DE1157735B - Manufacture of ferrimycin - Google Patents

Description

DEUTSCHESGERMAN

PATENTAMTPATENT OFFICE

C 23640 IVa/30hC 23640 IVa / 30h

ANMELDETAG: 14. MÄRZ 1961REGISTRATION DATE: MARCH 14, 1961

BEKANNTMACHUNG DER ANMELDUNG UNDAUSGABE DER AUSLEGESCHRIFT: 21. NOVEMBER 1963NOTICE THE REGISTRATION AND ISSUE OF EDITORIAL: NOVEMBER 21, 1963

Im Patent 1058 216 ist ein neues wasserlösliches Antibiotikum A 9578 beschrieben, das durch Züchtung des Actinomycetenstammes S. griseoflavus A 9578 oder seiner Mutanten erhalten wird.In the patent 1058 216 a new water-soluble antibiotic A 9578 is described, which by breeding of the actinomycete strain S. griseoflavus A 9578 or its mutants.

Es wurde nun gefunden, daß man das gleiche Antibiotikum, das nunmehr Ferrimycin genannt wird, und seine verschiedenen Komponenten, wie z. B. die Ferrimycine A, A1, A2 und B, auch bei der Züchtung eines Stammes S. lavendulae, A 21510, erhält.It has now been found that the same antibiotic, which is now called ferrimycin, and its various components, such as B. the ferrimycins A, A1, A2 and B, also in breeding of a strain S. lavendulae, A 21510.

Der Stamm A 21510 wurde aus einer Bodenprobe isoliert, welche im Kanton Obwalden, Schweiz, gesammelt wurde, und ist im Institut für spezielle Botanik der Eidgenössischen Technischen Hochschule Zürich unter der Bezeichnung A 21510 hinterlegt. Der Organismus weist folgende Charakteristika auf: Die Sporen besitzen eine glatte Oberfläche: das Luftmycel ist blaßkarmin bis zimtbraun bis braungrau; die Sporenketten bilden offene, unregelmäßige Schlaufen und Spiralen an den Enden langer gerader oder nur leicht gewellter Sporophoren; beim Wachstum zo auf peptonhaltigen Nährböden tritt eine schwarzbraune, melanoide Verfärbung auf. Das Wachstum ist relativ wenig temperaturabhängig, sowohl bei 18 als auch bei 40° C entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32° C.The strain A 21510 was isolated from a soil sample which was collected in the canton of Obwalden, Switzerland. was collected, and is in the Institute for Special Botany of the Federal Institute of Technology Zurich deposited under the designation A 21510. The organism has the following characteristics: The spores have a smooth surface: the aerial mycelium is pale carmine to cinnamon brown to brown-gray; the spore chains form open, irregular loops and spirals at the ends of longer straight or longer ones only slightly wavy sporophores; when growing on peptone-containing culture media, a black-brown, melanoid discoloration. The growth is relatively little temperature dependent, both at 18 as well as at 40 ° C, the fungus develops well, but the optimum is between 25 and 32 ° C.

Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces lavendulae, Stamm A 21510, auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 7 sowie 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S. 361 (1952), hergestellt. Bei den Medien 11 und 12 wurde das Rezept von Pridham et al. (Antibiotics Annual, 1956/1957, S. 947) benutzt. Die Herstellung von Medium 13 erfolgte gemäß den Angaben von Tresner und Danga (J. Bacteriology, 76, S. 239 [1958]) und diejenige von Medium 14 nach dem Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria, Committee on Bacteriological Technics of Soz. Amer. Bacteriol., Biotechn. Publications, Geneva, N. Y. (1946).For further characterization, the growth of Streptomyces lavendulae, strain A 21510, described on various nutrient media. The nutrient media 1 to 7 and 10 were after W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, p. 361 (1952). Media 11 and 12 did Recipe from Pridham et al. (Antibiotics Annual, 1956/1957, p. 947). The manufacture of Medium 13 was carried out as described by Tresner and Danga (J. Bacteriology, 76, p. 239 [1958]) and that of medium 14 according to the Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria, Committee on Bacteriological Technics of Soz. Amer. Bacteriol., Biotechn. Publications, Geneva, N.Y. (1946).

1. Synthetischer Agar:1. Synthetic agar:

Wachstum dünn, schleierartig, weißgelb; Luftmycel sehr spärlich, nur einen staubigen Überzug bildend.Growth thin, veil-like, white-yellow; Aerial mycelium very sparse, just a dusty coating forming.

2. Synthetische Lösung:2. Synthetic solution:

Sediment, Flocken weißgelb bis hellgelb.Sediment, flakes white-yellow to light yellow.

3. Glucose-Agar:3. Glucose agar:

Wachstum dünn, schleierartig oder pustelig, hellbraun bis dunkelbraun; Substrat teilweise dunkelbraun verfärbt; Luftmycel anfänglich Herstellung von FerrimycinGrowth thin, veil-like or pustular, light brown to dark brown; Partial substrate discolored dark brown; Aerial mycelium initially producing ferrimycin

Anmelder:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)Applicant:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Switzerland)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10Representative: Dipl.-Ing. E. Splanemann, patent attorney, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität:
Schweiz vom 18. März 1960 (Nr. 3065)Claimed priority:
Switzerland of March 18, 1960 (No. 3065)

Dr. Ernst Gäumann, Zürich,Dr. Ernst Gäumann, Zurich,

Dr. Ernst Vischer, Basel,Dr. Ernst Vischer, Basel,

und Dr. Hans Bickel, Binningen (Schweiz),and Dr. Hans Bickel, Binningen (Switzerland),

sind als Erfinder genannt wordenhave been named as inventors

schneeweiß mit blaßkarminen Flecken, später allmählich sich auf zimtbraun bis braungrau verdunkelnd.Snow-white with pale carmine spots, later gradually changing to cinnamon brown to brown-gray darkening.

