DE1593086C3 - Verfahren zur Isolierung von Peruvosid aus Pflanzenmaterialien - Google Patents

Description

Das Glukosid »Peruvosid« verfügt über eine ausgeprägte cardiotonische Wirkung, die etwa der des Strophanthins entspricht. Zum Unterschied von diesem therapeutisch viel gebrauchten Cardenolid wird es jedoch bei oraler Applikation erheblich besser resorbiert. Peruvosid ist ein Naturprodukt und beispielsweise in der Apocynocee Thevetia neriifolia Juss. (syn. Thevetia peruviana Merr.) enthalten. Es ist bekannt, die Verbindung aus den entfetteten und fermentierten Samen dieser Pflanzen durch Extrahieren und chromatographische Trennung der extrahierten Stoffe zu isolieren. Entsprechende Verfahren sind beschrieben in der IN-PS 66 196, referiert in Chemical Abstracts, Bd. 55, Spalte 14 832 (1961), und in Helvetica Chimica Acta, Bd. 43, S. 652 (1960) und Bd. 45, S. 938 (1962). Bei diesen bekannten Isolierungs- und Reinigungsverfahren werden Alkohole als Lösungsmittel verwendet. Die Ausbeuten an Peruvosid bei den bekannten Verfahren sind außerordentlich niedrig und in den meisten Fällen nicht reproduzierbar.

Es wurde nun gefunden, daß man überraschenderweise zu erheblich höheren und eindeutig reproduzierbaren Ausbeuten kommt, wenn man die Isolierung des Peruvosids mit Halogenkohlenwasserstoffen als Lösungsmittel durchführt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Isolierung von Peruvosid aus entfetteten fermentierten peruvosidhaltigen Pflanzenmaterialien, insbesondere aus Samen von Thevetia neriifolia Juss. durch Extraktion und anschließende chromatographische Trennung der extrahierten Stoffe, das dadurch charakterisiert ist, daß beide Stufen des Verfahrens mit Halogenkohlenwasserstoffen als Lösungsmittel durchgeführt werden.

Als Halogenkohlenwasserstoffe kommen beispielsweise die folgenden in Frage: Chloroform, Methylenchlorid, 1,1-Dichloräthan, 1,2-Dichloräthan, 1,1,2-Trichloräthan, l,l-Dichlor-2-fluor-äthan. Gegebenenfalls können auch Gemische dieser Lösungsmittel eingesetzt werden. Bevorzugte Lösungsmittel für die Extraktion ist Chloroform.

Nach dem neuen Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung erhält man Peruvosid in Ausbeuten von etwa 1 bis 1,2%, bezogen auf das entfettete unfermentierte Ausgangsmaterial. Die erzielte Ausbeute ist damit beispielsweise doppelt so hoch wie die nach dem Verfahren der IN-PS 66 196 erreichte Ausbeute.

Im einzelnen wird das neue Verfahren wie folgt durchgeführt:

Das als Ausgangsmaterial verwendete entfettete, fermentierte, peruvosidhaltige Pflanzenmaterial wird aus den zerkleinerten peruvosidhaltigen Pflanzenteilen, vorzugsweise aus Samen von Thevetia neriifolia in bekannter Weise gewonnen. Folgendes Vorgehen hat sich für die Herstellung des Ausgangsmaterials als zweckmäßig erwiesen:

Zunächst wird das glykosidhaltige Pflanzenmaterial gequetscht und anschließend mit einem fettlösenden organischen Lösungsmittel, z. B. mit einem Kohlenwasserstoff wie Petroläther, einem Halogenkohlenwasserstoff wie Chloroform oder einem Äther wie Diäthyläther, vorentfettet. Hierauf wird das vorentfettete Material erneut gemahlen und nochmals mn einem fettlösenden organischen Lösungsmittel perkoliert.

