DE1246166B - Process for the fractionated precipitation of dextran hydrolysates for therapeutic purposes - Google Patents

Description

Verfahren zur fraktionierten Fällung von Dextranhydrolysaten für therapeutische Zwecke Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur fraktionierten Fällung von Dextranhydrolysaten aus wäßriger Lösung durch Zugabe von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln bei höherer Temperatur und Ausfällung der Fraktionen durch Abkühlung auf niedrigere Temperatur.Process for the fractional precipitation of dextran hydrolysates for therapeutic purposes Purposes The invention relates to a method for the fractional precipitation of Dextran hydrolysates from aqueous solution by adding water-soluble organic Solvents at higher temperatures and precipitation of the fractions by cooling to a lower temperature.

Dextran, teilweise abgebaut aus nativem Dextran, das aus Sucrose durch die Mikroorganismen Leuconostoc mesenteroides biosynthetisch hergestellt worden ist, besitzt keine gleichförmige Molekulargröße, sondern stellt ein Gemisch aus Dextranen mit verschiedenen Molekulargewichten dar. Dextran, partially broken down from native dextran, that from sucrose biosynthetically produced by the microorganisms Leuconostoc mesenteroides is does not have a uniform molecular size but is a mixture Represent dextrans with different molecular weights.

Es ist bekannt, daß vom physiologischen Standpunkt die Anwendung von solchen Dextranprodukten z. B. als Grundmittel oder Füllmittel für Plasmaaustauschstoffe eine Herz-Lungen-Maschine oder künstliche Niere an sich unerwünscht beeinnußt. It is known that from the physiological point of view the application of such dextran products e.g. B. as a base or filler for plasma exchangers a heart-lung machine or artificial kidney per se undesirably influenced.

Daher sind verschiedene Arbeitsweisen angegeben worden, wonach man z. B. ein Fällmittel zu einer wäßrigen Lösung von teilweise abgebautem Dextran hinzugibt und Dextranfraktionen mit einer Molekulargröße, die so gleichförmig wie möglich ist, aus dem polydispersen Dextran selektiv niederschlägt. Therefore, various modes of operation have been specified, after which one z. B. adding a precipitant to an aqueous solution of partially degraded dextran and dextran fractions having a molecular size as uniform as possible is, from which polydisperse dextran precipitates selectively.

Nach einem anderen Verfahren zur Herstellung von für pharmazeutische Zwecke geeignetem Dextran, insbesondere in gelöster Form für Injektionszwecke, mit einem Molekulargewicht von 104 bis 4-10'i durch Vergärung von Zuckerlösungen und saure Hydrolyse der erhaltenen Dextranlösungen arbeitet man so, daß die durch Fällung der vorgorenen Lösung mit Alkohol erhaltenen rohen Dextrane getrocknet und feinst gemahlen, zunächst mit Chlorwasserstoffsäure, vorzugsweise von 1 bis 10°/oss angequollen und erst das erhaltene Gel durch Zusatz von Wasser und Erwärmen hydrolysiert wird, worauf das neutralisierte Hydrolysenprodukt fraktioniert wird. According to another method of making for pharmaceutical Dextran suitable for purposes, especially in dissolved form for injection purposes, with a molecular weight of 104 to 4-10'i through fermentation of sugar solutions and acid hydrolysis of the dextran solutions obtained is carried out in such a way that the by precipitation the pre-fermented solution with alcohol obtained raw dextrans are dried and finest ground, initially swollen with hydrochloric acid, preferably from 1 to 10% and only the gel obtained is hydrolyzed by adding water and heating, whereupon the neutralized hydrolysis product is fractionated.

Weiterhin ist ein Verfahren bekannt, wobei man zur Herstellung von für pharmazeutische Zwecke, insbesondere in gelöster Form für Injektionszwecke, geeignetem Dextran durch Vergärung von Zuckerlösungen und Hydrolyse der erhaltenen Dextranlösungen das neutralisierte Hydrolysenprodukt durch Zusatz eines Nichtlösungsmittels, wie Alkohol oder Aceton, und Zentrifugieren mit Trenn-oder Klärseparatoren in eine leichtere und eine schwerer flüssige Phase, gegebenenfalls wiederholt trennt. Hierbei findet also bei der Zugabe von wasserlöslichem Alkohol oder Aceton bei der gewählten Temperatur noch keine Fällung statt, während anschließend abgekühlt und dadurch das Auftreten von zwei Phasen erzielt wird. Furthermore, a method is known, wherein one for the production of for pharmaceutical purposes, especially in dissolved form for injection purposes, suitable dextran by fermentation of sugar solutions and hydrolysis of the obtained Dextran solutions the neutralized hydrolysis product by adding a non-solvent, such as alcohol or acetone, and centrifugation with separators or clarifiers in one lighter and a heavier liquid phase, optionally repeatedly separates. Here takes place with the addition of water-soluble alcohol or acetone with the chosen Temperature still no precipitation takes place, while subsequently cooled and thereby the appearance of two phases is achieved.

Man beginnt bei Temperaturen von beispielsweise 40 oder 56°C und kühlt dann auf Zimmertemperatur, beispielsweise 13 oder 19°C, ab.You start at temperatures of, for example 40 or 56 ° C and cools then to room temperature, for example 13 or 19 ° C.