4. Glucose-Asparagin-Agar:4. Glucose asparagine agar:

Wachstum dünn, schleierartig bis pustelig, hellbraun bis dunkelbraun; Substrat hellbraun verfärbt; Luftmycel sammetig blaßkarmin bis zimtbraun. Growth thin, veil-like to pustular, light brown to dark brown; Substrate discolored light brown; Aerial mycelium velvety pale carmine to cinnamon brown.

5. Calciummalat-Agar:5. Calcium malate agar:

Wachstum dünn, schleierartig, hellbraun mit spärlichem blaßkarminem Luftmycel.Growth thin, veil-like, light brown with sparse pale carmine aerial mycelium.

6. Gelatinestich (27° C):6. Gelatin prick (27 ° C):

Wachstum im Stich dunkelbraun oder braungelb; Substrat dunkelbraun verfärbt; Luftmycel fehlt; Verflüssigung fehlend oder nur sehr spärlich.Growth in the prick dark brown or brown-yellow; Substrate discolored dark brown; Aerial mycelium is absent; Liquefaction absent or only very sparse.

7. Stärkeplatte:7. Thickness plate:

Wachstum spärlich, punktförmig oder pustelig, weißgelb; Hydrolyse nach 10 Tagen 11 mm.Growth sparse, punctiform or pustular, white-yellow; Hydrolysis after 10 days 11 mm.

8. Kartoffel:8. Potato:

Wachstum anfänglich dünn, schleierartig, später runzelig, hellbraun bis dunkelbraun bis braunschwarz; Substrat dunkelbraun verfärbt; Luftmycel spärlich, punktförmig blaßkarmin.Growth initially thin, veil-like, later wrinkled, light brown to dark brown to brown-black; Substrate discolored dark brown; Aerial mycelium sparse, pale carmine punctiform.

309 749/371309 749/371

3 43 4

9. Karotte: Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in9. Carrot: Breeding takes place aerobically, for example in

Wachstum sehr spärlich. ruhender Oberflächenkultur, oder vorzugsweise sub-Very sparse growth. resting surface culture, or preferably sub-

mers unter Schütteln oder Rühren mit Luft odermers with shaking or stirring with air or

10. Lackmusmilch: Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten10. Litmus milk: oxygen in shaker bottles or the familiar ones

Wachstum spärlich, ringförmig, pustelig, hellbraun ₅ Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche bis braungelb; spärliche Koagulation und spar- zwischen 18 und 40⁰C. Eine wesentliche antibaklichePeptonisierung; Lackmus meist rot, teilweise terielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im aber blau. allgemeinen nach 1 bis 5 Tagen.Growth sparse, ring-shaped, pustular, light brown ₅ fermenters. A suitable temperature is a brownish yellow; sparse coagulation and economical between 18 and 40 ⁰ C. An essential antibaklichePeptonisierung; Litmus mostly red, but the nutrient solution shows some material effects in blue. generally after 1 to 5 days.

11 Hefeextrakt-Agar · ■ Zur Isolierung der Ferrimycine können z. B. fol-11 Yeast extract agar · ■ To isolate the ferrimycins, z. B. fol-

' Wachstum dünn,'schleierartig bis runzelig, hell- ¹⁰ &*** ^f ^T ^dieneiV Man trennt das Mycel vom braun bis dunkelbraun; Substrat wenig dunkel- Kulturfiltrat ab wonach die Hauptmenge der Fernbraun verfärbt; Luftmycel sehr gut entwickelt, ¹^¹¹* ™ Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben sammetig, blaßkarmin bis zimtbraun. ^^er rotzdem namhafte Mengen der Ferrimycine am'Growth thin,' veil-like to wrinkled, light- ¹⁰ & *** ^ f ^ T ^dienei V The mycelium is separated from brown to dark brown; Substrate little dark culture filtrate, after which the majority of the distant brown discolored; Aerial mycelium very well developed, ¹ ^ ¹¹ * ™ culture filtrate is found. It remains velvety, pale carmine to cinnamon brown. ^ ^he spit considerable amounts of ferrimycins on

Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteresMycelium adsorbed. It is therefore advantageous to do the latter

12. Carvajals Hafermehl-Agar: _{15 gu}t auszuwaschen. Dazu eignen sich Wasser und Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb; Luft- wäßrige organische Lösungsmittel, wie Alkohole, mycel sammetig, anfangs kreideweiß, später z. B. wäßriges Methanol.12. Carvajal oatmeal agar: _{15 gu} t wash. Water and growth are suitable for this, thin, veil-like, light yellow; Air-aqueous organic solvents, such as alcohols, mycelium velvet, initially chalky white, later z. B. aqueous methanol.

zimtbraun. Um die Ferrimycine dem Kulturfiltrat zu entziehen,cinnamon brown. To remove the ferrimycins from the culture filtrate,

13. Pepton-Eisen-Agar: VT^V^ Y^oneinander ^u trennen sind ver-13. Peptone-Iron-Agar: VT ^ V ^ Y ^{separate from each other} ^ u are separated

. . so schiedene Methoden geeignet, die einzeln oder m. . so different methods are suitable, which individually or m

Positive Reaktion. Kombination miteinander angewandt werden können.Positive response. Combination can be used with each other.

14. Nitratbrühe: Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Kulturlösung Nitrate werden zu Nitriten reduziert. während dieser Operationen auf einem pH zwischen14. Nitrate Broth: It has been shown to be beneficial to the culture solution Nitrates are reduced to nitrites. during these operations on a pH between

3 und 5 zu halten. 3 and 5 to hold.

