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Verfahren zur Reinigung eines zur Spaltung von Nucleinsäuren zu 5'-Mononucleotiden
geeigneten, 5'-phosphordiesterase-aktiven, wäßrigen Extraktes aus pflanzlichen Materialien
Es ist bekannt, daß man Nucleinsäuren zu Mononucleotiden mit Hilfe von Enzymen spalten
kann. Als enzymhaltige Substanzen sind für diesen Zweck neben bestimmten Mikroorganismen
vor allen Dingen Schlangengifte genannt worden. Schlangengiften haftet jedoch der
Nachteil an, daß infolge ihres Gehaltes an den verschiedenartigsten Enzymen der
Abbau schwer zu kontrollieren ist und häufig bis zu den Nucleosiden erfolgt. Ein
so weitgehender Abbau ist in den meisten Fällen unerwünscht. Man hat daher versucht,
die enzymatische Wirkung der Schlangengifte herabzusetzen, vor allen Dingen die
Wirksamkeit der 5'-Phosphordiesterase weitgehend zu erhalten und gleichzeitig die
Aktivität der 5'-Nucleotidase zu hemmen. Dies kann auf verschiedenen Wegen erfolgen.
Beispielsweise hat man die Schlangengifte unter Verwendung verschiedener Fällungsmanipulationen
gereinigt. Ein weiterer Weg zur Inaktivierung der Nucleotidase besteht darin, daß
man die Schlangengifte einer Hitzeeinwirkung aussetzt. Ferner ist bekanntgeworden,
daß bestimmte Metallionen zu inaktivieren vermögen. Auch die Kombination einzelner
Inaktivierungsverfahren ist beschrieben worden.
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An allen diesen Verfahren ist jedoch nachteilig, daß sie bei den meisten
der zur Verfügung stehenden Schlangengifte umständlich, zeitraubend und nur unter
Einhaltung von bestimmten Bedingungen durchführbar sind. Zudem ist die Beschaffung
der als Ausgangsmaterial für die enzymatische Spaltung erforderlichen Schlangengifte
kostspielig und gefährlich.
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Die Schwierigkeiten bei der Enzymgewinnung aus Mikroorganismen liegt
vor allen Dingen in den aufwendigen Vorrichtungen zur Züchtung, in der zusätzlichen
Herstellung der Nährmedien und in der ständigen Kontrolle der Züchtungsbedingungen,
wie Überwachung des Wachstums, der Nährmedien, der Temperaturen u. .dgl.
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Es ist daher bereits in einem älteren Vorschlag empfohlen worden,
zur Gewinnung von 5'-Mononucleotiden aus Nucleinsäuren wäßrige, 5'-phosphordiesterase-aktive
Extrakte aus pflanzlichen Materialien zu verwenden. Dabei wird gegebenenfalls so
vorgegangen, daß der Extrakt Reinigungsprozesse durchläuft. Im Anschluß daran wird
die störende 5'-Mononucleotidase durch Chromatographie entfernt. Neben einem erheblichen
Material- und Zeitaufwand birgt dieses Verfahren die Gefahr in sich, daß bei den
verschiedenen Reinigungsstufen Anteile der wertvollen 5'-Phosphordiesterase verlorengehen.
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Vorliegender Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes
Verfahren zur Reinigung eines zur Spaltung von Nueleinsäuren zu 5'-Mononucleotiden
geeigneten 5'-phosphordiesterase-aktiven wäßrigen Extraktes aus pflanzlichen Materialien
zu entwickeln.
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Es wurde gefunden, daß die Aufgabe dadurch gelöst werden konnte, daß
man die Extrakte in Gegenwart von Schwermetallsalzen kurzzeitig erwärmt und dann
abkühlt.
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Beim älteren Vorschlag wurde bereits auf eine weitgehende Erhaltung
der 5'-Phosphordiesterase-Aktivität acht gegeben. Dies erfolgt auch bei dem vorliegenden
Verfahren. Jedoch wird zusätzlich eine weitesgehende Inaktivierung der 5-Nucleotidase
erzielt und zudem mit einem sehr geringen Aufwand an Fremdmaterialien und mit einer
erheblichen Zeitersparnis gearbeitet.
