DE1493095B1 - Process for the production of 3-keto-delta? -Steroids of the androstane or pregnane series - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von S-Keto-zl'^-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe. Im besonderen ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein mikrobiologisches Verfahren, mittels welchem unter Verwendung des neuen Mikroorganismus Nocardia lucida n. sp. eine Doppelbindung in Stellung 1 eines 3-Keto-J⁴-steroids der Androstan- und Pregnanreihe eingeführt werden kann. Nocardia lucida n. sp. wurde beim Institute of Microbiology of the Rutgers University (U. S. A.) mit der Indexnummer I. M. 3890 und bei dem Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew (Surrey, England), mit der Indexnummer I.M.I. 113.416 hinterlegt.The present invention relates to a process for the preparation of S-keto-zl '^ - steroids of the androstane or pregnane series. In particular, the subject of the present invention is a microbiological process by means of which using the new microorganism Nocardia lucida n. Sp. a double bond in position 1 of a 3-keto-J ⁴ steroid of the androstane and pregnane series can be introduced. Nocardia lucida n. Sp. was deposited with the Institute of Microbiology of the Rutgers University (USA) with the index number IM 3890 and with the Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew (Surrey, England) with the index number IMI 113.416.

Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen der Gattung Nocardia fähig sind, eine Doppelbindung in Stellung 1 in das Steroidmolekül einzuführen (britische Patentschrift 874 188, deutsche Patentschrift 1 093 792, französische Patentschrift 1 270 506, indische Patentschrift 62 483). Daraus kann man jedoch nicht schließen, daß alle Mikroorganismen der obenerwähnten Gattung die besagte Dehydrierung bewirken, da bewiesen wurde, daß die Stämme von Nocardia rugosa, N. Brasiliensis, N. caprae und N. frabozae die Doppelbindung in Stellung 1 nicht einzuführen vermögen.It is known that numerous microorganisms of the genus Nocardia are capable of double bond to be introduced into the steroid molecule in position 1 (British patent specification 874 188, German patent specification 1 093 792, French patent 1 270 506, Indian patent 62 483). However, one can do this do not conclude that all microorganisms of the genus mentioned above cause said dehydration, since it was proven that the strains of Nocardia rugosa, N. Brasiliensis, N. caprae and N. frabozae are unable to introduce the double bond in position 1.

Der neue, im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus, der auch mit dem Namen Nocardia lucida n. sp. bezeichnet wird, gehört der Gattung Nocardia Trevisan an und erzeugt solche Enzyme, die eine Dehydrierung in Stellung 1 der 3-Keto-. J⁴-steroide der Androstan- oder Pregnanreihe bewirken, wobei die entsprechenden /I^1>4-Steroide mit hohen Umwandlungsausbeuten erhalten werden.The new microorganism used in the process according to the invention, which is also called Nocardia lucida n. Sp. is called, belongs to the genus Nocardia Trevisan and produces enzymes that cause dehydration in position 1 of the 3-keto-. J ⁴ steroids of the androstane or pregnane series cause the corresponding / I ^{1> 4} steroids to be obtained with high conversion yields.

Der neue Mikroorganismus weist außerdem die überraschende Eigenschaft auf, daß er als Kohlenstoffquelle außer den üblichen Kohlehydraten auch Mischungen von Kohlenwasserstoffen mit vorzugsweise 12 bis 18 Kohlenstoffatomen verwerten kann.The new microorganism also has the surprising property that it acts as a carbon source in addition to the usual carbohydrates, mixtures of hydrocarbons with preferably Can utilize 12 to 18 carbon atoms.

Mikroskopisches AussehenMicroscopic appearance

Der neue Mikroorganismus N. lucida bildet auf Kartoffel-Glukose-Agar anfangs ein Mycel mit sehr langen (25 bis 30 μ · 1,0 bis 1,5 μ), oft verkrümmten, wenig verzweigten, unseptierten Hyphen. Nach etwa 24 Stunden werden die Hyphen kürzer und septiert, und die ersten Fragmente erscheinen als bakteroidartige Elemente von etwa 3 · 0,8 μ Durchmesser.The new microorganism N. lucida initially forms a mycelium with very on potato glucose agar long (25 to 30 μ x 1.0 to 1.5 μ), often crooked, poorly branched, unseptate hyphae. After about For 24 hours the hyphae become shorter and septate, and the first fragments appear as bacteroid-like Elements about 3 x 0.8 μ in diameter.

Eine vollständige Fragmentierung in kokkoidartige Elemente von etwa 1 μ Durchmesser wird erst um die 40. Stunde nachgewiesen. Solche kokkoidartigen Elemente erscheinen häufig charakteristisch angeordnet. A complete fragmentation into coccoid-like elements of about 1 μ in diameter is only possible around the 40th hour proven. Such cocoid-like elements often appear to be characteristically arranged.

In keinem Nährboden konnte die Bildung von Luftmycel nachgewiesen werden. Das Mycel ist gram-positiv und nicht widerstandsfähig gegen Säure. Der Mikroorganismus wächst gut bei einer Temperatur von 28 bis 30⁰C und erzeugt keine löslichen Pigmente auf den üblichen Nährböden.The formation of aerial mycelium could not be detected in any culture medium. The mycelium is gram-positive and not resistant to acid. The microorganism grows well at a temperature of 28 to 30 ^° C. and does not produce any soluble pigments on the usual nutrient media.

Makroskopisches AussehenMacroscopic appearance

In der Tabelle sind die bei den angegebenen Kulturböden beobachteten Eigenschaften angeführt, wobei die Beobachtungen nach einer 7tägigen Bebrütung bei 28 bis 30⁰C durchgeführt wurden.In the table, the observed at the indicated culture soil properties are given, the observations were made after a 7-day incubation at 28 to 30 ⁰ C.

KulturnährbodenCulture medium Wachstumgrowth spärlichsparse Farbecolour BemerkungenRemarks Czapek-Agar¹)Czapek agar ¹ ) reichlich, glatte,plentiful, smooth, von weißlich bis hellrosafrom whitish to light pink Bennet-Agar¹)Bennet agar ¹ ) glänzende Patina mitshiny patina with LachsrosaSalmon pink sauberem Randclean edge kein Wachstumno growth Glycin-glycerin-Agar¹)Glycine-Glycerin-Agar ¹ ) sehr spärlichvery sparse Glycerin- Pepton-Glycerine peptone Rosa, sehr hellPink, very bright Kartoffel-Agar¹)Potato agar ¹ ) reichlich, glatte,plentiful, smooth, Emerson-AgarEmerson agar glänzende Patinashiny patina LachsrosaSalmon pink kein Wachstumno growth Stärke-Agar undStarch agar and Pridham-Salze²)Pridham Salts ² ) reichlich, glatte,plentiful, smooth, Glukose-AgarGlucose agar glänzende Patinashiny patina LachsrosaSalmon pink Hefeextrakt¹)Yeast extract ¹ ) reichlich, glatte,plentiful, smooth, Glukose-Kartoffel-Agar³)Glucose Potato Agar ³ ) glänzende Patinashiny patina LachsrosaSalmon pink spärlichsparse Nutrient-Agar¹)Nutrient agar ¹ ) mäßigmoderate BlaßrosaPale pink Fleischextrakt-Stärke-
Penton-A ear¹)Meat extract starch
Penton-A ear ¹ ) mäßigmoderate sehr helles Rosavery light pink keine Stärkehydrolyseno starch hydrolysis *L w LJ VV-JlJl l^fZytii I
Gelatine-Agar¹)* L w LJ VV-JlJl l ^ fZytii I
Gelatin agar ¹ ) gut, dunkle Brühe, rosawell, dark broth, pink sehr helles Rosavery light pink keine Gelatinverfiüssigungno gelatin liquefaction Hefebrühe¹)Yeast broth ¹ ) Niederschlag auf demPrecipitation on the HellrosaLight pink Bodenfloor spärlichsparse Milchmilk farbloscolorless die Milch wird alkalisch,the milk becomes alkaline, keine Gerinnungno coagulation

