίο form filtriert wird. Das F.luat wird auf ca. 5 ml konden 11,7 cm gegen die Kathode. zentriert, lyophilisiert, bei 40° im Hochvakuum nach-

Die Verbindung besitzt im Vergleich zu /?'-⁼¹-Cor- getrocknet und dann mit Luftfeuchtigkeit äquilibriert. ticotropin stark erhöhte und verlängerte corticotrope Man erhält 279 mg Acetat des D-Ser-'-Gly'-Lys¹⁷·¹⁸-Wirkung. /?-'"^2l-Corticotropin-Pro'-¹-amides als weißes, amor-

Das als Ausgangsmaterial verwendete Oktadeka- 15 phes, gut wasserlösliches Pulver von unscharfem Zerpeptidderivat kann wie folgt hergestellt werden: setzungspunkt bei ca. 180". Es weist im Dünnschicht-

chromatosramm auf Aluminiumoxyd (DA) und auf

BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe- Cellulose (DC) folgende Rf-Werte auf:

Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-GIy-Lys(BOC)-

Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC) · NH₂ ²° >

Rf (52 A)	- 0,27
Rf(IOl)	= 0,66
Rf(IOl E)	-= 0,36
Rf (112E)	= 0,15

2,9gfeinpulverisiertesBOC · D-Ser-Tyr-Gly-Met- DC:
Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GlyOH (dargestellt wie
im Beispiel 1 beschrieben) und 2,1 g H ■ Lys(BOC)-

PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS- 25 Das als Ausgangsmaterial verwendete Tetrakosa-

(BOC)-NH₂ (s. Nr. C 40 616 IVb/12qu, Case 5806/ peptidderivat kann wie folgt hergestellt werden:
5503/1 ; 2), werden in 27 ml Pyridin, 0,7 ml Wasser

und 2,38 ml 1-n. Salzsäure suspendiert und nach Zu- _{1 7} . „ _
gäbe von 1,07g Dicyclohexylcarbodiimid bei 50° ge- ' ^z-^Val-'y^r-' ro-NH,
rührt. Die Mischung wird bald fest und wird nach 30 18,8g Z-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 95 ml 90%-3stündigem Stehenlassen bei 50° mit einer Lösung iger Trifluoressigsäure gelöst und während einer von weiteren 1,07 g Dicyclohexylcarbodiimid in 1ml Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Man Pyridin versetzt, homogenisiert und dann nochmals engt zur Trockne ein und pulverisiert den öligen während 4 Stunden bei 50° stehengelassen. Schließlich Rückstand durch Zugabe von 100 ml Wasser und Zergibt man 300 ml Wasser zu, homogenisiert und filtriert 35 reiben bei 0°. Nach Abfiltrieren wird er bis zur Geden gallertig-flockigen Niederschlag ab. Er wird ge- wichtskonstanz über Kaliumhydroxvd getrocknet und trocknet und in 100 ml Dimethylformamid bei 70° dann aus Essigester-Petroläther umgefällt. Das amorphe gelöst, wobei der größte Te:! des gebildeten Dicyclo- Pulver (17,01 g) wird zusammen mit 5,15 ml Trihexylharnstoffs unlöslich bleibt und abfiltriert wird. äthylamin in 17OmI absolutem Tetrahydrofuran ge-Aus dem Filtrat wird das Kondensations-Rohprc Juki 4° löst, auf —15° abgekühlt, und während 5 Minuten durch Zugabe von 600 ml Benzo! und 400 ml Petrol- mit einer Lösung von 4,44 ml Isobutylchlorcarbonat äther ausgefällt, abfiltriert und getrocknet. (4,65 g) in 2,5 ml absolutem Tetrahydrofuran versetzt. Nach 1,0 g dieses Rohproduktes werden zur Reinigung in 15minutigem Rühren bei —10° gibt man langsam je 75 ml Ober- und Unterphase des Lösungsmittel- 107 ml 0,64-n. Ammoniak in absolutem Essigester zu systems Methanol — 2-n. Essigsäure-Chloroform-Te- 45 und läßt noch während 1 Stunde bei 0° uno. während trachlorkohlenstoff (10:3:7:5) unter leichtem Er- 6 Stunden bei 20° rühren. Das Gemisch wird stark wärmen gelöst und nach Craig über 135 Stufen mit eingeengt, der klebrice Rückstand in 500 ml Essigester Phasenvolumen von je 25 ml verteilt. Aus den Ver- gelöst und nacheinander mit Wasser, 2-N-Sodalösung teilungselementen Nr. 88—110 (r_max = 100, K = 2,8) und wiederum Wasser gewaschen und zur Trockne erhält man bei Einengen zur Trockene und Weg- 50 eingeengt. Man erhält nach zweimaligem Umfallen sublimieren des Ammoniumacetate.; bei 45° im Hoch- des Rückstandes aus Essigester-Petroläther und Trockvakuum insgesamt 490 mg reines geschütztes Okta- nen im Hochvakuum 14,4 g eines amorphen Pulvers, decapeptidamid-acetat als weißes, amorphes Pulver. das sich dünnschichtchromatographisch einheitlich In der Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel verhält. Auf Silicagelplatten ergeben sich folgende weist es die folgenden Rf-Werte auf: 55 R_f-Werte:

Rf (52) = 0,55 _{Rf im System} Chloroform-Methanol (9:1) = 0,35

= °'⁶⁸ Rf (43 A) =0,63

~ ' 60 2. H-Val-Tyr-Pro-NH₂

ο τ- ^, Vi-^SP/l,^e TT- ™_ λ ¹⁴'^{4g Z}-^Val-^Tyr-Pro-NH₂ werden in 150 ml Me-

H-D-Ser-Tyr-GIy-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try- thanol gelöst und mit 1,5 g 10%iger Palladiumkohle Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val- bei Normaldruck und unter COj-Absorption bis zur Lys-Val-Tyr-Pro-NH₂ (D Ser^Gly^Lys¹⁷·¹⁸- Sättigung (Dauer ca. 2 Stunden) hydriert. Nach Ab-

^-«-Corticotropin-Pro^-amid) ^{5 ffltrie}J^en ,^des Katalysators und Einengen des Filtrates

, ^τατ Trockne wird der Rückstand in 15 ml Methanol

2:93 mg geschütztes Tetrakosapeptid-amid werden und 40 ml Essigester gelöst, durch Zugabe von 120 ml

in 14 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und bei Petroläther ausgefällt, abfiltriert und im Hoch-

12

vakuum bei 40° getrocknet. Man erhält 9,52 g eines matographisch reines geschütztes Pentapeptid als amorphen Pulvers, das sich dünnschichtchromato- weißes, amorphes Pulver erhalten. Es weist im Dünngraphisch auf Celluloseplatten einheitlich verhält: schichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf- Werte

Rf (40) = 0,73 ₅ ^auf:

R_f (45) — o,72 Rf im System Chloroform-Methanol (9: 1) =0,42

R, (54) = 0,70 Rf (43 A) = 0,68

3. Z-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH₂ 6- H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH₂

9,74 g Z-Lys(BOC)-OH und 9,52 g H-Val-Tyr- io 5,72 g Z-Val-Lys(BOC)Val-Tyr-Pro-NH₂ werden in

PrO-NH₂ werden in 40 ml absolutem Dimethylform- 75 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 600 mg

amid gelöst und mit einer Lösung von 5,76 g Dicyclo- lO'Viger Palladiumkohle bei Zimmertemperatur unter

hexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril versetzt. Man CO,-Absorption hydriert. Die Wasserstoffaufnahme

rührt während 12 Stunden bei Raumtemperatur, fi!- ist nach ungefähr 5 Stunden beendet, und man filtriert triert dann den ausgeschiedenen Dicyclohexylharn- 15 den Katalysator ab und dampft die Lösung zur

stoff ab und engt die Lösung zur Trockne ein. Der Trockne ein. Man erhält 4,74 g Pentapeptid-amid als

feste schaumige Rückstand wird zweimal aus Essig- amorphes chromatographisch einheitliches Pulver,

ester-Petroläther umgefällt und ergibt 16,02 g amor- das im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel

phesTetrapeptidderivat, das auf Silicagel-Dünnschicbt- folgende R_t-Werte aufweist:

platten die folgenden Rf-Werte aufweist: 2° R_f (52) — 0,40

Rf im System Chloroform-Methanol (9:1) -_ 0,29 ^{Rf (100)} = °-³⁵

Rr (43A) -0,68 7. Z-LyS(BOC)-LyS(BOC)-PrO-VaI-LyS(BOC)-

VaI-Ty r-Pro-N H₂

4. H-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH_{2 25 335 g Z}._Lys(_BOC)-Lys( BOC)-PrO-O H (hergestellt 15,5 g des geschützten Tetrapeptidamids werden in wie in Beispiel 1 angegeben) werden in 20 ml absolu-100 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 1,5 g tem Dimethylformamid gelöst und nach Zugabe von 10"-„iger Palladiumkohle bei Normaldruck bis zur 0,65 ml Triäthylamin auf —15° abgekühlt. Man läßt Sättigung hydriert. (Dauer ca. 4 Stunden). Das nach dann bei —15° 0,58 ml Pivaloylchiorid zutropfen. Abfiltrieren des Katalysators und Einengen des FiI- 3° Nach 6 Minuten gibt man eine vorgekühlte Lösung trates zur Trockne erhaltene Rohprodukt wird an- von 3,34 g H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH₂ in 10ml schließend in 10 ml Methanol und 120 ml Essigester absolutem Dimethylformamid zu und rührt das Gegelöst und durch Zugabe von 120 ml Petroläther aus- misch während 20 Minuten bei —10°, während 5 Stungefällt und im Hochvakuum bei 40° getrocknet. Man den bei 0°, und während 2 Stunden bei 20°. Zur Auferhält 11,9 g eines amorphen Pulvers, das im Dünn- 35 arbeitung gibt man 70 ml Essigester und 50 ml Wasser schichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rr-Werte zu und extrahiert die organische Phase nacheinander aufweist: mit 0,1-M.-Zitronensäure, 2%iger Ammoniaklösung

und Wasser, trocknet über Natriumsulfat und ver-

Rt im System Chloroform-Methanol (9: 1) =0,08 dampft das Lösungsmittel. Der pulverig-amorphe

