DE1470338A1

DE1470338A1 - Verfahren zur Herstellung von 5-Nucleotiden

Info

Publication number: DE1470338A1
Application number: DE19631470338
Authority: DE
Inventors: Seizi Igarasi; Akira Imada; Yoshio Nakao; Ikuo Nogami
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1962-01-31
Filing date: 1963-01-29
Publication date: 1969-04-03
Also published as: US3243354A; GB977489A; MY6800094A

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHONWALD_p

DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES „ , to--H™irJ^%

g.ni.V.cyorCr.fuDs [!.,' Ü,.: > „!ek«elrifchf KÖLN 1, DEICHMANNHAUS D^ Cum.Oi jioKeile/ Dr.-l

Köln, 22.Oktober 1968 Pu/Bt

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON 5'"NUCLEOTIDEn

Die Herstellung von 5'-Nucleotiden unter Verwendung von Mikroorganismen erfolge bisher nach einem der beiden folgenden Verfahren:

1) Ribonucleinsäure wird durch Einwirkung von durch Mikroorganismen erzeugter Phosphodiesterase hydrolysiert.

2) Mikroorganismen, die während der Bebrütung 5'-Nucleotide zu bilden und diese im Medium anzureichern vermögen, werden unter geeigneten Bedingungen zu diesem Zweck bebrütet.

Diese bekannten Verfahren sind jedoch zwangsläufig mit Nachteilen verbunden, wenn sie industriell durchgeführt werden. Beim erstgenannten Verfahren müssen Mikroorganismen, die Ribonucleinsäure liefern, z.B. Hefe, und Mikroorganismen, die das Enzymsystem zur bevorzugten Hydrolyse der Ribonucleinsäure zu 5'-Nucleotiden zu bilden vermögen, bebrütet werden. Beim zweiten Verfahren werden zwar die gewünschten 5'-Nucleotide während der Bebrütung der Mikroorganismen angereichert, aber die Konzentration dieser 5¹-Nucleotide ist unvermeidlich niedrig.

Die Nachteile der bekannten Verfahren werden durch die Erfindung vermieden, deren Gegenstand ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden ist, bei dem diese unmittelbar aus den Zellen von asporogenen Hefen gewonnen

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Neue Unteriagen (Art7|1Aha.2Nr.1Satz3deeXnd«runQ«e8.v.4.ai^ ORIGINAL IN6PECTE0

werden, und zwar aus der intrazellularen Ribonucleinsaure dieser Hefen durch Einwirkung eines gleichzeitig vorhandenen Enzymsystems. Das Verfahren gemäß der Erfindung eignet sich zur großtechnischen Herstellung von 5'-Nucleotiden, nach denen die Nachfrage ständig wächst.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird, kurz gesagt, so durchgeführt, daß man ausgewachsene asporogene Hefen in einer wäßrigen sauren Lösung suspendiert hält. Beispielsweise hält man diese Hefen etwa 1 bis 10 Stunden in einer Pufferlösung oder in einer Salzlösung einer Konzentration von etwa 0,1 bis 0,5 Mol/l suspendiert. Der Pj^-Wert der Suspension wird wenigstens für die ersten 10 bis J>0 Minuten dieser Zeit im sauren Bereich von etwa 3,0 bis 6,0, zweckmäßig von 4,5 bis 5,5, gehalten. Die Suspension kann man ruhig stehen lassen, bewegen und/oder belüften. Es ist zu bemerken, daß mehr als 90$ der in den Zellen der asporogenen Hefen enthaltenen Ribonucleinsäure aus den Zellen als 5'-Nucleotide ausgeschieden werden, indem die Hefen lediglich der genannten Behandlung unterworfen werden.

Die Anmelderin stellte fest, daß fast die gesamte intrazellulare Ribonucleinsäure zu 5'-Nucleotiden abgebaut werden kann, wenn die asporogenen Hefen unter geeigneten Bedingungen in einem sauren Medium in Suspension gehalten werden, und daß die hierbei gebildeten 5^f-Nucleotide aus den Zellen in das Medium übertreten. Dem Verfahren gemäß der Erfindung liegen diese Peststellungen zugrunde.

