DE1543837A1

DE1543837A1 - Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide

Info

Publication number: DE1543837A1
Application number: DE19661543837
Authority: DE
Inventors: Paul Bellet; Gerard Nomine; Truong Van Thuong
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1965-10-05
Filing date: 1966-09-28
Publication date: 1970-01-02
Also published as: GB1157528A; SE322526B; FR1468831A; US3471464A; BE694334A; DK119831B

Description

PATENTANWÄLTE

DR, F. ZUMSTEIN - DR. E. ASSMANM

DR. R. KOENIQSBERQER - DIPL.-PHYS. R. HOLZBAUEFi

TELEFON! 22 34 70 und 221« 11

TELEGRAMME: ZUMPAT "OeTBCHECKKONTO: MÖNCHEN 91130

BANKKONTO; BANKHAU3 H. AUFHÄUSER

O M D N CrtEN 2,

90/H, 1042 I)

ROÜSSBL-UCLAPp Paris _t Frankreich

Verfahren tsur Herstellung neuer Polypeptide

Die vorliegende Erfindung betrifft ain Verfahren zur Herstel lung neuer Polypeptide ο

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren aur Herstellung neuer Polypeptide·, die dem Insulin .oder öinem seiner direkten Derivate, wie den N-acylierten Derivaten, ent etammen»

Die neuen, nach dem erfindungagemäaaen Verfahren erhaltenen Polypeptide zeichnen sich dadurch auo, dass in ihnen mindestens 65 1· der von den Arginineinheiten stammenden Guanidylgruppen in Form einer Verbindung mit einem Dicarbony!derivat _t wie ei·

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BAD ORiQlHAt

ηβϊΆ ü-ülcarbonyle!oriva Uj₁ blockiert aind , und dar;3 darüber hinaus pro Hol Insulin zwischen O und 2_t5 Mol einer durch vorsichtige aaurti Hydrolyse fraizuse czenden Üieui-bonylverbindung enthalten oind

Ea let bekannt» dass Insulin_; ein In Pankreas ezv.augtes Protein hojcmon, bams rkenswdt* te phyaiöloßlecho i5-^!.gener.hui':sn iV.ifweJ.3fc 3ο begitist ea lnebooonriers g"ieichaei. tig »wei rypou von Akt L /J tat:

eine Hypcglyknm'.äwirkuKjEj und

eine anabolioclie Aktiv! tut

Dxo Hypoglykaßiewirkung ν/υχ-αο in der Th-^rapeutik zur ßohandlung von Diabetes eingesetzt: Dagegen konnte üie aiiaboJ'.«ehe Aktivität bia Jetzt nicht verwendet werden, da die Hypo^Iykämiev/ir kung deo Inaulins der Verwendung bein Menschen von normaler Qlykämia entgegenstand.

Es wurde nun gefunden» dass die neuen, oash der. erfindungsge niäsoen Verfahren erhaltenen Polypeptide physiologische Eigenschaften besitzen, die von denen des Mutterproteins unterschiedon sind; sie weisen keine HypoelyKäiaiev/irkung mehr auf und behalten die anabolische Aktivität bei.

Die so erreichte Trennung der beiden grundsätzlich η physi.o logischen Wirkungen äes Insulins stellt eine bedeut. nda Be

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rechtigung des erfindungsgensäsBen Verfahrens dar-

Die Erfindung liefert insbesondere ein Verfahren &ur Herstellung neuer Polypeptide, die dem Insulin oder einem seiner direkten Derivate, wie den H aeylierten Derivaten, entstammen, wobei diese Polypeptide dadurch ausgezeichnet sind, dass die Guanidylgruppe des Argininkettenglieds im Insulin in Form einer Verbindung mit einem Dicarbonyläorivat_; wie eineis ß-Dicar bonylderivat, blockiert ist, und daao sie darüber hinaus pro Hol Insulin zv/inc^en 0 und 2_t5 Mol einer durch vorsichtige Hydrolyse freizusetzenden Dicarbony!verbindung enthalten.