In den beschriebenen Merkmalen, speziell Morpho- 25 1. Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z. B. logie der Sporen und der Sporenketten, Farbe des Aktivkohlen, wie Norit, aktivierte Erden, wie Fuller-Luftmycels und Fähigkeit zur Melaninbildung beim erde oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Wachstum auf peptonhaltigen Nährböden (vgl. Ett- Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmäßig mit linger et al., Arch. Mikrobiol., 31, S. 326 [1958]) Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen stimmt der Stamm A 21510 mit Streptomyces laven- 3° Lösungsmitteln mit Wasser oder wäßrigen Säuren, dulae überein. Er wird deshalb vorläufig dieser z. B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridin-, verGattung zugezählt. dünnten Essigsäure-Methanol- oder Wasser-Methanol-In the features described, specifically morpho 25 1. One can use adsorbents, e.g. B. Logy of the spores and the spore chains, color of activated carbon, such as Norit, activated earth, such as Fuller-Luftmycels and ability to form melanin with earth or floridin, or resin adsorbers such as asmit. Growth on peptone-containing nutrient media (cf. Ett- The adsorbates are expediently eluted with linger et al., Arch. Mikrobiol., 31, p. 326 [1958]) mixtures of water-miscible organic if the strain A 21510 agrees with Streptomyces lavens 3 ° solvents with water or aqueous acids, dulae match. He is therefore provisionally this z. B. with water-methanol, water-pyridine, verGus counted. diluted acetic acid-methanol or water-methanol

Es ist bekannt, daß eine Anzahl anderer Vertreter Eisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteilhaft der Gattung S. lavendulae Antibiotika produzieren. für die Elution eines Noritadsorbates hat sich das Wie weiter unten gezeigt wird, unterscheiden sich aber 35 Gemisch von Wasser (2 Volumteile), Methanol (1 Vodiese bekannten Substanzen in charakteristischer lumteil), Eisessig (1 Volumteil) und Butanol (2 Volum-Weise von den Ferrimycinen. teile) erwiesen.A number of other representatives are known to have glacial acetic acid-butanol mixtures. As particularly beneficial of the genus S. lavendulae produce antibiotics. for the elution of a noritol adsorbate the As will be shown below, there are 35 different mixtures of water (2 parts by volume), methanol (1 Vodiese known substances in characteristic lum part), glacial acetic acid (1 volume part) and butanol (2 volume way from the ferrimycins. parts) proved.

Es ist weiter bekannt, daß Streptomycetenstämme 2. Eine zweite Methode zur Abtrennung der Ferri-It is also known that Streptomycetenstämme 2. A second method for separating the ferric

gelegentlich degenerieren und viele ursprünglich mycine aus dem Kulturfiltrat besteht darin, daß man beschriebene Stämme heute nicht mehr erhältlich 40 die antibiotische Aktivität an Kationenaustauschern sind (vgl. »Applied Microbiology«, 6, S. 52 ff. [1958]). adsorbiert, wobei besonders Säuregruppen enthaltende Das Auffinden einer weiteren Species, die Ferrimycin Harze, wie »Amberlite IRC-50«, geeignet sind. Letzteres produzieren, bedeutet somit eine Bereicherung der kann sowohl in der Säureform als auch in der Natrium-Technik, form verwendet werden, doch hat sich ein Gemischoccasionally degenerate and many originally mycine from the culture filtrate consists in that one described strains no longer available today 40 the antibiotic activity on cation exchangers are (see. "Applied Microbiology", 6, p. 52 ff. [1958]). adsorbed, particularly containing acid groups Finding another species that ferrimycin resins, such as "Amberlite IRC-50", are suitable. The latter produce, thus means an enrichment that can both in the acid form and in the sodium technology, form can be used, but has become a mixture

Erfindungsgemäß züchtet man zur Erzeugung der 45 dieser beiden Formen im Volumenverhältnis 1:2 be-Ferrimycine einen der obigen Beschreibung ent- sonders bewährt. Die Elution geschieht zweckmäßig sprechenden Streptomycetenstamm in wäßriger, eine mit verdünnten Säuren, z. B. mit methanolischer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und gegebenenfalls Salzsäure.According to the invention, be-ferrimycins are grown in a volume ratio of 1: 2 to produce the 45 of these two forms one of the above descriptions is particularly effective. The elution is expedient speaking Streptomycetenstamm in aqueous, one with dilute acids, z. B. with methanolic Carbon and nitrogen source and optionally hydrochloric acid.

wachstumsfördernde Stoffe sowie anorganische Salze 3. Weiter können die basischen Ferrimycine auchgrowth-promoting substances and inorganic salts 3. The basic ferrimycins can also be used

enthaltender Nährlösung aerob, bis diese eine wesent- 50 direkt aus dem Kulturfiltrat ausgefällt werden, z. B. liehe antibakterielle Wirkung zeigt, und isoliert hierauf mittels Umsetzung mit einer organischen Säure vom die Ferrimycine. Typus der Pikrinsäure. Durch Behandlung diesercontaining nutrient solution aerobically until this is a substantial 50 precipitated directly from the culture filtrate, z. B. Liehe shows antibacterial effect, and then isolated from it by means of reaction with an organic acid the ferrimycins. Picric acid type. By treating this

Als Kohlenstoffquelle kommen z. B. assimilierbare Fällungen mit Salzen organischer Basen, z. B. mit Kohlenhydrate, wie Glukose, Saccharose, Laktose, Triäthylammoniumsulfat, oder mit verdünnten Säuren Mannit, Stärke, sowie Glycerin in Frage. Als stick- 55 wird das Antibiotikum in Form des entsprechenden stoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls Wachstums- Salzes erhalten. Man kann dabei sowohl in wäßrigem fördernde Stoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide Medium als auch in einem mit Wasser mischbaren und Proteine, sowie deren Abbauprodukte, wie Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, arbeiten. Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasser- Diese Überführung der schwerlöslichen Salze in lösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und 60 leichtlösliche Salze der Ferrimycine wird entweder mit Weizen, von Destillationsrückständen der Alkohol- Mineralsäuren oder an Ionenaustauscherharzen, z. B. herstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der an »Amberlite IRA-400, durchgeführt. Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwoll- 4. Eine Anreicherung der Ferrimycine wird auchAs a carbon source z. B. assimilable precipitations with salts of organic bases, e.g. B. with Carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, triethylammonium sulfate, or with dilute acids Mannitol, starch, and glycerin are in question. As a stick- 55 the antibiotic is in the form of the appropriate Substantial nutrients and possibly growth salt obtained. You can do this both in aqueous Promoting substances may be mentioned: amino acids, peptides medium as well as in a water-miscible medium and proteins, as well as their degradation products, such as solvents such as methanol or acetone, work. Peptone or tryptone, also meat extracts, water- This transfer of the sparingly soluble salts in soluble fractions of cereal grains, such as maize and 60 readily soluble salts of ferrimycins, is made with either Wheat, of distillation residues of alcohol mineral acids or of ion exchange resins, z. B. production, of yeast, beans, in particular that of »Amberlite IRA-400, carried out. Soy plant, from seeds, for example the cotton 4. An enrichment of the Ferrimycine is also

pflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. dadurch erreicht, daß man wäßrige oder alkohclisch-Von anderen anorganischen Salzen kann die Nähr- 65 wäßrige Lösungen des Salzes mit einem Überschuß lösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsvon Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink mitteln, wie Aceton, Dioxan usw., versetzt, wobei die und Mangan enthalten. Salze in fester Form ausgefällt werden.plant, etc., but also ammonium salts and nitrates. achieved in that one aqueous or alcoholic From Other inorganic salts can use the nutrient aqueous solutions of the salt with an excess solution, for example, chlorides, carbonates, sulfates of organic, water-miscible solutions of Alkalis, alkaline earths, magnesium, iron, zinc agents such as acetone, dioxane, etc., added, the and contain manganese. Salts are precipitated in solid form.

5. Eine weitere Methode der Anreicherung und/oder Auftrennung der Ferrimycine besteht darin, daß man wäßrige Lösungen desselben mit Lösungen von Phenol in Chloroform extrahiert, wobei sowohl das pn der wäßrigen Lösung als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden. So befindet sich die antibiotische Aktivität z. B. bei einer Verteilung zwischen einer Lösung, die auf 100 cm³ Chloroform 100 g Phenol enthält, und einer wäßrigen Phase von pH 1 bis 6 fast ausschließlich in der organischen Phase, während sie bei der Verwendung einer Lösung, die auf 100 cm³ Chloroform nur 33 g Phenol enthält, der wäßrigen Phase lediglich bei einem pn zwischen 4 und 6 annähernd vollständig entzogen wird. Versteht man unter dem Verteilungskoeffizienten der Ferrimycine das Verhältnis von Konzentration in der organischen Phase zur Konzentration in der wäßrigen, so geht aus den obigen Angaben hervor, daß der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinkendem Ph der wäßrigen Phase abnimmt. Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoeffizienten der Ferrimycine in diesem System einzustellen, kann man durch Kombination von wenigen Verteilungsoperationen einen Großteil inaktiver Verunreinigungen abtrennen.5. Another method of enriching and / or separating the ferrimycins is that aqueous solutions of the same are extracted with solutions of phenol in chloroform, both the pn of the aqueous solution and the phenol content of the chloroform solution being varied. So is the antibiotic activity z. B. with a distribution between a solution containing ^{100 g of phenol per 100 cm 3 of} chloroform, and an aqueous phase of pH 1 to 6 almost exclusively in the organic phase, while when using a solution containing 100 cm ^{3 of} chloroform contains only 33 g of phenol, is almost completely withdrawn from the aqueous phase only at a pn between 4 and 6. If one understands the ratio of concentration in the organic phase to concentration in the aqueous phase by the distribution coefficient of the ferrimycins, it follows from the above data that the distribution coefficient increases with increasing phenol content of the organic phase and decreases with decreasing Ph of the aqueous phase. Since it is thus possible to set any desired distribution coefficient of the ferrimycins in this system, a large number of inactive impurities can be separated off by combining a few distribution operations.

6. Eine andere Anreicherungs- und/oder Auftrennungsmethode für die Ferrimycine stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z. B. an Norit, Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikaten, Silicagel, Calciumsulfat, sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel, Celite u. dgl. als Trägersubstanzen, oder aber Chromatographie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an »Dowex 50«, »Amberlite IRC-50« u. dgl. Beispielsweise hat sich die Verteilungschromatographie an Cellulose unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Butanol (4 Volumteile), Eisessig (1 Volumteil) und Wasser (5 Volumteile) und die Chromatographie an stark sauren Ionenaustauschern, wie »Dowex 50 WX₂« in Ammoniumacetatpuffer (ph 4,5) von steigender Konzentration besonders bewährt.6. Another enrichment and / or separation method for the ferrimycins is chromatography, such as adsorption chromatography on various materials, e.g. B. Norit, aluminum oxide, magnesium silicates, silica gel, calcium sulfate, and partition chromatography with cellulose, starch, silica gel, Celite and the like. B. on "Dowex 50", "Amberlite IRC-50" and the like. For example, partition chromatography on cellulose using the solvent system butanol (4 parts by volume), glacial acetic acid (1 part by volume) and water (5 parts by volume) and chromatography are suitable Strongly acidic ion exchangers such as "Dowex 50 WX ₂ " in ammonium acetate buffer (pH 4.5) of increasing concentration have proven particularly effective.

7. Weiter können die Ferrimycine durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert und/ oder voneinander getrennt werden. Folgende Lösungsmittelsysteme haben sich dabei besonders bewährt:7. Furthermore, the ferrimycins cannot by countercurrent distribution according to Craig between two miscible solvent phases are enriched and / or separated from one another. The following solvent systems have particularly proven themselves:

a) sek. Butanol — ^₁₀ n-Ammonacetatpuffer von Ph 4,68.a) sec. Butanol - ^ ₁₀ n-ammonium acetate buffer of Ph 4.68.

b) ¹Ao η-Ammoniumacetatpuffer vom pn 4,6 — 10°/₀ige Lösung von Phenol in Chloroform. Der Verteilungskoeffizient des Antibiotikums im System b) und damit die Lage der Aktivitätsmaximums in der Verteilung kann einerseits durch Änderung des pn der Pufferlösung und andererseits durch Variierung des Phenolgehaltes der organischen Phase beliebig verändert werden.b) ^1-η Ao ammonium acetate from the pn 4.6 to 10 ° / ₀ by weight solution of phenol in chloroform. The distribution coefficient of the antibiotic in system b) and thus the position of the maximum activity in the distribution can be changed as desired on the one hand by changing the pn of the buffer solution and on the other hand by varying the phenol content of the organic phase.

c) Benzylalkohol (200 Volumteile) — n-Butanol (100 Volumteile) — 1 n-Salzsäure (6 Volumteile)— Wasser (300 Volumteile) — bei 19°C gesättigte, wäßrige Natriumchloridlösung (60 Volumteile).c) Benzyl alcohol (200 parts by volume) - n-butanol (100 parts by volume) - 1 n-hydrochloric acid (6 parts by volume) - Water (300 parts by volume) - aqueous sodium chloride solution (60 parts by volume) saturated at 19 ° C.