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Obwohl bereits Enzymgewinnungsverfahren mit einer Inaktivierung störender
Enzyme mittels Schwermetallionen und/oder Hitzeeinwirkung bekannt waren, lassen
sich jedoch aus diesen bekannten Verfahren keine Parallelen zu dem vorliegenden
Verfahren ziehen. Bei den Enzymen aus Schlangengiften hat man einen Aktivitätsbereich
bei ganz bestimmten pH-Werten festgestellt. Demgegenüber weisen die aus pflanzlichen
Materialien gewonnenen Enzyme einen viel breiteren Bereich auf, so daß daraus der
Schluß gezogen werden muß, daß es sich um ein chemisch andersartig aufgebautes Enzym
handelt, obwohl es die gleiche Wirkung wie ein Schlangengiftenzym besitzt. Daher
läßt sich auch nicht voraussehen, ob Schwermetallionen und die Einwirkung von Wärme
einerseits die Aktivität der Pflanzenenzyme bestehen läßt und andererseits störende
Enzyme. inaktiviert.
Unter wäßrigem Extrakt aus pflanzlichen Materialien
werden gemäß dem vorliegenden Verfahren in erster Linie wäßrige Extrakte aus Pflanzen,
oberirdischen und/oder unterirdischen Pflanzenteilen, wie Früchten, Samen, Knollen,
Wurzeln und/oder Rüben, ferner aus Pflanzenkeimlingen sowie aus Gemischen verschiedener
und beliebiger Pflanzen oder Pflanzenteile, gegebenenfalls mit Keimlingen, verstanden.
Als besonders geeignet haben sich rohe Extrakte aus Samen, Keimen und/oder Keimbestandteilen
von Di- oder Monokotyledonen, wie beispielsweise Leguminosen, Weizen, Reis, Gerste
und/oder Gräser sowie die bei der Malzbereitung anfallenden sogenannten Putzkeime
erwiesen. Es liegt auch im Rahmen der Erfindung, daß man an Stelle der rohen Extrakte
solche verwenden kann, die teilweise vorgereinigt sind. Beispielsweise können die
Extrakte durch fraktionierte Calciumphosphatgelfraktionierungen oder Ausfällungen
durch Aceton oder Alkohol vorgereinigt sein.
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Erfindungsgemäß werden die heterogen zusammengesetzten Extrakte aus
pflanzlichem Material, die gegebenenfalls zwecks Verhinderung von unerwünschten
Infektionen mit in Wasser schwer oder unlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie
beispielsweise Toluol und/oder Chloroform, versetzt sein können, vor ihrer Anwendung
zur Spaltung der Nucleinsäuren kurze Zeit, etwa 5 bis 40 Minuten, zweckmäßigerweise
15 bis 25 Minuten, in Gegenwart von Schwermetallsalzen auf Temperaturen zwischen
45 und 70° C, vorzugsweise 55 und 65° C, erwärmt. Von besonderem Vorteil ist die
Verwendung von anorganischen Salzen, wie Chloride, Sulfate, Nitrate der Metalle
Zink, Nickel und Kupfer. Die Konzentration an Schwermetallsalzen in den Extrakten
soll zweckmäßigerweise 10-2- bis 10'5molar betragen.
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Es hat sich als überraschend herausgestellt, daß bei vorliegendem
Verfahren der pH-Wert in weiten Grenzen schwanken kann, wobei verständlicherweise
extrem saure oder alkalische Bereiche zu vermeiden sind. Zur Erzielung einer weitgehenden
Inaktivierung der 5-Nucleotidase hat sich die Einstellung des Extraktes auf pH-Werte
zwischen 4 und 7 als besonders zweckmäßig herausgestellt. Diese kann gegebenenfalls
durch Pufferlösungen, wie beispielsweise Phosphat-, Phthalat-, Acetat oder Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Puffer
erfolgen.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Extrakte werden
als solche direkt zur Spaltung von Nucleinsäuren eingesetzt.