Unter Dicarbonylderivat iet 3( wohl ein Dike ton ei·? el* t&M MMlI beispielsweise ein Ketoester^ ein Diester oder ein

Ketoftldeh/d su verstehen

Alo ß Ditarbnnylverbindung seien insbteondere Aceteasigeäureeeter₅ Nitrcmalondialdehyd, Meeoxaldialdehyd; Oycl hexandion 1_C3_C Xlhcxymethylenaceteeeigeäureäthyleeter und Ace-cylacotcn genannt

Es ist bemerkenswert, dass die nach dem erfindr.ngsgemässen Verfahren erhaltenen neuen Polypeptide_r deren von Arginin staunende Quanidylgruppen in Fora «Ines 2-ABino-4,6--dimethylpyrittidins blockiert sind, selbst bei einer Dosis, die 10 mal höher ist als die tee rergleichbaren Insuline, keine ^poglykftaievirkuae atrf-

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&£. _f;i." =::,]■■■<■ ir. ;; DC·.: i sch-- .'>_:-^!-· - - f-f:: 1; dor -'"'.ν '-■:-'■'.: i*;fc unter ":■. ·ι ^f =;j ·:;,;

.''-.i- Ki"¹' '; -κ i'';hr,f fcC'if die ire j. 'von Bi'lfundtiron

ί).!β neuen Polypeptide werden durch Einwirkung eines Dicarbonyl derivat«? insbesondere eines OC oder Q Dicarbonylderivats, auf Insulin oder eines seiner direkten Derivate, wie der N-acylierten Derivate_¥ erhalten»

Die ntruktuT- des so modifizierten InoulinmolekUls ist nicht vollkommen geklärt» Die ürgebnisee einer Reihe von phsysiko · chemischen Untersuchungen zeigt jedoch, dass die Guanidy!gruppe dee Argininkettenglieds eich mit dem Dicarbonylderivat verbunden hat. So ergibt sich, wenn das Dicarbonylderivat Acetylaceton ist, für das Argininkettenglied im Insulin folgende Formel:

OK₃ ^N C

H-(CHg)₃-NH - σ

-CO \

CH

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154 3337

Da auseerdeia die Menge d«r neuen 'Olypeptidu anzeigi* d:i;; mehrere Moleküle der Dicarbony .!derivate'inagesam t ml fc üens Insulin reagiert haben, wLrn finden; raffißη_f das» bs-jfclmmr.e ander basische G-ruppen, die In freiem Zustand in den: .DisuLinisoIokül vorhanden aindj in blockiertem Zustaud '/orliagßü- Sa iiande1.1; «ich insbesondere um- die NH, On. ρ ρ a ü jb ■ Lyainkot toiigLxeds und ovencuüii um Nli^-ßruppan der " yn'n- \nd l'hfiriyiaLanLnk:?) tvtiU--i;Li»}(ler sowie um diö Imidazo ίΠί- f.i-iipp-j d»r ITJLίΐ HJInk·/ C t^n gtiedsr, Diese baainehen livup wn küⁱ\nsn jßlt ei η ess Diuarboayl derivat, wio Acebylacol n, unter Bildung einoa Imine cdor süv Enamins reagieren

Das LyeinkettenglJ ad kann dann im Pall J deo Ace fcylaceioriB in· nertelb der neue.i Polypeptide folgende Porael annehmen:

GH- (CH₂) £-NH -C-- u'H- GOGIl

-00 ^Jn3

Eb beeteht jedoch insbesondere gegenüber Säuren -sin eehr groaear Stabil!tateunterschied zwischen dem Pyrimidin, das bei der Blockierung der Ouanldylgcappe durch ein Molekül Acetylaceton «nteteht, und den Iain- oder Enaminfunktionen, die, wie pan annlnat, durch Rtaktion ewinehen einer baaiachen HH₂- oder »H«Pttnktion xmä Blntn Molekül Acetylaceton gebildet werden,

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So ermöglicht beiapielawöiae die vorsichtige saure Hydrolyse der neuen Polypeptide duron 2n Chlorwasserstoffaäure die Frei aetzung der unter liraatänckm durch Acetylaceton blockierten HH^ oder Nil· Gruppen, wüuei das AcetyiacuLon regeneriert wird und air,α dcnlerbar iot. :.u.ne dass der Heat de3 Moleküls weiter vorurnlfirt wird und wc bei d Ui iilcokterung der (iuanLdy!gruppen iiii.h: H/i.^e^ri ff«n wird Darüber hinaua führt diß Hydrolyse IiM' ri'»^!i«:i i'Di.ypoptiaa durch konzentriert«* Ghlorwauaeratoff oauro ;','.i\i Abbau dt;r ϊ oly) ;pc u'.xet iengliolör . ^o bei. die veröchLe-· ileiioii, dia Kotton_£-;iiods'* darstellenden Säuren wi.eüor freigesetzt werden, mit Auimahae Jon blockierten Ar^lniiiOi das durch die*# Behanailing «iiv»r««it· Ia OxnitMn «ad aad*r«r*#ita Ia 2-Ä>dra*jr-4,G-diaefchylpyriaidin überführt wird, wenn dia Blockierung mit tela Acetylaceton durchgeführt wurde=

Unter den neuen, nach dem erfindungageicäsaen Verfahren erhal tenen Polypeptiden sind insbasondere die hervorzuheben» bei de nen der Prozentsatz des duroh vorsichtige saure Hydrolyse freiauaetzenden Dicarbonylderivats zwischen einachlieaallch O und 2,5 Mol pro Hol Insulin liegt.