8. Ein gutes Verfahren für Anreicherung und/oder Auftrennung der Ferrimycine ist die Elektrophorese. Sie wird als Hochspannungselektrophorese bei 500 bis 4000VoIt durchgeführt. Besonders bewährt hat sich das Gegenstromverfahren. Dabei werden die als Kation vorliegenden Ferrimycine örtlich festgehalten, indem man die durch das elektrische Feld erzwungene Bewegung mittels einer entgegengesetzt gerichteten Elektrolytströmung genau kompensiert. Stoffe mit anderer elektrischer Beweglichkeit verlassen die Trennapparatur an den beiden Elektrodenenden.8. A good method for enriching and / or separating the ferrimycins is electrophoresis. It is carried out as high-voltage electrophoresis at 500 to 4000VoIt. Has particularly proven itself the countercurrent process. The ferrimycins present as a cation are retained locally, by moving the motion forced by the electric field by means of an oppositely directed Electrolyte flow precisely compensated. Substances with a different electrical mobility leave the separation apparatus at both ends of the electrodes.

Zur Herstellung von weitgehend reinen Präparaten hat sich folgende Kombination der aufgeführten Anreicherungsverfahren bewährt. Aus dem Kulturfiltrat werden die Ferrimycine am gepufferten Ionenaustauscher »Amberlite IRC-50« adsorbiert und mittels methanolischer Salzsäure eluiert. Die Eluate werden bei pn 5 im Vakuum konzentriert, wobei ein wäßriges Konzentrat der Ferrimycine erhalten wird, das volumenmäßig ungefähr einem Hundertstel der Kulturlösung entspricht. Dieses wird gemäß der obenerwähnten Methode 5 einige Male zwischen Phenol-Chloroform-Gemischen einerseits und wäßrigen Lösungen von variierendem ph andererseits verteilt, wobei nach Gefriertrocknung ein Präparat erhalten wird, das in bezug auf das lyophilisierte Kulturfiltrat eine um den Faktor 500 bis 1000 erhöhte spezifische Wirksamkeit besitzt. Durch Behandlung eines solchen Präparates gemäß der oben aufgeführten Methoden 6, 7 und 8 können weitgehend einheitliche Präparate der Ferrimycine vorzugsweise in Form eines Salzes erhalten werden.For the production of largely pure preparations, the following combination of the listed has been found Proven enrichment process. The ferrimycins are made from the culture filtrate on the buffered ion exchanger "Amberlite IRC-50" adsorbed and eluted with methanolic hydrochloric acid. The eluates are concentrated at pn 5 in vacuo to give an aqueous concentrate of ferrimycins which by volume approximately one hundredth of the culture solution is equivalent to. This is done several times between phenol-chloroform mixtures according to the above-mentioned method 5 on the one hand and aqueous solutions of varying pH on the other hand distributed, wherein after freeze-drying, a preparation is obtained which, with respect to the lyophilized culture filtrate, has a Has specific effectiveness increased by a factor of 500 to 1000. By treating one Preparations according to the above-mentioned methods 6, 7 and 8 can be largely uniform preparations the ferrimycins are preferably obtained in the form of a salt.

Wie aus papierchromatographischen Untersuchungen hervorgeht, besteht das Antibiotikum Ferrimycin aus zwei Hauptkomponenten, nämlich der Base A und der Base B. Erstere läßt sich wiederum in die Komponenten A1 und A2 auftrennen. Diese verschiedenen Komponenten werden im Verlaufe des beschriebenen Anreicherungsprozesses weitgehend voneinander getrennt, speziell bei der Verteilungschromatographie an Cellulose, bei der Chromatographie an Ionenaustauscherharzen und bei der Gegenstromverteilung. As can be seen from paper chromatographic studies, the antibiotic is ferrimycin of two main components, namely the base A and the base B. The former can in turn be converted into the Separate components A1 and A2. These various components are described in the course of the Enrichment process largely separated from each other, especially in partition chromatography on cellulose, in chromatography on ion exchange resins and in countercurrent distribution.

Die beiden Hauptkomponenten Ferrimycin A und B werden papierchromatographisch definiert durch einen direkten Vergleich ihrer Rf-Werte mit den Rf-Werten einer Reihe von bekannten Antibiotika (2 bis 11) in den Systemen A bis G. Beim System H wird durchlaufend chromatographiert. Die angegebenen Zahlen sind dort die in Zentimeter gemessenen Laufstrecken der Antibiotika nach 16stündiger Chromatogrammdauer. Der Nachweis der Antibiotika erfolgt bioautographisch mit Staphylococcus aureus oder Bacillus subtilis.The two main components Ferrimycin A and B are defined by a paper chromatography direct comparison of their Rf values with the Rf values of a number of known antibiotics (2 to 11) in systems A to G. System H is continuously chromatographed. The numbers given there are the distances of the antibiotics measured in centimeters after a chromatogram lasting 16 hours. The antibiotics are detected bioautographically with Staphylococcus aureus or Bacillus subtilis.