') Waksman, S. A., »The Actinomyces«, Vol. II, S. 328 bis 334.') Waksman, S. A., "The Actinomyces", Vol. II, pp. 328 to 334.

²) Pridham, T. C, »Antibiotics Annual«, 1956/1957, S. 947 bis 953. ² ) Pridham, T. C, "Antibiotics Annual", 1956/1957, pp. 947-953.

³) Glukose-Kartoffel-Agar: 200 g geschälte Kartoffeln, 20 g Glukose, 20 g Agar, destilliertes Wasser, 1000 ml bei pH 7,2. ³ ) Glucose potato agar: 200 g peeled potatoes, 20 g glucose, 20 g agar, distilled water, 1000 ml at pH 7.2.

Biochemische EigenschaftenBiochemical properties

Stärke: keine Hydrolyse;Starch: no hydrolysis;

Gelatine: keine Verflüssigung;Gelatin: no liquefaction;

Nitrate: Reduktion zu Nitriten; gute Verwertung der Nitrate für das Wachstum;Nitrates: reduction to nitrites; good utilization of nitrates for growth;

Milch: die Milch wird alkalisch; keine Peptonisierung, keine Gerinnung;Milk: the milk becomes alkaline; no peptonization, no clotting;

Melanin: kaum nachweisbare Bildung; Indol: keine Bildung;Melanin: hardly detectable formation; Indole: no formation;

Tyrosin: Tyrosin wird abgebaut; Erzeugung von H₂S: positive Bleiacetatreaktion;Tyrosine: tyrosine is broken down; Generation of H ₂ S: positive lead acetate reaction;

Säureerzeugung aus Kohlehydraten: positiv aus Glukose, Fruktose, Sorbit, Glycerin und Mannit, negativ aus Xylose, Maltose, Laktose, Saccharose, Arabinose und Inosit.Acid generation from carbohydrates: positive from glucose, fructose, sorbitol, glycerine and mannitol, negative from xylose, maltose, lactose, sucrose, arabinose and inositol.

Die oben angegebenen Kohlenwasserstoffe können zur Züchtung gut verwendet werden. Phenol wird nicht verwertet. *The above hydrocarbons can be used well for cultivation. Will phenol not recovered. *

Identifizierung des StammesIdentification of the tribe

Die Beschreibung des untersuchten Mikroorganis-The description of the examined microorganism

»mus entspricht der Gattung Nocardia Trevisan (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology — Seventh Edition 1957, S. 713 bis 715).»Mus corresponds to the genus Nocardia Trevisan (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology - Seventh Edition 1957, pp. 713 to 715).

Aus dem analytischen Schlüssel der Nocardia-Gattung von Waksman und H e η r i c i (Wa k sm a n, S.A., »The Actinomycetes«, Vol. II, 1961) ergibt sich für den untersuchten Mikroorganismus eine der Nocardia rubra nahestehende systematische Lage. Dennoch unterscheidet sich Nocardia lucida von dem Stamm Nocardia rubra durch verschiedene Eigenschaften. Im nachfolgenden werden die bei Vergleich der Eigenschaften von Nocardia lucida n. sp. mit denjenigen der bekannten Arten erhaltenen Angaben angeführt.From the analytical key of the Nocardia genus by Waksman and H e η r i c i (Wa k sm a n, S.A., "The Actinomycetes", Vol. II, 1961) results for the microorganism examined a systematic situation close to Nocardia rubra. However, Nocardia lucida is different from the strain Nocardia rubra by various properties. In the following, the at Comparison of the properties of Nocardia lucida n. Sp. obtained with those of the known species Information given.

Der neue Stamm Nocardia lucida unterscheidet sich von:The new strain Nocardia lucida differs from:

1. Nocardia rubra:1. Nocardia rubra:

a) weil er kein Mycel mit matt runzeliger Patina von lebhafter roter Farbe bildet,a) because it does not form mycelium with a dull, wrinkled patina of vivid red color,

b) weil er Hyphen länger als 10 bis 15 μ bildet,b) because it forms hyphae longer than 10 to 15 μ,

c) weil er Säuren aus Sorbit bildet.c) because it forms acids from sorbitol.

2. N. opaca:2. N. opaca:

fc a) weil das Mycel auf Glycerin-Kartoffel-Agarfc a) because the mycelium on glycerine potato agar

™ nicht trocken, rauh, gefaltet und lederfarbig ist,™ is not dry, rough, folded and leather-colored,

b) weil er auf Kartoffel-Agar keine Büschel von Lufthyphen bildet,b) because it does not form clusters of aerial hyphae on potato agar,

c) weil er Phenol nicht verwertet,c) because he does not use phenol,

d) weil er viel längere Hyphen (bis 25 bis 30 μ) bildet.d) because it forms much longer hyphae (up to 25 to 30 μ).

3. N. polychromogenes:3. N. polychromogenes:

a) weil er kein weißliches Luftmycel bildet,a) because it does not form a whitish aerial mycelium,

b) weil er keine 70 bis 100 μ langen, sehr verzweigten Fäden bildet,b) because it is not 70 to 100 μ long, very branched Forms threads,

c) weil er die Stärke nicht hydrolysiert.c) because it does not hydrolyze the starch.

4. N. globerula:4. N. globerula:

a) weil er keine Fäden 1 · 2 bis 9 μ bildet,a) because it does not form threads 1 · 2 to 9 μ,

b) weil das Mycel nicht orange oder braunorange gefärbt ist,b) because the mycelium is not colored orange or brown-orange,

c) weil er die Nitrate reduziert.c) because it reduces nitrates.

5. N. coeliaca:5. N. coeliaca:

a) weil er keine kurzen Stäbchen von 0,8 · 5 μ bildet,a) because it does not form short rods of 0.8 5 μ,

b) weil er auf Glycerin-Kartoffel-Agar kein trokkenes gefaltetes Mycel mit Orangefarbe bildet,b) because it does not form dry, folded mycelium with an orange color on glycerine potato agar,

c) weil er die Nitrate reduziert,c) because it reduces nitrates,

d) weil er Säuren aus Glukose und Glycerin bildet.d) because it forms acids from glucose and glycerine.