Rf (43A) =0,27 40 Rückstand (5,74 g) weist im Dünnschichtchromato-

r r, ,τ ^^ ,-τ- τ, -κ,TT gramm auf Silicauel nur geringe Verunreinigungen auf

5. Z-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH_{2 und wird ohne} ~_{Reinigung zur} Weiterreaktion ein-

5,28 g Z-VaI-OH und 3,07 ml Triäthylamin werden gesetzt.

in 50 ml absolutem Essigester gelöst auf —10° ge- . , ,
kühlt und mit einer Lösung von 4,57 ml Isobutyl- 45 ^R'^{lm Svstem} Chloroform-Methanol (9:1) = 0,23 chlorcarbonat in 5 ml Essigester versetzt. Man rührt _{TT T T} ,„„.-„. „ ,, . _{T rn},^\
noch während 15 Minuten bei -10° und gibt dann ⁸· H-L_ys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-bei ca. -5° eine Lösung von 11,87 g H-Lys(BOC)- vai-lyr-Pro-NM₂
Val-Tyr-Pro-NH., in 10 ml Dimethylformamid zu. Die 5,7 g des oben beschriebenen Oktapeptidcerivates Mischung wird während 30 Minuten bei 0° und wäh- 5« werden in 100 ml Methanol gelöst und nach Zugabe rend 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann von 550 mg 10%iger Palladiumkohle bei Normaldruck mit 100 ml Wasser und 200 ml n-Butanol versetzt. bis zur Sättigung hydriert. Nach Abfiltrieren des Nach Abtrennung der wäßrigen Phase wird die orga- Katalysators und Nachspülen mit Methanol wird das irische Phase nacheinander mit 10%iger Weinsäure- Filtrat zur Trockne eingedampft. Der weiße, schaumige lösung (bei 0°), gesättigter Natriumbicarbonatlösung 55 Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst, mit und gesättigter Natriumsulfatlösung gewaschen, über 20 ml 2-n. Essigsäure extrahiert, die Chloroformphase Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. sodann auf 20 ml eingeengt und daraus das Peptid Der schaumige Rückstand wird zur Vorreinigung ein- durch Zugabe von 60 ml Petroläther ausgefällt und mal aus Methanol-Essigester-Petroläther und einmal bei 50° im Hochvakuum getrocknet Nach Äquilibräeaus Methanol-Acetonitril umgefällt und ergibt 12,15 g ^6o ren mit der Luftfeuchtigkeit erhält man 5,21 g eines eines amorphen Pulvers, das im Lösungsmittelsystem amorphen, dünnschichtchromatographisch einheit-Methanol-0,1 M.-Ammoniumacetatlösung-Chloro- liehen Pulvers, das laut Titrations- und Elementar- form-Tetracnlorkohlenstoff (9:3:4:4) mit Phasen- analysen pro Mol Oktapeptid-amid 0,63 Mol Essigvolumina von je 25 ml über 250 Stufen multiplikativ säure und 13 Mol H₂O enthält. Auf Silicagel erhält verteilt wird. Aus den Verteflungselementen Nr. 81-115 65 man folgende Rf-Werte: 0max=91; K =0,57) werden beim Einengen zur

Trockne und Wegsublimieren des Ammoniumace- Rf im System Chloroform-Methanol (9:1) =0,08

tates im Hochvakuum bei 45° insgesamt 7,94 g chro- R_f (100) = 0,46

923

Tyr-Pro-NH₂

3,91 g Z-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS-(BOC)-NHNH₂ (vgl. deutsches Patent 12 14 242) werden unter leichtem Erwärmen in 40 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, auf —20° abgekühlt und bei dieser Temperatur unter Rühren nacheinander langsam mit 6,58 ml 2,15-n. Salzsäure und mit 0,74 ml 5-n. Natriumnitritlösung versetzt. Man rührt zuletzt noch während 15 Minuten bei —10' und gibt dann eine vorgekühlte Lösung von 4,07 g H-Lys(BOC)-LyS(BOC)-PrO-VaI-LyS(BOC)-VaI-T)T-PrO-NIl₂ (enthaltend 2,5% CH₃COOH + 15,3";, H₂O) in 11 ml Dimethylformamid sowie 1,98 ml Triethylamin zu. Die Mischung wird während 1 Stunde bei O" gerührt, worauf man das pH durch Zugabe von Triäthylamin auf 7,5 einstellt und über Nacht bei 0° stehen läßt. Das Reaktionsgemisch wird sodann im Hochvakuum auf ein Volumen von ca. 20 ml eingeengt und mit 100 ml Wasser versetzt. Dabei fällt das Rohprodukt in gailertiger Form aus. Es wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und anschließend dreimal aus Methanol-Wasser und zweimal aus Methanol-Benzol-Petroläther umgefällt. Das so vorgereinigte Material (4,72 g) wird im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (12:4:9: 3) [Puffer =-- 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in 960 ml Wasser] einer Craig-Verteilung über 160 Stufen mit Phasenvolumina von je 20 ml unterworfen. Aus den Verteilungselementen Nr. 45 —74 (/-_milx = 57; K = 0,55) werden beim Einengen zur Trockne und Wegsublimierendes Ammoniumacetates bei 45° im Hochvakuum insgesamt 3,3 g chromatographisch reines geschütztes Tetradekapeptid als weißes, amorphes Pulver vom Zersetzungspunkt ca. 210° gewonnen. Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Ri-Werte auf:

II. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-GluiOtBui-His-

Phe-Arg-Tyr-Gly-LysCBOQ-Pro-Val-Gly-LysiBOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-PrO-VaI-LyS-

(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH₂

355 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Mel-Glu(OlBu)-His-Phc-Arg-Tyr-Gly-OH und 400 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val-(Jly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(B0C)-Pro-Val-Lys(I?OC)-Val-Tyr-Pro-NH₂ werden in einem Gemisch von 3,7 ml Pyridin und 0,273 ml 1-n. Salzsäure unter Erwärmen auf 50° homogenisiert. Die breiig-gallertige Masse wird sodann mit einer Lösung von 131 mg Dicyclohexyl-carbodiimid in 0,2 ml Pyridin versetzt, mit Stickstoff bespült, nochmals gut homogenisiert und dann während 3 Stunden bei 50° stehen gelassen. Nach dieser Zeit gibt man eine zweite Portion von 131mg Dicyclohexyl-carbodiimid in 0,2 ml Pyridin zu, spült erneut mit Stickstoff, homogenisiert und läßt während weiteren 3 Stunden bei 50° stehen. Zuletzt gibt man 50 ml Wasser zu, homogenisiert, filtriert den feinkörnig-gallertigen Niederschlag ab und trocknet ihn bei 45° im Hochvakuum. Zur Entfernung von Dicyclohexylharnstoff und anderer lipophiler Verunreinigungen wird er zweimal nacheinander heiß in Methanol suspendiert, durch Zugabe von Benzol und Petroläther ausgefällt, abfiltriert und getrocknet. Das so vorgereinigce Produkt wird im Lösungsinittelsystem Methanol - Puffer - Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:6:4) [Puffer = 28,5 ml Eisessig > 19,25 g Ammoniumacetat in 960 ml Wasser] über 185 Stufen multiplikativ verteilt, mit Phasenvolumina von je 10 ml. Aus den Verteilungselementen Nr. 67—86 (r_m!lx = 77; K = 0,71) isoliert man beim Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Ammoniumacetates im| Hochvakuum bei 45° das reine, geschützte Tetrakosapeptidamid als weißes, amorphes Pulver von unscharfem Zersetzungspunkt bei ca. 220°. Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:

Rf im System Chloroform-Methanol (9:1) = 0,17 Rf (43 A) = 0,62

Rr (100) = 0,87

10. H · LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-

Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys-

Val-Tyr-Pro-NH,

4,97 g des geschützten Tetradekapeptidamids werden unter Erwärmen in 100 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von Ig 10%iger Palladiumkohle bei Raumtemperatur und Normaldruck unter Absorption des sich bildenden Kohlendioxyds bis zur Sättigung hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, das Filtrat auf ca. 15 ml konzentriert und daraus das hydrierte Tetradekapeptid durch Zugabe von 50 ml Benzol und 150 ml Petroläther ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum bei 45° getrocknet. Man erhält 4,25 g eines amorphen Pulvers, das sich im Dünnschichtchromatogramm auf Süicagel einheitlich verhält und folgende Rf-Werte aufweist:

Rf (Chloroform-Methanol =7:3) = 0,42
j^f ($->\ = 0 41

_{Rf (1}öo) I O₃₈

ΒΟΓ Tv! riv nrv, ⁱ- ^ü(J(-lyr-Gly-OCH₃

Rf (43 A)	= 0,18
Rf (52)	= 0,41
Rf(IOO)	= 0,33

so 10,12 g BOC-Tyrosin .„ _o

ester gelöst und nach Abkühlen auf 20° mit einer Lösung von 3,84 g Glycin-methylester in 10 ml Essigester versetzt. Dazu gibt man 10,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form und rührt während 18 Stun-

den bei 25°. Dann wird auf 0° abgekühlt, nach 30 Minuten vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und aus dem Filtrat durch Einengen und Ausfällen mit Petroläther das rohe Dipeptidderivat als amorphe, zähe Masse isoliert. Sie wird durch noch-

maiiges Umfallen aus Essigester-Petroläther weiter gereinigt und kann dann aus dem gleichen Lösungsmittelgemisch kristallisiert werden; F. 124—125°.

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten:

Rf (43 A) =0,65

Rf (CHClg-Methanol = 8:2) = 0,68
Rf = 0,77

2. H-Tyr-Gly-OCHa-hydrochlorid

2 g BOC-Tyr-Gly-OCH~ werden unter Erwärmen in 20 ml absolutem Essigester gelöst und bei 20° mit 20 ml 4-n. Salzsäure in absolutem Essigester versetzt. Nach einigen Minuten beginnt ein Niederschlag auszufallen. Nach 30 Minuten engt man das Reaktionsgemisch im Vakuum auf ca. 10 ml ein und vervollständigt die Ausfällung des Dipeptidester-hydrochlorids durch Zugabe von 50 ml Petroläther. Man homogenisiert, filtriert das amorphe Produkt ab, wäscht mit Petroläther und trocknet im Hochvakuum bei 30°. Das Dipeptidester-hydrochlorid wird als hygroskopisches Pulver vom F. ca. 110—115 (Zersetzung) erhalten. Es zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende Rr-Werte:

Rt (43 A)	8:2)	= 0,33
Rr (CHCI3-MethanoI -		- 0,36
Rt(101)	= 0,60

3. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-OCHj

1,69 g H-Tyr-Gly-OCHa-hydrochlorid werden unter leichtem Erwärmen in 10 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und dann auf 0° abgekühlt. Man gibt nacheinander 0,84 ml Triäthylamin, 1,23 g BOC-D-Ser-OH und 1,65 g Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt die Mischung während 20 Stunden bei 25° und zuletzt noch während einer Stunde bei 0°. Das ausgeschiedene Gemisch von Triätliylammoniumchlorid und Dicyclohcxylharnsloff wird abfiltriert und das Filtrat bis auf einen öligen Rückstand eingeengt. Durch Zugabe von 30 ml Essigester und 100 ml Petroläther wird das Rohprodukt als schmierige Masse ausgefällt. Zur Vorreinigung löst man es wieder unter Erwärmen in wenig Essigester und fällt es durch ZuZugabe von viel Petroläther aus (1,8 g). Das dünnschichtchromatographisch noch unreine Produkt wird zur Reinigung im Lösungsmittelsystem. Essigester-Benzol - 0,05 - m. wäßrige Ammoniumacetatlösung (2:1:2) mit Phasenvolumina von je 10 ml nach Craig multiplikativ verteilt. Nach 250 Stunden isoliert man aus den Verteilungselementen Nr. 45—74 (r_max = 60; K = 0,32) das Tripeptidderivat durch Verdampfen des Lösungsmittels und Wegsublimieren des Ammoniumacetates bsi 45° im Hochvakuum als chromatographisch reine Verbindung. Kristalle aus Methanol-Wasser, F. 180—182°. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ergeben sich folgende Rf-Werte:

Rt (52)	8:2)	= 0,76
Rt (101)	= 0,78
Rf (CHCL-Methanol =	= 0,58.

schichtchromatographisch einheitlich. Sie weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:

Rf (52) = 0,60

Rf (101) = 0,61.

5. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Nle-OCHj

3,09 g BOC-D-Ser-Tyr-Gly-OH werden in einem Gemisch von 5 ml absolutem Dimethylformamid und

ίο 15 ml Acetonitril unter leichtem Erwärmen gelöst. Nach Abkühlen auf 10° wird eine Lösung von 1,23 g frisch hergestelltem Norleucinmethylester in 15 ml Acetonitril zugegeben. Sodann werden 2,04 g festes Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Die Lösung wird während einer Stunde bei 10° und während 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges Dicyclohexylcarbodiimid wird durch Zugabe von 1,4 ml Eisessig und eine Stunde Rühren bei Raumtemperatur zerstört. Man filtriert vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab und verdampft bei 50" Badtemperatur am Vakuum zur Trockne. Der Rückstand, ein gelbliches öl, wird in 200 ml Essigester gelöst, die Lösung mit 70 ml 1-n. Zitronensäurelösung, zweimal 70 ml 2-n. Natriui.ihydrogencarbonatlösung und zweimal 70 ml gesättigter Natriumchloridlösung extrahiert, über festem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das weiße, schaumige Rohprodukt wird aus Essigester-Petroläther kristallisiert und bei 50° am Hochvakuum getrocknet. 3,50 g, F. 138—142°; nach nochmaligem Kristallisieren F. 143—246°.

Es weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgenden Rf-Werte auf:

Rf (Benzol-Aceton = 1:1)= 0,18.
BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Nle-NH-NHj

4. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-OH

Man löst 685 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-OCH,, in 5 ml 1-n. Natronlauge, läßt während 10 Minuten bei 20° stehen und neutralisiert dann die Lösung durch Zugabe von 5 ml 1-n. Salzsäure. Das geschützte Tripeptid wird mit 50 ml wassergesättigtem n-Butanol extrahiert, die Butanolschicht viermal mit je 4 ml Wasser gewaschen und auf ca. 3 ml eingeengt. Durch Zugabe von 30 ml Petroläther erhält man eine schmierige Fällung, die aus Essigester kristallisiert werden kann (F. 168° [Zersetzung]). Die Substanz ist dünn-3,30 g BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Nle-OMe werden in 18 ml absolutem Äthylalkohol gelöst. Zur klaren, gelben Lösung werden 1,8 ml Hydrazinhydrat gegeben und die leicht trübe Lösung während 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das auskristallisierte Produkt wird abfiltriert und mit kaltem absolutem Äthanol gewaschen. Nach Trocknung bei Raumtemperatur über konzentrierter Schwefelsäure wird im Hochvakuum getrocknet: 1,4 g, F. = 152— 161°(Zers.).

Aus der Mutterlauge können durch Einengen, Filtrieren und Trocknen weitere 0,5 g F. 134,5—139° (Zersetzung) erhalten werden.

Nach Umkristallisieren aus Methanol-Äthanol = 1:1, F. 172—177° (Zersetzung).