Systemsystem lala IbIb 22 33 44th 55 66th 77th 88th 99 1010 1111 A A. 0
0,49
0,34
0,050
0.49
0.34
0.05 0
0,63
0,58
0,150
0.63
0.58
0.15 0
0,05
0,22
00
0.05
0.22
0 0
0,05
0
00
0.05
0
0 0
0,17
0,02
00
0.17
0.02
0 0
0,02
0,22
00
0.02
0.22
0 0
0,02
0,03
00
0.02
0.03
0 0
0,66
0,72
X 0
0.66
0.72
X 0
0,55
0,62
X 0
0.55
0.62
X 0,92
0,92
0,93
0,920.92
0.92
0.93
0.92 0,07
0,32
0,390.07
0.32
0.39 0
0,22
0,11
00
0.22
0.11
0 B B. C C. D D.

lala 77th 22 33 44th 55 66th 77th 88th 99 1010 1111 Systemsystem 0,32
0,47
0,74
2,70.32
0.47
0.74
2.7 IbIb 0
0,22
0,07
00
0.22
0.07
0 0,10
0,14
00.10
0.14
0 0,22
0,12
00.22
0.12
0 0
0,04
0,02
00
0.04
0.02
0 0
0,05
00
0.05
0 X
0,49
X
(14,5) X
0.49
X
(14.5) 88th 0,86
0,91
0,94
270.86
0.91
0.94
27 0,43
0,610.43
0.61 0,12
0,36
0,69
10.12
0.36
0.69
1 E E. 0,32
0,47
0,74
7,60.32
0.47
0.74
7.6 X
0,42
X
(8,8)X
0.42
X
(8.8) F F. G G H H

A wassergesättigtes Butanol,A water-saturated butanol,

B Butanol—Eisessig—Wasser (4:1:5)
(obere Phase),B butanol — glacial acetic acid — water (4: 1: 5)
(upper phase),

C wassergesättigtes Butanol + 2 % p-Toluolsulfosäure, C water-saturated butanol + 2% p-toluenesulphonic acid,

D wassergesättigtes Butanol + 2% Piperidin,
E Butanol—Pyridin—Wasser (6:4: 3),D water-saturated butanol + 2% piperidine,
E butanol — pyridine — water (6: 4: 3),

F 80% Äthanol + 1,5% Natriumchlorid, Whatman Nr. 4 imprägniert mit 0,95molarem Natriumsulfat + 0,05molarem Natriumhydrosulfat, F 80% ethanol + 1.5% sodium chloride, Whatman No. 4 impregnated with 0.95 molar sodium sulfate + 0.05 molar sodium hydrosulfate,

G Butanol—Äthanol—Wasser (1:1: 2),G butanol — ethanol — water (1: 1: 2),

H Butanol—Butylacetat—Eisessig—Wasser
(10: 3 : 1,3 :14,3) (obere Phase),H butanol — butyl acetate — glacial acetic acid — water
(10: 3: 1.3: 14.3) (upper phase),

Analyse:Analysis:

C C.

is H is H

Fe Fe

Äquivalentgewicht .Equivalent weight.

P&MCS P & MCS

Ultraviolettspektrum Ultraviolet spectrum

(Eil) (Express)

lala Ferrimycin A,Ferrimycin A, IbIb Ferrimycin B,Ferrimycin B, 22 Streptomycin,Streptomycin, 33 Ristocetin A,Ristocetin A, 44th Ristocetin B,Ristocetin B, 55 Neomycin B,Neomycin B, 66th Viomycin,Viomycin, 77th Chlortetracyclin,Chlortetracycline, 88th Oxytetracyclin,Oxytetracycline, 99 Actinomycin J,Actinomycin J, 1010 Cycloserin,Cycloserine, 1111 Grisein,Grisiness, χχ Antibiotikum über ganze Laufstrecke verteilt,Antibiotics distributed over the entire course, OO Position unscharf.Position out of focus.

Ferrimycin A1Ferrimycin A1

47,63%47.63%

6,72%
4,88%6.72%
4.88%

1078
7,871078
7.87

229 ηιμ (336)
f 319πιμ(37)
\ 425 πιμ (27,6)229 ηιμ (336)
f 319πιμ (37)
\ 425 πιμ (27.6)

Ferrimycin A 2Ferrimycin A 2

48,77%
6,65 %
4,82%48.77%
6.65%
4.82%

984
7,73984
7.73

227 πιμ (332) 319 πιμ (37)
425 ηιμ (25)227 πιμ (332) 319 πιμ (37)
425 ηιμ (25)

Bei der Papierelektrophorese in 0,lmolarem Acetatpuffer von pH 4,6 wandern Ferrimycin A und B gegen die Kathode. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist etwa halb so groß wie diejenige des Streptomycins.In paper electrophoresis in 0.1 molar acetate buffer of pH 4.6, ferrimycin A and B migrate against the cathode. The migration speed is about half that of streptomycin.

Ferrimycin A, wie es z. B. mittels Elektrophorese oder Chromatographie an Ionenaustauschern oder Cellulose erhalten wird, ist ein rotbraunes Pulver, das gut löslich ist in Wasser, Methanol, Dimethylformamid, Benzylalkohol, Eisessig oder Phenol-Chloroform-Gemischen. Das Infrarotspektrum ist in Fig. 1 wiedergegeben. Das Ultraviolettspektrum (in Wasser) zeigt ein Maximum bei 318 ηιμ (E W = 47,2) und Inflexionen bei 229 und 400 πιμ. Die Elementaranalyse des Hydrochloride gibt folgende Werte: C = 50,68%, H = 6,99%, N = 13,45%, Fe (grav.) = 3,55%, Fe (color.) = 3,66%, Cl = 2,75%.Ferrimycin A, as it is e.g. B. is obtained by means of electrophoresis or chromatography on ion exchangers or cellulose, is a red-brown powder that is readily soluble in water, methanol, dimethylformamide, benzyl alcohol, glacial acetic acid or phenol-chloroform mixtures. The infrared spectrum is shown in FIG. The ultraviolet spectrum (in water) shows a maximum at 318 ηιμ (EW = 47.2) and inflections at 229 and 400 πιμ. The elemental analysis of the hydrochloride gives the following values: C = 50.68%, H = 6.99%, N = 13.45%, Fe (grav.) = 3.55%, Fe (color.) = 3.66% , Cl = 2.75%.

