DE1617467C3

DE1617467C3 - Verwendung einer wäßrigen Lösung eines Peroxides oder einer Peroxosäure oder eines Peroxosalzes zur Fixierung von Erythrozyten

Info

Publication number: DE1617467C3
Application number: DE19661617467
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Funaki
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1966-05-12
Filing date: 1966-11-25
Publication date: 1975-10-23
Also published as: DE1617467A1; DE1617467B2

Description

darin zu sehen, daß sie sich sehr gut als Antigen- oder Antikörperträgerstoffe eignen und für die Diagnose der Blasenmole sowie für den Hämagglutinaüonshemmungstest verwendbar sind. Als Beispiele seien weiterhin die Schwangerschafts- und Chorionepithliomdiagnose genannt.

Die durch die erfindungsgemäße Verwendung einer wäßrigen Lösung eines Peroxides oder einer Peroxoiäure oder eines Peroxosalzes fixierten Erythrozyten können auch zur Diagnose von verschiedenen Krankheiten, bedingt durch Autoantikörper u. ä., benutzt werden.

In Krankenhäusern ist es für die Ärzte in der Regel sehr mühsam, die Zählung der Erythrozyten der vielen Blutarten durchzuführen, da keine — wie zu wünschen — Standardproben von Erythrozyten vorliegen. Durch die Erfindung ist es jedoch sehr einfach, derartige Standardproben fixierter Erythrozyten /M gewinnen.

Weitere Einzelheiten und Merkmale der Erfindung and aus der nachfolgenden Beschreibung einiger Ausführungsbeispiele ersichtlich. Unter der Bezeichnung »die Erythrozyten wurden fixiert« ist hierbei jeweils zu verstehen, daß die Erythrozyten in Gegenwart von destilliertem Wasser, Säuren, Alkalien, oberflächenaktiven Agenzien usw. nicht mehr hämolysiert wurden. Wie schon erwähnt, können sämtliche Erythrozyten eines beliebigen Wirbeltieres fixiert werden, wobei lediglich die Fixierbedingungen sich jeweils ändern.

Beispiel 1

0,1 cm³ menschliches Blut wurde mit einem Liter 'jiner 0,17%>igen Wasserstoffperoxidlösung (Salzgehalt 0,9 %) bei 0° C gemischt. Hierbei wurden die Erythrozyten fixiert.

Beispiel 2

Wasserstoffperoxyd wurde in einer Menge von 0,17% einem Liter einer physiologischen Kochsalzlösung bei 25° C beigegeben. Ungefähr 25 Minuten später wurde der Lösung 1 cm³ menschliches Blut beigemischt, was die Fixierung der Erythrozyten zur Folge hatte.

Beispiel 3

Wasserstoffperoxyd wurde in der Menge von 0,3 °/o zwei Liter einer physiologischen Kochsalzlösung bei 50° C beigegeben. 10 Minuten später wurden 50 cm³ Hunde-, Hennen- oder Krötenblut der Lösung beigemischt, was die Fixierung der Erythrozyten zur Folge hatte.

B eispiel 4

Eine gesättigte Lösung von Bariumperoxyd (BaO.,) in physiologischer Kochsalzlösung wurde mit Hennen- oder Meerschweinchenblut im Verhältnis von 1000:2 bei 37° C gemischt. Hierbei zeigte sich in der gesättigten Lösung nach einer halben Stunde Blasenbildung an der Oberfläche der Lösung. Nach mehr als 1 Stunde Reaktionszeit waren die Erythrozyten fixiert

Beispiel 5

Nach einer halbstündigen Reaktionszeit einer gesättigten Lösung von Kaliumperoxodisulfat (K₂S₂O₈), gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, mit Hennen- oder Meerschweinchenblut (Verhältnis 1000 : 2) bei 37° C waren sämtliche Erythrozyten fixiert.

