DE1158746B - Herstellung von Insektiziden auf biologischem Wege - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines durch Mikroorganismen erzeugten Insektizids; es bezieht sich insbesondere auf Verbesserungen in bezug auf die Einleitung der Sporenbildung und Bildung eines Parasporalkörpers bei aktivem, insektizid wirkendem Material, wie es im folgenden eingehend erläutert wird.

Es ist bereits bekannt, Insektenschädlinge mittels Wirkstoffen zu bekämpfen, die auf mikrobiologischem Wege hergestellt wurden. Die Vorteile können wie folgt zusammengefaßt werden:

1. Die nichttoxische Natur solcher Insektenbekämpfungsmittel, mit denen anderen Lebensformen kein Schaden zugefügt wird, und infolgedessen das Fehlen von giftig wirkenden Rückständen;

2. der ungewöhnlich hohe Grad der Spezifität des Insektizids der für die als Wirtstiere dienenden Insekten;

3. die Möglichkeit einer kombinierten Anwendung mit organischen Schädlingsbekämpfungsmittehi, wodurch sich die Schutzwirkung in einem bestimmten Gebiet erhöht;

4. die Einfachheit, mit welcher solche Insektizide auch ohne große Kosten hergestellt werden „ können;

5. der offensichtliche Mangel an Widerstandsfähigkeit gegenüber solchen Mitteln seitens der Insekten.

Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung hat es sich als vorteilhaft erwiesen, einen Sporen bildenden Bazillus zu verwenden, welcher als Bacillus thuringiensis identifiziert worden ist. Dieser Sporen bildende Bazillus wurde zuerst durch E. Berliner aus erkrankten Larven der Mittelmeermehlmotte isoliert. (Zeitschrift für das gesamte Getreidewesen, 3, S. 63 bis 70, 1911). Berliner beschreibt diesen Organismus als ein grampositives, mit Geißeln versehenes sporenbildendes Stäbchen. Nach der Sporenbildung enthalten die Zellen des das Insektizid erzeugenden Bacillus an ihrem einen Ende eine Spore und an ihrem anderen Ende einen wie einen Diamant geformten Parasporalkörper, d. h. einen nicht sporenartigen Körper. Ein proteinartiger Giftstoff, welcher in der Zusammensetzung dem nicht sporenartigem kristallinen Einschluß entsprach, ist schon aus der Sporenbildung unterworfenen Kulturen von Bacillus thuringiensis isoliert worden (C. L.Hannay and P.Fritz-James, Can. J. Microb., Vol. 1, pp. 694 bis 710, 1955). Andere sporenbildende Bazillen, welche in ihren Zellen ebenfalls einen insektizid wirksamen nicht sporenartigen Körper Herstellung von Insektiziden
auf biologischem Wege

Anmelder:

Bioferm Corporation,
Wasco, Calif. (V. St. A.)

Vertreter: Dr.-Ing. K. Boehmert

und Dipl.-Ing. A. Boehmert, Patentanwälte,

Bremen, Feldstr. 24

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 14. Juli 1958 und 9. Juni 1959
(Nr. 748 164 und Nr. 818 999)

John Cosimo Megna, Wasco, CaHf. (V. St. A.),
ist als Erfinder genannt worden

bzw. einen Parasporalkörper bilden, können gleichfalls zur Anwendung kommen, insbesondere Bacillus sotto (Nature, Vol. 173, pp. 545, 546, 1954; Can. J. Microb., Vol. 2, pp. Ill bis 121, 1956).

Während die Sporenbildung und Parasporalkörperbildung beim Wachstum von Bacillus thuringiensis und Bacillus sotto und ähnlichen Insektizide erzeugenden Bazillen stets unter bestimmten Bedingungen in gewissen Fermentationsmedien beobachtet werden, treten doch zahlreiche Schwierigkeiten auf, wenn man versucht, solche bekannten Arbeitsweisen für die industrielle Herstellung einzusetzen. Diese Schwierigkeiten betreffen unter anderem die viel zu langen Fermentationszeiten, eine ungenügende oder zu langsame Sporen- und Parasporalkörperbildung sowie das damit zusammenhängende Problem der Abtrennung des aktiven Insektenbekämpfungsmittels.