Die Ferrimycine A1 und A 2 unterscheiden sich physikalisch und chemisch nur unwesentlich voneinander. Die entsprechenden Werte von stark angereicherten Präparaten, die durch Cellulosechromatographie in essigsauren Butanol-Wasser-Systemen erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: The Ferrimycins A1 and A 2 differ physically and chemically only insignificantly from each other. The corresponding values of highly enriched Preparations obtained by cellulose chromatography in acetic acid butanol-water systems are summarized in the following table:

In Fig. 5 sind die Ultraviolettspektren (in Wasser: c = 5 · 10-³) des gereinigten Ferrimycins A (Kurve 1, Extinktion E = A) und der Komponenten Ferrimycin A₂ (Kurve 2, E = A—0,1) und Ferrimycin A₁ (Kurve 3,E = A—0,2) wiedergegeben.In FIG. 5, the ultraviolet spectra (in water: c = 5 x 10- ³⁾ of the purified Ferrimycins A (curve 1, Absorbance E = A) and the component ferrimycin A ₂ (curve 2, E = A-0.1) and ferrimycin A ₁ (curve 3, E = A-0.2).

Das papierchromatographische Verhalten von Ferrimycin A, Al, A2 und B ist in Fig. 4 dargestellt. Der Nachweis erfolgte bioautographisch mit Staphylococcus aureus. Es bedeutetThe paper chromatographic behavior of ferrimycin A, A1, A2 and B is shown in FIG. Of the Proof was made bioautographically with Staphylococcus aureus. It means

I = System Butanol—Eisessig—Wasser (4:1: 5)I = system butanol - glacial acetic acid - water (4: 1: 5)

10 Stunden,
II = System Butanol—Butylacetat—Eisessig—10 hours,
II = system butanol — butyl acetate — glacial acetic acid

Wasser (100: 30: 13 : 143) 24 Stunden,
TII = wie II, aber 60 Stunden,Water (100: 30: 13: 143) 24 hours,
TII = like II, but 60 hours,

1 = Rohprodukt, enthaltend Ferrimycin A und B,1 = crude product containing ferrimycin A and B,

2 = Ferrimycin B,2 = ferrimycin B,

3 = Ferrimycin A,3 = ferrimycin A,

4 = Ferrimycin Al,4 = ferrimycin Al,

5 = Ferrimycin A2.5 = ferrimycin A2.

Bei der Chromatographie hochgereinigter Ferrimycin Α-Präparate an Cellulosesäulen mit einem kochsalzhaltigen tert.-Butanol-Salzsäure-Gemisch werden die reinen Ferrimycine Al und A2 in Form der Dihydrochloride erhalten. Ihre Eigenschaften sind nachfolgend tabellarisch zusammengefaßt:In the chromatography of highly purified Ferrimycin Α preparations on cellulose columns with a saline Tert.-butanol-hydrochloric acid mixture produces the pure Ferrimycins Al and A2 in the form of the dihydrochlorides obtain. Their properties are summarized in the following table:

Ferrimycin A^DihydrochloridFerrimycin A ^ dihydrochloride

MikroanalyseMicroanalysis

C 46,70%, 46,44%C 46.70%, 46.44%

H 6,79%, 6,77%H 6.79%, 6.77%

N 12,73%, 12,80%N 12.73%, 12.80%

Fe 5,27%, 5,34%Fe 5.27%, 5.34%

Cl 6,43%, 6,31%Cl 6.43%, 6.31%

(C)CH₃ 1,95%, 2,15%(C) CH ₃ 1.95%, 2.15%

Titration (HeIv., 37, S. 1872 [1954])Titration (HeIv., 37, p. 1872 [1954])

a)
b)
c)a)
b)
c)

4,11
7,92
11,44.11
7.92
11.4

Äquivalentgewicht Equivalent weight

11291129

9 109 10

UV-Absorption (H₂O) säure in Form amorpher Salze gefällt. Mit NinhydrinUV absorption (H ₂ O) acid precipitated in the form of amorphous salts. With ninhydrin

in entsteht bei längerem Erhitzen in pyridinhaltigemin is formed in a pyridine-containing one upon prolonged heating

■" Ulf·! ti,, Jl/ „ , . ,, . , „.. - τλ· in ι. ι .■.·■ "Ulf ·! Ti ,, Jl /",. ,,., ".. - τλ · in ι. Ι. ■. ·

319 mu, E^1% 28 3 ßutanol eine blauviolette Färbung. Die Farbreaktionen319 mu, E ^1% 28 3 ßutanol a blue-violet color. The color reactions

/im_mn τ? 1™ ολ'/ι nach Sakaguchi und Molisch sowie der Anthron-/ im _m n τ? 1 ™ ολ '/ ι according to Sakaguchi and Molisch as well as the anthrone

4JU DILI, £ 1™ Z0,4 «it · -KT χ ι τ ·· J τ- ·4JU DILI, £ 1 ™ Z0.4 «it · -KT χ ι τ ·· J τ- ·

5 test verlaufen negativ. Neutrale Losungen der Ferrimy-IR-Absorption (KBr): eine reagieren nicht mit Kaliumferrocyanid, dagegen5 tests are negative. Neutral solutions of the Ferrimy IR absorption (KBr): one does not react with potassium ferrocyanide, against it

Vergleiche Fig 7 schwach angesäuerte momentan unter Bildung vonCompare Figure 7 weakly acidic instantaneous to give

Berlinerblau. Berlinerblaufärbungen entstehen auchBerlin blue. Berlin blue stains also arise

Craigsche Verteilung mit Ferricyanid-Eisenchlorid-Reagens, während Zu-Craig's distribution with ferricyanide ferric chloride reagent, while addi-

Verteilungskoeffizientbei 25⁰C im System n-Buta- ¹⁰ satz V_0n Kaliumferricyanid allein keine merkliche nol-Benzylalkohol-0,001 n-HCl-gesättigte Farbreaktion und Zusatz von Eisenchlorid allem eineVerteilungskoeffizientbei 25 ⁰ C in the system n-butanone ¹⁰ set V _0n potassium ferricyanide alone no appreciable nol-benzyl alcohol 0.001 N HCl-saturated color reaction and the addition of ferric chloride mainly a

wäßrige NaCl-Lösung(10:5:15:3) 0,372 Braunfarbungbewirkt.RotgefarbteFerrimycmlosungenAqueous NaCl solution (10: 5: 15: 3) 0.372 causes brown coloring. Red colored Ferrimycm solutions

verandern ihre Farbe beim Zutropfen von starkerchange their color when added dropwise from stronger

Papierchromatographie Mineralsäure reversibel über violettrot nach farblos.Paper chromatography mineral acid reversible from violet-red to colorless.