6. N. blackwellii:6. N. blackwellii:

a) weil er kein weißes Luftmycel bildet,a) because it does not form a white aerial mycelium,

b) weil er keine farblosen Kolonien auf Kartoffel-Agar bildet,b) because it does not form colorless colonies on potato agar,

c) weil er Säuren aus Mannit und Sorbit bildet,c) because it forms acids from mannitol and sorbitol,

d) weil er die Nitrate reduziert.d) because it reduces nitrates.

7. N. asteroides:7. N. asteroides:

a) weil er kein Mycel von gelber oder oranger Farbe bildet,a) because it does not form a mycelium of yellow or orange color,

b) weil er kein weißes Luftmycel bildet,b) because it does not form a white aerial mycelium,

c) weil er Säuren aus Mannit bildet,c) because it forms acids from mannitol,

d) weil er die Kristalle des Tyrosins abbaut.d) because it breaks down the crystals of tyrosine.

8. N. leishmanii:8. N. leishmanii:

a) weil er kein Luftmycel bildet,a) because it does not form aerial mycelium,

b) weil er die Milch nicht koaguliert,b) because it does not coagulate the milk,

c) weil er säurefest ist.c) because it is acid-proof.

9. N. formica:9. N. formica:

a) weil sich die Hyphen des Mycels in kokkoidartigen Formen fragmentieren,a) because the hyphae of the mycelium fragment into coccoid-like shapes,

b) weil er kein Luftmycel bildet,b) because it does not form aerial mycelium,

c) weil er kein braunes lösliches Pigment bildet,c) because it does not form a brown soluble pigment,

d) weil er Paraffin verwertet.d) because it uses paraffin.

10. N. gardneri:10. N. gardneri:

a) weil er Gelatine nicht verflüssigt,a) because it does not liquefy gelatin,

b) weil er Säuren aus Glukose oder Mannit bildet,b) because it forms acids from glucose or mannitol,

c) weil er kein cremefarbiges Mycel aufweist,c) because it has no cream-colored mycelium,

d) weil er kein Luftmycel bildet.d) because it does not form aerial mycelium.

11. N. crythropolis:11. N. crythropolis:

a) weil er Hyphen langer als 11 μ (bis 25 bis 30 μ) aufweist,a) because he hyphae longer than 11 μ (up to 25 to 30 μ) having,

b) weil er kokkoidartige Elemente bildet,b) because it forms cokcoid-like elements,

c) weil er kein trockenes, runzeliges, orangefarbiges Mycel auf Glycerin-Kartoffel-Agar bildet,c) because there is no dry, wrinkled, orange-colored mycelium on glycerine-potato agar forms,

d) weil er Nitrate zu Nitriten reduziert,d) because it reduces nitrates to nitrites,

e) weil er Säuren aus Glukose und Glycerin bildet.e) because it forms acids from glucose and glycerine.

12. N. rugosa:12. N. rugosa:

a) weil er kein Mycel mit dicker, gefalteter, cremefarbiger Schicht aufweist,a) because it has no mycelium with a thick, folded, cream-colored layer,

b) weil er Milch nicht koaguliert,b) because he does not coagulate milk,

c) weil er Gelatine nicht verflüssigt,c) because it does not liquefy gelatin,

d) weil er Nitrate reduziert,d) because it reduces nitrates,

e) weil er keine Säuren aus Arabinose bildet und Säuren aus Sorbitol produziert.e) because it does not form acids from arabinose and produces acids from sorbitol.

13. N. brasiliensis:13. N. brasiliensis:

a) weil er kein lederfarbiges Luftmycel bildet,a) because it does not form a leather-colored aerial mycelium,

b) weil er Gelatine nicht verflüssigt,b) because it does not liquefy gelatin,

c) weil er keine Säuren aus Inosit bildet,c) because it does not form acids from inositol,

d) weil er kein gefaltetes, gelbfarbiges Mycel auf Glukose-Hefeextrakt-Agar bildet.d) because it does not form folded, yellow-colored mycelium on glucose-yeast extract agar.

14. N. caprae:14. N. caprae:

a) weil er kein Luftmycel bildet,a) because it does not form aerial mycelium,

b) weil er keine braunen löslichen Substanzen bildet,b) because it does not form any brown soluble substances,

c) weil er Milch nicht koaguliert,c) because he does not coagulate milk,

d) weil er Paraffin verwertet.d) because it uses paraffin.

15. N. petroleophila:15. N. petroleophila:

a) weil er kein weißes Luftmycel bildet,a) because it does not form a white aerial mycelium,

b) weil er keine gelbweißlichen Kolonien auf Pepton-Fleischextrakt-Agar bildet,b) because it does not form yellow-white colonies on peptone meat extract agar,

c) weil er auf Kartoffeln wächst.c) because it grows on potatoes.

16. N. corallina:16. N. corallina:

a) weil er auf Glycerin-Kartoffel-Agar kein gehobenes, trockenes Mycel mit gelbbraunen oder korallenroten Falten bildet,a) because on glycerine potato agar there is no upscale, forms dry mycelium with yellow-brown or coral-red folds,

b) weil er Hyphen langer als 10 μ (bis 25 bis 30 μ) bildet,b) because he hyphae longer than 10 μ (up to 25 to 30 μ) forms,

c) weil er Phenol nicht verwertet,c) because he does not use phenol,

d) weil er keine rosa Schicht auf der Milchoberfläche bildet,d) because it does not form a pink layer on the milk surface,

e) weil er Säuren aus Glukose bildet.
17. N. salmonicolor:e) because it forms acids from glucose.
17. N. salmonicolor:

a) weil er auf Pepton-Fleischextrakt-Agar kein zusammengefaltetes, gelbes, in orangerote Farbe übergehendes Mycel aufweist,a) because on peptone meat extract agar there is no folded, yellow, orange-red Mycelium has faded color,

b) weil er Säuren aus Glukose und Glycerin bildet, ■b) because it forms acids from glucose and glycerine, ■

c) weil er auf Kartoffeln kein gehobenes, warziges, brüchiges, glänzendes, lederfarbiges Mycel, dessen Farbe dann in orange und blutrote Farbe übergeht, bildet.c) because there is no raised, warty, brittle, shiny, leather-colored mycelium on potatoes, the color of which then changes to orange and blood-red color.

Daraus kann geschlossen werden, daß der untersuchte Mikroorganismus von den bisher bekannten Arten verschieden ist, und deshalb wurde ihm der Name Nocardia lucida n. sp. gegeben.From this it can be concluded that the microorganism examined is different from the previously known Species is different, and therefore the name Nocardia lucida n. Sp. given.

