DE1470360B2 - Verfahren zur herstellung von purinnucleosiden - Google Patents

Verfahren zur herstellung von purinnucleosiden

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DE1470360B2
DE1470360B2 DE1964T0025833 DET0025833A DE1470360B2 DE 1470360 B2 DE1470360 B2 DE 1470360B2 DE 1964T0025833 DE1964T0025833 DE 1964T0025833 DE T0025833 A DET0025833 A DE T0025833A DE 1470360 B2 DE1470360 B2 DE 1470360B2
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Akira Nishinomiya; Igarasi Seizi Ashiya; Imada (Japan)
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

in der Ri die oben angegebene Bedeutung hat mit Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin, Cytidin oder den entsprechenden 2'-, 3'-, 5'-, 2',3'- oder 3',5'-Ribonucleotiden oder Adenindesoxyribosid, Hypoxanthindesoxyribosid, Guanindesoxyribosid, Cytosindesoxyribosid, Thymindesoxyribosid oder den entsprechenden 3'-, 5'- oder S'.S'-Desoxyribonucleotiden oder Gemischen derselben in einem wäßrigen Medium vom pH-Wert 4-10 bei Temperaturen zwischen 20 und 500C in Gegenwart eines Phosphats und eines den Ribosyl- oder Desoxyribosylrest übertragenden Enzymsystems der folgenden-Bakterienstämme:
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck,
ATCC-9621;
Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier,
NRRL,B-909;
Bacillus brevisMigula emend. Ford,
ATCC-9999;
Bacillus sphaericus Neide, USDA-344;
Bacterium cadaveris GaIe et Epps,
ATCC-9760;
Corynebacterium sepedonicum
(Spiek. et Kott.) Skaptason et Burkholder,
ATCC-15 391;
Erwinia aroideae (Townsend) Holland,
ATCC-15 390;
Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer)
Long et Hammer, ATCC-8071;
Vibrio percolans Mudd et Warren,
NRRL-S-31
umsetzt.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden der allgemeinen Formel
in der Ri ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Mercaptogruppe, eine niedere Alkylaminogruppe, eine
,5 Furfurylaminogruppe oder niedere Aeylaminogruppe ist und R2 für Ribosyl oder Desoxyribosyl steht und der neidere Alkylrest bis zu 6 Kohlenstoffatome und der niedere Acylrest bis zu 7 Kohlenstoffatome enthält. Purinnucleoside, die gemäß der Erfindung hergestellt werden können, sind beispielsweise Purinribosid, 6-Mercaptopurjnribosid, Kinetinribosid (d.h. 6-Furfurylaminopurinribosid), 6-Methylaminopurinribosid, 6-Chlorpurinribosid, 6-Jodpurinribosid und die entsprechenden Desoxyriboside. Diese Purinnucleoside wurden bisher in der Natur nicht oder, im Vergleich zu den in den Nucleinsäuren enthaltenen Nucleosiden, nur in sehr geringen Mengen gefunden.
Die vorstehend genannten Purinnucleoside sind bekanntlich nützliche und wertvolle chemische oder biochemische Agentien in enzymatischen und biochemischen Untersuchungen. Während Purinnucleoside wie Adenosin, Guanosin, Xanthosin und Inosin sich leicht herstellen lassen, z. B. durch Hydrolyse von Ribonucleinsäuren oder Desoxyribonucleinsäuren unter BiI-dung eines Gemisches von Nucleosiden und Abtrennung der einzelnen Nucleoside mit oder ohne Desaminierung oder durch Dephosphorylierung der Nucleotide mit Hilfe von Phosphatase, können die obengenannten Purinnucleoside bisher nur durch chemische Synthesen hergestellt werden, die viele Reaktionsstufen und genaue Einhaltung der Reaktionsbedingungen erfordern. Bei allen bisher bekannten chemischen Verfahren, die von der Base und Ribose oder Desoxyribose ausgehen, ist es schwierig, die Reaktion so zu führen, daß sie an den gewünschten Stellungen der Base und der Ribose oder Desoxyribose stattfindet. Ferner ist die Handhabung der labilen Ribose bzw. der noch labileren Desoxyribose schwierig. Speziell zur Herstellung von Purindesoxyribonucleosiden im technischen Maßstab ist bisher ein zufriedenstellendes Syntheseverfahren nicht entwickelt und bekanntgeworden.