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Nachstehend soll das Verfahren näher erläutert werden: Beispiel 1
a) Herstellung des Keimextraktes 100 g Gerstenputzkeime und 1000 ccm Wasser,
zu Beginn des Extrahierens mit Natronlauge auf pH 8,0 eingestellt, werden 2 Stunden
bei Zimmertemperatur gerührt und dann zentrifugiert. Der Extrakt wird mit Natronlauge
oder mit Essigsäure auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Dann wird so viel einer
Schwermetallösung hinzugefügt, daß die gewünschte Molarität erreicht wird. Die anschließende
Erhitzung erfolgt bei den zu untersuchenden Temperaturen und Zeitintervallen in
einem Wasserbad. Nach der Hitzebehandlung wird abgekühlt und der pH-Wert des so
vorbehandelten Extraktes wieder auf 8,0 eingestellt (vgl. Spalten 1 bis 6 der nachstehenden
Tabelle).
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b) Spaltungsansatz 3 ccm des nach a) erhaltenen Gerstenputzkeimextraktes
oder eines Extraktes anderer Pflanzen, z. B. aus Weizenölkeimen, werden mit 2 ccm
Natriumnucleinatlösung (1,687o/oig in bezug auf Nucleinsäure) und 3 ccm 0,1 m Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Puffer
von pH 8,0 unter Zusatz von Toluol versetzt. In den zugehörigen Blindversuchen ersetzt
man die Nucleinsäurelösung durch 2 ccm Wasser. Die Dauer der enzymatischen Spaltung
beträgt bei 37° C etwa 20 Stunden. Die Ergebnisse sind in den Spalten 7 und 8 der
nachstehenden Tabelle aufgeführt.
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Zur Bestimmung des Spaltungsverlaufs werden nach beendeter Bebrütung
die Ansätze nach vorhergehender Abkühlung mit Trichloressigsäure-Uranylacetatlösung
versetzt und filtriert. Dann wird die UV-Adsorption im Spektrophotometer gegen den
Blindansatz gemessen. Die P20$-Bestimmung erfolgt mit Hilfe des Spektrophotometers
nach den Angaben von M. R o c k s t e i n und P. N. H e r ro n, Analyt. Chemistry,
23 (l951), S. 1500.
| Spalte |
| 1 2 j 3 4 5 6 7 ; 8 |
| Lfd. Vorbehandlung des Extraktes |
| Nucleinsäure |
| Nr. Extraktionsmaterial Metallsalz Erwärmung |
| Konzen- Tempe- Dauer pH-Wert Nucleinsäure- P205- |
| Art tration ratur spaltung Abspaltung |
| Mol ° C Minuten °/o °/e |
| Versuche mit verschiedenen Salzen, Salzkonzentrationen und
pH-Werten |
| bei gleicher Temperatur und Erwärmungsdauer |
| 1 Gerstenputzkeime CuC12 I 0,002 65 20 I 5 87 I 11 |
| 2 Gerstenputzkeime cuC12 0,0002 65 20 1 5 91 j 4 |
| 3 Gerstenputzkeime NiC12 0,001 65 20 i 5 100 15 |
| 4 Gerstenputzkeime NiC12 0,00025 65 20 5 100 18 |
| 5 Gerstenputzkeime NiCl2 ; 0,001 65 20 6 100 15 |
| 6 Gerstenputzkeime NiC12 0,00025 65 20 6 100 16 |
| 7 Gerstenputzkeime NiC12 0,001 65 20 7 96 15 |
| 8 Gerstenputzkeime NiC12 0,00025 65 20 7 87 8 |
| 9 Gerstenputzkeime ZnC12 0,01 65 20 4 96 10 |
| 10 Gerstenputzkeime zncl2 0,001 65 20 4 92 3,6 |
| 11 Gerstenputzkeime ZnC12 0,01 65 20 6 85 2,6 |
| 12 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 65 1 20 6 79 2,7 |
| (Fortsetzung) |
| Spalte |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 |
| Lfd. Vorbehandlung des Extraktes Nucleinsäure |
| Nr. Metallsalz Erwärmung |
| Extraktionsmaterial Konzen- Tempe- Nueleinsäure- P206- |
| Axt tration ratur Dauer pH-Wert spalte . Abspaltung |
| Mol ° C |
| Minuten o/' |
| 0/0 |
| Versuche in Abhängigkeit der Temperatur und der Zeit |
| mit gleichem Schwermetallsalz und gleicher Salzkonzentration |
| 13 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 55 5 4 92 32 |
| 14 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 55 10 4 97 23 |
| 15 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 55 20 4 87 16 |
| 16 Gerstenputzkeime znC12 0,001 55 40 4 69 2 |
| 17 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 65 5 4 85 0,5 |
| 18 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 65 10 4 80 0,4 |
| 19 Gerstenputzkeime znC12 0,001 65 20 4 75 0,3 |
| 20 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 65 , 40 4 59 0,1 |
Vergleichsversuche verschiedener Keimextrakte ohne Erwärmung und Schwermetallsalzzusatz
und mit Erwärmung und Schwermetallsalzzusatz
| 21 Gerstenputzkeime - 0 - - - 100 12 |
| 22 Weizenölkeime - 0 - - - 75 27 |
| 23 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 65 20 4 72 0 |
| 24 Weizenölkeime ZnC12 , 0,001 65 20 4 43 0,5 |
Beispiel 2 a) Herstellung des Keimextraktes 150 g Weizenölkeime werden in 1000 ccm
Wasser eingetragen und bei Raumtemperatur und bei einem pH-Wert von 7,5 (durch Zugabe
von Kalilauge eingestellt) 2 Stunden gerührt. Danach wird die Mischung zentrifugiert.