Der Mikroorganismus N. lucida kann durch Gefriertrocknung aufbewahrt werden, wobei Milch oder Milchserum als Aufschlämmungsmittel verwendet werden. Er kann auch durch aufeinanderfolgende Züchtung auf Glukose-Kartoffel-Agar aufbewahrt werden.The microorganism N. lucida can be preserved by freeze drying, using milk or Milk serum can be used as a suspending agent. He can also by successive Cultivation can be kept on glucose-potato agar.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-/l^I4-steroiden der Androstan-* oder Pregnanreihe durch Bebrütung eines entsprechenden 3-Keto-/l⁴-steroids mit einer Kultur der Gattung Nocardia unter submersen und aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff-, Stickstoffquelle und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bebrütung mit einer Kultur von Nocardia lucida n. sp. durchgeführt wird. Darauf wird das resultierende 3-Keto-J¹ ^-steroid in bekannter Weise extrahiert.The present invention is a process for the preparation of 3-keto / l ^I4-steroids of the androstane or pregnane * by incubation of a corresponding 3-keto / l ⁴ -steroid with a culture of the genus Nocardia and under submerged aerobic conditions in a nutrient medium containing carbon, nitrogen and mineral salts, which is characterized in that the incubation with a culture of Nocardia lucida n. sp. is carried out. The resulting 3-keto-J ¹ ^ steroid is then extracted in a known manner.

Als Kohlenstoffquelle können Stärke, Dextrin, Melasse, Saccharose, Glukose, Maltose, Glycerin, Pflanzenöle, Getreide- und Hülsenfrüchtemehl, Getreideweiche und andere hierfür übliche Substanzen verwendet werden. Als Stickstoffquelle kommen außer einigen der obenerwähnten stickstoffhaltigen Substanzen auch Kasein, Ammoniumsalze, Peptone, Fleisch- und Fischmehl oder andere für diesen Zweck üblicherweise verwendete Substanzen in Frage. Die anorganischen Salze können Sulfate, Phosphate, Chloride oder Nitrate von Natrium, Kalium, Magnesium, Eisen oder Kobalt sowie Calciumkarbonat sein. Die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen, wie »Tween 80« (eingetragene Schutzmarke für PoIyoxyäthylen-sorbitan-monooleat), ist ebenfalls nützlich.Starch, dextrin, molasses, sucrose, glucose, maltose, glycerin, Vegetable oils, cereal and legume flour, cereal softening and other substances customary therefor be used. In addition to some of the nitrogen-containing substances mentioned above, the nitrogen source is used also casein, ammonium salts, peptones, meat and fish meal or others for this Purpose commonly used substances in question. The inorganic salts can be sulfates, phosphates, Chlorides or nitrates of sodium, potassium, magnesium, iron or cobalt as well as calcium carbonate. The use of surface-active substances such as "Tween 80" (registered trademark for polyoxyethylene sorbitan monooleate), is also useful.

Es wurde außerdem überraschenderweise gefunden, daß die obenerwähnten Kohlenstoffquellen vollständig durch rohe Gasöl-Paraffin-Mischungen ersetzt werden können. Der Mikroorganismus verwendet vorzugsweise Mischungen von Kohlenwasserstoffen, die 12 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten.It has also surprisingly been found that the above-mentioned carbon sources completely can be replaced by crude gas oil-paraffin mixtures. The microorganism preferably uses Mixtures of hydrocarbons containing 12 to 18 carbon atoms.

Der Mikroorganismus wird unter submersen und aeroben Bedingungen in Drehkolben oder in Fermentern bei einer Temperatur zwischen 24 und 34° C, vorzugsweise bei 30° C, während einer Zeit von 30 bis 50 Stunden kultiviert. Der pH-Wert des Nährbodens muß zwischen 7 und 8 liegen, vorzugsweise zwischen 7,5 und 7,6. Während der Gärung bleibt der pH-Wert praktisch beständig.The microorganism is grown under submerged and aerobic conditions in rotary flasks or in fermenters at a temperature between 24 and 34 ° C, preferably at 30 ° C, for a period of 30 cultivated for up to 50 hours. The pH of the nutrient medium must be between 7 and 8, preferably between 7.5 and 7.6. The pH value remains practically constant during fermentation.

Das Ausgangssteroid kann der Mikroorganismenkultur entweder in fester Form oder in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Aceton, Dimethylformamid oder deren Analogen, gelöst zugesetzt werden. Die Fermentierung wird unter den gleichen Bedingungen während 20 bis 50 Stunden ausgeführt.The starting steroid can be the microorganism culture either in solid form or in a suitable one organic solvents such as methyl alcohol, ethyl alcohol, acetone, dimethylformamide or their analogues, added in solution. The fermentation takes place under the same conditions carried out for 20 to 50 hours.

Die Umwandlung des 3-Keto-/1⁴-steroids in das entsprechende 3-Keto-il¹⁴-steroid wird durch Dünnschichtchromatographie festgestellt (vgl. Egon Stahl, Pharmac. Weekblad, 92, 1957, S. 829; Chemiker Zeitung, 82, 1958, S. 323; Va η D a m und Mitarb, J. Chromatography, 4, 1960, S. 26). Die Extraktion kann nach bekannten Verfahren ausgeführt werden, wobei die Gärungsbrühe mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, Chloroform, Methylenchlorid, Trichloräthylen und deren Analogen, ausgeschüttelt wird.The conversion of the 3-keto / 1 ⁴ -steroid to the corresponding 3-keto-steroid il ¹⁴ is determined by thin layer chromatography (see, Egon Stahl, Pharmac Weekblad, 92, 1957, S. 829;.. Chemiker Zeitung, 82, 1958, p. 323; Va η D am and Mitarb, J. Chromatography, 4, 1960, p. 26). The extraction can be carried out according to known methods, the fermentation broth being shaken out with a suitable solvent such as methyl isobutyl ketone, chloroform, methylene chloride, trichlorethylene and their analogues.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.The following examples explain the process according to the invention.

Beispiel 1
/|¹⁴-Pregnadien-17a,21-diol-3,l 1,20-trionexample 1
/ | ^14- Pregnadiene-17a, 21-diol-3, l 1,20-trione

Eine 3 Tage alte Kultur von N. lucida auf Kartoffel-Glukose-Agar gezüchtet wird benutzt, um zwei 300-ml- Λ Erlenmeyerkolben, die je 50 ml des folgenden Nähr- ^ bodens enthalten, zu beimpfen:Bred a 3 day old culture of N. lucida on potato glucose agar is used to two 300-ml Erlenmeyer flask Λ that ml per 50 of the following nutrients ^ soil contained to inoculate:

KCl IgKCl Ig

NaNO₃ 6 gNaNO ₃ 6 g

Wasserfreies MgSO₄ 0,3 gAnhydrous MgSO ₄ 0.3 g

Ca(H₂PO₄J₂-H₂O -4,0gCa (H ₂ PO ₄ J ₂ -H ₂ O -4.0g

FeSO₄ · 7 H₂O 20 mgFeSO ₄ · 7 H ₂ O 20 mg

ZnSO₄ ■ 7 H₂O 5 mgZnSO ₄ · 7 H ₂ O 5 mg

CoCl₂-OH₂O 5 mgCoCl ₂ -OH ₂ O 5 mg

Mischung 1:1 von Gasöl (spezifisches
Gewicht bei 15°C/4°C = 0,8203);
Flammpunkt 72° C und von rohem
Paraffin (Dichte bei 15⁰C = 0,891;
Dichte bei 8O⁰C = 0,772); Erstarrungspunkt der entstandenen Mischung: 46°C 15 ml Mixture 1: 1 of gas oil (specific
Weight at 15 ° C / 4 ° C = 0.8203);
Flash point 72 ° C and of raw
Paraffin (density at 15 ⁰ C = 0.891;
Density at 8O ⁰ C = 0.772); Freezing point of the resulting mixture: 46 ° C 15 ml

Leitungswasser 1000 mlTap water 1000 ml

Der pH-Wert wird mit verdünnter Natronlauge auf 7,5 bis 7,6 eingestellt, Sterilisation 30 Minuten bei 120°C. _ä The pH is adjusted to 7.5 to 7.6 with dilute sodium hydroxide solution, sterilization at 120 ° C. for 30 minutes. _Ä

Die Gasöl-Paraffin-Mischung wird separat sterili- % siert und dem Nährboden unter steriler Bedingung hinzugefügt;The gas oil-paraffin mixture is Siert separately sterilized% and added to the culture medium under sterile condition;

Man fermentiert die Kultur bei 30° C auf einem Schüttelgerät mit 220 U/min und einer Exzentrizität von 6 cm.The culture is fermented at 30 ° C. on a shaker at 220 rpm and an eccentricity of 6 cm.

