DE1185144B

DE1185144B - Verfahren zur Reinigung eines zur Spaltung von Nucleinsaeuren zu 5'-Mononucleotiden geeigneten 5'-phosphordiesteraseaktiven waessrigen Extraktes aus pflanzlichen Materialien

Info

Publication number: DE1185144B
Application number: DEZ9151A
Authority: DE
Inventors: Dr Heinrich Kirchhoff; Dr Gerhard Pfleiderer; Dr Kurt Holle
Original assignee: Zellsloff Fabrik Waldhof AG
Current assignee: Zellsloff Fabrik Waldhof AG
Priority date: 1961-12-23
Filing date: 1961-12-23
Publication date: 1965-01-14

Description

Verfahren zur Reinigung eines zur Spaltung von Nucleinsäuren zu 5"-Mononucleotiden geeigneten 5-phosphordiesteraseaktiven wäßrigen Extraktes aus pflanzlichen Materialien Gegenstand der Hauptpatentanmeldung Z 8815 IV a/6 a ist ein Verfahren zur Reinigung eines zur Spaltung von Nueleinsäuren zu Mononucleotiden geeigneten 5'-phosphordiesteraseaktiven wäßrigen Extraktes aus pflanzlichen Materialien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Extrakt in Gegenwart von Schwermetallsalzen kurzzeitig erwärmt und dann abkühlt.
Durch dieses Verfahren wird erreicht, daß in nach einem älteren Vorschlag gewonnenen wäßrigen Extrakten aus pflanzlichen Materialien die Wirkung der Y-Phosphordiesterase voll erhalten bleibt, während die 5-Nucleotidase gehemmt wird.
Unter wäßrigem Extrakt aus pflanzlichen Materialien, der nach dem Verfahren der Hauptpatentanmeldung Z 8815 IV a16 a gereinigt werden kann, werden in erster Linie wäßrige Extrakte aus Pflanzen, oberirdischen und/oder unterirdischen Pflanzenteilen, wie Früchten, Samen, Knollen, Wurzeln undloder Rüben, ferner aus Pflanzenkeimlingen sowie aus Gemischen verschiedener und beliebiger Pflanzen oder Pflanzenteile, gegebenenfalls mit Keimlingen, verstanden. Als besonders geeignet haben sich dabei rohe Extrakte aus Samen, Keimen und/oder Keimbestandteilen von Di- oder Monokotyledonen, wie beispielsweise Leguminosen, Weizen, Reis, Gerste undloder Gräsern, sowie die bei der Malzbereitung anfallenden sogenannten Putzkeime erwiesen. An Stelle der rohen Extrakte können nach diesem Verfahren auch solche verwendet werden, die teilweise vorgereinigt sind. Beispielsweise können die Extrakte durch fraktionierte Calciumphosphatgelbehandlung oder Ausfällungen durch Aceton oder Alkohol vorgereinigt sein.
Es wurde nun in Weiterentwicklung des Gegenstandes der Hauptpatentanmeldung Z 8815 IV a16 a. wobei man zur Reinigung eines zur Spaltung von Nueleinsäuren zu 5'-Mononucleotiden geeigneten Y#-phosphordiesteraseaktiven wäßrigen Extraktes aus pflanzlichen Materialien den Extrakt in Gegenwart von Schwermetallsalzen kurzzeitig erwärmt und dann abkühlt, gefunden, daß man den Extrakt lediglich kurzzeitig erwärmt und dann abkühlt.
Es hat sich nämlich als überraschend herausgestellt, daß ein Schwermetallsalzzusatz nicht zu erfolgen braucht. Wie bei dem Verfahren der Hauptpatentanmeldung Z 8815 IV a/6 a wird aber auch bei der vorliegenden Arbeitsweise zur Erzielung einer weitgehenden Inaktivierung der 5'-Nucleotidase zweckmäßig der Extrakt auf pH-Werte zwischen 4 und 7 eingestellt, wobei zur Einstellung der pH-Werte ebenfalls Pufferlösungen, wie beispielsweise Phosphat-, Phthalat-, Acetat- oder Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Puffer, dienen können.
Zur Reinigung von Schlangengiftenzymen war schon eine Inaktivierung störender Enzyme durch Einwirkung von Hitze bekannt. Doch kann man daraus nicht auf die Durchführbarkeit bei Enzymen aus pflanzlichem Material schließen, da letztere anders aufgebaut sein müssen, wie ein Vergleich der Enzymaktivitätsbereiche gezeigt hat.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Extrakte werden als solche direkt zur Spaltung von Nucleinsäuren eingesetzt.
In den folgenden Beispielen wird das Verfahren näher erläutert.
Zur Herstellung eines Keimextraktes werden 100 g Gerstenputzkeime in 1000 ccm Wasser eingetragen. Danach wird 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und dann zentrifugiert. Der Extrakt weist danach einen pH-Wert von 5 bis 6 auf und wird mit Natronlauge oder mit Essigsäure auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Anschließend wird bei den zu untersuchenden Temperaturen und Zeitintervallen in einem Wasserbad erhitzt. Nach der Hitzebehandlung wird abgekühlt und der pfl-Wert auf 8 eingestellt.
Für den Spaltungsansatz werden 15 ccm des oben erhaltenen Gerstenputzkeimextraktes oder eines Extraktes anderer Pflanzen, z. B. aus Weizenölkeimen, mit 10 ccm Natriumnucleinatlösung (2%ig in bezug auf Nucleinsäure) und 12 ccm 0,1 m-Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Puffer von pH 8,0 unter Zusatz von Toluol versetzt. In den zugehörigen Blindversuchen ersetzt man die Nucleinsäurelösung durch 10 ccm Wasser. Die Dauer der enzymatischen Spaltung beträgt bei 37'C etwa 20 Stunden. Die Ergebnisse sind in den Spalten 5 und 6 der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
Zur Bestimmung des Spaltungsverlaufs werden nach beendeter Bebrütung die Ansätze nach vorhergehender Abkühlung mit Trichloressigsäure-Uranylacetat-Lösung versetzt und filtriert. Dann wird die UV-Adsorption im Spektrophotometer gegen den Blindansatz gemessen. Die P205-Bestimmung erfolgt mit Hilfe des Spektrophotometers nach den Angaben von M. Rockstein und P. N. Herron, Analyt. Chemistry, 23 [19511, S. 1500.