Es wurde nun gefunden, daß bei Durchführung der Fermentation mittels der vorstehend genannten Mikroorganismen in einer wässerigen Nährlösung unter Belüften und submers dann wesentliche Verbesserungen erzielt werden können, wenn diese Nährlösungen ein gewisses Gleichgewicht aufweisen, wie dieses Merkmal hier bezeichnet werden soll. Dieses Gleichgewicht beruht gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung darauf, daß die fermentierbaren Kohlehydrate und der für das Wachstum der betreffenden Mikroorganismen zur

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Verfügung stellende Stickstoff so aufeinander abgestimmt sind, daß sie praktisch zur gleichen Zeit nach dem Beginn der Sporenbildung erschöpft oder verbraucht sind.

Wenn der vorstehend genannten Bedingung nicht Rechnung getragen wird, beginnt die Sporenbildung nur sehr langsam und schreitet mit einer geringen Geschwindigkeit fort mit dem Ergebnis, daß die zuerst zur Sporenbildung angeregten Zellen, bevor über-

hydrolysiertes Maiserzeugnis ist, und in Selbstauflösung begriffene Hefesorten, obwohl die zuletzt genannten Substanzen weniger befriedigende Ergebnisse liefern. Weiterhin hat sich gezeigt, daß der Einsatz 5 von ölfreiem Mehl aus den Schalen von Baumwollsamen in dem Nährmedium, beispielsweise des schon erwähnten »Pharmamedia«-Erzeugnisses, eine ganz besonders günstige Wirkung zeigt, doch können statt dessen auch andere ölfreie Getreidemehle oder Ge-

haupt ein wesentlicher Teil der vorhandenen Zellen io treideschrote verwendet werden, beispielsweise Maiszur Sporenbildung gekommen ist, unter Bildung freier schrotmehl, Saflorschrotmehl, Sojabohnenschrot und Sporen und Parasporalkörper auseinanderbricht, wor- andere, ähnliche Produkte. Die vorliegende Erfindung auf dann einige der Sporen zu sprossen beginnen und sieht aber die Verwendung solcher Mehle oder Schrote so die Gesamtmenge der lebensfähigen Sporen ver- nicht zwangsweise vor und diese können daher auch ringern, während gleichzeitig die Filtration und Ab- 15 fortgelassen werden. Der Zusatz von »Pharmamedia« trennung erschwert wird. Beispielsweise werden in oder vergleichbaren Produkten führt aber zu einem einer vorgegebenen Nährlösung innerhalb eines prak- Anwachsen der gesamten Zellbevölkerung um das tisch verwendbaren Fermentationszyklus nicht einmal Mehrfache, beispielsweise um das Zwei- bis Fünf-10% der gesamten Kultur zur Sporenbildung an- fache, verglichen mit Nährlösungen, welche keinen geregt, falls kein Gleichgewicht der vorstehend be- 20 derartigen Getreidestoff enthalten. Bei der praktischen schriebenen Art zwischen den fermentierbaren Kohle- Durchführung der Erfindung werden bevorzugt wässehydraten und dem für das Wachstum zur Verfügung rige Nährlösungen eingesetzt, welche zwischen 0,6 stehenden Stickstoff besteht. und 2% und insbesondere 1,4 bis 1,9 °/o an irgend-

Ganz im Gegensatz hierzu werden bei Befolgung einer Melasse, vorteilhaft Rübenmelasse, und bis zu der erfindungsgemäßen Lehre leicht 75 bis 95% der 25 etwa 2%, vorteilhaft zwischen 1 und 1,5% »Pharmagesamten Zellen zur Sporenbildung gebracht. media« oder ein ähnliches ölfreies Getreidemehl bzw.