Nach 40 Stunden werden in jeden Kolben 25 mg /f^-Pregnen-na^l-diol^ll^O-trion, in 1 ml Äthanol gelöst, eingebracht, und das Gemisch wird unter denselben Bedingungen weiter 24 Stunden fermentiert. Die chromatographische Prüfung (Dünnschichtplatten aus Silikagel, Lösungsmittel Benzol zu Äthylazetat 70:30) zeigt fast vollständiges Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Stoffes, dessen Rf-Wert demjenigen des /1^1A-Pregnadien-I7a, 21-diol-3,ll-20-trions gleich ist.After 40 hours, 25 mg / f ^ -Pregnen-na ^ l-diol ^ ll ^ O-trione dissolved in 1 ml ethanol are introduced into each flask, and the mixture is fermented for a further 24 hours under the same conditions. The chromatographic test (thin-layer plates made of silica gel, solvent benzene to ethyl acetate 70:30) shows almost complete disappearance of the starting product and the formation of a substance whose Rf value ^{matches that of des / 1 1A} -Pregnadiene-17a, 21-diol-3, II- 20-trions is the same.

Extraktion, Kristallisation und Identifizierung werden in der folgenden Weise ausgeführt: Der Inhalt der beiden Kolben wird vereinigt, mit 50 ml Petroläther in einem Scheidetrichter heftig ausgeschüttelt, worauf die Petrolätherschicht verworfen wird. Die Brühe wird dann nochmals mit Methylisobutylketon extrahiert; der organische Auszug wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockene eingedampft.Extraction, crystallization and identification are carried out in the following way: The content the two flasks are combined, vigorously shaken out with 50 ml of petroleum ether in a separating funnel, whereupon the petroleum ether layer is discarded. The broth is then again made with methyl isobutyl ketone extracted; the organic extract is dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and used Evaporated dry.

Der trockene Rückstand wird an 1 g Silicagel chromatographiert. Durch Eluieren mit 5% Äthyläther—Äthylacetat erhält man ein kristallines Produkt, das bei 230 bis 234°C schmilzt; [a]f = +170° (1% in Dioxan), k_max = 238 ηΐμ, EJ* = 435.The dry residue is chromatographed on 1 g of silica gel. Eluting with 5% ethyl ether-ethyl acetate gives a crystalline product which melts at 230 ° to 234 ° C .; [a] f = + 170 ° (1% in dioxane), k _max = 238 ηΐμ, EJ * = 435.

Das gewonnene Produkt erwies sich chromatographisch und bei IR-Untersuchung einer authentischen Probe von J¹⁴-Pregnadien-17a,21-diol-3,ll-20-trion gleich. Eine chromatographische Prüfung zeigt, daß die Umwandlung vollständig und die Ausbeute hoch ist. Ausbeute: 75%.The product obtained was found to be identical by chromatography and on IR examination of an authentic sample of J ¹⁴ -pregnadiene-17a, 21-diol-3, ll-20-trione. Chromatographic examination shows that the conversion is complete and the yield is high. Yield: 75%.

Beispiel 2Example 2

Λ¹ -⁴-Pregnadien-l 7a,21 -diol-3,11-20-trion Λ ^1-4 -Pregnadien-l 7a, 21-diol-3.11-20-trione

1515th

Die Fermentierung wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt mit dem Unterschied, daß der Nährboden Glukose (60 g/l) an Stelle der rohen Gasöl-Paraffin-Mischung enthält. Die chromatographische Analyse bestätigt das fast vollständige Verschwinden des Ausgangsproduktes unter gleichzeitiger Bildung eines Stoffes mit einem Rf-Wert, der dem des zl'^-Pregnadien-na^l-diol^ll^O-trions gleich ist. Ausbeute: 85%·The fermentation is carried out as described in Example 1 with the difference that the nutrient medium contains glucose (60 g / l) instead of the raw gas oil-paraffin mixture. The chromatographic Analysis confirms the almost complete disappearance of the starting product with simultaneous Formation of a substance with an Rf value equal to that of the zl '^ - Pregnadien-na ^ l-diol ^ ll ^ O-trions. Yield: 85%

2525th

Beispiel 3Example 3

Die Fermentierung wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt mit dem Unterschied, daß der Nährboden folgende Zusammensetzung hat:The fermentation is carried out as described in Example 1 with the difference that the nutrient medium has the following composition:

Glukose 20 gGlucose 20 g

Pepton*) 5 gPeptone *) 5 g

Tripton*) 5 gTripton *) 5 g

Hefeextrakt 5 gYeast extract 5 g

CaCOs 2,5 gCaCOs 2.5 g

Destilliertes Wasser 1000 mlDistilled water 1000 ml

*) Handelsnamen fur enzymatisch hydrolysierte Fleischextrakte.*) Trade names for enzymatically hydrolyzed meat extracts.

Die chromatographische Prüfung zeigt das fast völlige Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Produktes mit einem Rf-Wert gleich Dann wird unter den gleichen Bedingungen weitere 40 Stunden fermentiert. Die chromatographische Analyse auf dünner Silicagelschicht, wobei als chromatographisches System * Chloroform zu Methanol zu Wasser 92,5:7,5:0,5 verwendet wird, bestätigt das Verschwinden der Ausgangsverbindung und die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des Prednisolons gleich ist.The chromatographic test shows the almost complete disappearance of the starting product and the Formation of a product with an Rf value equal to Then, under the same conditions, further Fermented for 40 hours. Chromatographic analysis on a thin layer of silica gel, being used as a chromatographic System * Chloroform to methanol to water 92.5: 7.5: 0.5 is used confirms this Disappearance of the starting compound and the formation of a product whose Rf value corresponds to that of the Prednisolone is the same.

Die Brühe wird mit Methylisobutylketon extrahiert, der organische Auszug über Natriumsulfat getrocknet und dann zur Trockene eingedampft. Der trockene Rückstand wird zwischen 500 ml Petroläther mit einer Siedestrecke von 60 bis 80°C und 600 ml 80%igem wäßrigem Methanol verteilt.The broth is extracted with methyl isobutyl ketone, the organic extract over sodium sulfate dried and then evaporated to dryness. The dry residue is between 500 ml of petroleum ether distributed with a boiling range of 60 to 80 ° C and 600 ml of 80% aqueous methanol.

