CH670830A5

CH670830A5 -

Info

Publication number: CH670830A5
Application number: CH5230/86A
Authority: CH
Inventors: Aniko Horvath; Gyoergy Keri; Tamas Gulyas; Istvan Teplan; Sandor Vigh; Gyoergyi-Major Boekoenyi
Original assignee: Innofinance Altalanos Innovaci
Priority date: 1986-01-03
Filing date: 1986-12-29
Publication date: 1989-07-14
Also published as: FI85866C; NL8603291A; JPS62228099A; SE8700016L; GB2185025B; SE8700016D0; GB8700017D0; GB2185025A; HUT43090A; IT8719002A0; FR2595705B1; FI865347A; BE906056A; FR2595705A1; FI85866B; US4758552A; IT1216835B; JPH0631314B2; ES2004036A6; HU194913B

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft neue, in 6-Stellung eine aromatische Aminocarbonsäure enthaltende Gonadoliberin-Deriva-te und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Die neuen Verbindungen entsprechen der allgemeinen Formel (I)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X,-X2-X3-Pro-X4 (I),

worin

X] für den Rest von ortho-Aminobenzoesäure oder me-ta-Aminobenzoesäure,

X2 für Leucyl-, Tryptophyl- oder Phenylalanylgruppe,

X3 für Arginyl-, Leucyl- oder Glutaminylgruppe und

X4 für Glycylamid- oder Alkylamidgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht.

Die neuen Verbindungen sind demnach Nonapeptidal-kylamide beziehungsweise Dekapeptidamide. Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Salze dieser Verbindungen.

Die in den Formeln verwendeten Abkürzungen entsprechen der in der Peptidchemie akzeptierten Nomenklatur, wie sie zum Beispiel in J. Biol. Chem. (241, 527 [1966]) definiert ist. Die in der Beschreibung vorkommenden Abkürzungen haben dementsprechend folgende Bedeutung:

x -x-

Gip: Pyroglutaminsäure

(Pyroglutamyl)

His: Histidin

(Histidyl)

Trp: Tryptophan

(Tryptophyl)

Ser: Serin

(Seryl)

Tyr: Tyrosin

(Tyrosyl)

Gly: Glycin

(Glycyl)

Phe: Phenylalanin

(Phenylalanyl)

Leu: Leucin

(Leucyl)

Pro: Prolin

(Prolyl)

Glu: Glutaminsäure

(Glutamyl)

Gin: Glutamin

(Glutaminyl)

Arg: Arginin

(Arginyl)

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Mab: m-Aminobenzoesäure Aa: Anthranilsäure Boc: tert.-Butyloxycarbonyl Bzl: Benzyl

DCC: Dicyclohexylcarbodiimid DCU: Dicyclohexylcarbamid DIC: Diisopropylcarbodiimid DMF: Dimethylformamid DNP: Dinitrophenyl EA: Äthylamid Et: Äthyl

HPLC: Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie

Me: Methyl

ONP: o-Nitrophenyl

OPCP: Pentachlorphenyl

TEA: Triäthylamin

TFA: Trifluoressigsäure

THF: Tetrahydrofuran

TLC: Dünnschichtchromatographie

Tos: Tosyl

UV: Ultraviolett

Z: Benzyloxycarbonyl

Es ist eine allgemeine Eigenschaft des Gonadoliberins (Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2; in der Fachliteratur auch als Gonadotropin releasing Hormon, GnRH sowie als das luteinisierende und follikelstimulierende Hormon freisetzendes Hormon, LH/FSH-RH, bezeichnet) und seiner bekannten Derivate, das luteinisierende und das follikelstimulierende Hormon (LH und FSH) freizusetzen.

Zu Beginn der Achtziger Jahre wurde bekannt, dass sich die Struktur des Gonadoliberins gewisser Fische und Vögel von der Gonadoliberinstruktur der Säugetiere unterscheidet (J.A. King und R.P. Miller, J. Biol. Chem. 257, 10722-28

[1982]; South-African Journal of Science 78, 124 [1982]; N. Sherwood et al., Proc. Nati. Acad. Sei. 80, 2794—2798

[1983]). Diese Abweichungen betreffen im Falle der Vögel die Aminosäure in 8-Stellung, im Falle der Fische die Aminosäure in 7- bzw. 8-Stellung.

Aus der Literatur ist auch bekannt, dass die Gonadolibe-rin-Derivate, die in 6-Stellung statt des Glycins eine D-Ami-nosäure mit hydrophober aliphatischer oder aromatischer Seitenkette enthalten, eine verglichen mit Gonadoliberin stärkere Wirkung zeigen (J. Sandow et al., Control of Ovulation, Butterworth, London, 1978, S. 49-70; A.V. Schally, D.H. Coy, C.A. Meyers, Ann. Rev. Biochem. 47, 89-128 [1978]).

Es ist ferner bekannt, dass die biologische Wirkung des Gonadoliberins noch erhöht werden kann, wenn man die Glycinamidgrupoe in 10-Stellung durch eine aliphatische Amidgruppe ersetzt (M. Fujino et al., J. Med. Chem. 16, 1144-1147 [1973]).

Momany (F.A. Momany, J. Amer. Chem. Soc. 98, 2990-2996 [1976] und J. Amer. Chem. Soc. 98, 2996-3000 [1976]) untersuchte den Energieinhalt der unterschiedlichen möglichen Konformationen des Dekapeptids und wies nach, dass der niedrigste Energieinhalt bei einer räumlichen Anordnung auftritt, in der das Molekül bei dem Glycin oder D-Alanin in 6-Stellung U-förmig gebogen ist (ß-turn). Von anderen Forschern (R.M. Freidinger, D.F. Veber, P.D. Schwenk, J.R. Brooks, R. Saperstein, Science 210, 656-658 [1980]) wurde ein GnRH-Derivat (Formel IV) synthetisiert, in dem diese Raumstruktur durch Austausch des Glycins in 6-Stellung gegen y-Lactam fixiert wurde.

Glp-His-T rp-Ser-Tyr-NH 0— C

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H^N-Gly-Pro-Ag-C-CH

II I

O CH,

/•

CH.

h3c

"CH,

(IV)

Verglichen mit nativem Gonadoliberin hat die Verbindung eine grössere biologische Aktivität.