Die Substanz kristallisiert aus wasserhaltigen Lösungsmitteln mit 1 Mol Kristallwasser. Chromatographisch einheitliche Substanz, Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel:

Rf (Chloroform-Methanol =1:1) = 0,64
Rf (Chloroform-Methanol =8:2)= 0,28

6. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Nle-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH

1,14 g (2 mMol) BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Nle-NHNHj, werden in 10 ml Dimethylformamid suspendiert und unter Rühren bei —15° mit 4 ml einer 2-n. Lösung von Chlorwasserstoff in Essigester und noch mit 0,23 g (2,2 mMol) tert.-Butylnitrit versetzt. Die Reaktionslösung wird weitere 10 Minuten bei —15° gerührt, und anschließend durch Zugabe von 1 ml Triäthylamin schwach basisch gestellt. Die so erhaltene

Lösung des BOC-i etrapeptid-a;:ids wird tropfenweise zu einer auf —10° gekühlten, Lösung von 1,42 g (1,6 mMol) H-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH in 30 ml Dimethylformamid und 1,5 ml Wasser gegeben. Das Reaktionigemisch wird 22 Stunden bei 0" gerührt, darauf mit 100 ml Wasser versetzt, und das ausgeschiedene amorphe Produkt wird abgenutscht, mit Dimethylformamid-Wasser (1: 5), Wasser und Acetonitril gewaschen und getrocknet. Nach Reinigung durch Umfallen aus wäßrigem Acetonitril und Äquilibierung mit Luftfeuchtigkeit werden 1,44 g (S9%) reines BOC-Dekapeptidtetrahydrat vom F. 235—240° erhalten; [a]f = —22° (c = 1 in Pyridin-Wasser 1: 1). Die Substanz zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende Rf-Werte:

Rf (52 A)
Rf (101)

== 0,3-0,4
= 0,6-0,7

7. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Nle-Glu(OtBu)-His
Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys-

(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-PrO-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

300 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-NIe-GIut(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH und 310 mg H-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden mit 6ml Pyridin, 0,5 ml Wasser und 0,15 ml 1-n. Salzsäure versetzt. Hierauf wird eine Lösung von 100 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 0,75 ml Pyridin zugesetzt und 5 Stunden bei 45—50° gerührt. Dann werden weitere 75 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und über Nacht bei 45° gerührt. Das Gemisch von Kondensationsprodukt und Dicyclohexyl-harnstoff wird gesamthaft durch Zugabe von 75 ml Wasser ausgefällt, abhltriert und getrocknet. Zur Abtrennung des Dicyclohexyl-harnstoffes wird es zweimal nacheinander heiß in Äthanol suspendiert, bzw. teilweise gelöst, und durch Zugabe von Benzol und Petroläther wieder gefällt. Das so vorgereinigte Material wird wie in Beispiel 1 beschrieben durch Gegenstromverteilung gereinigt. Nach 120 Verteilungsschritten im Lösungsmittelsystem Methanol - Puffer - Chloroform - Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4) [Puffer: 28,5ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in 960 ml Wasser] wird das reine, geschützte Tetrakosapeptid aus den Fraktionen 46—58 erhalten (Verteilungszahl K == 0,82). Bei Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten zeigt das geschützte Peptidderivat folgende Rf-Werte:

Rf (100) = 0,61

Rf (Chloroform-Methanol 75: 25) = 0,41

8. H-D-Ser-Tyr-Gly-NIe-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lysi-Lys-Lys-Lys-Pro-

Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH (essigsaures Salz)

Die Abspaltung dei Schutzgruppen aus dem geschützten Peptid und die Überführung des trifluoressigsauren in das essigsaure Sah: geschieht wie in Beispiel 1 beschrieben. Das freie Tetrakosapeptid zeigt bei der Papierelektrophorese (Pyridin-Acetat-Puffer, pH = 6,35; Laufzeit 1 Stunde; 2000 V) eine Laufstrecke von 8,5 cm gegen die Kathode. Bei der Dünnschichtchromatographie an Alurniniumoxyd weist die Verbindung im System 101 eine:n Rf-Wert von 0,41 auf.

Beispiel 5

Man löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumacetat, 2,5 mg Natriumchlorid und 2,0 mg D - Ser¹ - GIy^- £' i7,?b «ι-:". Corticotropin - hexaacetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. Die Lösung wird bei 120° 20 Minuten autoklaviert. Das pH ist nach der Sterilisation 3,7.

Beispiel 6

Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumchloridlösung 0,5 mg D-Ser^l-Gly³-Lys"-¹⁸-^_: ²¹-Corticotropin-hexaacetat und säuert die Lösung mit 0,1-n.Salzsäure auf pH 3,2 an. Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie in Beispiel 4 hitzesterilisiert.

Beispiel 7

In 0,8 ml destilliertem Wasser werden 7,05 ml

Glycin ' und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und

0,055 ml 0,1-n. HCl zugefügt. Anschließend wird

hexaacetat in der Lösung und mit destilliertem Wisser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise nitriert, in Ampullen abgefüllt und bei 120° 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.