Der Methanolextrakt wird abgetrennt und im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft.The methanol extract is separated and evaporated to a small volume in vacuo.

Das Konzentrat wird mit 600 ml Methylisobutylketon extrahiert, dann mit wenig Wasser gewaschen, worauf der organische Extrakt auf ein Volumen von etwa 5 ml eingedampft wird; dann werden 20 ml Äthyläther hinzugefügt, und die Mischung wird zum Auskristallisieren in einen Kühlschrank gebracht.The concentrate is extracted with 600 ml of methyl isobutyl ketone, then washed with a little water, whereupon the organic extract is evaporated to a volume of about 5 ml; then 20 ml Ethyl ether is added and the mixture is placed in a refrigerator to crystallize.

Man erhält 1,3 g (87%) zl^-Pregnadieh-i 1/3,17a, 21-triol-3,20-dion, das bei 240 bis 241°C schmilzt; [a]f= +100° (1% Dioxan), A_max=242m^ EJ*. = 415; mit einer authentischen Probe von zl^li4-Pregnadien-ll/S,17a,21-triol-3,20-dion erweist es sich bei der chromatographischen Prüfung als identisch und verschieden von zf^d1.3 g (87%) of zl ^ -Pregnadieh-i 1 / 3.17a, 21-triol-3,20-dione, which melts at 240 to 241 ° C., are obtained; [a] f = + 100 ° (1% dioxane), A _max = 242m ^ EJ *. = 415; With an authentic sample of zl ^li4 -Pregnadien-ll / S, 17a, 21-triol-3,20-dione, it turns out to be identical and different from zf ^ d in the chromatographic test

3535

4040

dem des
Ausbeute:the des
Yield:

l'-⁴-Pregnadien-17a,21 -diol-3,11,20-trions. 80%·l'- ⁴ -pregnadiene-17a, 21-diol-3,11,20-trione. 80%

Beispiel 4 A^{1 A}-Pregnadien-11 /3,17a,21 -triol-3,20-dionExample 4 A ^{1 A} -Pregnadiene-11 / 3,17a, 21 -triol-3,20-dione

500 ml Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1 werden in 2000-ml-Kolben sterilisiert, die mit drei Wellenbrechern versehen sind. Sie werden mit einer Mycelsuspension angeimpft, die durch Waschen einer halben, 3 Tage lang in einem Roux-Kolben auf Kartoffel-Glukose-Agar gezüchteten Kultur gewonnen wurde.500 ml of nutrient medium of the same composition as in Example 1 are placed in 2000 ml flasks sterilized, which are provided with three breakwaters. You will be inoculated with a mycelial suspension, cultured by washing for half a day, 3 days in a Roux flask on potato-glucose agar Culture was won.

Die Kolben werden 36 Stunden bei 28° C auf einem Schüttelgerät mit 120 U/min und einer Exzentrizität von 70 mm inkubiert. 300 ml jener Kultur dienen zum Animpfen von 3 1 eines in 5-1-Laborfermentern sterilisierten Nährmediums der gleichen Zusammensetzung.The flasks are placed on a shaker at 120 rpm and eccentricity at 28 ° C. for 36 hours incubated from 70 mm. 300 ml of that culture are used to inoculate 3 liters of one sterilized in 5-1 laboratory fermenters Nutrient medium of the same composition.

Die Fermentierung wird mit einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/min mit einer Luftzufuhr von 11 t/min bei einer Temperatur von 30° C ausgeführt.The fermentation is carried out at a stirring speed of 300 rpm with an air supply of 11 t / min at a temperature of 30 ° C.

Nach 48 Stunden Fermentierung werden 1,5 g A⁴- Pregnen -11/S,17a,21 - triol - 3,20 - dion, gelöst in 60 ml Methylalkohol, zugefügt.After 48 hours of fermentation, 1.5 g of A ⁴ - Pregnen -11 / S, 17a, 21 - triol - 3,20 - dione, dissolved in 60 ml of methyl alcohol, are added.

Beispiel 5
I^{1 A}-pregnadien-l 1 /3,17a,21 -triol-3,20-dionExample 5
I ^{1 A} -pregnadiene-l 1 / 3.17a, 21 -triol-3,20-dione

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 48 Stunden erreicht hat, 25 mg 9a-Fluor-/l*-pregnen-l 1 /3,17a,21 -triol-3,20-dion hinzugefügt werden, die in 1 ml Methanol in Gegenwart von 0,1 ml einer 20%igen wäßrigen Lösung von Polyoxyäthylen - sorbitan - monooleat (»Tween 80«) gelöst sind. Nach 40 Inkubationsstunden bestätigt die chromatographische Analyse das vollständige Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des 9a-Fluor-J¹'*-pregnadien-ll_j8,17a,21-triol-3,20-dions gleich ist.The procedure is as in Example 1 with the difference that when the culture has reached the age of 48 hours, 25 mg of 9a-fluorine / l * -pregnen-l 1 / 3.17a, 21 -triol-3.20- dione are added, which are dissolved in 1 ml of methanol in the presence of 0.1 ml of a 20% strength aqueous solution of polyoxyethylene sorbitan monooleate ("Tween 80"). After 40 hours of incubation, the chromatographic analysis confirmed the complete disappearance of the starting material and the formation of a product having Rf value to that of ^9a-fluoro-1 J '* -Pregnadien-ll _j 8,17a, 21-triol-3,20-dione is equal to.

Dann wird mit Methylisobutylketon extrahiert und anschließend zwischen 80%igem wäßrigem Methanol und Petroläther verteilt, worauf das Methanol abgedampft und der Rückstand nochmals mit Methylisobutylketon, wie im Beispiel 4, extrahiert wird. Man erhält mit 71%iger Ausbeute das 9a-Fluor-J^i;4-pregnadien-ll/3,17a,21-triol-3,20-dion, das bei 274 bis 275°C schmilzt; [a]f = +94° (Dioxan); l_max = 238 ΐημ, EJ* = 404.It is then extracted with methyl isobutyl ketone and then partitioned between 80% aqueous methanol and petroleum ether, whereupon the methanol is evaporated and the residue is extracted again with methyl isobutyl ketone, as in Example 4. ^{The 9a-fluoro-Ji; 4} -pregnadiene-II / 3.17a, 21-triol-3,20-dione, which melts at 274 to 275 ° C., is obtained in a 71% yield; [a] f = + 94 ° (dioxane); l _max = 238 ΐημ, EJ * = 404.