Beispiel 6

Zwei Liter destilliertes Wasser wurden bei 40° C mit 18 g Salz und 54 g Peroxodisulfursäure gemischt. Weiterhin wurden 50 cm³ Blut eines Rindes hinzugegeben, was die Fixierung der Erythrozyten in Milchbraun zur Folge hatte.

Beispiel 7

Acht Liter destilliertes Wasser wurden mit 72 g Salz und 220 g Peroxodisulfursäure gemischt. Weiterhin wurden 200 cm³ Blut eines Rindes zugegeben, was die Fixierung der Erythrozyten in Milchbraun zur Folge hatte.

Beispiel 8

Eine gesättigte Lösung von Ammoniumperoxodisulfat in physiologischer Kochsalzlösung wurde mit menschlichem Blut oder Blut von Kröten zusammengegeben, das durch Wasser 50fach verdünnt war. Das Mischungsverhältnis betrug 1000:2. Die Temperatur wurde auf einen Wert von 40° C eingestellt. Die Erythrozyten waren 30 Minuten später fixiert.

Beispiel 9

Eine 0,2-M-Natriumperoxoboratlösung, enthaltend physiologische Kochsalzlösung, wurde mit menschlichem oder mit Hundeblut im Verhältnis von 1000 : 2 bei einer Temperatur von 40° C zusammengegeben. Die Erythrozyten waren ungefähr 30 Minuten später fixiert.

Beispiel 10

50 cm³ 0,32-N Methylhydroperoxyd (CH₃OOH) wurden mit 1,35 g Natriumchlorid und 100 cm³ destilliertem Wasser gemischt. 0,2 cm³ menschliches Blut wurden der auf 45° C erhitzten Lösung zugegeben, was die Fixierung der Erythrozyten nach 25 Minuten zur Folge hatte.

Versuch 1

Gemäß Beispiel 1 fixierte Erythrozyten wurden in einer 0,9%>igen NaCI-Lösung bei O⁰C (Gefrierpunkt) 6 Jahre aufbewahrt. Im Mikroskop konnte festgestellt werden, daß sich die Anzahl und die Form der fixierten Erythrozyten nicht verändert hatte.

Versuch 2

Gemäß Beispiel 1 fixierte Erythrozyten wurden in einer 0,9%igen NaCI-Lösung unter Hinzufügung von 0,0001 % Thiomersal bei Raumtemperatur 2 Jahre aufbewahrt. Im Mikroskop wurde festgestellt, daß die Anzahl und die Gestalt der fixierten Erythrozyten erhalten geblieben ist.

Versuch 3

Es wurde eine 1,0- bis l,8prozentige Suspension gemäß Beispiel 3 mit Wasserstoffperoxid fixierter Erythrozyten und einer neutralen Phosphatpufferlösung (pH 7,4) verwendet. Die Erythrozyten stammten aus Rinder-, Hennen- oder Krötenblut. Dieser Suspension wurde Human Choriongonadotropin (HCG) zugegeben. Die fixierten Erythrozyten wurden bei Raumtemperatur (15° C) 60 Minuten lang

sensibilisiert und anschließend mit der Phosphatpufferlösung gespült. Anti-HCG-Serum (in einer Menge entsprechend 0,5 J. E. HCG) wurde in Reagenzgläser eingebracht, und es wurde jeweils 0,1 ml filtrierter Urin Schwangerer und männlicher Personen in die Reagenzgläser eingebracht. Anschließend wurden dann 0,4 ml der mit HCG sensibilisierten Erythrozyten-Suspension hinzugefügt und durch Schütteln vermischt. Die Mischung aus den mit HCG sensibilisierten Erythrozyten und dem Anti-HCG-Serum zeigt Agglutination. Der Urin Schwangerer verhindert jedoch diese Agglutination.