Darüber hinaus werden öfters auch größere Para- Getreideschrot und ferner zwischen etwa 0,5 und sporalkörper erhalten. Ein weiterer Vorteil der vor- 1,9% und insbesondere zwischen etwa 0,8 und 1,7% liegenden Erfindung besteht darin, daß die Möglich- Feststoffe aus einer Getreideweiche enthalten. Außerkeit einer Verseuchung der Kulturen durch andere 30 dem enthalten diese Lösungen eine geringe Menge Mikroorganismen infolge der relativ kurzen Fermen- eines Pufferstoffes, vor allem Calciumcarbonat, wobei tationsperiode wesentlich verringert worden ist. ein geeigneter Zusatz bei 0,1% liegt.

Unter Berücksichtigung der vorstehend erwähnten Für die Durchführung des Fermentationsverfahrens

Grundsätze können zahlreiche Nährlösungen ver- wird der Pü-Wert der Nährlösung mittels Natriumwendet werden, welche die erwähnten Merkmale auf- 35 hydroxyd, Caliumhydroxyd oder einem anderen geweisen. Ein außerordentlich befriedigend arbeitendes eigneten Alkali auf einen Wert im Bereich zwischen Nährmedium besteht aus einer wässerigen Flüssigkeit, 7,2 und 7,6 eingestellt. Die Nährlösung wird anwelche 1,86% Zucker- oder Rübenmelasse, 1,4% schließend 20 bis 30 Minuten lang bei 121° C in ein- »Pharmamedia« (ölfreies Mehl aus den Schalen von zelnen Ansätzen sterilisiert. Der Fermentationsbottich, Baumwollsamen), 1,67% Feststoffe aus einer Ge- 40 welcher die so hergestellte Nährlösung aufnimmt, treideweiche sowie einen Pufferstoff enthält, um den wird dann mit etwa 5 Volumprozent vegetativem p_H-Wert innerhalb der nachstehend genannten bevor- Impfgut beimpft, welches sich vorzugsweise in der zugten Bereiche zu halten. Calciumcarbonat in einer »Log Phase« des Wachstums befindet, obwohl an Menge von 0,1%, bezogen auf die Nährlösung, hat dieser Stelle bemerkt werden kann, daß das Stadium sich als ein besonders günstiger Pufferstoff erwiesen. 45 der Überführung des Impfgutes für den Enderfolg Gute, aber nicht in gleicher Weise befriedigende Er- nicht kritisch ist.

gebnisse werden erstens mit einer wässerigen Flüssig- Das vegetative Impfgut für die Behälter der Aus-

keit mit einem Gehalt von 1,4% an Rübenmelasse saat und der Fermentationsbottiche kann mittels der und 1,2% an Feststoffen aus einer Getreideweiche üblichen im Tauchverfahren arbeitenden Fermentie- und zweitens mit einer wässerigen Nährlösung er- 50 rungsmethoden hergestellt werden, und es besteht im halten, welche 0,6% Rübenmelasse und 0,5% Fest- allgemeinen aus zwei oder mehr Übergangsstadien stoffe aus einer Getreideweiche enthält, wobei in einer in Flaschen geschüttelten, auf einer Nährbrühe jedem Fall noch 0,1% Calciumcarbonat als Puffer- gezüchteten Kultur. Im folgenden wird eine geeignete stoff vorliegen. Die zwei zuletzt erwähnten Nährlösun- Arbeitsweise zur Herstellung eines solchen Impfgutes gen bewirken zwar eine ausgezeichnete Sporenbildung, 55 beschrieben:

doch ist das Zellwachstum wesentlich geringer im Von einer 24 bis 48 Stunden alten Kultur des

Vergleich zu dem zuerst erwähnten besonders bevor- Bacillus thuringiensis, welche auf der Oberfläche eines zugten Nährmedium. Nährbodens aus Agar-Agar wächst, wird mit einer