Beispiel 6Example 6

9a-Fluor-J¹-⁴-pregnadien-ll£,16a,17a,21-tetroi-3,20-dion 9a-fluoro-J ^1-4 -Pregnadien-ll £, 16a, 17a, 21-tetroi-3,20-dione

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem einzigen Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von Stunden erreicht hat, 25 mg 9a-Fluor-zI⁴-pregnenll/?,16a,17a,21-tetrol-3,20-trion hinzugefügt werden, die in 1 ml Methanol in Gegenwart von 0,1 ml einer 20%igen wäßrigen Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat-Lösung gelöst sind. Nach 40 Inkubationstagen bestätigt die chromatographische Analyse das Verschwinden des Ausgangsproduktes und die BildungThe procedure is as in Example 1 with the only difference that when the culture has reached the age of hours, 25 mg of 9a-fluoro-zI ⁴ -pregnenII / ?, 16a, 17a, 21-tetrol-3,20-trione are added are dissolved in 1 ml of methanol in the presence of 0.1 ml of a 20% aqueous polyoxyethylene sorbitan monooleate solution. After 40 days of incubation, chromatographic analysis confirms the disappearance of the starting product and its formation

009525/285009525/285

eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des 9a - Fluor - zl¹·⁴ - pregnadien - ίίβ,16α,17α21 - tetrol-3,20-dions gleich ist. Die nach der gleichen Methode, wie im Beispiel 4 beschrieben, ausgeführte Extraktion führt zur Trennung des 90-FIuOr-Zl¹ ^-pregnadienll/U6a,17a,21 -tetrol-3^0-dions in 60%iger Ausbeute, das bei 260 bis 266° C schmilzt; [α]? = +67° * (1% Dioxan), X_max = 239 πΐμ, EJ* = 385. Drei Dünnschichtchromatogramme auf Silicagel zeigen, daß das Produkt mit Triamcinolon identisch ist.of a product whose Rf value is the same as that of 9a - fluorine - zl ¹ · ⁴ - pregnadiene - ίίβ, 16α, 17α21 - tetrol-3,20-dione. The extraction carried out by the same method as described in Example 4 leads to the separation of the 90-FIuOr-Zl ¹ ^ -pregnadienll / U6a, 17a, 21-tetrol-3 ^ 0-dione in 60% yield, which at 260 melts up to 266 ° C; [α]? = + 67 ° * (1% dioxane), X _max = 239 πΐμ, EJ * = 385. Three thin-layer chromatograms on silica gel show that the product is identical to triamcinolone.

Beispiel 7Example 7

9a-Fluor-/l^1A-pregnadien-llftl6a,17a,21-tetrol-3,20-dion 9a-fluorine- / ^1A -pregnadiene-llftl6a, 17a, 21-tetrol-3,20-dione

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 30 Stunden erreicht hat, diese im Verhältnis 1 Teil Kulturbrühe/ zu 2 Teile steriles Leitungswasser verdünnt wird. Nach der Verdünnung werden in jeden Kolben 25 mg 9a-FIuor-zl⁴-pregnen-ll^,16a,17a^l-tetrol-3,20-dion, gelöst in 0,125 ml Dimethylformamid in Gegenwart eines Tropfens einer 20%igen wäßrigen Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat-Lösung, zugefügt. Anschließend wird weitere 40 Stunden fermentiert. Die chromatographische Analyse bestätigt das Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des 9a-Fluor-J¹⁴-pregnadien-l 1 β,ίβα,ίΊα^λλ-tetrol-3,20-dions entspricht. Das 20/9-Hydroxyderivat ist praktisch abwesend.The procedure is as in Example 1, with the difference that when the culture has reached the age of 30 hours, it is diluted in a ratio of 1 part of culture broth to 2 parts of sterile tap water. After dilution, 25 mg of 9a-fluorine-zl ⁴ -pregnen-II ^, 16a, 17a ^ l-tetrol-3,20-dione, dissolved in 0.125 ml of dimethylformamide in the presence of a drop of 20% strength aqueous polyoxyethylene, are added to each flask sorbitan monooleate solution, added. It is then fermented for another 40 hours. The chromatographic analysis confirms the disappearance of the starting product and the formation of a product whose Rf value ^{corresponds to that of 9a-fluoro-J 14} -pregnadiene-l 1 β, ίβα, ίΊα ^ λλ -tetrol-3,20-dione. The 20/9 hydroxy derivative is practically absent.

Extraktion nach dem Verfahren gemäß Beispiel 4 führt zur Abtrennung des 9U-FIuOr-Zl^{1 A}-pregnadienll/U6a,17a,21-tetrol-3,20-dions. Ausbeute: 68%·Extraction according to the method according to Example 4 leads to the separation of the 9U-FIuOr-Zl ^{1 A} -pregnadienll / U6a, 17a, 21-tetrol-3,20-dione. Yield: 68%

35 Beispiel 8 35 Example 8

ji ·*. Pregnadien-17o^l -diol-3,11,20-trionji *. Pregnadien-17o ^ l -diol-3,11,20-trione

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem einzigen Unterschied, daß bei der Zusammensetzung des Nährmediums das NaNO₃ und das Ca(H₂PO.^ durch (NH₄)J₂HPO₄ in einer Konzentration von 4,7 g/l ersetzt werden. Die chromatographische Analyse bestätigt das vollständige Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des zl^M-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trions entspricht. Die wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführte Extraktion führt zur Abtrennung des Prednisons in einer Ausbeute von 65%.The procedure is as in Example 1 with the only difference that in the composition of the nutrient medium the NaNO ₃ and the Ca (H ₂ PO. ^ Are replaced by (NH ₄ ) _{I 2} HPO ₄ in a concentration of 4.7 g / l The chromatographic analysis confirms the complete disappearance of the starting product and the formation of a product whose Rf value ^{corresponds to that of the zl M} -pregnadiene-17a, 21-diol-3,11,20-trione leads to the separation of the prednisone in a yield of 65%.

. Beispiel 9 . Example 9

17a-Methyl-17a-methyl

ienO,! 70-diol-3-onienO ,! 70-diol-3-one

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 48 Stunden erreicht hat, 25 mg per Kolben 17a-Methyl-J^androsten^n/J-diol-S-on, gelöst in 0,125 ml Dimethylformamid in Gegenwart eines Tropfens einer 20%ig^en wäßrigen Polyoxyäthyten-sorbitan-monooleat-Lösung, zugefügt werden. Anschließend wird weitere 24 Stunden fermentiert. Die chromatographische Analyse bestätigt die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des 17o-Methyl-il¹'*-androstadien-3,170-diol-3-ons entsprichtThe procedure is as in Example 1 with the difference that when the culture has reached the age of 48 hours, 25 mg per flask of 17a-methyl-I ^ androsten ^ n / I-diol-S-one, dissolved in 0.125 ml of dimethylformamide in the presence of a drop of a 20% strength aqueous ^en Polyoxyäthyten sorbitan monooleate solution are added. It is then fermented for a further 24 hours. Chromatographic analysis confirms the formation of a product whose Rf value corresponds to that of 17o-methyl-il ¹ '* -androstadien-3,170-diol-3-one

Der Inhalt von 20 Kolben wirdmit 200 ml Methylenchlorid extrahiert, worauf das Lösungsmittel eingedampft und der Rückstand aus Aceton—Petroläther umkristallisiert wird. Es werden Kristalle von 17a-MethyI-/l^1A-androstadien-3,17/3-diol-3-on erhalten, die bei 160 bis 162°C schmelzen; [a]2> = +85° (CHCl₃); 4«. = 244 mm Ei* = 260; 305 πΐμ, EJ* = 175. Ausbeute: 70%.The contents of 20 flasks are extracted with 200 ml of methylene chloride, the solvent is evaporated and the residue is recrystallized from acetone-petroleum ether. Crystals of 17a-methyl / l ^1A -androstadien-3,17 / 3-diol-3-one are obtained which melt at 160 to 162 ° C .; [α] 2> = + 85 ° (CHCl ₃ ); 4 «. = 244 mm egg * = 260; 305 πΐμ, EJ * = 175. Yield: 70%.