Als asporogene Hefen eignen sich für· die Zwecke der Erfindung beispielsweise die folgenden Gattungen: Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Kleockera, Mycoderma, Rhodotorula und Torulopsis. Am besten geeignet hiervon sind beispielsweise die folgenden Spezies:

Brettanomyces claussenii Ousters Brettanomyces bruxellensis Kufferath et van Laer Candida pseudotropicalis (Cast.) Basgal Candida tropicalis (Cast.) Berkhout

Candida utilis (Henneberg) Lodder et van Rij Cryptococcus laurentii (Kufferath) Skinner Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Buillemin Kloeckera apiculata (Reess emend. Klöcher) Janke Kloeckera africana (Klöcker) Janke Myooderma tannica Asai

Rhodotorula mucilaginosa (Jörg.) Harrison Rhodoturula pallida Lodder

Torulopsis candida (Saito) Lodder Torulopis famata (Harrison) Lodder et van Rij

Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt in einem wäßrigen Kulturmedium. Das Kulturmedium muß im allgemeinen die Nährstoffe für die Mikroorganismen enthalten, z.B. Stoffe, die assimilierbaren Kohlenstoff liefern, Stoffe, die digerierbaren Stickstoff liefern, und vorzugsweise anorganische Substanzen, Vitamine, sonstige das Wachstum fördernde Faktoren usw. Diese Nährstoffe können natürlichen Ursprungs oder synthetisch hergestellt sein. Geeignete Kohlenstoff liefernde Stoffe sind beispielsweise Glucose, Lactose, Maltose, Glycerin, Stärke, Dextrin usw. Geeignete Stickstofflieferanten sind beispielsweise Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoff usw. Stoffe, die gleichzeitig Kohlenstoff und Stickstoff liefern, sind beispielsweise Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Maismaische, Melasse, Kasein, Käseinhydrolya*e, Gluten, Reiskleie, verschiedene Aminosäuren usw. Als anorganische Nährstoffe kommen beispielsweise infrage: Kaliumphosphat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Eisen-III-chlorid, Natriumnitrat, Calciumchlorid usw.

Die Bebrütung erfolgt gewöhnlich etwa 10 bis 72 Stunden bei einer Temperatur von etwa 25 bis 30°C. Die optimale Bebrütungsdauer ändert sich mit Faktoren, wie Art der asporogenen Hefen, Zusammensetzung des Mediums, Temperatur, Bewegung oder Ruhezustand des Mediums usw. Die auf

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diese Weise gezüchteten asporogenen Hefen enthalten Ribonucleinsäure in einer Menge von etwa 4 bis 10$, bezogen auf das Gewicht der trockenen Zellen.

Als nächste Stufe werden die erhaltenen Rohzellen der asporogenen Hefen in einem wässrigen Medium gehalten, dessen p„-Wert auf etwa 3,0 bis etwa 6,0, vorzugsweise auf 4,5 bis 5,5, eingestellt ist. Zu diesem Zweck können die asporogenen Hefen vom Kulturmedium abgetrennt werden oder auch darin belassen werden. Wenn sie vom Kulturmedium abgetrennt werden, suspendiert man sie anschließend in einen wäßrigen Medium. Vorzugsweise wird eine wäßrige Pufferlösung als wäßriges Medium verwendet. Beispielsweise kann eine essigsaure Pufferlösung oder eine bernsteinsaure Pufferlösung mit dem gewünschten p_H-Wert vorteilhaft verwendet werden. Falls erforderlich, können organische oder anorganische Salze weiterhin in solchen Mengen Zugesetztwerden, daß die Endkonzentration an Salz etwa 0,1 bis 0,5 Mol pro Liter beträgt. Als Salze werden für diesen Zweck vorzugsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Ammoniumchlorid verwendet. Die Suspension wird im allgemeinen 1 bis 10 Stunden bei einer Temperatur von etwa 20 bis 50°, vorzugsweise von 30 bis 45°C, stehen gelassen oder geschüttelt oder gerührt.

Wenn die asporogenen Hefen dem sauren wäßrigen Medium ohne vorherige Abtrennung vom Kulturmedium ausgesetzt werden, ist das letztere auf einen sauren p„-Wert von etwa 3,0

bis 6,0, vorzugsweise von 4,5 bis 5,5, und eine Salzkonzentration von etwa 0,1 bis 0,5 Mol/l, beispielsweise durch Zusatz der vorstehend genannten Stoffe oder durch Verdünnen mit Wasser, einzustellen. Die weitere Behandlung kann in der gleichen Weise wie bei der vorstehend beschriebenen Suspendierung durchgeführt werden.