Dieses freizusetzende Dlearbonylderivat staiuBt» wie man ennira«tt von den Ininen oder Bnaminen, die ausgehend von den freien NH₂- oder NH-Gruppen, insbesondere ausgehend von der NH₂~Grupj>6 des Lyβins, gebildet wurden; es 1st jedoch aöglich, dass das

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finder^; : .. c ä-, ·; · r " . , ■ ■ \ ■ . .

iiie Lj sr besü^.i i ■:■"; dv.r .- f r. > ■ .:. ■.*'_:. ;.■.·„ .;■/.■"■ ■■.-:; ".,·: --'".-fUlirte Hypothese soli k^inei^Ca^ In ^t;Ie he-:'_c-}..':[ - .:;.. ..-τ ΐ!·":ί'-:;α.ν:ΐ· Erfindung beachrinken^

Dee erfindungegemässe Verfahren 2ur Herstellußg der neuei: Polypeptide ist dadurch gekennzeichnet, dass man in wäßrigem Milieu Ineulin oder eines seiner direkten Derivate, wie die N-acylierten Derivate, alt einen Dicarbonylderivat, wie einem B-Dicar bonylderivat, unsetst, wobei die Reaktion bei einem pH zwischen 7,5 Μχιύ 8;5 bti einer Temperatur zwischen einschliesslich 0 und 25⁰C durchgeführt wird, die Reaktionsaiechung mit schwach angesäuerten Wasser auf einen pH zwischen einschliesslich 5 und 6 bringt und ein Polypeptid isoliert, bei dem mindestens 65 # der von den Arginineinheiten stammenden Guanidylgruppen in Fons einer Verbindung Bit den angewandten Dicarbonylderivat blockiert sind, und dass darüber hinaus pro Mol Insulin zwischen 0 ~ nd 2,5 Hol der durch vorsichtige saure Hydrolyse freizusetzenden Dioarbonylverbindung enthält.

Die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrene kann noch durch folgende Punkte charakterisiert werden:

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*-..:■ BAD ORlQlHAL

Sie Kondensationsreaktion wird in wäßrigem oder wäßrig alkoholischen Milieu in Gegenwart eines Alkalibicarbonate oder einer Pufferlösung, auf Phosphat- oder Boratbaeie, durchgeführt t die Kondensationsreaktion wird in wäßrige* Milieu in Gegenwart eines anderen in Wasser löslichen Lösungsmittels, wie lösungsmittel mit mono- und poly-Hydroxygruppen, Dimethylformamid, Aceton, Birnethylsulfoxyd durchgeführt; das Dicarbonylderivat ist Acetylaceton, τοη dem man einen grosaen Übersohuss verwendet und man arbeitet bei einer Temperatur zwischen einsohllesslich 20 und 25⁰C, wobei der pH bei ca. 8 liegt.

Ee ist festsusteilen, daes dae fortschreitende oder völlige Verschwinden der Guanidylgruppe im Insulin duroh verschiedene Methoden sichtbar gemacht werden kann= So erlaubt die Farbreaktion von Sakagushi /"DUMAZERT et POFPI, Bull.Ste. ChIm_n Biol* Ht (1939) 1380^7,die für die freie Guanidylgruppe von Argininderivaten spesifisoh ist, qualitativ und quantitativ die Guanldylgruppen in den neuen Polypeptiden zu meeeen und den Zeitpunkt su bestimmen, wo die ümsetsung vollständig ist.

Die Beetiaoung der Hypo glykäsii β wirkung und der anafcolischeii Aktivität der neuen Polypeptide, die im Vergleich mit den Aktivitäten des Insulins durchgeführt wurde, erlaubt auch, die Wirksamkeit der Aktivität des Dicarbonylderivats zu bestimmen.

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Die Hypoglykäaiewirkung wird auf übliche Weis· beim fc*««**»fi Aireh Verringerung dee Olykämiegrades gemessen, die durch eine Injektion des su untersuchenden Produkte hervorgerufen wird. Bei» epielaweiae bewirkt Insulin bei einer Doei» τοη 0,5 ΙοΒ.Αβ eine Erniedrigung um 40 ^₀

Die anabolische Aktivität kann gemesöen werden durch die Geschwindigkeit der Einführung in vivo von C₁₄ Glykokole in die diaphragmatisehen Proteine der Maus. Unter diesen Arbeitsbedingungen des Versuchs bewirkt das Insulin bei einer Dosis von 5 χ.Β«Ae eine Steigerung der Einführungsgesohwindigkeit um 50 Jt.