Beispiel 10
1 Ta-Methyl-J¹⁴-androstadien-l 7£-ol-3-onExample 10
1 Ta-methyl-J ¹⁴ -androstadien-l 7 £ -ol-3-one

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem einzigen Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 48 Stunden erreicht hat, 25 mg per Kolben 17a-Methyl-/f^-androsten-n/S-ol-S-on, gelöst in 0,125 ml Dimethylformamid, zugefügt werden. Hierauf wird weitere 24 Stunden fermentiert. Die chromatographische Analyse bestätigt die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des Ha-Methyl-zl^-androstadien-17/S-ol-3-ons entspricht. Durch die Extraktion erhält man Kristalle des 17a-Methyl-/4^1>4-androstadien-17/?-ol-3-ons, die bei 163 bis 165°C schmelzen; [α]? = 0° (CHCl₃); l_max = 245 ηΐμ, Ε}* = 510. Ausbeute: 72%.The procedure is as in Example 1 with the only difference that when the culture has reached the age of 48 hours, 25 mg per flask of 17a-methyl- / f ^ -androsten-n / S-ol-S-one, dissolved in 0.125 ml of dimethylformamide are added. This is followed by fermentation for a further 24 hours. Chromatographic analysis confirms the formation of a product whose Rf value corresponds to that of Ha-methyl-zl ^ -androstadien-17 / S-ol-3-one. The extraction gives crystals of 17a-methyl- / 4 ^{1> 4} -androstadien-17 /? - ol-3-one, which melt at 163 to 165 ° C; [α]? = 0 ° (CHCl ₃ ); l _max = 245 ηΐμ, Ε} * = 510. Yield: 72%.

B e i s ρ i e 1 11B e i s ρ i e 1 11

6a,9a-Difluor- A¹ -⁴-pregnadien-l 1 ß,l 7a,21 -triol-3,20-dion 6a, 9a-difluoro- A ^1-4 -Pregnadien-l 1 Q, l 7a, 21-triol-3,20-dione

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 40 Stunden erreicht hat, 25 mg per Kolben oa^a-Difluor-zf-pregnen-ll^,17a,21-triol-3,20-dion, gelöst in 0,125 ml Dimethylformamid in Gegenwart eines Tropfens einer 20%igen wäßrigen Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat-Lösung, zugefügt werden. Anschließend wird weitere 48 Stunden fermentiert. Die chromätographische Analyse bestätigt die Bildung eines Produktes mit einem Rf-Wert gleich dem des 6a,9a-Difluor-/l¹-⁴-pregnadien-ll/?,17a,21-triol-3,20-dions. Der Inhalt der 20 Kolben wird mit 500 ml Methylisobutylketon extrahiert, der Auszug gewaschen und bis fast zur Trockene eingedampft. Gegen Ende der Konzentration kristallisiert das oa^a-Difiuor-zl^-pregnadien-ll/S,17a,21-triol-3,20-dion, das bei 220 bis 223°C schmilzt; [σ]?= +88° (l%Dk>xan), λ_ηαχ=237τη_μ, EJ*„= 380. Ausbeute: 86%·The procedure is as in Example 1 with the difference that when the culture has reached the age of 40 hours, 25 mg per flask oa ^ a-Difluor-zf-pregnen-ll ^, 17a, 21-triol-3,20- dione dissolved in 0.125 ml of dimethylformamide in the presence of a drop of a 20% strength aqueous polyoxyethylene sorbitan monooleate solution. It is then fermented for a further 48 hours. The chromatographic analysis confirms the formation of a product with an Rf value equal to that of 6a, 9a-difluoro- / l ¹ - ⁴ -pregnadiene-II / ?, 17a, 21-triol-3,20-dione. The contents of the 20 flasks are extracted with 500 ml of methyl isobutyl ketone, the extract is washed and evaporated to almost dryness. Towards the end of the concentration the oa ^ a-difluor-zl ^ -pregnadien-ll / S, 17a, 21-triol-3,20-dione, which melts at 220 to 223 ° C; [σ]? = + 88 ° (l% Dk> xan), λ _ηαχ = 237τη _μ , EJ * "= 380. Yield: 86% ·

Beispiel 12
Δ¹ -⁴-Pregnadien-3,20-dionExample 12
Δ ^1-4 -Pregnadien-dione 3,20-

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 40 Stunden erreicht hat, 25 mg per Kolben Progesteron, gelöst in 0,2 ml Dimethylformamid in Gegenwart eines Tropfens einer 2O^u/oigen wäßrigen Lösung von Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat, zugefügt werden. Die Kultur wird dann 48 Stunden fermentiert und daraufhin in üblicher Weise aufgearbeitet. Man erhält soThe procedure is as in Example 1 with the difference that when the culture has reached the age of 40 hours, 25 mg per flask of progesterone, dissolved in 0.2 ml of dimethylformamide in the presence of a drop of a 2O ^u / o aqueous solution of polyoxyethylene sorbitan monooleate. The culture is then fermented for 48 hours and then worked up in the usual way. You get so

^{1 4}-Pregnadien-3,20-dion. ^{1 4} -Pregnadiene-3,20-dione.

Claims (4)

Patentansprüche:Patent claims: 1. Verfahren zur Herstellung von 3-Keto- A¹ ^-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe durch Bebrütung eines entsprechenden 3-Keto-J*-steroids mit einer Kultur der Gattung Nocardia unter submersen und aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff-, Stickstoffquelle und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium, dadurch ge-1. Process for the production of 3-keto A ¹ ^ steroids of the androstane or pregnane series by incubating a corresponding 3-keto-J * steroid with a culture of the genus Nocardia under submerged and aerobic conditions in a carbon, nitrogen source and Nutrient medium containing mineral salts, thereby kennzeichnet, daß die Bebrütung mit einer Kultur von Nocardia lucida n. sp. durchgeführt wird.indicates that the incubation with a culture of Nocardia lucida n. sp. carried out will. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle eine Mischung von aliphatischen Kohlenwasserstoffen der Art Gasöl-Paraffin, die vorzugsweise 12 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, verwendet wird.2. The method according to claim 1, characterized in that a mixture is used as the carbon source of aliphatic hydrocarbons of the gas oil-paraffin type, which preferably have 12 to 18 carbon atoms contains is used. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung bei einer Temperatur zwischen 24 und 34° C, vorzugsweise bei 30° C, durchgeführt wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the fermentation at a Temperature between 24 and 34 ° C, preferably at 30 ° C, is carried out. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8, vorzugsweise bei 7,5 bis 7,6, durchgeführt wird.4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the fermentation at a pH between 7 and 8, preferably 7.5 to 7.6, is carried out.