Obwohl zahlreiche assimilierbare Kohlehydrate im Schlinge ein Teil der Organismen entnommen und Rahmen der Erfindung verwendet werden können, 60 zur Beimpfung von 75 ml Nährbrühe verwendet, wie die verschiedensten Zuckerarten, Rohrzucker- welche sich in einer Erlenmeyerflasche von 500 ml melasse, Rübenmelasse und ähnliche Stoffe, so haben Inhalt befindet. Die Inkubationsperiode wird mit Vorsieh doch Rübenmelassen als ganz besonders günstig teil bei einer Temperatur von 30° C unter intensiver erwiesen. In gleicher Weise können an Stelle der Fest- Sauerstoffzufuhr durchgeführt. Die Belüftung erfolgt stoffe aus Getreideweichen, welche zu besonders gün- 65 vorteilhaft in der Weise, daß man die beimpften 'Stigen Resultaten führen, auch andere Materialien zur Flaschen in einen drehbaren Schüttler einstellt, Anwendung kommen, beispielsweise Sojawürze, Würz- welcher pro Minute 220 Bewegungen von 2,54 cm grundlage 2 C (A. E. Staley Mfg. Co.), welches ein Länge ausführt. 24 Stunden nach der obenerwähnten

ersten Inkubationszeit wird ein Kolben von 11 Inhalt, welcher 125 ml eines wässerigen Mediums mit 1,02 % Rübenmelasse, 0,85¹⁰Zo' Festkörpern aus einer Getreideweiche und 0,1% Calciunicarbonat enthält, mit 5 bis 10% dieser Kultur in der Nährbrühe beimpft und dann, wie schon beschrieben, inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubationszeit kann der Inhalt des zuletzt erwähnten Kolbens als Saatkultur für das weitere Verfahren verwendet werden.

Die Fermentation selbst wird nach erfolgter Beimpfung, wie oben beschrieben, vorzugsweise bei einem Druck von 0,35 kg/cm² und einer Oberflächengeschwindigkeit von etwa 1,61 m/min am Belüfter mit oder ohne Rühren und bei einer Inkubationstemperatur von etwa 30° C durchgeführt. Der p_H-Wert des Fermentationsansatzes sinkt schnell von seinem Anfangswert zwischen etwa 7,2 und 7,6 bis auf etwa 6,4 bis 6,6 ab und steigt anschließend sehr rasch auf einen Wert zwischen 7,5 und 8,5. Insbesondere wenn Fermentationsmedien verwendet werden, welche etwa 1,86% Rüben- oder Rohrzuckermelasse, 1,4% »Pharmamedia«, 1,7% Festkörper aus Getreideweicheln und 0,1% Calciumcarbonat enthalten, beträgt die Gesamtmenge an Bakterienzellen pro Kubikzentimeter etwa 2 bis 5 · 10⁹ und etwa 3 bis 4 Stunden; nachdem das größte Wachstum erreicht worden ist, beginnt die Sporenbildung. Diese Sporenbildung setzt sich dann in relativ konstanter Geschwindigkeit noch etwa 5 bis 10 Stunden nach Erreichen der Wachstumsspitze fort, und vor diesem Zeitpunkt tritt kaum eine Zellzersetzung ein. Die Fermentationsperiode dauert gewöhnlich etwa 14 bis 32 Stunden, wobei das Optimum üblicherweise zwischen 16 und 20 Stunden liegt.

Die Isolierung der gebildeten Sporen und Parasporalkörper wird vorteilhaft unter Zusatz einer Filterhilfe, beispielsweise »Celite 512«, in Mengen von etwa 2% durchgeführt, wobei durch eine Filterpresse (Druckfilter) filtriert und der Filterkuchen unter erzwungener Luftzirkulation oder in einem Vakuumtrockner bei 40 bis 50° C getrocknet wird. Die Abtrennung der Zellen und Parasporalkörper von der verbrauchten Fermentationsbrühe kann jedoch auch auf andere Weise erfolgen, beispielsweise mittels Zentrifugen mit festen oder perforierten Auffangkörben oder mittels Separatoren; es brauchen auch keine Filtermittel zur Anwendung zu kommen. Die für die Isolierung getroffenen Maßnahmen sollen so schnell als möglich durchgeführt werden, insbesondere die Filtration selbst, damit noch nicht beschädigte Zellen möglichst nicht aufgebrochen werden und die Sprossung der Sporen und/oder eine Selbstzersetzung ganz verhindert oder wesentlich verringert wird.