Es versteht sich, dass diese Versuche auf analoge Veite in all den Fällen angewandt werden können, wo das ausgewählte Dicarbonyl reagens mit der Quanidylgruppe des Insulins unter Bildung einer definierten Verbindung reagiert.

Sie folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne ihre Anwendung su beschränken_β

Beispiel 1

Zu einer klaren Losung von 0,5 g Insulin in 40 com einer TJtigen Lösung von Kaliumbioarbonat in Wasser fügt man unter Rühren 5 com Acetylaceton. Das Rühren der Reaktionen!echung wird

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- ίο -

während 6 Tagen bei Rauntemperatur (ca. 20⁰C) fortgesetzt* Der gebildete Kioderschlag wird durch Zentrifugieren getrennt, »it

₄ Wasser schwach angesäuertem (pH 5,5 bis 6Vi dann Bit Aceton gewaschen und getrocknet» Die Ausbeute ist ca» 87 ^ an gebildetes Polypeptide bei den 65 £ der Ouanidylgruppen in Fora Ton 2-Amino-4,6-dimettiylpyrlmidin blockiert sind. Das neue Polypeptid fällt in Form sines amorphen weiseen Pulvera an, das in motwfth sJLkalisohen Lösungen, wie 0,1n Ammoniak, löslich und in verdünnten wäflrlfpn Säuren und den übliohen organischen Lösungsmitteln unlöslich ist.

Analyse» C₂₆₄H₃₈₇O₇₆H₆₅S₆ * 5 879,64

berechnet! C 53.90 H 6,64 N 15,48 * gefunden: 54,1 6,5 15«5

_t ÜV-8psktrum*

in O.01η Ammoniak . Inflexion bei 280 ψ b]*^ * 20 max. bei 288 syi E₁J_- » 23 max. bei 305 mn e]* * 27

in 0.1η Chlorwasserstoffsäure

Λ *·*· ^b«i 276 wfi

Inflexion bei 281 nyi

Λ max. bei 308 mi

BAD ORIGINAL 909881/1658 ^L

Bie totale saure Hydrolyse des Produktes wird mit Hilfe τοη 6n Chlorwasserstoffsäure durch Braitsen bei 110⁰O während 24· Stunden durchgeführt, lach Entfernen der OhlorwasseretoffeHur« wird das Öydrolysat einer «weidimenaionalen Chromatographie Unter folgenden Bedingungen unterworfen:

Saures Lösungsmittel; imeaaaengeeetst aus n-Butanol/Esaigeaure/Waeser Im Verhältnis 4 : 1 : 5.

2.RIeI

Baβ!seheβ Löeungenittel, susamensesetst aus Oollldin/Waaeer 1» TerfAltnle 1 ι 1.

Ilnhydrin/Oollidln.

Vergleich alt einem Onroaatograes, das τοη einem Insulin-» hydrolyeat stammt» weist dieses Ohromatogramm einige besondere Oharakterletlka auf:

Anvesenheit eines schwachen Arginlnfleoks; Anwesenheit eines Fleoke, der der Mischung Lyaln/Ornithin ent· sprleht, im Vergleich mit dem der IneulinTergleichsprobe im wesentlichen Terdoppelt und in der horizontalen Eiohtung etwas weniger gewandert ί

909881/1658 bad

Anwesenheit eines gelben Viertes, der des 2-Hydr<«y~4_t6-

dimethylpyrimidin entspricht»

Die vorsichtige saure Hydrolyse dta erhaltenen Polypeptide wird mit Hilfe von 2n Chlorvae β ere toffeäur β durch BrMtstii auf de» Vu-•erbad während 10 Hinuten durchgeführt. lach des V«utrali*ier«n der Chlorwasserstoffsäure kann man da· neue, ·ο gebildet« Insulinderivat isolieren und auch das freigesetzte Acetylaceton mit o-Phenylendianin kondensieren. Die letsttre Seaktion, dl· die kolorimetrische Messung de· Acetylacetone erattglioht, aelgt die Freisetzung von ca. einea Molekül Acetylaceton pro Molekül Folypeptid an«