Es ist aus der DT-AS 10 72 249 bereits bekannt, die Desoxyribosylgruppe von einem 2-Desoxyribosid enzymatisch auf 5-Fluor-uracil zu übertragen, wobei ein Enzymsystem von Streptococcus faecalis (ATCC 8043) verwendet wird. Eine enzymatische Übertragung einer Pentosylgruppe unter Bildung von Purinnucleosiden der Formel (I) war jedoch nicht bekannt.
Es wurde nun gefunden, daß die im Anspruch angegebenen aeroben Bakterienstämme Enzymsysteme bilden, die in der Lage sind, eine Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe eines Nucleosids in die 9-Stellung einer Purinbase unter Bildung eines Purinnucleosids zu überführen. Es wurde ferner gefunden, daß die zur Überführung der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe fähigen Enzymsysteme wenigstens eine Art von Phosphorylase enthalten und daß die Anwesenheit eines
Phosphats für die Wirkung der Enzymsysteme notwendig ist.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden reichlich und billig erhältliche Nucleoside oder Nucleotide als Lieferanten der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe für die Herstellung der gewünschten wertvollen Nucleoside eingesetzt. Die Erfindung ermöglicht unter milden enzymatischen Bedingungen somit auch die Großherstellung von Purindesoxyribonucleosiden, die nach den bisher bekannten Verfahren schwierig im [0 technischen Maßstab herzustellen waren.
Die in Nucleinsäuren enthaltenen Nucleoside oder Nucleotide lassen sich leicht durch Hydrolyse herstellen. Einige so erhältliche Purin-5'-nucleotide werden beispielsweise als Würzen verwendet, während die Pyrimidinnucleotide bei weitem nicht das Interesse gefunden haben wie die wertvollen Purinnucleotide. Diese weniger wertvollen Pyrimidinnucleotide eignen sich gut als Ausgangsmaterialien für das Verfahren gemäß der Erfindung, d.h. als Lieferant der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe. Als Lieferant der Ribosyl-•gruppe kommen "die Ribonucleoside Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin und Cytidin und die diesen Ribonucleosiden entsprechenden 2'-, 3'-, 5'-, 2',3'- oder 3',5'-Ribonucleotide in Frage, während als Lieferanten einer Desoxyribosylgruppe die Desoxyribonucleoside Adenindesoxyribosid, Hypoxanthindesoxyribosid, Guanindesoxyribosid, Cytosindesoxyribosid und Thymindesoxyribosid und die diesen Desoxyribonucleosiden entsprechenden 3'-, 5'- oder 3',5'-Desoxyribonucleotide geeignet sind. Diese Nucleoside und/oder Nucleotide können natürlich auch als Gemisch eingesetzt werden und brauchen nicht rein zu sein.
Das andere Ausgangsmaterial ist die Purinbase, die der Basenkomponente des gewünschten Purinnucleosids entspricht und auf die eine Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe übertragen wird. Diese Purinbase hat die allgemeine Formel
40
(II)
45
in der Ri die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat. Geeignete Purinbasen sind beispielsweise Purin, 6-Mercaptopurin, 6-Chlorpurin, 6-Jodpurin, Benzoyladenin,. Kinetin, 6-Methylaminopurin, 6-Äthylaminopurin, 6-Isopropylaminopurin und 6-Hexylaminopurin.
Für die Zwecke der Erfindung werden die folgenden aeroben Bakterienstämme verwendet:
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck,
ATCC-9621;
Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier,
NRRLB-909;
Bacillus brevis Migula emend. Ford,
ATCC-9999;
Bacillus sphaericus Neide, USDA-344;
Bacterium cadaveris GaIe et Epps, ATCC-9760;
60 Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kott)
Skaptason et Burkholder, ATCC-15 391;
Erwinia aroideae(Townsend) Holland,
ATCC-15 390;
Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer)
Long et Hammer ATCC-8071;
Vibrio percolans Mudd et Warren, NRRL, S-31.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann die Kulturbrühe der Bakterien unmittelbar als Enzymquelle gebraucht werden, oder die Zellen können in Form einer Suspension in Wasser, einer Pufferlösung oder einer Salzlösung verwendet werden. Die abgetrennten Zellen können ferner vor der Reaktion einer Vorbehandlung unterworfen werden, z. B. einer Zerstörung durch Beschallen, Mahlen mit Glaskugeln, Behandlung mit einem die Zellen zerstörenden Mittel wie Phenol oder Natriumdesoxychelat oder Waschen mit einem organischen Lösungsmittel wie Aceton oder Äthylacetat. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann auch so durchgeführt werden, daß man die genannten aeroben Bakterien unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium züchtet, das beide Ausgangsmaterialien enthält.
Die Kultivierung der Bakterien erfolgt in einem geeignetem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen. Das Kulturmedium muß assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen für die verwendeten Bakterien enthalten. Zweckmäßig ist der Zusatz von anorganischen Salzen und Spurenelementen. Als Nährstoffe für die Kultivierung kommen die allgemein zu diesem Zweck verwendeten Stoffe in Frage. Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Stärke, lösliche Stärke, Dextrin, Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose und Glycerin. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Gluten, Natriumglutamat, Harnstoff, Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumlactat und Nitrate wie Natriumnitrat und Kaliumnitrat. Weitere geeignete anorganische Salze sind beispielweise Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und Caliumchlorid.. Als Spurenelemente können Borsäure, Kupfersulfat, Eisen(III)-chlorid, Mangansulfat, Natriummolybdat und Zinksulfat verwendet werden.
Die Bedingungen, unter denen die aeroben Bakterien bebrütet werden, werden vorteilhaft auf die verwendeten Bakterienstämme und/oder das Kulturmedium abgestimmt. Gewöhnlich wird die Kultivierung bei einer Temperatur von 20 bis 400C für eine Dauer von 1 bis 6 Tagen durchgeführt.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden die gewünschte Purinbase der allgemeinen Formel (II) einerseits und ein oder mehrere Nucleoside und/oder Nucleotide als Lieferant einer Ribosyl- bzw. Desoxyribosylgruppe andererseits mit den Bakterienzellen oder dem durch die Bakterien gebildeten Enzymsystem zusammengeführt. Bei dieser Reaktion wird der pH-Wert des Mediums zwischen etwa 4 und 10 gehalten, jedoch kann in einigen Fällen ein pH-Wert von 5,0 bis 8,0 erforderlich sein. Die Temperaturen liegen im Bereich von 20 bis 50° C.
Es ist zu betonen, daß für die Übertragungsreaktion die Anwesenheit eines Phosphats erforderlich ist. In einigen Fällen, in denen beispielsweise die Enzymquelle mit dem Phosphat verunreinigt ist, oder in denen Nucleotide zusammen mit Phosphormonoesterase oder
Pyrophosphatase verwendet werden, ist jedoch der Phosphatzusatz unnötig. Die Phosphatkonzentration im Reaktionsgemisch beträgt 0,1 bis lOOmMol/l, jedoch kann sich ein zu hoher Phosphatüberschuß nachteilig auf die Bildung der gewünschten Purinnucleoside auswirken.
Die im Reaktionsmedium angereicherten gewünschten Purinnucleoside werden nach bekannten Methoden isoliert. Beispielsweise kann die Abtrennung durch Ausnutzung des Unterschieds in der Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln zwischen der gewünschten Verbindung und den Verunreinigungen, des Unterschieds in den Verteilungskoeffizienten zwischen zwei Lösungsmittelschichten, des Unterschieds in der Adsorbierbarkeit an Adsorptionsmitteln wie Aktivkohle oder Ionenaustauscherharzen, des Unterschiedes in der Dialysierbarkeit durch eine halbdurchlässige Membran oder des Unterschiedes in der Kristallisierbarkeit aus einem Lösungsmittel sowie durch Filtration oder Zentrifugieren des Reaktionsgemisches mit oder ohne Zusatz von Filterhilfsstoffen erfolgen. In der Praxis werden-diese Methoden zur Trennung oder Isolierung je nach der gewünschten Reinheit und dem Zustand der Produkte in Kombination oder wiederholt durchgeführt.
In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze, mit der Ausnahme der die Umwandlung der Basen in die entsprechenden Nucleoside betreffenden Angaben, auf das Gewicht. Die bei den Versuchen verwendeten Stamme von aeroben Bakterien sind bei der American Type Culture Collection (ATCC), Washington, D. C, USA, beim Northern Utilization Research Branch, U.S.Dept. of Agriculture (NRRL), Peoria, I 11., USA, und beim U.S.Department of Agriculture (USDA) hinterlegt und tragen die Hinterlegungsnummern, die aus den obengenannten Abkürzungen mit einer Zahl bestehen.
Tabelle
Umwandlung (Mol-%)
60 Minuten 120 Minuten
Beispiel 1
40
6-Mercaptopurin 65,6 75,7
Purin 74,0 77,5
Bcnzoyladenin 66,9 69,8
Kinetin 57,6 51,5
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck ATTC-9621 wurde über Nacht bei 28° C auf einer Bouillon-Agar-Schrägkultur kultiviert, die 1% Glucose enthielt. Fünfundzwanzig 200-ml-Kolben, die je 40 ml eines wäßrigen Kulturmediums enthielten, wurden mit den Zellen beimpft, wobei jeweils eine Übertragung mit einer öse vorgenommen wurde. Das Medium bestand aus Dextrin (20,0 g), Polypepton (10,0 g), Fleischextrakt (10,0 g), Dikaliumhydrogenphosphat (1,0 g), Natriumchlorid (5,0 g) und sterilisiertem Leitungswasser (1 Liter) und war auf pH 7,2 eingestellt. Das beimpfte Medium wurde 2 Tage bei 28° C unter Schütteln bebrütet. Nach der Bebrütung wurde die gesamte Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden mit 0,8%iger wäßriger Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (200 ml) suspendiert.
Ein Gemisch aus 0,2 ml einer 0,005molaren wäßrigen Lösung der Base gemäß Tabelle 1, 0,5 ml einer 0,01 molaren wäßrigen Lösung von 5'-Thymidylsäure, 0,1 ml einer l.Omolaren Acetatpufferlösung vom pH 5,75, 0,05 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Zellsuspension und 0,15 ml Wasser wurde 60 bzw. 120 Minuten bei 370C gehalten, worauf die 6s Umwandlung der Basen zu den entsprechenden Desoxyribosiden in Prozent ermittelt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannt.
Beispiel 2
Erwinia aroideae (Townsend) Holland ATTC-15 390 wurde 2 Tage bei 28°C auf einem Bouiilon-Agar-Schrägnährboden kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Ein wäßriges Kulturmedium (250 ml) in einem 1-Liter-Kolben wurde mit den Zellen in einer Menge von 7 Ösen beimpTt. Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das gemäß Beispiel 1 verwendete Medium. Die Kultivierung wurde 3Tage bei 32°C unter Schütteln durchgeführt. Dann wurden Kinetin und 5'-Thymidylsäure in solchen Mengen zur Kulturflüssigkeit gegeben, daß die Konzentration 5 mMol/1 bzw. 25 mMol/1 betrug. Die Kulturflüssigkeit wurde mit Essigsäure auf pH 6,2 eingestellt. Die Kultivierung wurde noch 3 Stunden bei 32°C forgesetzt, worauf die Kulturbrühe zur Abtrennung der Feststoffe zentrifugiert wurde.
Die obenstehende Flüssigkeit wurde mit Salzsäure auf pH 4,5 eingestellt und durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule gegeben. Die Aktivkohle wurde mit Wasser gewaschen und mit 50%igem Äthanol, das 1,4% Ammoniak enthielt, eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, mitwäßrigem Ammoniak auf pH 11 eingestellt und durch eine Kolonne gegeben, die mit quaternärem basischen Polystyrol-Ionenaustauscherharz (Formiatform) gefüllt war. Die Säule wurde mit einer Ameisensäure-Ammoniak-Pufferlösung vom pH-Wert 8,2 eluiert. Das Eluat wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 253 mg Kinetindesoxyribosid erhalten wurden.
Beispiel 3
Auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise wurde eine Enzymquelle aus Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck ATCC-9621 hergestellt.
Ein Gemisch aus 40 ml einer wäßrigen 0,025molaren Lösung von 6-Mercaptopurin, 20 ml einer wäßrigen 0,2molaren Lösung von 5'-Thymidylsäure, 10 ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,75 und 30 ml der Enzymquelle wurde 3 Stunden bei 370C gehalten. Nach der Reaktion wurde d?s Gemisch zur Abtrennung von Niederschlägen zentrifugiert. Die klare Flüssigkeit wurde in üblicher Weise einer Behandlung mit Aktivkohle, der Chromatographie mit Ionenaustauscherharz und abschließend der Gefriertrocknung unterworfen, wobei pulverförmiges 6-Mercaptopurindesoxynucleosid in einer Ausbeute von 192 mg (68,2 Mol-%) erhalten wurde.
Beispiel 4
Die gleiche Reaktion wie im Beispiel 3 wurde durchgeführt, wobei jedoch Desoxy-5'-guanylsäure an Stelle von 5'-Thymidylsäure verwendet wurde. Als Produkt wurden 170 mg 6-Mercaptopurindesoxyribosid (63,7 Mol-%) erhalten.
Beispiel 5
Erwinia aroideae (Townsend) Holland ATCC-15 390 wurde 2 Tage bei 28° C auf einem Bouillon-Agar-
Schrägnährboden kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Ein Kulturmedium (250 ml) in einem 1-Liter-Kolben wurde mit den Zellen geimpft in (7 Ösen). Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das im Beispiel 1 verwendete Medium. Anschließend wurde 4 Tage bei 28° C unter Schütteln bebrütet. Danach wurden 200 ml der Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden mit einer 0,8%igen Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (50 ml) suspendiert.
Ein Gemisch aus 0,2 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabelle 2 genannten Basen, 0,5 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von Inosin, 0,1 ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,75 (die lOmMol Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,2 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle wurde 120 Minuten bzw. 60 Minuten bei 37°C gehalten, worauf die Umwandlung der Basen zu den entsprechenden Ribosiden ermittelt wurde. Die in Tabelle 2 genannten Ergebnisse wurden erhalten.
TabelIe-2
28° C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden abgetrennt, mit einer 0,8%igen wäßrigen Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser suspendiert (80 ml).
Ein Gemisch aus 0,5 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von Uridin, 0,2 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabelle 4 genannten Basen, 0,1 ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,75 (die lOmMol Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,2 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle wurde 120 Minuten bei 37° C gehalten, worauf die Umwandlung der Basen zu den entsprechenden Ribonucleosiden in Prozent bestimmt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt.
Tabelle 4
Base
Umwandlung (Mol-%)
nach 120 Min.
Umwandlung (Mol-%)
60 Minuten 120 Minuten
6-Mercaptopurin 64 72
Kinetin 25 46
Purin 57 65
Benzoyladenin 4 17
Beispiel 6
Auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise wurde eine Enzymquelle aus Aerobacter aerogenes (Kruse) BeijerinckATCC-9621 hergestellt.
Ein Gemisch aus 0,2 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabelle 3 genannten Basen, 0,5 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von Guanosin, 0,2 ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,9 (die 10 mMol Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,1 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle wurde 80 Minuten bei 37° C gehalten, worauf der Umsatz der Basen zu den entsprechenden Ribosiden halbquantitativ durch Papierchromatographie bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 genannt.
Tabelle 3
Base
6-Mercaptopurin + + +
Kinetin + + +
Purin + + +
Benzoyladenin + +
*) Die Umwandlung ist mit + + + bezeichnet, wenn sie etwa 78% betrug. Eine geringere Umwandlung ist je nach der visuellen Dichte der Farbe unter UV-Licht auf dem Chromatogramm mit + + oder + ausgedrückt.
Beispiel 7
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck ATCC-9621 wurde über Nacht bei 28° C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Ein Kulturmedium (100 ml) in einem 500-ml-Kolben wurden mit den Zellen geimpft (1 Öse). Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Medium. Die Zellen wurden 2 Tage bei
6-Mercaptopurin 73
Purin 64
Benzoyladenin 42
Beispiel 8
Die in Tabelle 5a) und b) genannten Mikroorganismen wurden über Nacht bei 28° C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Mit den Zellen (1 Öse) wurde ein Kulturmedium (40 ml) geimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Kulturmedium hatte. Die Kultivierung wurde 2 Tage bei 28° C unter Schütteln durchgeführt. Die Zellen wurden abgetrennt und mit einer 0,8%igen wäßrigen Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (50 ml) suspendiert.
Ein Gemisch aus 1 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabellen 5a) und b) genannten Purinbasen, 2,5 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von Cytidindesoxyribosid, 1 ml einer 0,5molaren tris-Pufferlösung vom pH-Wert 7,5 (die 10 mMol Phosphatpufferlösung enthielt) und 0,5 ml der obengenannten Enzymquelle wurde 60 Minuten bei 37° C gehalten.
Nach der Reaktion wurde der pH-Wert des
Umwandlung*) 50 Gemisches mit Essigsäure unter Kühlung mit Eis auf 5,0 eingestellt. Die gebildete Fällung wurde durch Zentrifugieren entfernt. Zur oben stehenden Flüssigkeit (2 ml) wurde Aktivkohle (300 mg) gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde mit Eis gekühlt. Die Aktivkohle wurde
durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und mit einer 5%igen wäßrigen Perchlorsäurelösung (3 ml) zusammengegeben. Das Gemisch wurde 60 Minuten gekocht und dann zentrifugiert, wobei die oben stehende Flüssigkeit abgetrennt wurde. Die erhaltene Fällung wurde mit einer 5%igen wäßrigen Perchlorsäurelösung gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde mit der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen oben stehenden Flüssigkeit vereinigt. Die Umwandlung jeder Purinbase in das entsprechende Desoxypurinnucleosid wurde durch Umsetzung mit Diphenylamin und anschließend Kolorimetrie bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 5a) und b) genannt.
609 529/325
Tabelle 5a
10
Mikroorganismen Umwandlung (MoI-0ZO) von
6-Chlorpurin 6-Jodpurin
6-Methylaminopurin
Aerobacter aerogenes (Kruse), Beijerinck, ATCC-9621, A Erwinia aerodeae (Townsend), Holland, ATCC-15 390, B Pseudomonas putrefaciens
(D. et H.) Long et Hammer, ATCC-8071, C Vibrio percolans Mudd et Warren, NRRL S-31, D Aeromonas hydrophila (Chester), Stanier, NRRL, B 909, E Bacillus brevis Migula emend. Ford, ATCC-9999, F Bacillus sphaericus Neide, USDA-344, G Bacterium cadaveris ATCC-9760, H Corynebacterium sepedonicum (Sp. et K.) Skaptason et Burkholder, ATCC-15 391, I
84 81,5 71,5
10,5 10 11,5
88 79 77,5
77 78 76
57,5 54 62,5
27,5 31,0 38
43 41,5 47
54 55 18
28 29 40
Tabelle 5b
Umwandlung (Mol-%) von
6-Mercaptopurin Purin
Kinetin
Benzoyladenin
Mikroorganismus EFG
43 41 62 61 48
82 48 73 80 49
81 50 75 71 38
50 36 42 44 24
Beispiel 9
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden verschiedene Purinbasen mit Uridin an Stelle von Cytidindesoxyribosid umgesetzt, wobei die in Tabelle 6 genannten Ergebnisse erhalten wurde. Mit den Buchstaben sind die gleichen Mikroorganismen wie in den Tabellen 5a) und b) bezeichnet.
Tabelle 6
Umwandlung (Mol-%) von
Mikroorganismen A B
6-Chlorpurin 72 43 82 75 64 32 52 50 25
6-Jodpurin 68 40 78 75 58 32 54 54 27
6-Methylaminopurin 52 35 75 72 60 40 50 20 38
6-Mercaptopurin — — — — 75 32 68 58 41
Purin — — — — 89 58 75 72 52
Kinetin — — — — 91 57 78 72 40
Benzoyladenin — — — — 42 37 44 42 22
Das Zeichen »—« bedeutet, daß die Verbindung nicht getestet wurde.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden der allgemeinen Formel I
    in der Ri ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Mercapto-, Niederalkylamino-, Furfurylamino- oder Niederacylaminogruppe und R2 den Ribosyl- oder Desoxyribosylrest bedeuten und hierbei der Niederalkylrest bis zu 6 Kohlenstoffatome und der Niederacylrest bis zu 7 Kohlenstoffatome enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Purinbase der allgemeinen Formel Il
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