Es hat sich herausgestellt, daB bei diesen Trennmethoden die Anwendung von zu stark konzentrierten wäßrigen Dextranlösungen in der Praxis zur Koagulierung nur derjenigen Teile der Lösungen führt, die bei der Zugabe dem Fällmittel ausgesetzt sind. Das bedeutet, daß eine lokale Fällung stattfindet. Dementsprechend ist es notwendig, daß man wäßrige Dextranlösungen in einer Konzentration verwendet, die so niedrig wie möglich liegt, um Dextranfraktionen in gleichförmigster Molekulargröße zu erhalten. It has been found that with these separation methods the application of excessively concentrated aqueous dextran solutions in practice for coagulation leads only to those parts of the solutions which are exposed to the precipitant during the addition are. This means that local precipitation takes place. It is accordingly necessary that one uses aqueous dextran solutions in a concentration that as low as possible in order to obtain dextran fractions of the most uniform molecular size to obtain.

Daraus ergibt sich weiterhin, daß von einem Fällmittel größere Mengen erforderlich werden als dann, wenn Dextran aus seiner konzentrierten wäßrigen Lösung abgetrennt wird ; ferner ist als Folge davon, daß sich feine Niederschläge entwickeln, für deren Abtrennung eine erhebliche Zeit erforderlich ist. Infolgedessen sind die bekannten Arbeitsweisen bei technischer Anwendung mit beträchtlichen Mängeln belastet, insbesondere auch deswegen, da man nach den bekannten Verfahren nicht die erforderliche Gleichmäßigkeit der einzelnen Moleküle erzielen kann, so daß die spätere praktische Anwendung der bekannten Produkte zu den nicht so stabilen Lösungen führt, wie erforderlich ist.This also means that larger amounts of a precipitant will be required than when dextran is extracted from its concentrated aqueous solution is separated; furthermore, as a result of the development of fine precipitates, a considerable time is required for their separation. As a result, the known working methods with technical application burdened with considerable deficiencies, in particular because the known method does not provide the necessary Uniformity of the individual molecules can be achieved, so that the later practical Application of the known products leads to the solutions that are not as stable as required is.

Daher besteht die Aufgabe der Erfindung darin, in rationeller Weise Dextranprodukte mit höherer Gleichmäßigkeit der Moleküle und in stabilerer Form innerhalb kürzerer Arbeitszeiten herzustellen. Therefore, the object of the invention is in a rational manner Dextran products with higher molecular uniformity and in a more stable form to produce within shorter working hours.

Gemäß der Erfindung erreicht man dies durch ein Verfahren zur fraktionierten Fallung von Dextranhydrolysaten aus wäßriger-Lösung durch Zugabe von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln bei höherer Temperatur und Ausfällung der Fraktionen durch Abkühlung auf niedrigere Temperatur, wobei man bei Zimmertemperatur so lange organisches Lösungsmittel zur wäßrigen Lösung des Dextranhydrolysats gibt, wie noch kein Niederschlag auftritt, und die Lösung unter Rühren abkühlt. According to the invention, this is achieved by a method for fractionated Precipitation of dextran hydrolysates from aqueous solution by adding water soluble organic solvents at higher temperature and precipitation of the fractions by cooling to a lower temperature, keeping at room temperature for so long organic solvent is added to the aqueous solution of the dextran hydrolyzate, as is still the case no precipitate occurs and the solution cools while stirring.

Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn bis zu einer unmittelbar oberhalb des Gefrierpunktes der nach der Fällmittelzugabe gebildeten Lösung liegenden Temperatur abgekühlt wird. Die Abkühlung bzw. die fraktionierte Abkühlung und das Halten bei den Kühltemperaturen können sich über mehrere Stunden erstrecken. It is particularly advantageous if up to one immediately lying above the freezing point of the solution formed after the addition of the precipitant Temperature is cooled. The cooling or the fractional cooling and that Holding at the cooling temperatures can take several hours.

Man erhält auf diese Weise solche Dextranprodukte, die sich für medizinische Zwecke besonders gut eignen. In this way one obtains such dextran products which are useful for medicinal purposes Purposes particularly well.

Diese Produkte weisen eine merklich verbesserte Lagerungsstabilität auf, zeigen eine gleichförmigere Molekulargröße, werden mit kleineren Fällmittelmengen erhalten und benötigen eine kürzere Arbeitszeit zu ihrer Herstellung, wie die nachstehenden tabellarischen Daten zeigen.These products have markedly improved storage stability on, show a more uniform molecular size, with smaller amounts of precipitant and require a shorter labor time to make them, like the ones below show tabular data.

In der praktischen Ausführung dieses Verfahrens arbeitet man so, daß zunächst ein Fällmittel zu einer wäßrigen Lösung von teilweise abgebautem Dextran mit einer grundmolaren Viskosität von 0, 10 bis 0, 30 hinzugegeben wird, vorzugsweise in Konzentrationen im Bereich zwischen 2% (Gew./Vol.) und 10% (Gew./Vol.) bei normaler Temperatur, nämlich bei 15 bis 25°C. In diesem Fall soll das betreffende Fällmittel in solchen Mengen zugefügt werden, daß bei der Zugabetemperatur keine Dextranniederschläge erzeugt werden. Die Mengen, die hier jeweils angewendet werden und dabei keine Niederschläge erzeugen, entsprechen denjenigen, die einen Wert von über 95 °/o für die Durchlässigkeit der wäßrigen Lösung von teilweise abgebautem Dextran mit hinzugegebenem Fällmittel ergeben ; die Durchlässigkeit wird bei einer Wellenlänge von 550 mll mit einem Elektrophotometer gemessen. In the practical execution of this procedure one works like this, that first a precipitant to an aqueous solution of partially degraded dextran with an intrinsic molar viscosity of from 0.1 to 0.30 is added, preferably in concentrations ranging between 2% (w / v) and 10% (w / v) at normal Temperature, namely at 15 to 25 ° C. In this case, the precipitant in question should be added in such amounts that no dextran precipitates at the addition temperature be generated. The amounts that are used here and no precipitation produce correspond to those which have a value of over 95% for the transmittance the aqueous solution of partially degraded dextran with added precipitant result ; the transmittance is measured at a wavelength of 550 ml with an electrophotometer measured.