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Es wurde festgestellt, daß die Einwirkungsdauer des sauren Mediums auf die Mikroorganismen nicht sehr lang sein muß, daß jedoch eine Behandlungsdauer von wenigstens 10 bis 30 Minuten erforderlich ist. Das wäßrige Medium, in dem die Mikroorganismen gehalten werden, wird zunächst genau auf einen gewünschten p^-Wert im sauren Bereich eingestellt und für eine Zeit, die langer ist als die genannte Mindestzeit, beim sauren p_H-Wert innerhalb eines gewünschten Bereichs gehalten. Danach braucht keine Korrektur des Pu-Werts mehr vorgenommen zu werden, auch wenn er bis zum neutralen Bereich ansteigt.

Es ist vorteilhaft, die asporogene Hefe vor oder während des Suspendierungsprozesses einer physikalischen oder chemischen Behandlung zu unterwerfen, durch die eine gewisse Beschädigung der Zellwände oder eine Erhöhung ihrer Durchlässigkeit bewirkt wird. Hierdurch kann die für die Suspendierung erforderliche Zeit verkürzt werden. Beispielsweise kann man die asporogene Hefe vor der Suspendierung einmal oder mehrmals gefrieren lassen· Eine Erhöhung der Wirksamkeit des Suspendierungsprozesses wird auch erzielt, wenn man die Zellen der Hefe der Einwirkung folgender Stoffe aussetzt: Organische Lösungsmittel, wie Äthylacetat, Toluol, Aceton usw., Antibiotika, insbesondere Antibiotika vom Polyentyp, wie Nystatin (siehe J.D.Dutcher u. Mitarb., Antibiotics Annual (1953-195²O, S. 191), Eurocidin (siehe K. Nakazawa, "Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan", 2^, S. 65O), Candimycin (siehe M.Shibata u.Mitarb., "The Journal of Antibiotics", Series B, Bd. 7, S.I68 (1954), japanisches Patent 301 24o),Amphotericin B (siehe J. Vandeputte u.Mitarb. "Antibiotics Annual" (1955-1956), S.587), Trichomycin (siehe Hosoya u. Mitarb. "The Jamal of Antibiotics", Series B, £, S.564 (1952) ) usw., kationaktive oberflächenaktive Mittel, wie Cetyltrimethylammoniumbromid, oder Glucanasen, hergestellt durch einen Mikroorganismus der Gattung Trametes oder Streptomyces, z.B. Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd. 90 9 8 U7 1 126

Durch diese Behandlungen verschwinden 80 bis 100$ der intrazellularen Ribonucleinsäure, und 60 bis 90$ dieser Säure wird in 5*-Nucleotide umgewandelt, z.B. in 5¹-Adenylsäure, 5^!-Guanylsäure, 5¹-Cytidylsäure und 5¹-Uridylsäure. Diese Säuren treten aus den Zellen in das umgebende Medium über und reichern sich darin an. Wenn der Mikroorganismus 5'-Adenylsäuredeamxnase bildet, kann 5'-Inosinsäure anstelle von 5'-Adenylsäure angereichert werden.

Wenn die Aktivität der Nucleotidasen zu hoch ist, lassen sich die unerwünschten Polgen einer Dephosphorylierung vermeiden, wenn man dem Medium einen Nueleotidase-Inhibitor, wie Arsenate u.dgl., zusetzt.

Als 5¹-Nucleotide werden auf diese Weise im allgemeinen 5¹-Adenylsäure, 5*-Guanylsäure, 5^r-Uridylsäure, 5¹-Cytidylsäure usw. erhalten. Wenn Deaminase in der Lösung vorhanden ist, können 5'-Inosinsäure und/oder 5'-Xanthylsäure erhalten werden, aber die Bildung dieser Desaminierungsprodukte kann verhindert werden, wenn die Wirksamkeit der Desaminase vorher ausgeschaltet wird. Die 5¹-Nucleotide können durch Adsorption, z.B. an Aktivkohle oder Ionenaustauschharzen, durch Fällung mit Hilfe von Salzen oder durch Extraktion mit Lösungsmitteln aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden. Je nach der Art der Abtrennung des zu verwendenden Produkts können die 5^!-Nucleotide als Gemisch von zwei oder mehr Arten von 5'-Nucleotiden oder auch einr zein aus dem Reaktionsgemisch gewonnen werden.

Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben, in denen die Prozentsätze der Bestandteile-der Medien als Gew.-#/Vol. ausgedrückt sind und die übrigen Mengenangaben sich auf das Gewicht beziehen. Die Temperaturen sind sämtlich unkorrigiert.

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— Ύ —

Beispiel 1

Rhodotorula pallida Lodder wird 30 Stunden bei 20° in 30 1 eines Mediums (p_H 6,2) bebrütet, das folgende Zusammensetzung hat: 5»ο $6 Glucose, o,5 % Pepton, 0,5 % Fleischextrakt, 0,2 % Hefeextrakt, 0,o5# Magnesiumsulfat und 0,ol # Calciumchlorid. Die Zellen werden dann abgetrennt und in 5 1 einer essigsauren Pufferlösung (0,25 Mol, Pti5*0) suspendiert. Nachdem die Suspension 5 Stunden bei 37 bewegt worden ist, werden die Zellen vom flüssigen Anteil abgetrennt. Sie werden mit Wasser gewaschen, und das ablaufende Waschwasser wird zum flüssigen Anteil gegeben. Aus der Lösung werden die 5'-Nucleotide in üblicher Weise abgetrennt. Erhalten werden 8,2 g 5^!-Adenylsäure, 7*7 g 5'-Quanylsäure, 5,3 g S'-Cytidylsäure und 6,7 g 5'~Uridyl-* säure.

Beispiel 2

Rhodotorula pallida Lodder wird 30 Stunden bei 28° in 3o 1 eines Mediums folgender Zusammensetzung bebrütet:

3, ο % MaJanaische, 0,5 % Harnstoff, 0,05 % Magnesiumsulfat, o,l % Kaliummonohydrogenphosphat und 0,5 % Kaliumdihydrogen-

phosphat. Der p„-Wert wird durch Zugabe von etwa 3 1 einer η

Pufferlösung, die 2 Mol Acetat enthält, auf 5*ο eingestellt. Es wird noch 6 Stunden bebrütet, worauf die Zellen abgetrennt werden. Das Piltrat wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt. Erhalten werden 7*5 g 5'-Adenylsäure, 6,9 g 5'-Guanylsäure, 5,1 g 5'-Cytidylsäure und 6,1 g

Beispiel 3

Mycoderma tannica Asai wird 30 Stunden bei 2b° in 30 1 des gleichen Mediums wie in Beispiel 1 bebrütet, worauf die Zellen abgetrennt werden. Sie werden in Io 1 Essigsäurepufferlösung (0,25 Mol, ΡτΛ,ο) suspendiert. Nachdem die

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Suspension 4 Stunden bei 37° bewegt worden ist, werden die Zellen vom flüssigen Anteil abgetrennt, der auf die gleiche Weise wie in den vorigen Beispielen behandelt wird. Erhalten werden 3,2 g 5^!-Adenylsäure, 2,6 g 5"Guanylsäure, 2,1 g Cytidylsäure und 3,1 g 5'-Uridylsäure.

Beispiel 4

1) Zum Nachweis der Bedeutung der pH-Werts-Begrenzung sind die folgenden Versuche gemacht worden:

Rhodotorulae pallida Lodder wird in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise inkubiert und dabei 1 kg (Nassgewicht) an Zellkörpern mit einem Gehalt von Io % Ribonucleinsaure gewonnen, loo g dieser Zellkörper werden in 5oo ml der im folgenden angegebenen Pufferlösungen suspendiert (o,25 Mol bei pH-Werten, die in der nachfolgenden Tabelle angegeben sind. Die Suspensions wird für 5 Stunden bei 37°C stehengelassen, dann werden die Zellkörper von der Flüssigkeit abgetrennt. Die Flüssigkeit wird in konventioneller Weise unter Verwendung von Aktivkohle, Ionenaustauschharzchromatographie usw., zur Gewinnung der 5'-Nucleotide weiterverarbeitet.