Ziel der Erfindung war es, neue Gonadoliberin-Derivate bereitzustellen, die eine vorteilhaftere biologische Wirkung 20 zeigen als die bekannten Verbindungen und nicht nur im Falle von Säugetieren, sondern auch zur Vermehrung anderer Gattungen, zum Beispiel Fischen, Reptilien usw. geeignet sind.

Ein weiteres Ziel der Erfindung war die Ausarbeitung ei-25 nes Verfahrens, mit dem an Stelle des in 6-Stellung befindlichen Glycins eine Aminosäure eingebaut werden kann, die nicht nur die vorteilhafteste Raumstruktur fixiert, sondern daneben auch den die biologische Wirkung steigernden aromatischen Ring enthält und nicht zur Racemisierung neigt. 30 Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass dieses Ziel erreicht werden kann, wenn an die Stelle der in 6-Stellung befindlichen Glycingruppe des Gonadoliberins ortho-Ami-nobenzoesäure (Anthranilsäure) oder meta-Aminobenzoe-säure eingebaut wird. Im ersteren Fall entsteht die Verbin-35 dung (V), im letzteren die Verbindung (VI):

Glp-His-T rp-Ser-Tyr-NH

40

HgN-Gly-Pro-Arg-Leu-C

Ö

45 Glp-His-Trp-Ser-Ty r-NH

HpN-Gly-Pro-Arg-Leu-C

. s

(V)

(VI)

Die Erfindung beruht weiterhin auf der Erkenntnis, dass die Wirkung dieser Gonadoliberin-Derivate noch weiter ge-55 steigert werden kann, wenn man die in 10-Stellung befindliche Glycinamidgruppe gegen eine Alkylamidgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen austauscht.

Schliesslich beruht die Erfindung auf der Erkenntnis,

dass durch Austausch der im Gonadoliberin in 8-Stellung beziehungsweise in 7- und 8-Stellung befindlichen Aminosäuren gegen gewisse andere Aminosäuren Gonadoliberin-Derivate hergestellt werden können, die nicht nur zur Vermehrung von Säugetieren, sondern auch zur Vermehrung anderer Gattungen geeignet sind.

Gegenstand der Erfindung sind demnach neue Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel (I)

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Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xi-X2-X3-Pro-X4

(I)

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- worin die Bedeutung von Xb X2, X3 und X4 die gleiche wie oben ist - und die Salze dieser Verbindungen. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen. Gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren werden a) unter Anwendung entsprechender Kombinationen von schrittweiser Kondensation und Fragmentkondensation die gegebenenfalls geschützten Aminosäuren kondensiert und dann die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen entfernt oder b) unter Anwendung der Methode der Peptidsynthese an einer festen Phase die gegebenenfalls geschützten Aminosäuren in der entsprechenden Reihenfolge zweckmässig mittels Carbodiimid- oder Aktivesterkopplung schrittweise an einen festen Träger kondensiert, das Endprodukt sauer oder basisch von dem festen Träger abgespalten und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen vor, während oder nach dem Abspalten vom Träger entfernt.

Von den Kombinationen gemäss a) ist folgende besonders vorteilhaft: das Pentapeptidazid der Formel (II)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 (II)

wird mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel (III)

X1-X2-X3-Pro-X4 (III)

- worin die Bedeutung von Xj, X2, X3 und X4 die gleiche wie oben ist - kondensiert.

Gemäss der Variante b) werden als fester Träger zweckmässig Benzhydrylaminharz oder chlormethylierte Polystyrolharze verwendet. Das Schutzgruppen enthaltende Produkt wird zweckmässig mit Fluorwasserstoff oder durch Äthylammonolyse vom Träger abgespalten.

Die erhaltenen Nona- beziehungsweise Dekapeptidamide können gewünschtenfalls mit physiologisch verträglichen Säuren zu Säureadditionssalzen umgesetzt werden. Gewünschtenfalls kann aus den Säureadditionssalzen die Base freigesetzt werden.

Die Erfindung betrifft auch für Heilzwecke und/oder vermehrungsbiologische Zwecke geeignete Kompositionen. Diese werden in an sich bekannter Weise hergestellt, zum Beispiel indem man Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder ihre Säureadditionssalze mit den üblichen Träger-, Streck- und sonstigen Hilfsstoffen vermischt und zu für Heilzwecke und/oder vermehrungsbiologische Zwecke geeigneten Präparaten formuliert.

Die Gonadoliberin-Derivate der allgemeinen Formel (I) werden Rindern in Dosen von 5-200 |rg intramuskulär, subcutan oder intravenös injiziert. Für Fische beträgt die als intramuskuläre oder subcutane Injektion verabreichte Dosis 0,1-100 ng.

Die Hauptvorteile der Erfindung sind folgende:

a) Die erfindungsgemässen neuen Gonadoliberin-Derivate sind, wie mit Rindern und Fischen vorgenommene vermehrungsbiologische Versuche ergaben, wirksamer als die bisher bekannten Gonadoliberin-Derivate.

b) Die in 6-Stellung befindliche Aminobenzoesäure enthält kein Symmetriezentrum, d.h. es kann zu keiner Race-matbildung kommen. Dadurch ist das Herstellungsverfahren einfacher und billiger.

c) o- und m-Aminobenzoesäure sind wesentlich billiger herstellbar als die in den bisher bekannten Gonadoliberin-Derivaten die gleiche Funktion ausübenden D-Aminosäu-ren.

d) Im Falle der Variante a) können sämtliche Endprodukte aus einem einzigen Intermediär, nämlich dem Pentapeptid der Formel (II), hergestellt werden.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Die dünnschichtchromatographischen RrWer-te wurden an Kieselgel (DC Alufolie, Merck) mit folgenden

Lösungsmittelgemischen bestimmt:

1. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 30:20:6:11

2. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 60:20:6:11

3. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 120:20:6:11

4. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 240:20:6:11

5. n-Butanol-Essigsäure-Wasser-Äthylacetat 1:1:1:1

6. n-Butanol-Essigsäure-Wasser 4:1:1

7. i-Propanol-Essigsäure (einmolar) 2:1

8. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 5:5:1:3

9. Aceton-Toluol 1:1

10. Chloroform-Essigsäure 24:2

11. Methyläthylketon-Pyridin-Wasser 65:15:20

12. Chloroform-Methanol-Essigsäure 85:10:5

13. n-Butanol-Eisessig-Ammoniak-Wasser

(1 Vol. conc. NH4OH, 4 Vol. Wasser) 6:1:1:2

Beispiel 1

[Aa6, Gin8, clesGly'"]-gonadoliberinäthylamid a) Boc-His(DNP)-Trp~OMe (M = 622,62)

21,12 g (50 mMol) Boc-His(DNP)-OH werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 C gekühlt und unter Rühren mit 10,32 g (50 mMol) Dicyclohexylcar-bodiimid und 7,66 g (50 mMol) N-Hydroxybenztriazol versetzt. Das Gemisch wird bei 0 °C 10 Minuten lang gerührt und dann das ausgefallene Dicyclohexylcarbamid abfiltriert.

12, 74 g (50 mMol) H-Trp • OMe • HCl werden in 70 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 °C gekühlt und mit 6,94 g (50 mMol) Triäthylamin versetzt. Man rührt 5 Minuten und filtriert dann vom ausgefallenen Triäthyl-amin-hydrochlorid ab.

Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei 0 °C gerührt. Anderntags wird das ausgefallene DCU abfiltriert und die Lösung zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 500 ml Äthylacetat gelöst, und die Lösung wird dreimal mit 100 ml eiskalter einmolarer Kaliumhydrogensulfatlösung, dann fünfmal mit gesättigter Natri-umhydrogencarbonatlösung und schliesslich zweimal mit 100 ml 10%iger Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und dann zur Trockne eingedampft. Die kristalline Substanz wird aus Äthylacetat unter Zugabe von Petroläther umkristallisiert. Man erhält 27,70 g (89%) der Titelverbindung, die bei 119-122 °C schmilzt, [aß2 = +14,1 (c = 1, DMF) R4f = 0,62; R5f = 0,41.

b) H-His(DNP)-Trp-OMe ■ 2HCI

Molekulargewicht der freien Base: 522,49

Molekulargewicht des Dihydrochlorids: 595,41

24,9 g (40 mMol) des Dipeptids Boc-His(DNP)-Trp-OMe werden in 100 ml Methanol gelöst und zu der Lösung 100 ml 4n methanolische Salzsäure gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen, wobei das Dipeptidesterhydrochlorid ausfällt. Es wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute: 21,91 g (92%), Schmp.: 198-202 "C. [a]2ß = 0,49 (c= 1, DMF), Rj? = 0,46; Rf = 0,18.

c) Glp-His(DNP) -Trp-OMe (M = 633,60)

4,85 g (36,8 mMol) L-Pyroglutaminsäure, 7,58 g Dicy-clohexylcarbodiimid und 5,63 g N-Hydroxybenztriazol werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird bei 5-10 °C 10 Minuten lang gerührt, dann wird das ausgefallene DCU abfiltriert.

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20,84 g (35 mMol) H-His(DNP)-Trp-OMe • 2HC1 werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung 9,72 ml (70 mMol) Triäthylamin gegeben. Nach 5 Minuten Rühren wird das Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert. Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anderntags wird das Gemisch mit 90 ml Aceton versetzt, die sich ausscheidende unlösliche Substanz wird abfiltriert. Die durch Verdampfen des Filtrâtes erhaltene ölige Substanz wird mit Äthylacetat verrieben, filtriert und dann getrocknet. Nach dem Trocknen werden die Kristalle dreimal mit 25 ml Wasser gewaschen und erneut getrocknet. Die Substanz kann durch Auflösen in kochendem Äthylacetat und Abkühlen der Lösung umkristallisiert werden. Ausbeute: 18,42 g (83,1%), Schmp.: 148-151 "C, [a]% = +5,2° (c=l, DMF), R? = 0,53; Rj = 0,38.

d) Glp-His-TrP-OMe (M = 466,50)

15,84 g (25 mMol) des geschützten Tripeptids Glp-His(DNP)-Trp-OMe werden in einem Gemisch aus 100 ml Dimethylformamid und 40 ml Wasser gelöst. Zu der Lösung werden 4 ml Mercaptoäthanol gegeben, und der pH-Wert wird mit Triäthylamin auf 8 gestellt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Die Substanz wird in wenig Methanol gelöst und durch Zusatz von Äther umkristallisiert. Ausbeute: 10,92 g (93,6%), [a]2è = +4,04° (c=0,42, DMF), RM,30

e) Glp-His-Trp-N2H3 (M=466,51)

9,33 g (20 mMol) des Tripeptids Glp-His-Trp-OMe werden in 250 ml Methanol gelöst und zu der Lösung 20 ml 98%iges Hydrazinhydrat gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 40 °C 3 Stunden lang, bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, am nächsten Tag wird das Produkt abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute: 7,58 g (81,2%), Schmp.: 166-169 °C, [a]2g = -22,3° (c=0,5, DMF) Rf = 0,50; R} = 0,14.

f) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe (M = 716,8)

7,0 g (15 mMol) Glp-His-Trp-N2H3 (Produkt des -Schrittes e) werden in 60 ml DMF gelöst und zu der auf 0 °C gekühlten Lösung unter Rühren 7,5 ml (45 mMol) 6 n Salzsäure gegeben. Dann werden langsam 1,035 g (15 mMol) Natriumnitrit in Form einer wässrigen gesättigten Lösung zugetropft. Das Gemisch wird bei 0 °C weitere 15 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 4,78 g (15 mMol) H Ser-Tyr-OMe • HCl in 15 ml DMF versetzt. Der pH-Wert wird mit 6,25 ml (45 mMol) Triäthylamin neutral gestellt, das Gemisch bei 0-4 °C über Nacht gerührt und anderntags im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das ölige Produkt wird mit Äther verrieben. Man erhält 12,1 g (100%) einer pulverförmigen Substanz, deren Chromatogramm zwar zwei geringfügige Verunreinigungen ausweist, die jedoch ohne weitere Reinigung zu dem gut kristallisierenden Hydrazid umgesetzt werden kann. Eine aus Methanol umkristallisierte Kontrollprobe der Substanz hat folgende physikalische Parameter: Schmp.: 188-190 °C, [a]2£ = -3,48° (c= 1, DMF), R/ = 0,58; R? = 0,26.