Die grundmolare Viskosität wird bei Temperaturen von 25 zt0, 1° C gemessen und nach der folgenden Gleichung bestimmt : wobei bei wobei wobei #r=#/#o, #sp = #r-1, # = Lösungsviskosität, #o = Lösungsmittelviskosität, c = Konzentration (im Wasser), ausgedrückt in g/100 ml. The intrinsic molar viscosity is at temperatures of 25 zt0.1 ° C measured and determined according to the following equation: where where where #r = # / # o, #sp = # r-1, # = solution viscosity, #o = solvent viscosity, c = concentration (in water), expressed in g / 100 ml.

Als Fälknittel wird ein solches angewendet, womit man Dextran fällen kann, ohne es chemisch zu verändern; das Fällmittel soll mit Wasser mischbar sein. A felling agent is used with which dextran is precipitated can without chemically changing it; the precipitant should be miscible with water.

In der praktischen Ausführung können aliphatische Alkohole verwendet werden, beispielsweise Methanol, Äthanol oder Isopropanol.In practice, aliphatic Alcohols used be, for example methanol, ethanol or isopropanol.

Bei der praktischen Ausführung wird weiterhin die fälhnittelhaltige Lösung allmählich unter Rühren abgekühlt ; der Temperaturbereich erstreckt sich von einer Höhe, die über die Zugabetemperatur nicht hinausgeht, hinunter bis oberhalb des Gefrierpunktes. In the practical implementation, the debt-containing funds will continue to be used Solution gradually cooled with stirring; the temperature range extends from a height that does not go beyond the addition temperature, down to above of freezing point.

Es wird eine relativ geringe Kühlgeschwindigkeit bevorzugt ; im einzelnen ist die Kühlgeschwindigkeit von den Lösungsverhältnissen und den Lösungsmitteln abhängig. Weiterhin soll, wenn das Fällmittel erst einmal hinzugegeben worden ist,-am System nichts mehr geändert werden. Nur ist dann darauf zu achten, daß die Lösungstemperatur so geregelt wird, daß sie in den genannten Bereich hineinfällt. A relatively slow cooling rate is preferred; in detail is the cooling rate of the solution ratios and solvents addicted. Furthermore, once the precipitant has been added, -am System nothing more can be changed. It is then only necessary to ensure that the solution temperature is regulated so that it falls into the area mentioned.

Während des Kühlvorganges soll so eingehend wie möglich gerührt werden. Das Kühlen soll ausgeführt werden, bis gewisse Dextrananteile ausgefällt sind, obwohl anfänglich der größere Teil Dextran noch aufgelöst verbleibt. Wenn die Lösung bei der betreffenden Temperatur stehengelassen wird, werden diejenigen Fraktionen abgetrennt, die außerhalb der zulässigen Grenzen für das erwünschte Dextran liegen und aus relativ höhermolekularem Dextran bestehen. During the cooling process, stirring should be as thorough as possible. The cooling is said to be carried out until certain proportions of dextran have precipitated, although initially the greater part of the dextran still remains dissolved. If the solution is the temperature in question is left to stand, those fractions are separated which are outside the permissible limits for the desired dextran and from relative consist of higher molecular weight dextran.

Dann wird die Lösungstemperatur unter Rühren wiederum reduziert. Wenn die Lösung nochmals stehengelassen wird, wird eine zweite Dextranfraktion abgetrennt. In diesem Fall soll die Lösung auf solche Temperaturen abgekühlt werden, bei denen die relativ niedrigermolekularen Dextrananteile, die jenseits der zulässigen Grenzen für das erwünschte Dextran liegen, noch unausgefällt in der zweiten Lösung verbleiben.Then the solution temperature is reduced again with stirring. if the solution is left to stand again, a second dextran fraction is separated off. In this case, the solution should be cooled to temperatures at which the relatively low molecular weight dextran components that are beyond the permissible limits lie for the desired dextran, still remain unprecipitated in the second solution.

So ist es möglich, daß man eine zweite Dextranfraktion mit einem mittleren Molekulargewicht erhält, die eine gleichförmigere Molekulargröße als das zuerst erhaltene Material aufweist. So it is possible that you have a second dextran fraction with a average molecular weight, which has a more uniform molecular size than that material received first.

Bei Ausführung dieser Arbeitsweise erhält man praktisch keinen Unterschied in der Molekulargröße der erhaltenen Dextranfraktionen. Es ist auch möglich, daß man Dextranfraktionen mit der erwünschten Molekulargröße durch Anwendung kleinerer Mengen Fällmittel und in kürzerer Behandlungszeit abtrennt. Practically no difference is obtained when performing this procedure in the molecular size of the dextran fractions obtained. It is also possible that one dextran fractions with the desired molecular size by using smaller ones Quantities of precipitant and separates in a shorter treatment time.

