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Verfahren zur Herstellung von Präparaten mit hohem Gehalt an freien
Desoxyribonucleinsäuren aus Fischmilch Desoxyribonucleinsäuren (DNS) bilden den
Hauptbestandteil der im Zellkern enthaltenen Chromosomen.
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Sie setzen sich zusammen aus Purin- und Pyrimidinderivaten, unter
anderem aus Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin, sowie 2-Desoxy-D-ribose und Phosphorsäure.
Die Desoxyribonucleinsäuren bilden eine doppelte Spirale, wobei die Purin- und Pyrimidinbasen
der einen Spiralkette durch Wasserstoffbrücken an die Pyrimidin- und Purinbasen
der komplementären DNS-Kette gebunden sind. Die nachstehende Zeichnung soll schematisch
einen etwa 4 Nucleotideinheiten langen Abschnitt einer solchen Doppelspirale der
DNS darstellen, die durch Wasserstoff-Brückenbindungen zusammengehalten wird.
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D = 2-Desoxy-D-ribose, Ad = Adenin, Th = Thymin, Cy = Cytosin, POH
= Phosphorsäure, Gu = Guanin.
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Das Molekulargewicht von Desoxyribonucleinsäuren aus Heringsspermen
beträgt etwa 6 106.
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Es ist bekannt, daß man bei der industriellen Gewinnung von Desoxyribonucleinsäure
keine nativen Produkte erhält. Meistens erhält man bei diesem Verfahren eine einstrangige
Desoxyribonucleinsäure, die schematisch wie folgt wiedergegeben werden kann:
Man erhält jedoch auch zahlreiche einfachere Einheiten der Desoxyribonucleinsäure,
die nachstehend als monomere DNS bezeichnet werden sollen. Die Elementaranalyse
für Desoxyribonucleinsäure ergibt einen Phosphorgehalt von 8,9 bis 9,3 0/o und einen
Stickstoffgehalt von 15,2 bis 14,3°/O.
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Die Desoxyribonucleinsäuren liegen in den Zellen und Geweben nicht
in freier Form, sondern an Proteine gebunden als Desoxyribonucleoproteide vor. In
den Spermen der Fische, der »Milch«, finden sich diese Proteine als Protamine, in
den Geweben des Kalbsthymus als Histone. Protamine und Histone zeichnen sich durch
einen hohen Gehalt an basischen Aminosäuren aus.
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Die bekannte Gewinnung nativer Desoxyribonucleinsäure durch Spaltung
von Desoxyribonucleoproteiden mit Alkalihydroxyd, beispielsweise mit 50/,der Natronlauge
bei 75"C, Behandlung mit konzentrierten Salzlösungen und Alkohol, führt zu einer
»Depolymeristation« bzw. Denaturierung der DNS, und bei der Abtrennung der die Desoxyribonucleinsäuren
begleitenden Ribonucleinsäuren sowie der verschiedenen in Freiheit gesetzten Proteine
treten Schwierigkeiten auf. Die nach bekannten Verfahren hergestellte DNS stellt
ein gelbes, pulverförmiges Produkt dar. Eine 1°/Oige Lösung in n/10 Natriumchloridlösung
besitzt
etwa die Viskosität von Wasser, was auf eine weitgehende
Depolymerisation schließen läßt.
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Weiterhin wird die Depolymerisation der Desoxyribonucleinsäuren z.
B. durch Enzyme, wie Desoxyribonuclease und Ribonuclease, Eisen in Form geringster
Mengen Rost und konzentrierte Salzlösungen gefördert. Durch Wärme wird die Desoxyribonucleinsäure
denaturiert.
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Aus allen diesen Gründen ist die Anmelderin zu dem Schluß gekommen,
daß es besser ist, die reine Deoxyribonucleinsäure aus dem Milieu, in dem sie sich
vorfindet, nicht zu extrahieren, sondern in einfacher Weise anzureichern, indem
nur die Proteine, an die die Desoxyribonucleinsäure gebunden ist, sowie die Ribonucleinsäuren,
die bei ihrer endgültigen Verwendung stören könnten, von den Desoxyribonucleinsäuren
abgetrennt werden.
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Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Präparaten
mit hohem Gehalt an freien Desoxyribonucleinsäuren aus Fischmilch durch Entwässerung,
Abspaltung von Protein und Reinigung.
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Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausgangsmaterial
bei Raumtemperatur oder darunter, vorzugsweise bei +10°C oder tiefer, mit 1 Volumen
Äthanol oder Methanol vom pH 6,5 homogenisiert, 1 Volumen Aceton zugibt, durch ein
Sieb Nr. 100 treibt, den durchlaufenden Anteil auf pH 9,5 bis 10 bringt, noch 15
Stunden auf pH 6,9 bis 7,0 bringt, filtriert und den Filterrückstand trocknet.
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Das Ausgangsmaterial zur Herstellung der Präparate besteht im wesentlichen
aus der »Milch« von Fischen, wie Hering, Stockfisch, Merlan, Kabeljau, Lachs bzw.
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Salm, Forelle u. dgl.
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Der Fisch wird in der Kälte getötet und die Milch herausgenommen
und, ohne sie zu zerreißen, in Holzkisten ausgebreitet und sofort mit Eis bedeckt
oder in Kühltruhen bei -10"C, vorzugsweise bei -30"C, gefroren und aufbewahrt.
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Beispiel 100 g gefrorene Heringsmilch bei Raumtemperatur rasch aufgetaut
und eine Stunde in 100 ccm 90 bis 95°/Oigem Äthylalkohol oder Methylalkohol eingelegt.
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Da Alkohol bisweilen sauer reagiert, wird sein pH-Wert vorher gegebenenfalls
auf etwa pH 6,5 eingestellt.
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Durch diese Behandlung wird die Milch etwas erhärtet und teilweise
entwässert. Alle Enzyme werden zerstört, d. h. sie können nicht mehr stören. Diese
Behandlung erfordert nur einige Minuten.
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Dann drückt man die Masse oberflächlich aus bzw. läßt den Alkohol
auf einem Büchnertrichter ohne Filter abtropfen, wobei ein Teil des Alkohols abgetrennt
wird, der wiederverwendet werden kann, und gibt den Rückstand in einen Homogenisator.
Diese Vorrichtung soll aus nichtrostendem Stahl, legiert mit Molybdän, Nickel oder
Chrom, bestehen. Vorzugsweise bestehen die Messer aus dieser Stahllegierung mit
Molybdän, Chrom oder Nickel. Die übrige Vorrichtung ist entweder emailliert oder
mit Glas ausgekleidet oder besteht aus einem polierten Kunststoff.
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Dieser Vorgang wird als trockene Zerkleinerung bezeichnet. Dabei
handelt es sich um ein einfaches mechanisches Reiben, bei dem die Umhüllungen der
Milch, d. h. der Spermazellen, aufgebrochen werden.
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Dem eigentlichen Zellinhalt geschieht dabei praktisch nichts.
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Die erhaltene zerkleinerte Masse wird hierauf mit dem vorher abgetrennten
Alkohol und dann mit
100 ccm reinem, wasserfreiem Aceton versetzt, dann zur Abtrennung
der Fragmente der äußeren Umhüllung der Milch durch ein Sieb Nr. 100 abgesiebt.
Schließlich wird die erhaltene dicke milchige Flüssigkeit in einem Homogenisator,
z. B. einem )Turmix« oder einer Kolloidmühle, zerkleinert, der gleichfalls z. B.
aus Molybdän- oder Chromnickelstahl hergestellt sein muß.
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Bei dieser »Naßzerkleinerung« wird der eigentliche Zellinhalt zerkleinert.
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Das dickflüssige Homogenisat wird in einen Erlenmeyerkolben gegeben
und vorzugsweise verschlossen mit einem Propellerrührer gerührt. Hierauf wird der
pH-Wert des Gemisches mit 8 g wäßriger Natronlauge 40° Be (d = 1,384) auf etwa 9,5
bis 10 gebracht. Man rührt 3 Stunden und läßt dann die Masse 12 Stunden stehen.
Sämtliche Maßnahmen werden bei Raumtemperatur oder vorzugsweise bei etwa +10 oder
bei nur +4°C durchgeführt.
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Während dieser Behandlung erfolgt praktisch keine Hydrolyse, jedoch
genügt die Lauge, um die Desoxyribonucleoproteide und die Ribonucleoproteide aufzuspalten.