Bei den durchgeführten Versuchen konnte man nach 15 Minuten in den Reagenzgläsern, in welchen der Urin der männlichen Untersuchungspersonen vorhanden war, die Agglutination beobachten, während sich in den Gläsern, in welchen der Urin Schwangerer war, keine Agglutination zeigte.

Claims

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oxydlösung oder einer Peroxosäuresalzlösung, wie

Patentanspruch: z. B. Kaliumperoxodisulfatlösung, wird das Wasser

stoffperoxyd durch die Katalase in den Erythrozyten

Verwendung einer wäßrigen Lösung eines Per- in Wasser und Sauerstoff zerlegt. Der Sauerstoff wird oxides oder einer Peroxosäure oder eines Per- 5 in die Atmosphäre abgegeben, und es bleibt nur Wasoxosalzes zur Fixierung von Erythrozyten. ser bei der Reaktion zurück. Die fixierten Erythrozy

ten können in verschiedener Festigkeit vorliegen.
Während sonst Erythrozyten in sehr kurzer Zeit

durch Reaktion mit destilliertem Wasser, Säuren, Al-

lo kalien, Saponin, oberflächenaktiven Stoffen, Streptolysin oder Antikörpern zerstört und hämolysiert wer-

Erythrozyten existieren im Blut von Wirbeltieren, den, ist es durch die erfindungsgemäße Verwendung in dem sie mehr als die Hälfte der Blutbestandteile der im Anspruch genannten Peroxiverbindungen in ausmachen. Die Zahl der Erythrozyten ist sehr groß sehr einfacher Weise möglich, fixierte Erythrozyten und beträgt ungefähr 5 X 10⁶ pro mm³ menschlichen 15 mit verschiedenen gewünschten Eigenschaften herzu-Blutes. Die Größe der Erythrozyten hängt von der stellen. So werden manche fixierte Erythrozyten inGattung des betreffenden Lebewesens ab. So ist z. B. nerhalb von 24 Stunden hämolysiert, wenn sie mit die Größe der Erythrozyten von Menschen 8 μΐη, destilliertem Wasser zusammengebracht werden, während die der Kaninchen 7 μΐη beträgt. während wiederum andere die Eigenschaft aufwei-

Erythrozyten weisen jedoch eine sehr geringe 20 sen, nicht in Gegenwart von destilliertem Wasser, Beständigkeit auf und werden schon durch eine sondern von Saponin zu hämolysieren. Andere fikleine Abweichung des osmotischen Druckes oder . xierte Erythrozyten hämolysieren nicht in Gegenwart des pH-Wertes des Mediums deformiert oder ähmoly- von Saponin, sondern in Gegenwart von oberflächensiert. Die Erythrozyten werden weitgehendst defor- aktiven Stoffen. Andere wiederum weisen eine geeigmiert, hämolysiert und somit zerstört, wenn sie in de- 25 nete Festigkeit auf, so daß keine Hämolyse auf stilliertes Wasser eingegeben oder mit oberflächenak- Grund von destilliertem Wasser, Saponin oder andetiven Agenzien zusammengebracht werden. Die Ery- ren Agenzien stattfindet. Die Fixierung ist im allgethrozyten werden weiterhin in kurzer Zeit durch eine meinen durch die Art der Erythrozyten bestimmt so-Streptolysin- oder Antigen-Antikörper-Reaktion wie durch die Menge der Erythrozyten beim Fixieren oder ähnliche Vorgänge hämolysiert. 3° und durch Konzentration, Menge und Temperatur