Die nachstehenden Tabellen I und II zeigen die Ergebnisse von Versuchen, die zur Veranschaulichung dieser Zusammenhänge ausgeführt worden sind. Tables I and II below show the results of experiments which have been carried out to illustrate these relationships.

Solche Methanolmengen, die bei 20°C keine Niederschläge brachten, wurden langsam unter Rühren zu 1000 ml jeweils von 2% (Gew./Vol.) und 10% (Gew./ Vol.) wäßrigen Lösungen teilweise abgebauten Dex--trans mit einer grundmolaren Viskosität von 0, 179 hinzugegeben. Danach wurden diese Testlösungen fraktioniert bis zu solchen Temperaturen abgekühlt, bei denen die ersten und zweiten Fraktionen jeweils aus den Lösungen in praktisch derselben Menge erhalten wurden. Tabelle I zeigt die so erhaltenen Fraktionen und die grundmolaren Viskositäten der 5-bis 10 °/Oigen Anteile jeweils von den höher-und den niedrigermolekularen Anteilen in der zweiten Fraktion. Such amounts of methanol that did not bring any precipitation at 20 ° C, were slowly with stirring to 1000 ml each of 2% (w / v) and 10% (w / v) Vol.) Aqueous solutions partially degraded Dex - trans with an intrinsic molar viscosity of 0.179 added. After that, these test solutions were fractionated into such Temperatures cooled at which the first and second fractions, respectively, from the solutions were obtained in practically the same amount. Table I shows the so obtained fractions and the intrinsic molar viscosities of the 5 to 10% fractions each of the higher and lower molecular weight fractions in the second fraction.

Tabelle I 2%(Gew./Vol.) 10% (Gew./Vol.) wäßrige Lösung wäßrige Lösung von Dextran von Dextran Methanolkonzentration [%] (Gew./Vol.) 42, 6 35, 9 Erste Fraktion fraktionierte Kühltemperatur (°C).............. ~3 1 Ausbeute 8, 1 8, 2 grundmolare Viskosität 0, 372 0, 364 Tabelle I (Fortsetzung) 2 °/o (Gew./Vol.) 10 °/o (Gew./Vol.) wäßrige Lösung wäßrige Lösung von Dextran von Dextran Zweite Fraktion fraktionierte Kühltemperatur (°C)...-38-21 Ausbeute (0/,)............ 56, 6 60, 0 grundmolare Viskosität 0, 205 0, 199 grundmolare Viskosität von höhermolekularen Anteilen... 0, 312 0, 306 grundmolare Viskosität von niedrigermolekularen Anteilen.. 0, 120' 0, 110 Wie aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich ist, haben unterschiedliche Dextrankonzentrationen in der Lösung, woraus Dextran fraktioniert abgetrennt werden soll, keine Wirkung auf die Gleichförmigkeit der Molekulargrößen der so abgetrennten Dextranfraktionen.Table I. 2% (w / v) 10% (w / v) aqueous solution aqueous solution of dextran of dextran Methanol concentration [%] (w / v) 42, 6 35, 9 First faction Fractional cooling temperature (° C) .............. ~ 3 1 Yield 8,18,2 intrinsic viscosity 0.372 0.364 Table I (continued) 2 ° / o (w / v) 10 ° / o (w / v) aqueous solution aqueous solution of dextran of dextran Second faction Fractional cooling temperature (° C) ...- 38-21 Yield (0 /,) ............ 56.6 60.0 intrinsic viscosity 0, 205 0, 199 Base molar viscosity of higher molecular weight fractions ... 0, 312 0, 306 intrinsic viscosity of lower molecular weight fractions .. 0, 120 '0, 110 As can be seen from the table above, different dextran concentrations in the solution from which dextran is to be fractionated have no effect on the uniformity of the molecular sizes of the dextran fractions thus separated.

Aus einer 5°/0 (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von teilweise abgebautem Dextran mit einer grundmolaren Viskosität von 0, 23 wurde eine Dextranfraktion in relativ derselben Qualität und Menge nach dem Verfahren gemäß der Erfindung bzw. der früheren Arbeitsweise abgetrennt. Tabelle II veranschaulicht die Beziehung zwischen den ausgefällten Mengen und der Zeit, während der für die Lösung die Möglichkeit zum Stehen bestand, als die Fraktionen abgeschieden wurden. From a 5% (w / v) aqueous solution of partially degraded Dextran with an intrinsic molar viscosity of 0.23 was a dextran fraction in relatively the same quality and quantity according to the method according to the invention or separated from the previous way of working. Table II illustrates the relationship between the amounts precipitated and the time during which for the solution to be possible existed when the fractions were separated.

Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung wurden 500 ml der vorstehend genannten Lösung in jeweils sieben 1000-ml-Becher eingemessen. Dazu wurden 319, 5 ml Methanol gegeben, d. h. eine Menge, wodurch keine Dextranniederschläge bei 20°C erzeugt wurden. Der Inhalt wurde jeweils langsam auf-12°C, während gut gerühtt wurde, in einem Aceton-Trocken- eis-Bad abgekühlt. Das Material wurde noch in der Kühlkammer, die auf-12°C gehalten wurde, während solcher Zeitperioden belassen, wie sie gegenüber jeder Versuchsnummer in Tabelle II angegeben sind. In the method according to the invention, 500 ml became the above Measure the above solution into seven 1000 ml beakers each. In addition, 319, Added 5 ml of methanol, i.e. H. a lot, eliminating dextran deposits 20 ° C were generated. The contents were each slowly brought to -12 ° C while stirring well in an acetone dry cooled ice bath. The material was still in the Leave the cooling chamber kept at -12 ° C during such periods of time, as indicated against each run number in Table II.