Beispiel 8

In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von 10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml 1-n. Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0,1-n. Salzsäure hergestellt. In dieser Lö-

sung werden 4,0 mg D-Ser¹-Gly³-Lys¹⁷'^I8-^¹~²¹-Corticotropin-hexaacetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 120° 20 Minuten auto-

klaviert. Das pH beträgt 3.6.

Beispiel 9

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:

y^

tropin-hexaacetat 1,0 mg

ZnCl₂ 5,25 mg

NaHPO₄:2 H₂O 1,05 mg

NaCl 2,0 mg

Benzylalkohol 10,0 mg

NaOH ad pH 8,3

Dest. Wasser ad 1,0 ml

Beispiel 10

Man stelli eine Suspension aus folgenden Komponenten her:

D-Ser^l-Gly³-Lys¹⁷'¹⁸-/?'-²⁴-Cortico-

tropin-hexaacetat 1,0 mg

ZnCl₂ 6,30 mg

Na₂NPO₄ · 2 H₂O 1,26 mg

NaCI 1,5 mg

Benzylalkohol 10,0 mg

NaOH pH 8,3

Dest. Wasser ad 1-00 ml

Beispiel 11

Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von 0,5 mg D-Ser¹-Gly³-Lys^17>18-^^l~²⁴-Corticotropinhexaacetat, 5,25 mg ZnCl* 1,05 mg Na₂HPO₄ · 2 H₂O und 2,0 mg NaCl vom pH 3,0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wässerigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die soviel Natronlauge enthält, daß eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird.

Beispiel 12

Man stellt eine Trockenvial aus folgenden Komponenten her: I₅,

40

Beispiel 14

2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 39 600 werden in ca. 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so daß das pH der Losung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden dann s,C mg

Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml:

tropin-hexaacetat 2,0 mg

ZnSO₄ · 7 H₂O 5,0 mg

Na₃PO₄ · 12 H₂O 5,5 mg

Mannit 40,0 mg

Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 1 ml destilliertem Wasser vermischt. Man erhält eine Suspension vom pH 7,6.

Beispiel 13

5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 werden in 5 ml 0,1-n. Natronlauge gelöst. Man filtriert die Lösung, gibt eine Lösung von 2,5 mg D-Ser¹-Gly³-Lys^I7-^l8-/?^l-^2l-Corticotropinhexaacetat hinzu, säuert dann mit Essigsäure oder Salzsäure auf pH 4 an und füllt mit Wasser auf 10 ml auf. Dabei fällt ein Poly-L-glutaminsäure-D-Ser¹-Gly³-Lys¹⁷'¹⁸-/?¹-^!!4-Corticotropin-Komplex fein verteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg ^""-Corticotropin als Komplexverbindung.

yy^

tropin-hexaacetat 4,0 mg

Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg

Natronlauge bis pH 7,4

Merthiolat 0,02 mg

Aqua dest. ad 1,0 ml

Beispiel 15

Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her:

yy^

tropin-hexaacetat 2,0 mg

Gelatine 280,0 mg

Phenol 5,0 mg

dest. Wasser ad 1,0 ml

Beispiel 16

Eine steril filtrierte wässerige Lösung von D-Ser¹-GIy³ - Lys¹⁷·¹⁸ -ß¹-²* - Corticotropin - hexaacetat wird unter aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphophat und Natriumchlorid vermischt und in Vials abgefüllt und lyophilisiert, so daß ein Trokkenvials erhalten wird, das folgende Komponenten enthelt

und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem yy^

tropin-hexaacetat 0,2 mg

Natrium-Polyphloretinphosphat

(86,5 %ig) 23,20 mg

NaCl 12,28 mg

Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulie, vermischt.

Beispiel 17

In analoger Weise wie in den Beispielen 5—16 werden Präparate hergestellt, die als adrenocorticotrop wirksames Peptid D-Se^-Gly^Lys^-^-^-^-Corticotropin-Pro²⁴-amid, D-Ser¹-Gly³-Lys"-¹»-/J¹-^ie-Corticotropin-Lys¹⁸ - amid, D - Ser¹ - GIy³- Nie⁴ - Lys¹⁷·¹⁸-/3¹-²⁴ - Corticotropin, D - Ser¹ - GIy³ - Nie⁴ - Lys¹⁷·¹⁸-Z?¹-²¹-Corticotropin -Pro²⁴ -amid oder D-Ser¹-GIy³-NIe⁴ - Lj">¹⁷·¹⁸ - ß^l~^ia - Corticotropin - Lys¹⁸ - amid enthalten.

Claims (8)

als erste Aminosäure eine Aminosäure mit D-Kon-Patentansprüche: figuration aufweisen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind

1. Adrenocorticotrop wirksame Peptide gemäß adrenocorticotrop wirksame Peptide gemäß dem Hauptpatent 14 93 5J9 mit einer Kettenlänge 5 Hauptpatent mit eiuer Kettenlänge von 18—39 von 18—39 Aminosäuren und zum N-Terminus Aminosäuren und zum N-Terminus hin vollständiger hin vollständiger Sequenz der natürlichen Corti- Sequenz der natürlichen Corticotropine, in der jedoch cotropine, in der jedoch eine oder mehrere der eine oder mehrere der Aminosäuren in den Stellungen Aminosäuren in den Stellungen 1—5, 17, 18 1—5, 17, 18 und 25 in bekannter Weise gegen andere und 25 in bekannter Weise gegen andere ₁₀ L-a-Aminosäuren ausgetauscht sein können, die da-L-a-Aminosäuren ausgetauscht sein können, ihre durch gekennzeichnet sind, daß sie als erst? Amino-C-terminälen Amide sowie Säureadditionssalze säure D-Serin, als dritte Aminosäure Glycin und als und Komplexe dieser Verbindungen, dadurch 17- und 18-ständige Aminosäuren L-Lysin aufweisen, gekennzeichnet, daß sie als erste Amino- sowie ihre C-terminalen Amide, Säureadditionssalze säure D-Serin, als dritte Aminosäure Glycin und 15 und Komplexe und Verfahren zur Herstellung der als 17- und 18-ständige Aminosäuren L-Lysin auf- genannten Verbindungen.

weisen. Die neuen Verbindungen haben eine Kettenlänge

2. Peptide gemäß Anspruch 1 mit einer Ketten- von 18—39 Aminosäuren vom N-Terminus der natürlänge von 18—25 Aminosäuren. liehen adrenocorticotropen Hormone, z. B. von ß-Cor-

3. D-Seryl-L-tyrosyl-glycyl-L-methionyl-L-glut- 20 ticotropin (Schwein), Corticotropin A (Schwein), Coramyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypticotropin (Rind), Λ-Corticotropin (Schaf). Insbesontophyl - glycy 1 - L - Iysyl - L - prolyl - L - valyl - glycy 1- dere weisen sie eine Kettenlänge von 18—29 oder 39, L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl- vorzugsweise 18—25, vor allem 24 Aminosäuren aut. L-Iysyl-L-valyl-tyrosyl-L-prolin, seine Säureaddi- Außer den definierten können noch weitere, bekannte tionssalze und Komplexe. 35 Abweichungen von der Sequenz der natürlichen

4. D-Seryl-L-tyrosyl-glycyl-L-methionyl-L-glut- adrenocorticotropen Hormone vorhanden sein. So amyl-L-histidyl-L-phenylaianyi-L-arginyl-L-trypto- kann insbesondere die vierte N-terminale Aminosäure phyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L- valyl - glycy 1-L- durch L-Norvalin oder L-Norleucin, die fünfte Aminolysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-Iysyl-L-prolyl-L-valylsäure durch L-Glutamin, die 25. Aminosäure durch L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolinamid, seine Säure- 30 L-Valin ersetzt sein. Besonders hervorzuheben in additionssalze und Komplexe. bezjg auf ihre adrenocorticotrope Wirkung sind

5. D-Seryl-L-tyrosyl-glycyl-L-methionyl-L-glut- D-Ser'-Gly^Lys'^^-^'-^-Corticotropin-Lys^-amid, amyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryp- D-Ser'-Gly'-Lys¹⁷·¹⁸-/?¹-^-Corticotropin und D-Ser¹-tophyl - glycyl - L - Iysyl - L - prolyl - L - valyl - glycyl- Gly'-Lys¹⁷· ^ΙΒ-β^τ "²⁴-Corticotropin-Pro^Z4-amid. L-Iysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid, seine Säure- 35 Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von additionssalze und Komplexe. therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Saksäure,

6. D-Seryl-L-tyrosyl-glycyl-L-norleucyl-L-glut- Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie amyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryp- Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen, tophyl - glycyl - L - Iysyl - L - prolyl - L - valyl - glycyl- Unter Amiden sind insbesondere Peptidamide, in L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-Iysyl-L-prolyl-L-valyl- 40 denen die C-terminale Carboxylgruppe amidiert ist, L - Iysyl - L - valyl - tyrosyl - L - prolin, seine Säure- zu verstehen.

additionssalze und Komplexe. Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer

7. Komplexe der Peptide gemäß einem der An- Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu sprüche 1—6, mit Zinkphosphat, Zinkpyrophos- verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer phat und/oder Zinkhydroxyd. 45 oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirk-

8. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit samen Peptiden entstehen und vor allem diejenigen, ACTH-Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß die ihnen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche man in an sich bekannter Weise Peptide mit einer anorganischen Stoffe sind Verbindungen, die sich von Kettenlänge von 18—39 Aminosäuren und zum Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, N-Terminus hin vollständiger Sequenz der natür- 50 Cobalt und insbesondere von Zink, ableiten, vor liehen Corticotronine, in der jedoch eine oder allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyromehrere der Aminosäuren in den Stellungen 1—5, phosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle. Orga-17, 18 und 25 in bekannter Weise gegen andere nische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung her-L-a-Aminosäuren ausgetauscht sein können, und vorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, die als erste Aminosäure D-Serin, als dritte Amino- 55 ζ. B. Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carbsäure Glycin und als 17- und 18-ständige L-Lysin oxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosaufweisen, oder ihre C-terminalen Amide aus den phorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenoen{sprechenden geschützten Peptiden hergestellt len und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosund, wenn erwünscht, die Verbindungen in ihre phat und Phyiinsäure, sowie Polymerisate und Co-Säureadditionssalze oder Komplexe überführt. 60 polymerisate von Aminosäuren, z. B. Protamin und

insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutamin-