DE1470360B2 - Verfahren zur herstellung von purinnucleosiden - Google Patents
Verfahren zur herstellung von purinnucleosidenInfo
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Description
in der Ri die oben angegebene Bedeutung hat mit Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin, Cytidin oder den
entsprechenden 2'-, 3'-, 5'-, 2',3'- oder 3',5'-Ribonucleotiden oder Adenindesoxyribosid, Hypoxanthindesoxyribosid,
Guanindesoxyribosid, Cytosindesoxyribosid, Thymindesoxyribosid oder den entsprechenden
3'-, 5'- oder S'.S'-Desoxyribonucleotiden
oder Gemischen derselben in einem wäßrigen Medium vom pH-Wert 4-10 bei Temperaturen
zwischen 20 und 500C in Gegenwart eines Phosphats und eines den Ribosyl- oder Desoxyribosylrest
übertragenden Enzymsystems der folgenden-Bakterienstämme:
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck,
ATCC-9621;
Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier,
NRRL,B-909;
Bacillus brevisMigula emend. Ford,
ATCC-9999;
Bacillus sphaericus Neide, USDA-344;
Bacterium cadaveris GaIe et Epps,
ATCC-9760;
Corynebacterium sepedonicum
(Spiek. et Kott.) Skaptason et Burkholder,
ATCC-15 391;
Erwinia aroideae (Townsend) Holland,
ATCC-15 390;
Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer)
Long et Hammer, ATCC-8071;
Vibrio percolans Mudd et Warren,
NRRL-S-31
umsetzt.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden der allgemeinen
Formel
in der Ri ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine
Mercaptogruppe, eine niedere Alkylaminogruppe, eine
,5 Furfurylaminogruppe oder niedere Aeylaminogruppe
ist und R2 für Ribosyl oder Desoxyribosyl steht und der
neidere Alkylrest bis zu 6 Kohlenstoffatome und der niedere Acylrest bis zu 7 Kohlenstoffatome enthält.
Purinnucleoside, die gemäß der Erfindung hergestellt werden können, sind beispielsweise Purinribosid, 6-Mercaptopurjnribosid,
Kinetinribosid (d.h. 6-Furfurylaminopurinribosid), 6-Methylaminopurinribosid, 6-Chlorpurinribosid,
6-Jodpurinribosid und die entsprechenden Desoxyriboside. Diese Purinnucleoside wurden bisher in
der Natur nicht oder, im Vergleich zu den in den Nucleinsäuren enthaltenen Nucleosiden, nur in sehr
geringen Mengen gefunden.
Die vorstehend genannten Purinnucleoside sind bekanntlich nützliche und wertvolle chemische oder
biochemische Agentien in enzymatischen und biochemischen Untersuchungen. Während Purinnucleoside wie
Adenosin, Guanosin, Xanthosin und Inosin sich leicht herstellen lassen, z. B. durch Hydrolyse von Ribonucleinsäuren
oder Desoxyribonucleinsäuren unter BiI-dung eines Gemisches von Nucleosiden und Abtrennung
der einzelnen Nucleoside mit oder ohne Desaminierung oder durch Dephosphorylierung der
Nucleotide mit Hilfe von Phosphatase, können die obengenannten Purinnucleoside bisher nur durch
chemische Synthesen hergestellt werden, die viele Reaktionsstufen und genaue Einhaltung der Reaktionsbedingungen erfordern. Bei allen bisher bekannten
chemischen Verfahren, die von der Base und Ribose oder Desoxyribose ausgehen, ist es schwierig, die
Reaktion so zu führen, daß sie an den gewünschten Stellungen der Base und der Ribose oder Desoxyribose
stattfindet. Ferner ist die Handhabung der labilen Ribose bzw. der noch labileren Desoxyribose schwierig.
Speziell zur Herstellung von Purindesoxyribonucleosiden im technischen Maßstab ist bisher ein zufriedenstellendes
Syntheseverfahren nicht entwickelt und bekanntgeworden.
Es ist aus der DT-AS 10 72 249 bereits bekannt, die Desoxyribosylgruppe von einem 2-Desoxyribosid enzymatisch
auf 5-Fluor-uracil zu übertragen, wobei ein Enzymsystem von Streptococcus faecalis (ATCC 8043)
verwendet wird. Eine enzymatische Übertragung einer Pentosylgruppe unter Bildung von Purinnucleosiden der
Formel (I) war jedoch nicht bekannt.
Es wurde nun gefunden, daß die im Anspruch angegebenen aeroben Bakterienstämme Enzymsysteme
bilden, die in der Lage sind, eine Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe eines Nucleosids in die 9-Stellung
einer Purinbase unter Bildung eines Purinnucleosids zu überführen. Es wurde ferner gefunden, daß die zur
Überführung der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe fähigen Enzymsysteme wenigstens eine Art von
Phosphorylase enthalten und daß die Anwesenheit eines
Phosphats für die Wirkung der Enzymsysteme notwendig ist.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden reichlich und billig erhältliche Nucleoside oder Nucleotide
als Lieferanten der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe für die Herstellung der gewünschten wertvollen
Nucleoside eingesetzt. Die Erfindung ermöglicht unter milden enzymatischen Bedingungen somit auch die
Großherstellung von Purindesoxyribonucleosiden, die nach den bisher bekannten Verfahren schwierig im [0
technischen Maßstab herzustellen waren.
Die in Nucleinsäuren enthaltenen Nucleoside oder Nucleotide lassen sich leicht durch Hydrolyse herstellen.
Einige so erhältliche Purin-5'-nucleotide werden beispielsweise als Würzen verwendet, während die
Pyrimidinnucleotide bei weitem nicht das Interesse gefunden haben wie die wertvollen Purinnucleotide.
Diese weniger wertvollen Pyrimidinnucleotide eignen sich gut als Ausgangsmaterialien für das Verfahren
gemäß der Erfindung, d.h. als Lieferant der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe. Als Lieferant der Ribosyl-•gruppe
kommen "die Ribonucleoside Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin und Cytidin und die diesen Ribonucleosiden
entsprechenden 2'-, 3'-, 5'-, 2',3'- oder 3',5'-Ribonucleotide in Frage, während als Lieferanten
einer Desoxyribosylgruppe die Desoxyribonucleoside Adenindesoxyribosid, Hypoxanthindesoxyribosid, Guanindesoxyribosid,
Cytosindesoxyribosid und Thymindesoxyribosid und die diesen Desoxyribonucleosiden
entsprechenden 3'-, 5'- oder 3',5'-Desoxyribonucleotide geeignet sind. Diese Nucleoside und/oder Nucleotide
können natürlich auch als Gemisch eingesetzt werden und brauchen nicht rein zu sein.
Das andere Ausgangsmaterial ist die Purinbase, die der Basenkomponente des gewünschten Purinnucleosids
entspricht und auf die eine Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe übertragen wird. Diese Purinbase
hat die allgemeine Formel
40
(II)
45
in der Ri die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) hat.
Geeignete Purinbasen sind beispielsweise Purin, 6-Mercaptopurin, 6-Chlorpurin, 6-Jodpurin, Benzoyladenin,.
Kinetin, 6-Methylaminopurin, 6-Äthylaminopurin, 6-Isopropylaminopurin
und 6-Hexylaminopurin.
Für die Zwecke der Erfindung werden die folgenden aeroben Bakterienstämme verwendet:
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck,
ATCC-9621;
Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier,
NRRLB-909;
Bacillus brevis Migula emend. Ford,
ATCC-9999;
Bacillus sphaericus Neide, USDA-344;
Bacterium cadaveris GaIe et Epps, ATCC-9760;
60 Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kott)
Skaptason et Burkholder, ATCC-15 391;
Erwinia aroideae(Townsend) Holland,
ATCC-15 390;
Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer)
Long et Hammer ATCC-8071;
Vibrio percolans Mudd et Warren, NRRL, S-31.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann die Kulturbrühe der Bakterien unmittelbar als Enzymquelle
gebraucht werden, oder die Zellen können in Form einer Suspension in Wasser, einer Pufferlösung oder einer
Salzlösung verwendet werden. Die abgetrennten Zellen können ferner vor der Reaktion einer Vorbehandlung
unterworfen werden, z. B. einer Zerstörung durch Beschallen, Mahlen mit Glaskugeln, Behandlung mit
einem die Zellen zerstörenden Mittel wie Phenol oder Natriumdesoxychelat oder Waschen mit einem organischen
Lösungsmittel wie Aceton oder Äthylacetat. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann auch so
durchgeführt werden, daß man die genannten aeroben Bakterien unter aeroben Bedingungen in einem
geeigneten Kulturmedium züchtet, das beide Ausgangsmaterialien enthält.
Die Kultivierung der Bakterien erfolgt in einem geeignetem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen.
Das Kulturmedium muß assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen für die verwendeten Bakterien
enthalten. Zweckmäßig ist der Zusatz von anorganischen Salzen und Spurenelementen. Als Nährstoffe für
die Kultivierung kommen die allgemein zu diesem Zweck verwendeten Stoffe in Frage. Geeignete
Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Stärke, lösliche Stärke, Dextrin, Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose
und Glycerin. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl,
Maisquellwasser, Gluten, Natriumglutamat, Harnstoff, Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid,
Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumlactat und Nitrate wie Natriumnitrat und Kaliumnitrat.
Weitere geeignete anorganische Salze sind beispielweise Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid
und Caliumchlorid.. Als Spurenelemente können Borsäure, Kupfersulfat, Eisen(III)-chlorid,
Mangansulfat, Natriummolybdat und Zinksulfat verwendet werden.
Die Bedingungen, unter denen die aeroben Bakterien bebrütet werden, werden vorteilhaft auf die verwendeten
Bakterienstämme und/oder das Kulturmedium abgestimmt. Gewöhnlich wird die Kultivierung bei einer
Temperatur von 20 bis 400C für eine Dauer von 1 bis 6 Tagen durchgeführt.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden die gewünschte Purinbase der allgemeinen Formel (II)
einerseits und ein oder mehrere Nucleoside und/oder Nucleotide als Lieferant einer Ribosyl- bzw. Desoxyribosylgruppe
andererseits mit den Bakterienzellen oder dem durch die Bakterien gebildeten Enzymsystem
zusammengeführt. Bei dieser Reaktion wird der pH-Wert des Mediums zwischen etwa 4 und 10
gehalten, jedoch kann in einigen Fällen ein pH-Wert von 5,0 bis 8,0 erforderlich sein. Die Temperaturen
liegen im Bereich von 20 bis 50° C.
Es ist zu betonen, daß für die Übertragungsreaktion die Anwesenheit eines Phosphats erforderlich ist. In
einigen Fällen, in denen beispielsweise die Enzymquelle mit dem Phosphat verunreinigt ist, oder in denen
Nucleotide zusammen mit Phosphormonoesterase oder
Pyrophosphatase verwendet werden, ist jedoch der Phosphatzusatz unnötig. Die Phosphatkonzentration im
Reaktionsgemisch beträgt 0,1 bis lOOmMol/l, jedoch
kann sich ein zu hoher Phosphatüberschuß nachteilig auf die Bildung der gewünschten Purinnucleoside
auswirken.
Die im Reaktionsmedium angereicherten gewünschten Purinnucleoside werden nach bekannten Methoden
isoliert. Beispielsweise kann die Abtrennung durch Ausnutzung des Unterschieds in der Löslichkeit in
verschiedenen Lösungsmitteln zwischen der gewünschten Verbindung und den Verunreinigungen, des
Unterschieds in den Verteilungskoeffizienten zwischen zwei Lösungsmittelschichten, des Unterschieds in der
Adsorbierbarkeit an Adsorptionsmitteln wie Aktivkohle oder Ionenaustauscherharzen, des Unterschiedes in der
Dialysierbarkeit durch eine halbdurchlässige Membran oder des Unterschiedes in der Kristallisierbarkeit aus
einem Lösungsmittel sowie durch Filtration oder Zentrifugieren des Reaktionsgemisches mit oder ohne
Zusatz von Filterhilfsstoffen erfolgen. In der Praxis werden-diese Methoden zur Trennung oder Isolierung
je nach der gewünschten Reinheit und dem Zustand der Produkte in Kombination oder wiederholt durchgeführt.
In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze, mit der Ausnahme der die Umwandlung
der Basen in die entsprechenden Nucleoside betreffenden Angaben, auf das Gewicht. Die bei den Versuchen
verwendeten Stamme von aeroben Bakterien sind bei der American Type Culture Collection (ATCC),
Washington, D. C, USA, beim Northern Utilization Research Branch, U.S.Dept. of Agriculture (NRRL),
Peoria, I 11., USA, und beim U.S.Department of Agriculture (USDA) hinterlegt und tragen die Hinterlegungsnummern,
die aus den obengenannten Abkürzungen mit einer Zahl bestehen.
Umwandlung (Mol-%)
60 Minuten 120 Minuten
40
6-Mercaptopurin | 65,6 | 75,7 |
Purin | 74,0 | 77,5 |
Bcnzoyladenin | 66,9 | 69,8 |
Kinetin | 57,6 | 51,5 |
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck ATTC-9621
wurde über Nacht bei 28° C auf einer Bouillon-Agar-Schrägkultur kultiviert, die 1% Glucose enthielt.
Fünfundzwanzig 200-ml-Kolben, die je 40 ml eines wäßrigen Kulturmediums enthielten, wurden mit den
Zellen beimpft, wobei jeweils eine Übertragung mit einer öse vorgenommen wurde. Das Medium bestand
aus Dextrin (20,0 g), Polypepton (10,0 g), Fleischextrakt
(10,0 g), Dikaliumhydrogenphosphat (1,0 g), Natriumchlorid (5,0 g) und sterilisiertem Leitungswasser (1 Liter)
und war auf pH 7,2 eingestellt. Das beimpfte Medium wurde 2 Tage bei 28° C unter Schütteln
bebrütet. Nach der Bebrütung wurde die gesamte Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert.
Die Zellen wurden mit 0,8%iger wäßriger Kochsalzlösung
gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (200 ml) suspendiert.
Ein Gemisch aus 0,2 ml einer 0,005molaren wäßrigen Lösung der Base gemäß Tabelle 1, 0,5 ml einer
0,01 molaren wäßrigen Lösung von 5'-Thymidylsäure, 0,1 ml einer l.Omolaren Acetatpufferlösung vom pH
5,75, 0,05 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Zellsuspension und 0,15 ml Wasser wurde
60 bzw. 120 Minuten bei 370C gehalten, worauf die 6s
Umwandlung der Basen zu den entsprechenden Desoxyribosiden in Prozent ermittelt wurde. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannt.
Erwinia aroideae (Townsend) Holland ATTC-15 390 wurde 2 Tage bei 28°C auf einem Bouiilon-Agar-Schrägnährboden
kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Ein wäßriges Kulturmedium (250 ml) in einem 1-Liter-Kolben
wurde mit den Zellen in einer Menge von 7 Ösen beimpTt. Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung
wie das gemäß Beispiel 1 verwendete Medium. Die Kultivierung wurde 3Tage bei 32°C unter Schütteln
durchgeführt. Dann wurden Kinetin und 5'-Thymidylsäure in solchen Mengen zur Kulturflüssigkeit gegeben,
daß die Konzentration 5 mMol/1 bzw. 25 mMol/1 betrug.
Die Kulturflüssigkeit wurde mit Essigsäure auf pH 6,2 eingestellt. Die Kultivierung wurde noch 3 Stunden bei
32°C forgesetzt, worauf die Kulturbrühe zur Abtrennung der Feststoffe zentrifugiert wurde.
Die obenstehende Flüssigkeit wurde mit Salzsäure auf pH 4,5 eingestellt und durch eine mit Aktivkohle
gefüllte Säule gegeben. Die Aktivkohle wurde mit Wasser gewaschen und mit 50%igem Äthanol, das 1,4%
Ammoniak enthielt, eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, mitwäßrigem Ammoniak
auf pH 11 eingestellt und durch eine Kolonne gegeben, die mit quaternärem basischen Polystyrol-Ionenaustauscherharz
(Formiatform) gefüllt war. Die Säule wurde mit einer Ameisensäure-Ammoniak-Pufferlösung
vom pH-Wert 8,2 eluiert. Das Eluat wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 253 mg Kinetindesoxyribosid
erhalten wurden.
Auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise wurde eine Enzymquelle aus Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck
ATCC-9621 hergestellt.
Ein Gemisch aus 40 ml einer wäßrigen 0,025molaren Lösung von 6-Mercaptopurin, 20 ml einer wäßrigen
0,2molaren Lösung von 5'-Thymidylsäure, 10 ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,75 und
30 ml der Enzymquelle wurde 3 Stunden bei 370C gehalten. Nach der Reaktion wurde d?s Gemisch zur
Abtrennung von Niederschlägen zentrifugiert. Die klare Flüssigkeit wurde in üblicher Weise einer Behandlung
mit Aktivkohle, der Chromatographie mit Ionenaustauscherharz und abschließend der Gefriertrocknung
unterworfen, wobei pulverförmiges 6-Mercaptopurindesoxynucleosid in einer Ausbeute von 192 mg
(68,2 Mol-%) erhalten wurde.
Die gleiche Reaktion wie im Beispiel 3 wurde durchgeführt, wobei jedoch Desoxy-5'-guanylsäure an
Stelle von 5'-Thymidylsäure verwendet wurde. Als Produkt wurden 170 mg 6-Mercaptopurindesoxyribosid
(63,7 Mol-%) erhalten.
Erwinia aroideae (Townsend) Holland ATCC-15 390 wurde 2 Tage bei 28° C auf einem Bouillon-Agar-
Schrägnährboden kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Ein Kulturmedium (250 ml) in einem 1-Liter-Kolben
wurde mit den Zellen geimpft in (7 Ösen). Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das im Beispiel
1 verwendete Medium. Anschließend wurde 4 Tage bei 28° C unter Schütteln bebrütet. Danach wurden 200 ml
der Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden mit einer 0,8%igen Kochsalzlösung
gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (50 ml) suspendiert.
Ein Gemisch aus 0,2 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabelle 2 genannten Basen, 0,5 ml einer
wäßrigen 0,005molaren Lösung von Inosin, 0,1 ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,75 (die
lOmMol Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,2 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten
Enzymquelle wurde 120 Minuten bzw. 60 Minuten bei 37°C gehalten, worauf die Umwandlung der Basen
zu den entsprechenden Ribosiden ermittelt wurde. Die in Tabelle 2 genannten Ergebnisse wurden erhalten.
TabelIe-2
28° C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden abgetrennt, mit einer 0,8%igen wäßrigen Kochsalzlösung
gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser suspendiert (80 ml).
Ein Gemisch aus 0,5 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von Uridin, 0,2 ml einer wäßrigen 0,005molaren
Lösung der in Tabelle 4 genannten Basen, 0,1 ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,75 (die
lOmMol Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,2 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten
Enzymquelle wurde 120 Minuten bei 37° C gehalten, worauf die Umwandlung der Basen zu den entsprechenden
Ribonucleosiden in Prozent bestimmt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt.
Base
Umwandlung (Mol-%)
nach 120 Min.
nach 120 Min.
Umwandlung (Mol-%)
60 Minuten 120 Minuten
6-Mercaptopurin | 64 | 72 |
Kinetin | 25 | 46 |
Purin | 57 | 65 |
Benzoyladenin | 4 | 17 |
Auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise wurde eine Enzymquelle aus Aerobacter aerogenes (Kruse) BeijerinckATCC-9621
hergestellt.
Ein Gemisch aus 0,2 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabelle 3 genannten Basen, 0,5 ml einer
wäßrigen 0,005molaren Lösung von Guanosin, 0,2 ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,9
(die 10 mMol Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,1 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten
Enzymquelle wurde 80 Minuten bei 37° C gehalten, worauf der Umsatz der Basen zu den entsprechenden
Ribosiden halbquantitativ durch Papierchromatographie bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend
in Tabelle 3 genannt.
Base
6-Mercaptopurin + + +
Kinetin + + +
Purin + + +
Benzoyladenin + +
*) Die Umwandlung ist mit + + + bezeichnet, wenn sie etwa 78% betrug. Eine geringere Umwandlung ist je nach der
visuellen Dichte der Farbe unter UV-Licht auf dem Chromatogramm mit + + oder + ausgedrückt.
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck ATCC-9621 wurde über Nacht bei 28° C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden
kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Ein Kulturmedium (100 ml) in einem 500-ml-Kolben
wurden mit den Zellen geimpft (1 Öse). Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1
verwendete Medium. Die Zellen wurden 2 Tage bei
6-Mercaptopurin 73
Purin 64
Benzoyladenin 42
Die in Tabelle 5a) und b) genannten Mikroorganismen wurden über Nacht bei 28° C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden
kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Mit den Zellen (1 Öse) wurde ein Kulturmedium (40 ml)
geimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Kulturmedium hatte. Die
Kultivierung wurde 2 Tage bei 28° C unter Schütteln durchgeführt. Die Zellen wurden abgetrennt und mit
einer 0,8%igen wäßrigen Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem
Wasser (50 ml) suspendiert.
Ein Gemisch aus 1 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabellen 5a) und b) genannten
Purinbasen, 2,5 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von Cytidindesoxyribosid, 1 ml einer 0,5molaren tris-Pufferlösung
vom pH-Wert 7,5 (die 10 mMol Phosphatpufferlösung enthielt) und 0,5 ml der obengenannten
Enzymquelle wurde 60 Minuten bei 37° C gehalten.
Nach der Reaktion wurde der pH-Wert des
Umwandlung*) 50 Gemisches mit Essigsäure unter Kühlung mit Eis auf 5,0
eingestellt. Die gebildete Fällung wurde durch Zentrifugieren entfernt. Zur oben stehenden Flüssigkeit (2 ml)
wurde Aktivkohle (300 mg) gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde mit Eis gekühlt. Die Aktivkohle wurde
durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und mit einer 5%igen wäßrigen Perchlorsäurelösung
(3 ml) zusammengegeben. Das Gemisch wurde 60 Minuten gekocht und dann zentrifugiert, wobei die
oben stehende Flüssigkeit abgetrennt wurde. Die erhaltene Fällung wurde mit einer 5%igen wäßrigen
Perchlorsäurelösung gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde mit der in der oben beschriebenen Weise
erhaltenen oben stehenden Flüssigkeit vereinigt. Die Umwandlung jeder Purinbase in das entsprechende
Desoxypurinnucleosid wurde durch Umsetzung mit Diphenylamin und anschließend Kolorimetrie bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 5a) und b) genannt.
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10
Mikroorganismen Umwandlung (MoI-0ZO) von
6-Chlorpurin 6-Jodpurin
6-Chlorpurin 6-Jodpurin
6-Methylaminopurin
Aerobacter aerogenes (Kruse), Beijerinck, ATCC-9621, A
Erwinia aerodeae (Townsend), Holland, ATCC-15 390, B
Pseudomonas putrefaciens
(D. et H.) Long et Hammer, ATCC-8071, C Vibrio percolans
Mudd et Warren, NRRL S-31, D Aeromonas hydrophila (Chester), Stanier, NRRL, B 909, E
Bacillus brevis Migula emend. Ford, ATCC-9999, F Bacillus sphaericus
Neide, USDA-344, G Bacterium cadaveris ATCC-9760, H Corynebacterium sepedonicum (Sp. et K.) Skaptason et Burkholder, ATCC-15 391, I
84 | 81,5 | 71,5 |
10,5 | 10 | 11,5 |
88 | 79 | 77,5 |
77 | 78 | 76 |
57,5 | 54 | 62,5 |
27,5 | 31,0 | 38 |
43 | 41,5 | 47 |
54 | 55 | 18 |
28 | 29 | 40 |
Umwandlung (Mol-%) von
6-Mercaptopurin Purin
Kinetin
Benzoyladenin
Kinetin
Benzoyladenin
Mikroorganismus EFG
43 | 41 | 62 | 61 | 48 |
82 | 48 | 73 | 80 | 49 |
81 | 50 | 75 | 71 | 38 |
50 | 36 | 42 | 44 | 24 |
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden verschiedene Purinbasen mit Uridin an Stelle von
Cytidindesoxyribosid umgesetzt, wobei die in Tabelle 6 genannten Ergebnisse erhalten wurde. Mit den Buchstaben
sind die gleichen Mikroorganismen wie in den Tabellen 5a) und b) bezeichnet.
Umwandlung (Mol-%) von
Mikroorganismen A B
6-Chlorpurin | 72 | 43 | 82 | 75 | 64 | 32 | 52 | 50 | 25 |
6-Jodpurin | 68 | 40 | 78 | 75 | 58 | 32 | 54 | 54 | 27 |
6-Methylaminopurin | 52 | 35 | 75 | 72 | 60 | 40 | 50 | 20 | 38 |
6-Mercaptopurin | — | — | — | — | 75 | 32 | 68 | 58 | 41 |
Purin | — | — | — | — | 89 | 58 | 75 | 72 | 52 |
Kinetin | — | — | — | — | 91 | 57 | 78 | 72 | 40 |
Benzoyladenin | — | — | — | — | 42 | 37 | 44 | 42 | 22 |
Das Zeichen »—« bedeutet, daß die Verbindung nicht getestet wurde.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden der allgemeinen Formel Iin der Ri ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Mercapto-, Niederalkylamino-, Furfurylamino- oder Niederacylaminogruppe und R2 den Ribosyl- oder Desoxyribosylrest bedeuten und hierbei der Niederalkylrest bis zu 6 Kohlenstoffatome und der Niederacylrest bis zu 7 Kohlenstoffatome enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Purinbase der allgemeinen Formel Il
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1463563 | 1963-03-18 | ||
JP1463463 | 1963-03-18 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1470360A1 DE1470360A1 (de) | 1969-11-13 |
DE1470360B2 true DE1470360B2 (de) | 1976-07-15 |
Family
ID=26350618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1964T0025833 Granted DE1470360B2 (de) | 1963-03-18 | 1964-03-17 | Verfahren zur herstellung von purinnucleosiden |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE1470360B2 (de) |
GB (1) | GB1063951A (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3799784B2 (ja) * | 1997-11-14 | 2006-07-19 | 味の素株式会社 | 2,6−ジアミノプリン−2’−デオキシリボシドおよび2’−デオキシグアノシンの製造法 |
-
1964
- 1964-03-17 GB GB1127164A patent/GB1063951A/en not_active Expired
- 1964-03-17 DE DE1964T0025833 patent/DE1470360B2/de active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
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DE1470360A1 (de) | 1969-11-13 |
GB1063951A (en) | 1967-04-05 |
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
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