Unter I<ippen des Bechers wurde die obere klare Flüssigkeit entfernt, um die Niederschläge abzutrennen.The upper clear liquid was removed while tapping the beaker, to separate the precipitation.

Andererseits wurden nach der früheren Arbeitsweise 500 ml derselben Lösung, wie vorstehend erwähnt, in jeden von sieben 3000-ml-Bechern eingemessen. Während der Inhalt jeweils eingehend bei 25°C gerührt wurde, wurden 510, 2 ml Methanol langsam zugefügt. On the other hand, after the earlier procedure, it became 500 ml Measure solution as noted above into each of seven 3000 ml beakers. While the contents were thoroughly stirred at 25 ° C., 510.2 ml of methanol were added slowly added.

Das Material wurde in einer Thermostatkammer, die bei 25°C gehalten wurde, während Zeitperiodén stehengelassen, die gegenüber jeder Versuchsnummer in Tabelle II angegeben sind. Unter Kippen des Bechers wurde die obere klare Flüssigkeit entfernt, um die Niederschläge abzusondern.The material was in a thermostatic chamber kept at 25 ° C was left to stand for periods of time opposite each test number in Table II are given. When the beaker was tilted, the upper liquid became clear removed to secrete the precipitates.

Bei den vorstehend genannten Versuchen wurde die Geschwindigkeit für die Abkühlung der Lösungen bei dem Verfahren gemäß der Erfindung so weitgehend wie möglich gleich der Geschwindigkeit der Methanolzugabe bei der früheren Arbeitsweise eingestellt. In the above experiments, the speed was so largely for the cooling of the solutions in the method according to the invention as possible equal to the rate of methanol addition in the previous procedure set.

Tabelle II Nr. des Versuchs 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 Zeit zum Stehenlassen (Minuten) 0 1 30 1 60 90 120 150 180 Niederschlagsmenge (g) Verfahren nach der Erfindung ............. 12,9 15,1 16,6 17,0 16,8 16,9 17,2 Frühere Arbeitsweise.. 10, 2 12, 0 14, 1 15, 5 16, 6 16, 8 16, 9 Die vorstehende Tabelle zeigt, daß bei dem Verfahren gemäß der Erfindung die Zeit, die benötigt wird, damit der fraktioniert abgesonderte Niederschlag das konstante Volumen erreicht, wesentlich kürzer als diejenigewar, die bei der früherenArbeitsweise benötigt wurde ; dementsprechend war es möglich, Dextranfraktionen der erwünschten Molekulargröße in einer in diesem Umfang abgekürzten Zeit abzutrennen.Table II No. of attempt 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 Time to stand (minutes) 0 1 30 1 60 90 120 150 180 Precipitation amount (g) Method according to the invention ............. 12.9 15.1 16.6 17.0 16.8 16.9 17.2 Previous way of working .. 10, 2 12, 0 14, 1 15, 5 16, 6 16, 8 16, 9 The table above shows that in the method according to the invention the time required for the fractional precipitated precipitation to reach constant volume was significantly shorter than that required in the previous method; accordingly, it was possible to separate dextran fractions of the desired molecular size in a shortened time to this extent.

Weiterhin weisen Dextranfraktionen, die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhalten wurden, eine höhere Wasserlöslichkeit als diejenigen auf, die nach der früheren Arbeitsweise abgetrennt wurden. Ein anderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die Dextraninjektion, hergestellt aus Fraktionen nach dem Verfahren gemäß der Erfindung, während der Lagerung keine Niederschläge entwickelt, die wie Noppen oder Kömchen gestaltet sind, wie oftmals bei Dextran- injektionen beobachtet worden ist, die nach der früheren Arbeitsweise hergestellt worden sind. Furthermore, dextran fractions obtained by the method according to obtained according to the invention have a higher water solubility than those which were separated according to the previous working method. Another advantage of the invention is that the dextran injection prepared from fractions according to the procedure according to the invention, no precipitates developed during storage, which like Knobs or kömchen are designed, as is often the case with dextran injections observed which have been manufactured according to the previous method.