Die Ergebnisse von verschiedenen Ansätzen mit Extrakten von Gerstenputzkeimen und Weizenölkeimen bei verschiedenen Temperaturen und Zeiten sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt:

2 1 4 5 1 6

Vorbehandlung des Extraktes Nucleinsäure

Lfd. Nr. Extraktionsmaterial Erwärmung Nucleinsäure- P2Q-

Temperatur Dauer PH-Wert spaltung Abspaltung

.c in Minuten 010 0/0

1 Gerstenputzkeime 55 20 4 81 2,0

2 Gerstenputzkeime 65 20 5 87 1,6

3 Gerstenputzkeime 65 15 6 92 2,3

4 Weizenölkeime 65 20 5 78 5,3

5 Weizenölkeime 65 15 6 84 6,1

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Reinigung eines zur Spaltung von Nucleinsäuren zu 5'#Mononucleotiden geeigneten 5'-phosphordiesteraseaktiven wäßrigen Extraktes aus pflanzlichen Materialien, wobei nach Patentanmeldung Z 8815 IV a/6 a der Extrakt in Gegenwart von Schwermetallsalzen kurzzeitig erwärmt und dann abgekühlt wird, dadurch gekennzeichnet, daßman den Extrakt lediglich kurzzeitig erwärmt und dann abkühlt. 2- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erwärmung des Extraktes 5 bis 40 Minuten, vorzugsweise 15 bis 25 Minuten, bei Temperaturen zwischen 45 und 70'C, vorzugsweise 55 und 65'C, durchgeführt wird. In Betracht gezogene Druckschriften: »Journal of Biological Chemistry«, 1952, Bd. 19& S. 293 bis 296; 1953, Bd- 201, S. 535 bis 546; 1957, Bd. 229, S- 289 bis 303.