Der so erhaltene feingemahlene Rückstand wird in üblicher Weise in wäßriger Suspension fermentiert. Zum Fermentationsgemisch wird vorteilhaft eine geringe Menge Toluol zugefügt, um einen Verderb des Pflanzenmaterial durch Einwirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen zu verhindern. Die Fermentationszeit liegt im allgemeinen zwischen 3 und 5 Tagen, vorzugsweise bei etwa 3 Tagen. Die Fermentationstemperatur liegt zwischen 30 und 50° C, vorzugsweise bei etwa 40° C. Zum Einsatz für das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wird zweckmäßigerweise das Wasser von dem fermentierten Pflanzenmaterial durch Abschleudern entfernt.

In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das fermentierte, entfettete Ausgangsmaterial mit einem Halogenkohlenwasserstoff, vorzugsweise mit Chloroform, extrahiert.

Durch Einengung des Extrakts erhält man das Peruvosid im Gemisch mit anderen Substanzen. Werden als Ausgangsmaterial entfettete fermentierte Samen von Thevetia neriifolia verwendet, so fäll: beim Einengen des Extrakts ein kristallines Gemisch von etwa einem Teil Peruvosid mit etwa 2 Teilen Neriifolin mit kleineren Beimengungen von Revusic aus.

Ungeeignet zur Extraktion sind organische Lösungs mittel mit aktivem Wasserstoff im Molekül, der beispielsweise nach der Methode von Zerewitinofi (Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft Bd. 40, S. 2023 [1907]) bestimmt werden kann. Sc sind z. B. Verbindungen mit OH-Gruppen, insbesondere auch Alkohole, ferner Verbindungen mit Amino-, Carboxy- und/oder Mercaptogruppen nicht für die Extraktion geeignet. Dagegen vermindert die Anwesenheit von Wasser bei der Extraktion die Ausbeuten nicht.

Die Trennung des Extraktionsgemisches in de; 2. Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolg nach den üblichen Methoden der Adsorptionschromatographie. Man kann das Gemisch in einei Säule oder in einer Schicht chromatographisch trennen. Als Sorptionsmittel kommen die in . de; Chromatographie üblichen Verbindungen in Frage beispielsweise feingepulvertes Kieselgel, Aluminiumoxid, Magnesiumsilikate oder Calciumphosphate. Bevorzugtes Sorptionsmittel ist Kieselgel.

Durch Anwendung von Halogenkohlenwasser stoffen als Elutions- bzw. Fließmittel, beispielsweise der oben im einzelnen genannten Lösungsmittel, er zielt man eine Abtrennung des gewünschten reiner Peruvosids von den unerwünschten Begleitstoffen wit Neriifolin. Es hat sich als besonders vorteilhaft er

wiesen, für die chromatographische Trennung dasselbe Lösungsmittel anzuwenden, das auch für die vorausgehende Extraktion des Peruvosids eingesetzt wurde, insbesondere Chloroform. In einer bevorzugteen Ausführungsform des Verfahrens wird das nach der ersten Verfahrensstufe erhaltene Gemisch aus Peruvosid mit den unerwünschten Begleitstoffen, beispielsweise Neriifolin, durch Elution mit einem Halogenkohlenwasserstoff, insbesondere Chloroform, über der 8- bis lOfachen Menge Sorptionsmittel (vorzugsweise Kieselgel), bezogen auf die Menge des zu trennenden Gemisches, Chromatographien. In dieser Ausführungsform wird beispielsweise aus dem oben angegebenen Gemisch von 1 Teil Peruvosid mit 2 Teilen Nerriifolin zuerst das Neriifolin praktisch quantitativ eluiert. Danach folgt bei der Elution eine kleine Gemischzone aus Neriifolin und Peruvosid und schließlich eine Fraktion, die aus reinem Peruvosid besteht.

In manchen Fällen ist es zweckmäßig, das nach der chromatographischen Trennung anfallende Peruvosid nochmals umzukristallisieren. Für eine solche eventuell erforderliche weitere Aufreinigung ist es vorteilhaft, ein organisches Lösungsmittel, das keinen aktiven Wasserstoff enthält, zu verwenden. Zum Beispiel eignet sich auch für eine Umkristallisation das bei der Extraktion und der chromatographischen Trennung bevorzugt verwendete Chloroform.