Die Dextranfraktion, die aus wäßrigen Lösungen von relativ polydispersem, teilweise abgebautem Dextran mit einer grundmolaren Viskosität von 0, 23 nach dem Verfahren gemäß der Erfindung und nach der früheren Arbeitsweise erhalten worden sind und hinsichtlich der so erhaltenen Molekulargrößen relativ dieselbe Qualität aufwiesen, wurden jeweils in physiologischen Salzlösungen aufgelöst, so daß jeweils eine 6 °/Oige (Gew./Vol.) Konzentration erhalten wurde. Das Material wurde gleichmäßig in 100 Ampullen jeweils mit einer Kapazität von 100 ml gegossen. Nach dem Verschließen durch Zuschmelzen wurde das Material einer Dampfsterilisation unter Druck bei 120°C während 20 Minuten unterworfen. Die Dextraninjektionen, die so nach dem Verfahren gemäß der Erfindung und der früheren Arbeitsweise hergestellt wurden, wurden gesondert in einem elektrischen Thermostaten bei 45°C während 50Tagen stehengelassen. Jede Injektion wurde auf Veränderungen ihres Zustandes im Verlaufe der Zeit geprüft. Die nachstehenden Ergebnisse wurden erhalten : pH-Änderungen Anzahl der Ampullen mit Injektionen, Vor dem Nach dem Anzahl der Ampullen beeinträchtigt Einbringen Einbringen mit gefäbten Injektionen durch Entwicklung un den in den von Fremdsubstanzen Thermostaten Thermostaten Verfahren gemäß der Erfindung 5, 8 5, 2 0 0 Frühere Arbeitsweise...... 5, 4 4, 1 8 dreiAmpullen enthielten Injektionen leicht gelblichbraun Tabelle III Nr. des Versuches 1) 23 45 6 Zugegebene Methanolmenge (ml).... 56, 2 126, 6 168, 9 217, 4 250, 0 310, 0 Fraktioniertemperatur (°C)...-10-15-18-26-28-32 Ausbeuter,,)............... 0 0 6, 7 63, 7 73, 2 74, 4 . 500-ml-Anteile wurden aus einer 5°/0 (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von teilweise abgebautem Dextran, hauptsächlich bestehend aus Dextran mit einer grundmolarenViskosität von 0, 32, entnommen. Zu jedem Anteil wurde Methanol in den jenigen Mengen zugegeben, wie in der vorstehenden Tabelle III jeweils veranschaulicht. Dextran wurde dann bei den Temperaturen fraktioniert, die in der Nähe des Gefrierpunktes jeder Lösung liegen, wie in der Tabelle angegeben ist.The dextran fraction, which have been obtained from aqueous solutions of relatively polydisperse, partially degraded dextran with an intrinsic molar viscosity of 0.23 by the process according to the invention and according to the earlier procedure and with regard to the molecular sizes thus obtained had relatively the same quality, were in each case in dissolved physiological salt solutions, so that in each case a 6% (w / v) concentration was obtained. The material was poured evenly into 100 ampoules each with a capacity of 100 ml. After sealing by melting, the material was subjected to steam sterilization under pressure at 120 ° C. for 20 minutes. The dextran injections thus prepared by the method according to the invention and the earlier procedure were separately left to stand in an electric thermostat at 45 ° C for 50 days. Each injection was checked for changes in its condition with the passage of time. The following results were obtained: pH changes number of ampoules with injections, Before after the number of ampoules impaired Introduction Introduction with colored injections through development un in the of foreign substances Thermostats thermostats Method according to the invention 5, 8 5, 2 0 0 Previous way of working ...... 5, 4 4, 1 8 contained three ampoules Injections easily yellowish brown Table III No of attempt 1) 23 45 6 Amount of methanol added (ml) .... 56, 2 126, 6 168, 9 217, 4 250, 0 310, 0 Fractionation temperature (° C) ...- 10-15-18-26-28-32 Exploiter ,,) ............... 0 0 6, 7 63, 7 73, 2 74, 4 . 500 ml portions were taken from a 5% (w / v) aqueous solution of partially degraded dextran, consisting mainly of dextran with an intrinsic viscosity of 0.32. Methanol was added to each portion in the amounts as illustrated in Table III above. Dextran was then fractionated at temperatures near the freezing point of each solution, as indicated in the table.

Wie aus den Beziehungen zwischen den Mengen hinzugegebenen Fällmittels und der Ausbeute an Dextranfraktionen an Hand der vorstehenden Tabelle leicht ersichtlich ist, beeinträchtigen die Zugabemengen die Ausbeute an Dextranfraktionen, die man durch Kühlung erhält. Dementsprechend ist es-erwünscht, so viel Fällmittel wie möglich einzubringen, soweit Dextran bei normaler Temperatur nicht ausgefällt wird, wie hier erläutert ist. As from the relationships between the amounts of precipitant added and the yield of dextran fractions can easily be seen from the table above is, the amounts added affect the yield of dextran fractions that one obtained by cooling. Accordingly, it is desirable to use as much precipitant as possible to be introduced, as far as dextran is not precipitated at normal temperature, such as is explained here.

Wie vorstehend ausgefült, kann man nach dem Verfahren gemäß der Erfindung mit kleineren Mengen eines Fällmittels und in viel kürzerer Behandlungszeit, als bei der früheren Arbeitsweise erforderlich ist, Dextranfraktionen mit verbesserter und gleichförmiger Molekulargröße und weit höherer Lagerungsstabilität als nach der früheren Arbeitsweise erwartet, abtrennen. As stated above, one can use the method according to the invention with smaller amounts of a precipitant and in a much shorter treatment time than in the earlier procedure is required, dextran fractions with improved and uniform molecular size and far higher storage stability than after expected to detach from the previous way of working.

Die Brandung wird nachstehend beispielsweise näher veranschaulicht. The surf is illustrated in more detail below, for example.

Beispiel 1 1500 ml einer 5, 0°/0 (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung (relative Viskosität = 2, 7) von teilweise abgebautem Dextran, enthaltend relativ große Mengen Dextran mit einer Molekulargröße als grundmolare Viskosität von 0, 21 ausgedrückt, das durch Säurehydrolyse aus nativem Dextran erhalten wurde, wurden unter Rühren mit 690 ml 95 °/Oigem Isopropanol gemischt, wobei in der betreffenden Lösung bei 20°C keine Dextranniederschläge erzeugt wurden. Example 1 1500 ml of a 5.0 ° / 0 (w / v) aqueous solution (relative Viscosity = 2.7) of partially degraded Dextran containing relatively large amounts Dextran with a molecular size expressed as an intrinsic viscosity of 0.21, obtained by acid hydrolysis from native dextran were stirred with stirring mixed with 690 ml of 95% isopropanol, with in the relevant solution at 20 ° C no dextran precipitates were generated.