Die erhaltenen Proteine (Protamine) werden ebenfalls zu sauren sowie basischen Aminosäuren,
wie Arginin und Lysin, abgebaut. Diese verbleiben in der Aceton-Alkoholmischung
ungelöst. Die äußerst alkaliempfindlichen Ribonucleinsäuren werden zu verwertbaren
Produkten abgebaut, wie Adenin, Uracil, Guanin, Cytosin und Ribosephosphat.
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Nach 12stündigem Stehen wird das Rühren wieder aufgenommen, und der
pH-Wert wird durch Zugabe von etwa 5 g konzentrierter Salzsäure auf 6,9 bis 7, und
zwar möglichst genau auf etwa 0,1 Einheiten eingestellt.
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Das Gemisch wird hierauf filtriert oder zentrifugiert, die klare
Flüssigkeit wird abdekantiert und der Rückstand bei Raumtemperatur in einem kräftigen
Luftstrom oder bei vermindertem Druck getrocknet. Das abdekantierte Gemisch von
Aceton und Alkohol wird wiedergewonnen und destilliert. Bei der Destillation hinterbleiben
als Rückstand Lipide.
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Das erhaltene trockne, körnige Produkt kann leicht zerkleinert und
gesiebt werden. Die Endausbeute beträgt 27 g eines Pulvers mit einem DNS-Gehalt
von 32,30/0 (indirekt durch Bestimmung des Phosphorsäure- und Ribosegehaltes ermittelt).
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Da das Produkt gemäß der Erfindung noch nicht rein ist, wird zur
Bestimmung des Molekulargewichts der Desoxyribonucleinsäure wie folgt verfahren:
Das Produkt wird in der Kälte mit einer lmolaren NaCl-Lösung ausgelaugt und filtriert.
1 Volumteil Filtrat wird dann mit 2 Volumteilen Alkohol (Mindestgehalt 95 0/o) versetzt,
wodurch sich die Desoxyribonucleinsäure in faseriger Form abscheidet und sich um
den Glasrührer legt.
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Werden bekannte D esoxyribonucleinsäurepräparate in dieser Weise
behandelt, so erhält man ein gelbes, pulverförmiges Produkt. Schon die Tatsache,
daß die nach dem Verfahren nach der Erfindung gewonnene Desoxyribonucleinsäure nach
der Aufarbeitung in Form von asbest- oder baumwollähnlichen Fasern und nicht pulverförmig
anfällt, zeigt, daß sie ein höheres Molekulargewicht hat.
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Ein Molekulargewichtsvergleich kann auch durch den folgenden einfachen
Versuch vorgenommen werden: Man stellt eine 1°/Oige Desoxyribonucleinsäurelösung
in n/10 Natriumchloridlösung her. Die mit dem faserigen Material hergestellte Lösung
hat die Viskosität
von Motorenöl, während die mit dem pulverförmigen
Material hergestellte Lösung nur die Viskosität von Wasser besitzt.
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Dieser einfache Versuch zeigt, daß nach dem Aufarbeitungsverfahren
gemäß der Erfindung die Desoxyribonucleinsäure nicht depolymerisiert wird, wie es
bei bekannten Präparaten der Fall ist. Das erfindungsgemäße Aufbereitungsverfahren
ist also schonender.
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Nach der Methode der Strömungsdoppelbrecåung erhält man ftlr die
aus dem Produkt gemäß der Erfindung gewonnenen reinen Desoxyribonucleinsäuren ein
Molekulargewicht von 4 Millionen i 10C/o, während technisch erhältliche Produkte
Molekulargewichte zwischen etwa 5000 und 60000 und etwas darunter ausweisen.
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Das erfindungsgemäß hergestellte Produkt ist frei von Fetten, Zellwasser
und Lipiden, die das Ranzigwerden verursachen, und enthält keine zerstörend wirkende
Enzyme mehr.
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Die nach dem vorliegenden Verfahren hergestellten Präparate beschleunigen
unter anderem die Heilung von Knochenbrüchen und eignen sich zur Behandlung von
psychischen und geistigen Erschöpfungszuständen.
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Ferner werden sie bei Anämie und Urämie verwendet Weitere Anwendungsgebiete
finden sich in der Tierheililunde, wo die Präparate als Ernährungsfaktoren eine
bedeutsame Rolle spielen.