g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 (M = 716,8)

12 g roher, pulverisierter Pentapeptidester Glp-His-Trp-Ser-Tyr- OMe werden in 200 ml Methanol gelöst und zu der Lösung 10 ml 98%iges Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Kristalle werden abfiltriert und im Exsikkator über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Die getrocknete kristalline Substanz wird in 250 ml 0,5 n Salzsäure gelöst. Die Lösung wird mit gesättigter Natriumcarbonatlösung auf pH 8 gestellt und bei 0 °C 2 Stunden lang stehengelassen. Dann werden die Kristalle abfiltriert, mit eiskaltem Wasser gewaschen und schliesslich getrocknet. Ausbeute: 6,12 g (auf beide Schritte bezogen 56,9%), Schmp.: 205-206 °C. [apß = 21,51° (c= 1, DMF), Rf1 = 0,39; Rf2= 0,14 Hydrazinstickstoff: berechnet: 3,91%

gefunden: 3,79%, 3,76%

h) H-Gln-Pro-NHEt ■ TFA (M = 367,3) (Boc: 370,49) 10 g (70 mMol) Prolinäthylamid (erhalten durch Hydrieren von 72 mMol Z-Pro-NHEt) werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit Triäthylamin auf pH 8 gestellt und mit der Lösung von 32 g (87 mMol) Boc-Gln-ONP in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Das zurückbleibende Öl wird in 50 ml 30%iger, mit Dichlor-methan bereiteter TFA-Lösung aufgelöst und die Lösung bei Raumtemperatur 20 Minuten lang stehengelassen. Dann wird im Vakuum eingedampft und das zurückbleibende Öl mit Äther verrieben. Ausbeute: 15,9 (62%), Schmp.: nicht messbar (stark hygroskopische Substanz) [a]2o = —44,4° (c= 1, Methanol), Rf1 = 0,32; R/ = 0,37, R'f3 = 0,21.

i) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt (M = 518,57)

7 g (26 mMol) H-Gln-Pro-NHEt • TFA werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 °C gekühlt und mit Triäthylamin auf pH 8 gestellt. Nach Zugabe der Lösung von 14 g (27,3 mMol) Z-Leu-pentachlor-phenylester in 40 ml Dimethylformamid wird das Gemisch bei +4 °C über Nacht gerührt. Anderntags wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand in 70 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird dreimal mit 15 ml kalter, 0,01 n Natronlauge, dann dreimal mit 15 ml Wasser extrahiert. Sämtliche Extrakte werden vereinigt und zweimal mit 10 ml Äthylacetat ausgeschüttelt. Die organischen Phasen werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, die Festsubstanz abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 10,4 g (77%), Schmp.: 84-88 °C, [a]2ß = -32,8° (c= 1, Methanol), Rf = 0,90.

j) H-Leu-Gln-Pro-NHEt • HBr (M = 465,5)

7,6 g (14,6 mMol) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt werden in 50 ml Eisessig gelöst und zu der Lösung 70 ml 4n eisessigsaurer Bromwasserstoff gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 90 Minuten lang stehengelassen und dann unter Rühren langsam in 800 ml eiskalten Äther einfliessen gelassen. Es wird 30 Minuten lang nachgerührt und dann der Niederschlag abfiltriert. Das Produkt wird im Exsikkator über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute: 7,9 g,

Schmp.: 147 °C, [a]2ß = —72,8° (c = 1, 2n Essigsäure), Rf2 = 0,30; R¥ = 0,82.

k) Boc-anthranilsäure (M = 237,27)

Die Lösung von 4 g (30 mMol) Anthranilsäure in 20 ml Dimethylformamid wird mit Triäthylamin auf pH 8 gestellt, mit 9 g tert.-Butyloxycarbonat versetzt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird eingedampft und das zurückbleibende viskose Öl in 50 ml Äthylacetat gelöst. Die organische Phase wird dreimal mit 20 ml eiskalter 0,01 n Schwefelsäure und dann dreimal mit 20 ml Wasser gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende viskose Öl kristallisiert im Kühlschrank. Ausbeute: 5,7 g (80%),

Schmp.: 91-93 °C, Rf> = 0,87; R'f°= 0,79.

I) Boc-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt (M = 603,85)

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Die Lösung von 2,3 g (5 mMol) H-Leu-Gln-Pro-NHEt • HBr in 10 ml DMF wird auf 0 °C gekühlt und mit Triäthylamin auf pH 8 gestellt. Dann werden zu der Lösung 750 mg (5,5 mMol) N-Hydroxybenztriazol, 1,1 g (5,5 mMol) DCC und schliesslich langsam, tropfenweise die Lösung von 1,3 g (5,5 mMol) Boc-anthranilsäure in 5 ml DMF gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Nach Abfiltrieren vom ausgeschiedenen DCU wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Äthylacetat gelöst und dreimal mit 20 ml 10%iger Citronensäure, dreimal mit 20 ml Wasser, dreimal mit 20 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlö-sung und schliesslich mit 20 ml gesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben. Die sich abscheidende blassgelbe, pulverförmige Substanz wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Ausbeute: 2,4 g (80%), Schmp.: 119— 121 °C,R?= 0,91

Aminosäureanalyse: Gin 0,97, Pro 1,03, Leu 1,00, Aa 0,92.

m) H-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt ■ TFA (M = 599,63)

603 mg (1 mMol) Boc-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt werden in 10 ml einer mit Dichlormethan bereiteten 30%igen TFA-Lösung gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Die Trifluoressigsäure wird im Vakuum schnell entfernt, der Rückstand wird mit Äther verrieben und getrocknet. Ausbeute: 515 mg (86%), Rf= 0,52.

n) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt (M = 1188,48)