Diese Lösung wurde unter Rühren mit einer so hoch wie möglich liegenden Geschwindigkeit dann langsam gekühlt, bis die Temperatur auf 3°C erniedrigt war, wobei ein Kühlmittel verwendet wurde, das aus Trockeneis und Aceton bestand. Nach dem Anhalten des Rührens wurde die Lösung bei der betreffenden Temperatur 60 Minuten lang stehengelassen ; die erste ausgefallene Dextranfralction wurde von der oberen klaren Flüssigkeit abgetrennt. This solution was stirred at as high a level as possible Speed then slowly cooled until the temperature was lowered to 3 ° C, using a coolant consisting of dry ice and acetone. To stopping the stirring, the solution was at that temperature for 60 minutes left standing for a long time; the first dextran fralction to fail was from the above separated clear liquid.

Diese obere klare Flüssigkeit wurde weiter unter Rühren gekühlt und 80 Minuten lang bei-15°C belassen. Die zweite Dextranfraktion wurde in derselben Weise, wie beschrieben, entfernt. This upper clear liquid was further cooled with stirring and Leave at -15 ° C for 80 minutes. The second fraction of dextran was in the same Way, as described, removed.

Die Abtrennung der dritten Dextranfraktion wurde durch Kühlung der oberen klaren Flüssigkeit nach Entfernung des vorstehend genannten. Niederschlags unter Rühren auf-21°C ausgeführt, d. h. bei einer Temperatur, die dem Gefrierpunkt der betreffenden Flüssigkeit nahekommt ; danach wurde sie 100 Minuten lang stehengelassen. The third dextran fraction was separated off by cooling the upper clear liquid after removing the above. Precipitation carried out with stirring to -21 ° C, d. H. at a temperature that is freezing comes close to the liquid in question; thereafter, it was left to stand for 100 minutes.

Die Ausbeute und die grundmolare Viskosität der vorstehend genannten drei verschiedenen Dextranfraktionen, die durch Kühlung abgetrennt wurden, lagen folgendermaßen : Erste Fraktion Zweite Fraktion Dritte Fraktion Ausbeute (g). 3, 3 44, 3 7, 6 Grundmolare Viskosität).. 0, 37 0, 22 0, 10 Die zweite Dextranfraktion, die so erhalten wurde und mit Bezug auf die Molekulargröße relativ gleichförmig war, zeigte sich als äußerst wirksam als Plasmaaustauschstoff fiir medizinische Behandlungen.The yield and the intrinsic molar viscosity of the three different dextran fractions mentioned above, which were separated off by cooling, were as follows: First parliamentary group Second parliamentary group Third parliamentary group Yield (g). 3, 3 44, 3 7, 6 Basic molar viscosity) .. 0, 37 0, 22 0, 10 The second fraction of dextran so obtained, which was relatively uniform in molecular size, was found to be extremely effective as a plasma exchange agent for medical treatments.

Beispiel 2 960ml 999°/oiges Methanol wurden unter Rühren bei 20° C zu 1500 ml einer 5, 0 °/0 (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung des teilweise abgebauten Dextrans, wie es im Beispiel 1 verwendet wurde, hinzugegeben. Mit Ausnahme der Kühltemperatur wurde derselbe Arbeitsvorgang wie im Beispiell ausgeführt ; es wurden die folgenden drei Dextranfraktionstypen erhalten : Erste FraktionZweite FraktionDritte Fraktion Kühltemperatur (°C) ............. 7 -23 -38 Ausbeute (%) .................. 4,4 45,4 5,6 Grundmolare Viskosität (#) ................. 0, 36 0, 21 0, 09 Beispiel 3 75 g felativ polydisperses, teilweise abgebautes Dextran mit einer grundmolaren Viskosität von 0, 13 wurden in Wasser aufgelöst, wobei 1500 ml einer 5% (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung (relative Viskosität = 2, 1) hergestellt wurden. Dazu wurden unter Rühren 1230 ml 99 °/Oiges Methanol gegeben, d. h. eine Menge, die bei 20°C keinen Dextranniederschlag hervorrief.Example 2 960 ml of 999% methanol were added with stirring at 20 ° C. to 1500 ml of a 5.0% (w / v) aqueous solution of the partially degraded dextran, as used in Example 1. The same operation as in the example was carried out except for the cooling temperature; the following three types of dextran fraction were obtained: First parliamentary group, second parliamentary group, third parliamentary group Cooling temperature (° C) ............. 7 -23 -38 Yield (%) .................. 4.4 45.4 5.6 Baseline viscosity (#) ................. 0, 36 0, 21 0, 09 Example 3 75 g of relatively polydisperse, partially degraded dextran with an intrinsic viscosity of 0.13 were dissolved in water, 1500 ml of a 5% (w / v) aqueous solution (relative viscosity = 2.1) being prepared. To this, 1230 ml of 99% methanol were added with stirring, ie an amount which did not cause dextran to precipitate at 20 ° C.

Sämtliche nachfolgenden Arbeitsvorgänge wurden unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 ausgeführt, ausgenommen jedoch die Kühltemperatur und die Zeit, während der die Lösung stehengelassen wurde. All subsequent operations were carried out under the same conditions as in example 1, except for the cooling temperature and the time during which the solution was left to stand.