Beispiel 2

Man lust 0,85 g Insulin und 3#5 g Kaliuabioarbonat in 37»5 cc« Wasser; βοdann fügt man 37 cob 95?Cigee Äthanol und θ co· Acetylaceton zu. Die Lösung wird während 28 fagan bei 20 bi· 25⁰C auf>Äwahrt, dann mit einer wäßrigen 1n Ohlorwaeeeretofflösung atüUrln pH von 5,6 bi· 5,8 schwach angesäuert. Der gebildete Niederschlag wird sentrlfugiert, alt Wasser, dann alt Aceton gewaschen und getrocknet. Man erhält 0*65 g Polypeptid (Ausbeute: l!pf), bei dem 95 £ der Guanidylgruppen in For» tob 2~Amino-4,6-dlnethylpyrlBidin blockiert sind«

Die vorsichtige saure Hydrolyse, wie in Beispiel 1 durohgeftlart, fUhrt tür Trelsetsung von ca. eine· Molekül Acetylaceton pace Molekül Pj*ypeptid.

* 909881/1658 Bad ori_GINal

Beispiel 3

Kui arbeitet genau wie 1» Beispiel 2, verwendet jedoch 0,5 g Insulin, 1.5 g Kaliuabioarbonat, 25 ccb Wasser, 15 cob 95*igee Xthanol, 10 com Acetylaceton und die Realctionsdauer ist 19 Tage. Man erhält 415 ng Polypeptid (Ausbeute: 83 #)» bei den 97,2 Ji Quanidylgruppen in Form von 2-Amino-4,6-dimethylpyri-' oidin blockiert sind.

Sie wie in Beispiel 1 vorsichtig durchgeführte saure Hydrolyse führt cur Freisetzung von ca«, 0,6 Mol Acetylaceton pro Mol Polypeptidο

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren sur Herstellung neuer Polypeptide, dadurch gelennseiohnet, dass man in wäßrigem Medium Insulin oder eines seiner direkten Derivate, wie die H-acylierten Derivate mit ein η Dicarbony!derivat, wie einem ß-Dicarbonylderivat, umsetzt, wobei die Umaetaung bei einem pH zwischen 7,5 and 8„5 bei einer Temperatur swlschen einschliesslich 0 und 25⁰O durchgeführt wird, die Beaktionsmischung durch schwach angesäuertes Wasser auf einen pH «wischen einschliesslich 5 und 6 bringt und ein Polypeptid isoliert, bei dem mindestens 65 # der von den Arginineinholten stammenden Guanidylgruppen In Form einer Verbindung mit dem verwendeten Dlcarbonylderivat blockiert sind, und dasd darüber hinaus pro Mol Insulin «wischen 0 und 2,5 Mol des durch vorsichtige saure Hydrolyse freisusetsenden Dicarbony!derivate enthält.

2. Verfahren gemttas Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ■an «la Polypeptid Isoliert, bei dem die fluanidylgruppe des Argininkettenglieds im Insulin in Porm einer Verbindung mit dea angewendeten Sioarbonylderivat blockiert ist, wobei das Polypeptid darüber hinaus pro Mol Insulin «wischen 0 und

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2»5 Mol der durch vorsichtige saure Hydrolyse freitsusetsenden Dioarbonylrerbindung enthält·

3· Verfahren geaiss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennseichnet» dass das Dl carbonyl derivat i0«tj2AO«tea let.

4· Verfahren gemüse Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet» dass die Kondensationsreaktion in wäßrigem oder wäßrig alkoholischen Milieu in Gegenwart eines Alkalibicarbonate oder einer Pufferlösung, auf Phosphat- oder Boratbasis» durchgeführt wird.

5· Verfahren genäse Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet» dass die Kondeneationsreaktlon in wäßrigem Hilieu in Gegenwart •la·« anderen in Wasser löslichen LösungsBdttftls* wie

LösungsBdtteln uit aono- und poly-Hydroxygruppsn, Diaethylforaaaid, Aceton, Disethylealfoxyd, durchgeführt wird»

6. Verfahren geaäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennseiohnet» dass das Bioarbony!derivat Acetylaceton ist, von dem man einen groseen Oberschuss verwendet, und dass nan bei einer Temperatur swlsehen elnsehllesslloh 20 und 25⁰C arbeitet» wobei der pH bei oa. β liegt.

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BAD ORIGINAL

7. Verfahren but Heretellu&g neuer Polypeptides dadurch gekennaeleJMftfe, Saee Mm ein naoh Sera Verfahren der Ansprtiohe 1 bis 6 erhaltenes Polypepfid einer Tcr ei oh tig en eauren Hydro ljree unterwirft «ηβ el» Polypeptid ieoXiert» das kein durch •lae eolofcs Torslehtig® aaure Hydrolye® frelsuoetaendee Qi-

aelir

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