Nach Einstellung des Extraktes auf einen pH-Wert von 5 durch Zugabe von Salzsäure
wird eine Zinkchloridlösung zugefügt, so daß die Molarität des Extraktes 0,005 Mol
an ZnC12 beträgt. Anschließend wird 20 Minuten bei 65° C gehalten, abgekühlt und
der pH-Wert des erhaltenen Keimextraktes wieder auf pH 5 eingestellt.
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b) 25 ccm des nach a) erhaltenen Weizenkeimextraktes werden mit 25
ccm einer 2%igen Nucleinsäurelösung, die aus Fischspermen hergestellt ist und hauptsächlich
Desoxyribonucleinsäure enthält, versetzt und der pH-Wert dieses Gemisches auf pH
7,5 eingestellt. Dieser pH-Wert wird durch laufende Zugabe von verdünnter Kalilauge
auf diesem Wert gehalten. Das Ende des Spaltungsverlaufs zeigt sich durch Bestehenbleiben
des pH-Wertes an. Die durchschnittliche Dauer des Verlaufs beträgt bei 37° C etwa
27 Stunden. Nucleinsäurespaltung 85 %, P205 Abspaltung 6 %.
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Beispiel 3 Es wird ein Keimextrakt verwendet, der entsprechend den
Angaben unter 1, a) hergestellt worden ist. Als Metallsatz wird ZnC4 in. einer Konzentration
von 0,001 Mol genommen, das auf den Gerstenputzkeimextrakt bei einer Temperatur
von 65° C und einem pH-Wert von 5 während 20 Minuten zur Einwirkung gelangte. 40
ccm des vorstehend genannten Gerstenputzkeimextraktes werden mit 10 ccm einer 2,5%igen
neutralisierten Desoxyribonueleinsäurelösung versetzt. Der Ansatz wird durch Zugabe
von Natronlauge auf einen pH-Wert von 8 eingestellt. Nach einer Dauer von 24 Stunden,
während der pH-Wert auf 8 durch laufende Zugabe von verdünnter Natronlauge sowie
die Inkubationstemperatur auf 37° C gehalten werden, beträgt die Nueleinsäurespaltung
75% bei einer Phosphatabspaltung von 9,6%.
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Beispiel 4 50g vakuumgetrocknete Keimwurzeln der Saubohne (vicia faba)
werden fein zermahlen und mit 50 ccm Wasser bei pH 8 (NaOH) 5 Stunden extrahiert.
Dieser Extrakt wird durch Zugabe von Salzsäure auf pH 5 eingestellt und mit einer
CuCl2 Lösung versetzt, so daß die Schwermetallkonzentration in der Mischung 0,0002
Mol beträgt. Es wird 20 Minuten auf 60° C erwärmt. Nach Abkühlung wird der Extrakt
durch Zugabe von Natronlauge wieder auf einen pH-Wert von 8 eingestellt.
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Zu 50 ccm dieses Extraktes werden 40 ccm 0,1m Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Puffer
von pH 8 unter Zusatz von Chloroform und 10 ccm einer 2,5%igen Natriumnucleinatlösung
gegeben und die Mischung auf 37° C erwärmt. Nach 18 Stunden beträgt die enzymatische
Spaltung 92 % der Nueleinsäure bei einer Phosphatabspaltung von 5,5 %.