358 mg (0,5 mMol) des gemäss Schritt g) hergestellten Pentapeptids Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 °C gekühlt und unter Rühren mit 0,34 ml 6n Salzsäure und dann tropfenweise mit der konzentrierten wässrigen Lösung von 37,7 mg Natriumnitrit versetzt. Nach 5 Minuten wird dem Gemisch eine auf 0 °C gekühlte Lösung zugesetzt, die aus 230 mg (0,5 mMol) des Tetrapeptids H-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt, 1 ml Dimethylformamid und 0,34 ml Triäthylamin hergestellt wurde. Erforderlichenfalls wird das Gemisch mit Trifluoressigsäure neutralisiert, dann bei 0 °C 2 Stunden lang gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule (2 x 95 cm) mit 0,2 n Essigsäure chromatographisch gereinigt. Die Abtrennung wird durch bei 280 nm gemessene UV-Absorption und dünnschichtchromatographisch verfolgt. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Ausbeute: 315 mg (52%), Rf5= 0,58; Rf7= 0,83; Rf= 0,72 Aminosäureanalyse: Ser 0,91, Gin 2,03, Pro 0,95, Leu

1,00, Tyr 1,10, His 1,02, Trp 0,81,

Aa 0,95

Beispiel 2

[AaP, desGlyw]-gonadoliberinäthylamid a) Z-Arg(N02)-Pro-NHEt (M = 465,47)

Zu der Lösung von 3,24 g (22,8 mMol) Prolinäthylamid in 70 ml Tetrahydrofuran werden 7,33 g (20,7 mMol) Z-Arg(N02)-0H und 1,034 g N-Hydroxybenztriazol gegeben. Das Gemisch wird unter Eiskühlung mit der Lösung von 5,34 g (25,9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Tetrahydrofuran versetzt und dann 5 Stunden lang unter Eiskühlung weitere 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gekühlt. DCU wird abfiltriert und mit Tetrahydrofuran gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst und die Lösung dreimal mit 35 ml eines im Verhältnis 1:5 bereiteten Gemisches aus konz. Ammoniak und Wasser, dann zweimal mit 20 ml Wasser, dann dreimal mit 35 ml n Salzsäure und schliesslich noch zweimal mit 20 ml Wasser 5 gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert, das Trockenmittel noch mit Chloroform nachgewaschen und dann die Chloroformlösung eingedampft. Der Rückstand wird in einem Gemisch aus 35 ml THF und 50 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung fil-io triert und der Filterrückstand mit 30 ml eines im Verhältnis 1:2 bereiteten Gemisches von Tetrahydrofuran und Äthylacetat gewaschen und dann die organische Phase eingedampft. Zu dem zurückbleibenden festen Schaum werden 100 ml Diäthyläther gegeben. Das Produkt wird abfiltriert, 15 mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 9,69 g (98%), Schmp.: 125 °C, [a]2g = -42,5° (c = 1 Methanol), Rf3 = 0,5; R'f = 0,72

b) Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NHEt (M = 578,65) 20 5,6 g (11,73 mMol) des geschützten Dipeptidäthylamids Z-Arg(N02)-Pro-NHEt werden in 30 ml Eisessig gelöst. Zu der Lösung werden 55 ml 4 n eisessigsaurer Bromwasserstoff gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 90 Minuten lang stehengelassen, dann mit 250 ml wasserfrei-25 em Äther versetzt und erneut eine Stunde lang stehengelassen. Die Lösung wird vom ausgefallenen Feststoff dekantiert, und zu dem Rückstand werden 100 ml Äther gegeben. Nach 15 Minuten wird filtriert. Das Produkt wird mit reichlich Äther gewaschen und dann im Vakuum über Phosphor-30 pentoxyd und Natriumhydroxyd getrocknet. Man erhält 6,44 g einer etwas hygroskopischen Substanz.

6,04 g (11,0 mMol) des erhaltenen Dipeptidäthylamid-hydrobromids werden in 150 ml Chloroform suspendiert und zu der Suspension 5,5 ml Triäthylamin gegeben. Die 35 Substanz beginnt in Lösung za gehen. Um das zu beschleunigen, werden weitere 2,5 ml Triäthylamin zugegeben. Anschliessend lässt man die mit 65 ml Chloroform bereitete Lösung von 6,4 g Z-Leu-OPCP in das Reaktionsgemisch ein-fliessen und rührt das Gemisch über Nacht. Das Gemisch 40 wird mit n Salzsäure, mit gesättigter Kochsalzlösung, mit 2 n Ammoniak und schliesslich erneut mit gesättigter Kochsalzlösung extrahiert. Dann wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Die Festsubstanz wird 45 abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 5,5 g (84,6%) Rohprodukt.

Das geschützte Tripeptidäthylamid wird unter leichtem Erwärmen in 30 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 50 Aktivkohle geklärt, die abfiltrierte Kohle wird zweimal mit 10 ml Äthylacetat gewaschen. Das Filtrat wird in Portionen mit 75 ml Diäthyläther versetzt. Ein Öl scheidet sich aus, das schnell fest wird. Nach zwei Stunden wird das Produkt abfiltriert, zuerst mit einem im Verhältnis 2:3 bereiteten Gemisch 55 aus Äthylacetat und Äther, dann mit reinem Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 4,7 g (74,3%), Schmp.: 116-118 °C, [a]2ß = 57,0° (c=l, Methanol), Rf3 = 0,74; Rf4= 0,49.

60 c) H-Leu-Arg(N02)-Pro-NHEt ■ HBr (M = 537,4)

1,18 g (2 mMol) des Tripeptids Z-Leu-Arg-(N02)-Pro-NHEt werden in 10 ml eisessigsaurem Bromwasserstoff gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt und dann mit 100 ml wasserfreiem Äther verrieben. 65 Nach dem Filtrieren wird die gelbliche, pulverförmige Substanz im Exsikkator getrocknet. Man erhält in einer Menge von 1,30 g ein blassgelbes, hygroskopisches Produkt. R2f = 0,14.