Das neue Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

2 kg geschälte Nüsse von Thevetia neriifolia werden gequetscht und mit Chloroform vorentfettet. Nach Mahlen und nochmaligem Entfetten mit Chloroform teigt man den Rückstand mit Wasser an und fermentiert 70 Stunden bei 40° C unter Zusatz von etwa 10 ml Toluol. Die noch feuchte Droge wird dann erschöpfend mit Chloroform extrahiert und der erhaltene Extrakt auf etwa 200 ml eingeengt. Dabei kristallisieren 35 bis 40 g eines Gemisches von Peruvosid und Neriifolin aus.

Das so erhaltene Gemisch wird von der Mutterlauge befreit und an 400 g Kieselgel für Chromatographie (0,05 bis 0,2 mm Partikelgröße) mit Chloroform als Elutionsmittel getrennt. Die erste Fraktion besteht aus etwa 23 bis 27 g reinem Neriifolin, gefolgt von einer Zwischenfraktion aus 1 bis 2 g eines Gemisches aus Peruvosid/Neriifolin und einer letzten Fraktion, die aus 11 bis 12 g reinem Peruvosid besteht. Man löst die gesamte Menge Peruvosid in 6 ml Aceton und setzt 6 ml Diäthyläther zu. Das Peruvosid kristallisiert in Prismen bzw. Drusen. Die Ausbeute beträgt 10 bis 11g. Der Schmelzpunkt liegt zwischen 160 und 163°. [«] f = -70° ±2° (c = 1,3 in Methanol). Die Substanz ist dünnschichtchromatographisch rein.

B e i s ρ i el 2

Der nach Beispiel 1 hergestellte Chloroformextrakt der fermentierten Samen von Thevtia neriifolia wird mit einem üblichen Trockenmittel wie Natriumsulfat getrocknet und mit Diäthyläther versetzt. Dabei scheidet sich ein kristallines Gemisch aus Peruvosid, Neriifolin und Ruvosid ab, das nach Abfiltrieren und Trocknen ein Gewicht von etwa 50 g hat.

Man chromatographiert das erhaltene Gemisch über 350 g Kieselgel analog Beispiel 1 mit Methylenchlorid als Elutionsmittel. Folgende Fraktionen werden dann in der nachstehenden Reihenfolge eluiert: Etwa 25 g reines Neriifolin, etwa 4 g Übergangsfraktion aus Neriifolin und Peruvosid, etwa 11 g reines Peruvosid und schließlich etwa 3 g eines Gemisches aus 2 Teilen Peruvosid und einem Teil Ruvosid. Das Peruvosid wird wie in Beispiel 1 beschrieben, umkristallisiert und zeigt die dort angegebenen physikalischen Eigenschaften.

Beispiel 3

Man arbeitet analog Beispiel 1, verwendet jedoch 1,2-Dichloräthan an Stelle von Chloroform zur Extraktion und erhält nach der Chromatographie (mit Chloroform) 24 g reines Neriifolin, 1,8 g einer Zwischenfraktion eines Gemisches aus Peruvosid/Neriifolin und 10,8 g reines Peruvosid mit den in Beispiel 1 angegebenen Eigenschaften.

Beispiel 4

Man arbeitet analog Beispiel 1, verwendet jedoch 1,1,2-Trichloräthan an Stelle von Chloroform zur Extraktion und erhält nach der Chromatographie (mit Chloroform) 22,5 g Neriifolin, 2,5 g einer Zwischenfraktion eines Gemisches aus Peruvosid/Neriifolin und 11 g reines Peruvosid mit den in Beispiel 1 angegebenen Eigenschaften.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Isolierung von Peruvosid aus entfetteten, fermentierten, peruvosidhaltigen Pflanzenmaterialien durch Extraktion und anschließende chromatographische Trennung der extrahierten Stoffe, dadurch gekennzeichnet, daß beide Stufen des Verfahrens mit Halogenkohlenwasserstoffen als Lösungsmittel durchgeführt werden.