Auf Grund der schwachen Resistenz der Erythro- der Peroxid-oder Peroxosäuresalzlösung.
zyten ist es schwierig, dieselben in ihrer ursprüngli- Die Erythrozyten menschlicher Lebewesen und

chen Form zu erhalten. Es hat sich gezeigt, daß Ery- Kaninchen sind nicht ganz einfach zu fixieren, westhrozyten mit sogenannten Fixierflüssigkeiten, wie halb zur Erzielung einer vollständigen Fixierung die Formalin oder Tannin, fixiert werden können, was 35 Temperatur während der Reaktion und die Menge an jedoch sehr schwierig und zeitraubend ist. Außerdem Peroxid oder Peroxosäuresalzlösung gesteigert wird, besteht die Gefahr, daß die Erythrozyten durch de- Im Gegensatz hierzu können die Erythrozyten von stilliertes Wasser, Säure, Alkalien oder oberflächen- Hunden, Hennen oder Kröten vollständig mit Hilfe aktive Agenzien hämolysiert werden, wenn das Fi- einer kleinen Menge an Peroxid- oder Peroxosäurexierverfahren nicht mit großer Geschicklichkeit 40 salzlösung unter relativ niedrigen Temperaturen volldurchgeführt wird. ständig fixiert werden.

Ein praktisch anwendbares Verfahren zur Fixie- Durch die Erfindung können Erythrozyten sämtli-

rung der Erythrozyten sowie zur Konservierung der- eher Wirbeltiere einschließlich Cyclomastata und selben hinsichtlich ihrer ursprünglichen Form und Mammalia fixiert werden.

Gestalt ist noch nicht bekannt, obwohl Erythrozyten 45 Diese Erythrozyten weisen den Vorteil auf, daß sie in Pulverform in Industrie und Wissenschaft viele nicht nur für sehr große Zeitdauer haltbar sind, son-Anwendungsmöglichkeiten haben. Besonders auf me- dem außerdem die ursprüngliche Form beibehalten, dizinischem Gebiet ist es wünschenswert, einheitliche Ein durch die erfindungsgemäße Verwendung von Teilchen von Erythrozyten zur Anwendung zu ha- Peroxiverbindungen vollständig fixierter Erythrozyt ben, mit denen sich nicht nur Fragen der Immunität 50 weist weiterhin den großen Vorteil auf, daß er in Gestudieren lassen, sondern man auch in einfacher genwart von destilliertem Wasser, Säuren, Alkalien, Weise diagnostizieren kann. oberflächenaktiven Agenzien oder anderen die Hä-

Ausgehend von dem vorgenannten Stand der molyse verursachenden Stoffen der Hämolyse nicht Technik an der eingangs erwähnten Problemstellung mehr unterzogen und somit praktisch universell verist es Aufgabe der Erfindung, Erythrozyten zu fixie- 55 wendbar ist.

ren und zu konservieren, ohne daß Hämolyse oder Die Schwierigkeit bei der Beobachtung von frisch

sonstige Zerstörungen auftreten. Diese Aufgabe wird gewonnenen Erythrozyten besteht unter anderem erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Erythrozy- darin, daß sie schon durch geringfügige Einflüsse der ten unter Verwendung einer wäßriger Lösung eines Umgebung ihre ursprüngliche Gestalt ändern. Derar-Peroxides oder einer Peroxosäure oder eines Per- 60 tige Einflüsse sind z. B. die beiden Glasplatten, die oxosalzes fixiert werden. bei einer Mikroskopie benutzt werden. Dieser Nach-

Die in einem Medium suspendierten Erythrozyten teil wird bei Verwendung von nach der Erfindung fiwerden in ihrer ursprünglichen Form fixiert. Die Fi- xierten Erythrozyten vermieden, da sie auf dem Obxierung findet dadurch statt, daß die Erythrozyten jektträger ihre ursprüngliche Form beibehalten. Die mit der wäßrigen Lösung eines Peroxides, einer Per- 65 durch die Verwendung von Peroxiverbindungen eroxosäure oder deren Salzen gemischt werden. Die findungsgemäße Fixierung wird deshalb insbesondere Fixierung ist kurzzeitig danach vollzogen. Beim Mi- bei sehr seltenen Erythrozyten angewandt. Eine weischen der Erythrozyten mit einer Wasserstoffper- tere Anwendung solcher fixierter Erythrozyten ist