Wenn in der vorliegenden Beschreibung auf die Zeit Bezug genommen wird, in welcher eine Erschöpfung oder ein Verbrauch der fermentierbaren Kohlehydrate stattfindet, so bezieht sich diese Aufgabe auf diejenigen Kohlehydrate, welche für das Wachstum der Mikroorganismen zur Verfügung stehen. Dieser Anteil kann leicht mittels üblicher Arbeitsweisen der einschlägigen Technik bestimmt werden. In gleicher Weise bezieht sich die Erschöpfung oder der Verbrauch von Stickstoff im vorliegenden Fall auf denjenigen Anteil, welcher für das Wachstum der Mikroorganismen zur Verfügung steht. Auch dieser Anteil läßt sich durch analytische Verfahren messen, welche in der Fermentationstechnik bekannt sind.

Wie schon erwähnt wurde, soll das Gleichgewicht in der Nährlösung so eingestellt werden, daß die fermentierbaren Kohlehydrate und der für das Wachstum von Bacillus thuringiensis oder Bacillus sotto 5 oder einem vergleichbaren, einen Insektenkrankheitsstoff erzeugenden Bazillus, wie Bacillus entomocides var. entomocides, zur Verfügung stehende Stickstoff zum gleichen Zeitpunkt nach Beginn der Sporenbildung erschöpft oder verbraucht sind. Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dauert die Fermentation gewöhnlich etwa 28 bis 32 Stunden, obwohl diese Zeit selbstverständlich auch variieren kann. Mehrere Stunden nach Erreichen des maximalen Wachstums beginnt die Sporenbildung, und im allgemeinen liegt dieser Beginn etwa 10 bis 18 Stunden nach dem Fermentationsanfang. Es werden aber auch gute Ergebnisse erzielt, wenn die Erschöpfung oder der Verbrauch der zur Verfugung stehenden fermentierbaren Kohlehydrate und die Erschöpfung oder der Verbrauch des für das Wachstum verfügbaren Stickstoffes nach Einsetzen der Sporenbildung inerhalb eines Zeitabstandes zueinander von 2 bis 4 Stunden und selbst bis zu 6 Stunden eintreten.
Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse von verschiedenen Fermentationsansätzen, welche unter den oben beschriebenen Fermentierungsbedingungen durchgeführt wurden. Bei den ersten sieben Versuchen wurde ein wäßriges Fermentationsmedium mit einem Gehalt von etwa 1,4% Rübenmelasse, etwa 1,2% Feststoffen aus einer Getreideweiche und 0,1% Calciumcarbonat verwendet, während bei den Versuchen 8 und 9 ein wäßriges Fermentationsmedium zur Anwendung kam, welches etwa 1,86% Rübenmelasse, etwa 1,4%' Pharmamedia, etwa 1,7% Feststoffe aus Getreideweichen und 0,1% Calciumcarbonat enthielt. Die Fermentation wurde in jedem Fall mittels Bacillus thuringiensis durchgeführt.

	Versuch Nr.	Alter des Fermen tations- ansatzes bei Erschöpfung an Kohle hydraten in Stunden	Alter des Fermen	Sporen bildung zum Zeit punkt der Isolierung in°/o
40 45	1	10	tationsansatzes zum Zeitpunkt des Auf hörens des Zellenwachstums (Verbrauch des verfügbaren Stickstoffes) in Stunden	90
	2	16	15	etwa 100
	3	16	10	87
	4	12	20	etwa 100
50	5	12	18	etwa 100
	6	16	16	etwa 100
	7	16	14	etwa 100
	8	10	16	etwa 100
	9	10	12	etwa 100
55		14

Bei Beachtung der erfindungsgemäßen Lehre gemäß den vorstehenden Erläuterungen wurden in typischen Versuchen, bei welchen Kulturen mit einem Gesamtgewicht von 149,7 kg und einer Gesamtmenge an Bakterienzellen zwischen 1 und 5 · 10⁹ und einer gleichen Menge an Sporen verwendet worden sind, nach einer Behandlung mit 2% »Celite 512«, Trocknen und Vermählen etwa 3,40 bis 4,08 kg eines feinen Pulvers erhalten, welches einen Festkörpergehalt von 96,7% und eine Sporenmenge zwischen 15 und 35 · 10⁹ aufwies. Falls »Celite« oder eine ähnliche Filterhilfe nicht verwendet wird, können End-

produkte erhalten werden, deren Wirksamkeit noch einige Male größer ist, beispielsweise fünf- bis zehnmal so groß.

Es hat sich für die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als vorteilhaft erwiesen, den Mikroorganismus Bacillus thuringiensis bzw. seine verschiedenen Abarten oder Mutanten zu verwenden.

Wie schon dargelegt wurde, hat es sich weiterhin als besonders vorteilhaft erwiesen, die Gewinnung der Sporen und Parasporalkörper mittels einer Filterhilfe, wie »Celite 512«, durchzuführen, wobei mit einem Druckfilter filtriert und dann getrocknet wird. Es wurde auch schon auf die Bedeutung hingewiesen, welche der Schnelligkeit des Arbeitens insbesondere in der Filtrationsstufe zukommt, weil nur so ein Aufbrechen der noch nicht beschädigten Zellen sowie eine Sprossung der Sporen und/oder eine Selbstauflösung der Zellen verbindert oder wenigstens stark verringert werden kann. Diese Maßnahme stellt ein Kennzeichen der Erfindung dar, welche ganz unabhängig davon ist, ob die weitere erfindungsgemäße Lehre befolgt wird, nämlich die Einregulierung des Nährmediums im Fermentationsprozeß, derart, daß die fermentierbaren Kohlhydrate und der für das Wachstum verfügbare Stickstoff etwa gleichzeitig oder mit einem Zeitunterschied, der nicht mehr als 6 Stunden beträgt, nach dem Einsetzen der Sporenbildung erschöpft sind. An Stelle von »Celite 512« können dabei andere Filterhilfen, wie Diatomeenerde, Bentonit, absorbierende Silicate, wie Methocel, und ähnliche Stoffe verwendet werden.

Claims (5)

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung von Insektiziden auf üblichem biologischem Wege unter Verwendung eines fermentierbaren Kohlehydrates und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Nährmediums und eines sporenbildenden Mikroorganismus, der gleichzeitig einen Parasporalkörper erzeugt, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung des Nährmediums so eingestellt wird, daß die Kohlehydrate und der assimilierbare Stickstoff in einem Abstand von nicht mehr als 6 Stunden untereinander und seit Beginn der Sporenbildung erschöpft werden, worauf die gebildeten Sporen und die Parasporalkörper aus dem Nährmedium abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation während eines Zeitraums von 14 bis 32 Stunden und bei einem Anfangs-pg-Wert zwischen 7,2 und 7,6 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die fermentierbaren Kohlehydrate und der für das Wachstum der Mikroorganismen zur Verfügung stehende Stickstoff etwa zum gleichen Zeitpunkt nach Beginn der Sporenbildung erschöpft sind, welche vorzugsweise innerhalb von 3 bis 7 Stunden nach Erreichen der Wachstumsspitze einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung der Sporen und Parasporalköxper auf dem erschöpften Nährmedium unter Verwendung einer Filterhilfe in Mengen von vorzugsweise 2% durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als fermentierbare Kohlehydrate in der Nährlösung für den Mikroorganismus Rübenmelassen und ölfreie Getreidemehle oder -schrote zur Anwendung kommen.

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