7

670 830

d) Boc Aa-OPFP (M = 403,32)

Zu der auf 0 C gekühlten Lösung von 2,4 g (10 mMol) Boc-anthranilsäure in 20 ml THF wird unter Rühren die Lösung von 2,2 g ( 11 mMol) DCC und 2,0 g Pentafluorphenol in 10 ml Tetrahydrofuran gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 0 C 3 Stunden lang, bei Raumtemperatur über Nach gerührt. Die Lösung wird filtriert und der Rückstand in 30 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird dreimal mit 10 ml eiskalter 10%iger Citronensäure, dreimal mit 10 ml kaltem Wasser, dreimal mit 10 ml gesättigter Natriumhydro-gencarbonatlösung und schliesslich noch dreimal mit 20 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das verbleibende Öl kristallisiert bei +4 °C. Ausbeute: 3,06 g (76%), Rf> = 0,90; R'f = 0,85.

e) Boc~Aa-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt (M = 675,75)

1,07 g des Tripeptidsalzes H-Leu-Arg(N02)-Pro-NHEt • HBr werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 °C gekühlt und mit der Lösung von 0,28 ml (2 mMol) Triäthylamin und 806 mg (2 mMol) Boc-Aa-OPFP in 5 ml Dimethylformamid versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit TEA auf 8 eingestellt. Man lässt die Lösung sich erwärmen und rührt bei 20 °C 48 Stunden lang, wobei man den pH-Wert mit TEA bei etwa 8 hält. Das Dimethylformamid wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 50 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird dreimal mit 20 ml 10%iger Citronensäure, dreimal mit 20 ml Wasser, dreimal mit 20 ml gesättigter Natriumhydrogencarbo-natlösung und schliesslich noch mit 20 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird mit Äther verrieben und das feste Produkt abfiltriert. Ausbeute: 1,05 g (77,8%), R?= 0,90; R^= 0,91; R'f°= 0,96.

f) Boc-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt (M = 630,74)

1,0 g (1,5 mMol) des Tetrapeptids Boc-Aa-Leu-Arg-(N02)-Pro-NHEt wird in 50 ml 50%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 400 ml 10%iger Palladiumaktivkohle 4 Stunden lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Ausbeute: 779 mg (82,5%), R/= 0,45.

g) H-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt ■ (TFA)2 (M = 724,67)

630 mg (1 mMol) des Tetrapeptids Boc-Aa-Leu-Arg-

Pro-NHEt werden in 5 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt, dann die Trifluoressigsäure im Vakuum schnell entfernt und der Rückstand mit Äther verrieben. Das Produkt wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 648,5 mg (89,5%), Rf = 0,34; Rf= 0,76.

h) Glp-His-Trp -Ser-Tyr-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt ■ CH}COOH (M = 1276,5)

358 mg (0,5 mMol) des gemäss Schritt c) des Beispiels 1 hergestellten Pentapeptids Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf —10 C gekühlt und unter Rühren tropfenweise mit 0,34 ml 6 n Salzsäure und dann mit der gesättigten wässrigen Lösung von 37,7 mg Natriumnitrit versetzt. Nach 5 Minuten wird eine auf —10 C gekühlte Lösung zugesetzt, die aus 362,3 mg (0,5 mMol) des Tetrapeptids H-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt • (TFA)2, 1 ml Dimethylformamid und 0,34 ml Triäthylamin bereitet wurde. Das Reaktionsgemisch wird bei — 5 °C eine Stunde lang und dann bei 0 °C eine Stunde lang gerührt. Man lässt die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen, entfernt das Lösungsmittel im Vakuum und reinigt den Rückstand an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule (2 x 95 cm) chromatographisch mit 0,2 n Essigsäure. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Ausbeute: 365,7 mg (57,3%), R/= 0,65; Rf6= 0,49; Rr= 0,69

Aminosäureanalyse: Ser 0,87, Glu 0,99, Pro 1,02, Leu 1,00, Tyr 0,97, His 1,03, Trp 0,82, Aa 0,91, Arg 1,01.

Beispiel 3

[ Mab6 ]-gonadoliberin a) Boc-metaaminobenzoesäure (Boc-Mab) (M = 237,25) 1,0 g (7,5 mMol) m-Aminobenzoesäure wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 gestellt, und zu dem Gemisch werden 2,5 g tert.-Butyloxycarbonat gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur einen Tag lang gerührt und dann auf die im Schritt k) des Beispiels 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Ausbeute: 1,4 g (80,9%), Schmp.: 92 °C, R'f°= 0,88;

RY = 0,84.

b) Boc-Mab-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 (M = 704,78) 1,5 g (2,5 mMol) H-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2-tri-

fluoracetat (N. Yanaihara et al., J. Med. Chem. Kj, 373 [1973]) werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 °C gekühlt und mit Triäthylamin auf pH 8 gestellt. Dann werden 383 mg (2,5 mMol) (N-Hydroxybenztriazol und 515 mg (2,5 mMol) DCC zugesetzt. Schliesslich wird tropfenweise die Lösung von 593 mg (2,5 mMol) Boc-Mab in 3 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in 30 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung dreimal mit 10 ml 10%iger Citronensäure, dreimal mit 10 ml Wasser, dreimal mit 10 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schliesslich mit 10 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben. Die weisse kristalline Substanz wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Ausbeute: 1,2 g (68%), Schmp.: 132-133 °C, Rf6= 0,43

c) Boc-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (M = 659,78)

1,0 g (1,5 mMol) Boc-Mab-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 wird auf die im Schritt f) des Beispiels 2 beschriebene Weise von der Schutzgruppe befreit. Ausbeute: 775 mg (78,3%), Rf= 0,52.

d) H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2■ (TFA)2 (M = 753,72) 670 mg (1 mMol) des Pentapeptidamids Boc-Mab-Leu-

Arg-Pro-Gly-NH2 werden in 5 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Dann wird die Trifluoressigsäure im Vakuum entfernt. Das zurückbleibende Öl wird mit Äther verrieben, das Produkt abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 689 mg (91,5%), Rf1 = 0,50; Rf5 = 0,53; Rf7= 0,42.

e) Glp-His—Trp-Ser-Tyr-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly—NH2 (M = 1244,39)

358 mg (0,5 mMol) des gemäss Schritt g) des Beispiels 1 hergestellten Pentapeptids Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf —10 °C gekühlt und unter Rühren zuerst mit 0,34 m 6n Salzsäure, dann tropfenweise mit der konzentrierten wässrigen Lösung von 37,7 mg Natriumnirit versetzt. Nach 5 Minuten wird die auf —10 °C gekühlte Lösung von 377 mg (0,5 mMol) H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ■ (TFA)2 in