Die nachfolgenden drei Arten Dextranfraktionen wurden erhalten : Erste Fraktion Zweite Fraktion Dritte Fraktion Kuhltemperatur (° Zeit, während der stehengelassen wurde (Minuten)... 70 100 120 Ausbeute 3 39, 2 3, 9 Grundmolare Viskosität (#) ............... 0,20 0,13 0, 08 Die zweite erhaltene Dextranfraktion wies eine gleichförmige Molekulargröße auf und war als antiödemisches Mittel wirksam.The following three kinds of dextran fractions were obtained: First parliamentary group Second parliamentary group Third parliamentary group Cooling temperature (° Time left to stand (minutes) ... 70 100 120 Yield 3 39, 2 3, 9 Base molar viscosity (#) ............... 0.20 0.13 0.08 The second fraction of dextran obtained had a uniform molecular size and was effective as an antiedema agent.

Beispiel 4 30 g relativ polydisperses, teilweise abgebautes Dextran mit einer grundmolaren Viskosität von 0, 29 wurden in Wasser aufgelöst, wobei 1500 ml einer 2 °/o (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung gebildet wurden. Dazu wurden unter Rühren 881 ml 99 °/oiges Methanol gegeben, d. h. eine Menge, durch die kein Dextranniederschlag bei 14°C gebildet wurde. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsvorgänge wurden unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 ausgeführt, ausgenommen jedoch die Kühltemperatur und die Zeit, während der die Lösung stehengelassen wurde. Die nachstehenden drei Arten Dextranfraktionen wurden erhalten : Erste Fraktion Zweite Fraktion Dritte Fraktion Kühltemperatur Zeit, während der stehengelassen wurde (Minuten).. 5 5 5 Ausbeute (g) 8, 2 11, 5 1, 0 Grundmolare Viskosität 0, 39 0, 28 0, 17 Beispiel 5 30 g teilweise abgebautes Dextran, das relativ viel Dextran mit einer Molekulargröße als grundmolare Viskosität von 0, 09 ausgedriickt enthielt, wurden in Wasser aufgelöst, wobei 300 ml einer 10 °/o (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung hergestellt wurden. Dazu wurden unter Rühren 250 ml 99 °/oiges Methanol gegeben, d. h. eine Menge, die bei 26° C keinen Dextranniederschlag bildete. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsvorgangue wurden unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 ausgeführt, ausgenommen jedoch die Kiihltemperatur und die Zeit, während der die Lösung stehengelassen wurde. Die nachstehenden drei Arten Dextran wurden erhalten : Erste Fraktion Zweite Fraktion Dritte Fraktion Kühltemperatur 16-26-36 Zeit, während der stehengelassen wurde (Minuten)... 30 50 90 Ausbeute (g)... 1, 2 17, 6 4, 7 Grundmolare Viskositat 0, 11 0, 09 0, 07 Example 4 30 g of relatively polydisperse, partially degraded dextran with an intrinsic viscosity of 0.29 were dissolved in water, 1500 ml of a 2% (w / v) aqueous solution being formed. 881 ml of 99% methanol were added to this with stirring, ie an amount by which no dextran precipitate was formed at 14 ° C. All of the following operations were carried out under the same conditions as in Example 1, except for the cooling temperature and the time for which the solution was allowed to stand. The following three kinds of dextran fractions were obtained: First parliamentary group Second parliamentary group Third parliamentary group Cooling temperature Time left to stand (minutes) .. 5 5 5 Yield (g) 8, 2 11, 5 1, 0 Base molar viscosity 0.39 0.28 0.17 Example 5 30 g of partially degraded dextran containing a relatively large amount of dextran with a molecular size in terms of intrinsic viscosity of 0.09 was dissolved in water to produce 300 ml of a 10% (w / v) aqueous solution. To this, 250 ml of 99% methanol were added with stirring, ie an amount which did not form any dextran precipitate at 26 ° C. All subsequent operations were carried out under the same conditions as in Example 1, except for the cooling temperature and the time during which the solution was allowed to stand. The following three kinds of dextran were obtained: First parliamentary group Second parliamentary group Third parliamentary group Cooling temperature 16-26-36 Time left to stand (minutes) ... 30 50 90 Yield (g) ... 1, 2 17, 6 4, 7 Base molar viscosity 0.111.0.09.0.07

Claims (1)

Patentanspruch : Verfahren zur fraktionierten Fällung von Dextranhydrolysaten für therapeutische Zwecke aus wäßriger Lösung durch Zugabe von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln bei höherer Temperatur und Ausfällung der Fraktionen durch Abkühlung auf niedrigere Temperatur, d a d u r c h gekennzeichriet, daß man bei Zimmer- temperatur so lange organisches Lösungsmittel zur wäßrigen Lösung des Dextranhydrolysats gibt wie noch kein Niederschlag auftritt, und die Lösung unter Rühren abkühlt. Claim: Process for the fractional precipitation of dextran hydrolysates for therapeutic purposes from aqueous solution by adding water-soluble organic Solvents at higher temperatures and precipitation of the fractions by cooling to a lower temperature, which indicated that one temperature as long as organic solvent is added to the aqueous solution of the dextran hydrolyzate as no precipitate has yet appeared, and the solution cools while stirring. In Betracht gezogene Druckschriften : Deutsche Patentschriften Nr. 930 652, 936 594, 916 848. Considered publications: German Patent Specifications No. 930 652, 936 594, 916 848.