Pjj-Wert	Puffer system	5'-AMP (g)	5'-GMP (g)	5'-UMP (g)	5'-CMP (g)
l,o	HCl-KCl	o,o5o	o,o4o	o,o3	o,o3
2,o	HCl-KCl	o,o7o	o,o6o	o,o45	o,o3o
3, ο	Essigsäure- Natriumacetat	o, 65	o, 5«	o,5o	o,47
4,o	tt	o,82	o, 73	o, 61	0,60
5,o	ti	o, 85	o, 75	o, 62	o,6l
6, ο	Il	o,8o	o,72	o,6o	o,59
7, ο	HCl-Trisamlno- methan	o,2o	o, 17	o, 14	o,13
8,o	Il	o,15	o, 11	o,o9	0,09 '
5'-AMP:	Adenosin 5'-mono- phosphat
5^f-GMP:	Guanosin 5'-mono- phosphat
5'-UMP:	Uridin 5'-mono- phosphat

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-Wert

Puffersystem

U7033B

5'-AMP 5'-GMP 5'-UMP 5'-CMP (g) (g) (g) (g)

5'-CMP: Cytidin 5'-monophosphat

2) Zum Nachweis der Bedeutung der spezifischen Salzkonzentration werden den Versuchen zu Ziffer 1 entsprechende Versuche durchgeführt, hier wird jetzt jedoch konstant bei einem Prj-Wert von 5, ο in einer Essigsäure-Pufferlösung gearbeitet, während die Salzkonzentration variiert wird. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich:

SaIzkonzentrat ion	5'-AMP	5 -GMP	5^l-UMP	5'-CMP
in Mol	(g)	(g)	(g)	(g)
0	o,o7	o,o5	o,o4	o,o4
o,o5	o, 15	o,13	o,ll	o,lo
o,l	o,7o	0,63	o,54	o,52
o,2	o, 85	o,75	o,62	o,6l
o,3	o, 84	o,73	o,62	o,6l
o,4	o,8l	o,71	0,60	0,60
o,5	o,78	0,70	o,61	0,60
o,6	o, 21	o,15	o,ll	o,lo
o,7	o, 15	o,lo	0,07	0,06
l,o	o, 12	o,lo	0,08	0,07

3) Zum N xhweis der Bedeutung der spezifischen Behandlungstemperatur werden Versuche gemäss Ziffer 1 durchgeführt, bei denen im Essigsäure-Puffer (0,25 Mol, pH 5,0) gearbeitet wird. Bei den miteinander zu vergleichenden Versuchen wird jetzt die Temperatur variiert. Das Ergebnis dieser Versuche Ist in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst:

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- Io -

Temperatur	5'-AMP	5'-GMP	5^f-UMP	5^f-CMP
⁰C	" Cs)	(g)	(g)	-(K)
Io	o,o6	o,o4	0,03	o, 03
15	o,o8	0,07	o,o4	o,o4
2o	o,59	o,5o	o,4l	0, 41
25	o,72	0,62	o,54	o,53
Ί>ο	o,82	o,71	o, 60	0,60
JJ	0,85	o,75	o,62	o, 61
45	0,83	o,72	o,6l	o,6l
5o	0,75	0,67	o,58	o,57
55	0,15	o,12	0, Io	o,lo
6o	0,09	0,07	o,o5	0,05

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Claims

Patentansprüche

( 1.) ) Verfahren zur Herstellung von 5^f-Nucleotiden durch enzymatische Spaltung von Hefe-Ribonucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man asporogene Zuchthefen bei Temperaturen von 20 bis 50⁰C in einem wässrigen Medium mit einem Salzgehalt von 0,1 bis 0,5 Mol/Liter suspendiert, den p„-Wert des wässrigen Mediums im Anfang der Hefebehandlung mindestens 10 bis 30 Minuten lang zwischen 3»0 und 6,0 - vorzugsweise 4,5 bis 5*5 hält, und die gebildeten 5^!-Nucleotide aus dem wäßrigen Medium gewinnt.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hefeausgangsmaterial vor der Behandlung einer an sich bekannten physikalischen oder chemischen Behandlung zur Beschädigung der Zellwände oder Erhöhung ihrer Durchlässigkeit unterwirft.

3·) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Hefe der Gattung Rhodotorula, Mycoderma, Rhodotorula pallida Lodder oder Mycoderma tannica Asai verwendet wird.

Neue Unterlagen (Art. 711 Abs. 2 fir.1 Satz 3 des Änderungsges. v. 4. %

OBiQtNAL IN$PECT89