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

670 830

8

1 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 0 °C 2 Stunden lang gerührt. Dann lässt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen. Anderntags wird das Gemisch im Vakuum eingedampft. Das rohe Deka-peptid wird an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule (2 x 95 cm) mittels eines im Verhältnis 15:1:4:20 bereiteten Gemisches aus Butanol, Propanol, Essigsäure und Wasser chromatographisch gereinigt. Der Substanzgehalt der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch beziehungsweise durch Messung der UV-Absorption bestimmt. Die das De-kapeptid enthaltenden Fraktionen werden lyophilisiert. Die Reinigung wird mit verdünnter Essigsäure wiederholt. Ausbeute: 323 mg (52%), Rf2 = 0,31; R/ = 0,49; Rf8 = 0,62.

Aminosäureanalyse:

Ser 0,91, Glu 1,03,Pro 0,97, Gly 1,10,

Leu 1,00, Tyr 0,97, His 1,05, Trp 0,87,

Mab 0,90, Arg 1,11.

Beispiel 4

[Aa6]-gonadoliberin M = 1244,39 a) Synthese

Die Verbindung wird mit der allgemein bekannten Methode der Peptidsynthese an der festen Phase (Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2151 [1963]) hergestellt.

0,75 g (0,3 mMol) Benzhydrylamin • HCl-Harz (0,4 mMol/g, Pierce) lässt man 2 Stunden lang in Dichlor-methan quellen. Beim Acylieren mit Aminosäuren wird jeweils der folgende Zyklus wiederholt:

Schritt Reagens, Arbeitsgang

9 10

11

12

CH2C12, Waschen 3 x Gemisch 33% TFA, 67% CH2C12 Gemisch 33% TFA, 67% CH2C12 CH2C12, Waschen 3 x CHC13, Waschen 2 x Gemisch 10% TEA, 90% CHC13 Waschen 2 x CHCI3, Waschen 2 x Äthanol, Waschen 2 x CH2C12, Waschen 2 x 3 Äqu. Boc-aminosäure gelöst in einem Gemisch aus CH2C12 und DMF, 3 Äqu. DCC oder DIC gelöst in CH2C12 CH2C12, Waschen 2 x Äthanol, Waschen 2 x

Rührdauer min 1 1

25 1

1

2 1 1 1

60 (unterschiedlich) 1 1

Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat wird bei 37 JC eingedampft. Das erhaltene Dekapeptid • Hf-Salz (371 mg) wird einer Gelchromatographie unterzogen.

5 c) Gelchromatographie

Die im vorhergehenden Schritt erhaltene Substanz wird an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule (2,5 x 100 cm) gereinigt. Als Elutionsmittel dient 20%ige Essigsäure. Die Trennung wird durch bei 280 nm gemessene UV-Absorp-10 tion sowie dünnschichtchromatographisch verfolgt. Die das Dekapeptid enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Ausbeute: 202 mg (54%)

d) Präparative HPLC 15 Es wird eine präparative HPLC-Säule (Whatman) der Masse 2,5 x 45 cm verwendet, die Cis-Silikagel LRP-1 der Teilchengrösse 13-24 [im enthält. Das Gleichgewicht wird mit einem Gemisch aus 15% Methanol und 85% 20%iger Essigsäure eingestellt. Nachdem sich das Gleichgewicht ein-20 gestellt hat, werden 202 mg der gelchromatographisch gereinigten Substanz, gelöst in dem gleichen Lösungsmittelgemisch, auf die Säule aufgegeben.

Eluiert wird mit einem linearen Konzentrationsgradien-25 ten, der mit einer Zusammensetzung von 15% Methanol und 85% 20%iger Essigsäure beginnt und einer Zusammensetzung von 25% Methanol und 75% 20%iger Essigsäure endet. Dann wird mit einem Gemisch von 40% Methanol und 60% 20%iger Essigsäure und schliesslich mit einem Gemisch 30 aus 80% Methanol und 20% 20%iger Essigsäure eluiert. Die Durchflussmenge beträgt 2 ml/min, der Druck 3,5 x 105 Pa. Die Fraktionen werden bei 280 nm detektiert, ihr Gehalt dünnschichtchromatographisch kontrolliert. Nach dem Lyo-philisieren erhält man das reine [Aa6]-gonadoliberin in einer 35 Menge von 123 mg (61,0%). Schmp.: 185-192 C, [a]2o = — 63,2° (c= 1, 0,1 n Essigsäure), Rf1 = 0,17 Aminosäureanalyse: Ser 0,92, Glu 1,03,Pro 1,1, Gly 0,97 Leu 1,00,Tyr 0,95, His 1,08, Trp 0,83 Aa 0,90, Arg 1,05.

40

Beispiel 5 [Aa6, Trp7, Leu8]-gonadoliberin

Die Verbindung wird mit der im Beispiel 4 beschriebenen Methode hergestellt. Ausbeute: 35%, Rf5 = 0,57. 45 Aminosäureanalyse: Ser 0,91, Glu 1,02,Pro 0,97, Gly 1,00 Leu 0,98 Tyr 1,03, His 0,93, Trp 1,82 Aa/Mab 0,90

Nach jedem Schritt wird ein Ninhydrintest durchgeführt. Werden freie Aminogruppen gefunden, so muss der Zyklus von der 5. Zeile ab wiederholt werden (Ninhydrintest nach Kaiser, E. et al., Anal. Biochem. 34, 595-598 [1970]). Nach dem letzten Schritt erhält man 344 mg (65%) Glp-His(Tos)-Trp-Ser(oBzl)-Tyr(oBzl)-Aa-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-Pep-tidharz (Molmasse des geschützten Peptids: 1764,92).

b) Abspaltung mit Fluorwasserstoff

Die Entfernung der Schutzgruppen und die Abspaltung des Peptids vom Harz werden in einem Schritt, mit flüssigem, wasserfreiem Fluorwasserstoff vorgenommen (Sakaki-bara, S. et al., Bull. Soc. Japan 40, 2164-2167 [1967]). Zu dem im vorhergehenden Schritt erhaltenen Peptidharz werden 5 ml Anisol und 100 ml Dithiothreit gegeben und schliesslich 20 ml HF in das Gemisch kondensiert. Bei 0 nC wird eine Stunde lang gerührt und dann das HF mittels eines Stickstoffstromes entfernt. Der Rückstand wird in wasserfreiem Äther suspendiert und dann filtriert. Die Festsubstanz wird mit 50%iger Essigsäure gewaschen. Das mit der

50

55

Beispiel 6 [Mab6, Phe7, Gln8]-gonadoliberin

Die Verbindung wird mit der im Beispiel 4 beschriebenen Methode hergestellt. Ausbeute: 43%, R^= 0,63.

Aminosäureanalyse: Ser 0,93, Glu 2,02,Pro 1,12, Gly 1,00, Tyr 0,97, Phe 1,07, His 0,95, Trp 0,87 Aa/Mab 0,89.

Beispiel 7

60 Herstellung einer Injektionslösung zur intramuskulären, subcutanen oder intravenösen Verabreichung a) Ein Gonadoliberinderivat der allgemeinen Formel (I) wird in einer Konzentration von 1-10 mg/ml in destilliertem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einem wässri-65 gen Puffer gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und dann in 50-500 ^g Substanz entsprechenden Volumina in Ampullen gefüllt. Die Lösung wird lyophilisiert, und die Ampullen werden verschlossen.

Der Inhalt der Ampulle wird vor der Behandlung durch Zugabe von 1-10 ml destilliertem Wasser frisch gelöst und das der notwendigen Dosis entsprechende Volumen der Lösung injiziert.

b) Ein Gonadoliberinderivat der allgemeinen Formel (I)

9 670 830

wird in einer Konzentration von 20-500 (ig in physiologischer Kochsalzlösung oder Benzylalkohol gelöst, in Ampullen gefüllt, und die Ampullen werden verschlossen. Diese Lösungen werden unmittelbar für Injektionszwecke verwen-5 det.

C

Claims

670 830 2

PATENTANSPRÜCHE

1. Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel (I)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-XI-X2-X3-Pro-X4 (I),

worin

X, für den Rest von ortho-Aminobenzoesäure oder me-ta-Aminobenzoesäure,

X2 für Leucyl-, Tryptophyl- oder Phenylalanylgruppe, X3 für Arginyl-, Leucyl- oder Glutaminylgruppe und X4 für Glycylamid- oder Alkylamidgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht, und die Säureadditionssalze dieser Verbindungen.
2. Gonadoliberinderivate, ausgewählt aus einer Gruppe, enthaltend:

[Aa6, Gin8, desGlyI0]-gonadoliberinäthylamid, [Aa6, desGly1 °]-gonadoliberinäthylamid, [Mab6]-gonadoliberin [Aa6Trp7, Leu8]-gonadoliberin,

[Mab6, Phe7, Gln8]-gonadoliberin und die Säureadditionssalze dieser Verbindungen nach Anspruch 1.
3. Verfahren zur Herstellung neuer Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel (I)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-XI-X2-X3-Pro-X4 (I)

und ihrer Säureadditionssalze, wobei in der allgemeinen Formel (I)

X] für den Rest von ortho-Aminobenzoesäure oder me-ta-Aminobenzoesäure,

X2 für Leucyl-, Tryptophyl- oder Phenylalanylgruppe, X3 für Arginyl-, Leucyl- oder Glutaminylgruppe und X4 für Glycylamid- oder Alkylamidgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen stehen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die gegebenenfalls geschützten Aminosäuren mittels schrittweiser Kondensation und/oder Fragmentkondensation kondensiert und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen entfernt oder b) unter Anwendung der Methode der Peptidsynthese an einer festen Phase die gegebenenfalls geschützten Aminosäuren in der entsprechenden Reihenfolge schrittweise an einen festen Träger kondensiert, das Endprodukt sauer oder basisch von dem festen Träger abspaltet und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen vor, während oder nach dem Abspalten entfernt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein geschütztes Pentapeptidazid der Formel (II)

Glp-His-T rp-Ser-Tyr-N 3 (II)

mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel (III)

X,-X2-X3-Pro-X4 (III)

worin die Bedeutung von Xls X2, X3 und X4 die gleiche wie in Anspruch 1 ist, kondensiert.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als festen Träger Benzhydrylaminharz oder chlor-methyliertes Polystyrol verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Schutzgruppen enthaltende Endprodukt durch Behandeln mit Fluorwasserstoff oder durch Äthylammono-lyse vom Träger abspaltet.
7. Verfahren zur Herstellung eines das luteinisierende und das follikelstimulierende Hormon freisetzenden Arzneimittelpräparates, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Go-

nadoliberinderivat der allgemeinen Formel (I), worin die Bedeutung von X], X2, X3 und X4 die gleiche wie in Anspruch 1 ist, oder sein Säureadditionssalz mit Träger- und Hilfsstoffen zu Arzneimittelpräparaten formuliert.
8. Verfahren zur Herstellung von für vermehrungsbiologische Zwecke geeigneten Kompositionen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), worin die Bedeutung von XI; X2, X3 und X4 die gleiche wie in Anspruch 1 ist, oder ihr Säureadditionssalz zu einem für die Vermehrung von Wirbeltieren geeigneten Präparat formuliert.
9. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin die Bedeutung von Xu X2, X3 und X4 die gleiche wie in Anspruch 1 ist, und ihrer Säureadditionssalze zur Herstellung von das luteinisierende und das follikalstimulie-rende Hormon freisetzenden Arzneimittelpräparaten.
10. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin die Bedeutung von X1; X2, X3 und X4 die gleiche wie in Anspruch 1 ist, und ihrer Säureadditionssalze zur Herstellung von vermehrungsbiologisch anwendbaren Kompositionen.
11. Das luteinisierende und das follikelstimulierende Hormon freisetzendes Arzneimittelpräparat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäss Anspruch 1 oder ihrem Säureadditionssalz.
12. Vermehrungsbiologisch verwendbare Komposition, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäss Anspruch 1 oder ihrem Säureadditionssalz.