Rf-Wert im System tert.-Butanol-O,004 n-HCl ¹^ ^BeimiSf^atz _T ^vo _fi ⁿ 2n-Natronlauge wird Eisenhydroxyd -gesättigtewäßrigeNaCl-Lösung(2: 1: 1);What- ausgefällt. Laßt man konzentrierte methanohsche man Nr. 1-Papier imprägniert mit Aceton-Η,Ο- ^LosunS^en ^v°ⁿ 8-Hydroxychinolm auf wäßrige Lögesättigter wäßriger NaCl-Lösung (6: 3 : 1) .. 0,59 sungen der Ferrimycine einwirken so scheiden sichRf value in the system tert.-butanol O, 004 ^n-1 ^ HCl ^When ISF ^atz _T ^vo _fi ⁿ 2N sodium hydroxide solution is ferric hydroxide -gesättigtewäßrigeNaCl solution (2: 1: 1); Whatman precipitated. Leaves concentrated methanohsche one No. 1 paper impregnated with acetone Η, Ο- ^solution S ^e n ^v ° ⁿ 8-hydroxyquinol on aqueous Lösaturated aqueous NaCl solution (6: 3: 1) .. 0.59 solutions of the ferrimycins act so divide

rasch dunkelgefarbte, kristalline Niederschlage vonrapidly dark colored, crystalline precipitates of

„ . .. ^.,,,,., so Eisen-hydroxychinolin ab. Die Mutterlaugen liefern". .. ^. ,,,,., so iron hydroxyquinoline from. Deliver the mother liquors

Fernmycm Α,-Dihydrochlorid _{nach Waschen mit} Chloroform beim Eindampfen dieFernmycm Α, dihydrochloride _{after washing with} chloroform during evaporation the

Mikroanalyse eisenfreien Ferrimycine in Form annähernd farbloserMicroanalysis of iron-free ferrimycins in the form of almost colorless ones

C 45,78 % Pulver, die auf Zusatz von Ferrichlorid in die rot-C 45.78% powder based on the addition of ferric chloride in the red

H 6,77 % gefärbten Ferrimycine zurückverwandelt werden. DieH 6.77% colored ferrimycins can be reconverted. the

N 12,75 % 25 Ferrimycine reagieren mit Natriumdithionit unterN 12.75% 25 Ferrimycins underreact with sodium dithionite

Fe 5,29 % Entfärbung. Beim Stehenlassen der Lösung an derFe 5.29% discoloration. When the solution is left on the

Cl 6,23 % Luft kehrt die ursprüngliche Farbe wiederum zurück.Cl 6.23% air returns the original color.

(C)CH₃ 2,16 % Bei der sauren Hydrolyse von Ferrimycin A können(C) CH ₃ 2.16% In the acid hydrolysis of ferrimycin A can

unter anderem Bernsteinsäure, l-Amino-5-hydroxyl-30 amino-pentan, <5-Aminovaleriansäure, Cadaverin und Ammoniak nachgewiesen werden.including succinic acid, l-amino-5-hydroxyl-30 amino-pentane, <5-aminovaleric acid, cadaverine and Ammonia can be detected.

Die freien Basen der Ferrimycine sind leicht aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wäßrigem Medium mitBariumhydroxyd, 35 Nautralisierung des überschüssigen Baryts mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumcarbonat- und -Sulfatniederschlages und Isolierung der freien Base ϊτν AVi f" ^T4 η"» mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Her-The free bases of the ferrimycins are easily accessible from their salts, from the sulfate z. B. by Reaction in an aqueous medium with barium hydroxide, 35 neutralization of the excess barite with carbon dioxide and separation of the barium carbonate and sulfate precipitate and isolation of the free base ϊτν AVi f "^ T4 η" »by means of freeze drying. It is easier to manufacture

u v-ADSorption <n₂uj stellung aus den Salzen unter Verwendung eines starku v adsorption <n ₂ uj position from the salts using a strong

λτηαχ 231 ΐημ, E }*_n 328 40 basischen Anionenaustauschers, z. B. der OH-Form λτηαχ 231 ΐημ, E} * _n 328 40 basic anion exchanger, z. B. the OH form

■Ämeu: 319 ηιμ, E }1 30 des unter der Bezeichnung Dowex-2 im Handel■ Ämeu: 319 ηιμ, E} 1 30 of the under the name Dowex-2 in the trade

λτηαχ 435 πιμ, Ε }?„ 26,2 befindlichen Produktes. λτηαχ 435 πιμ, Ε}? “26.2 located product.

tr Al·« r (KU Λ Fine der auffallendsten Eigenschaften der Ferrimy-tr Al · «r (KU Λ Fine of the most striking properties of the Ferrimy-

iK-ADSorption ικ,ογ;. _{dne ist} ^ _{ausgeprägtes} Stabilitätsminimum zwischeniK adsorption ικ, ογ ;. _{dne is} ^ _pronounced stability minimum between

Vergleiche Fig. 8 45 p_H6 und 9. Lösungen verlieren bei 20⁰C und beiCompare Fig. 8 45 p _H 6 and 9. Solutions lose at 20 ⁰ C and at

Craigsche Verteilung ^eine™ ^Ph™\⁷ ™ίΙ· Tf^ ^/tunden ?ⁿ Craig's distribution ^a ™ ^Ph ™ \ ⁷ ™ ίΙ · Tf ^ ^ / tunden? ⁿ

^{6 &} größten Teil ihrer Aktivität, wahrend sie bei der ^{6 &} most of their activity while they are at the

Verteilungskoeffizient bei 25⁰C im System n-Bu- gleichen Temperatur bei einem p_H von 1 bis 5 undDistribution coefficient at 25 ⁰ C in the system n-Bu- same temperature at a p _H of 1 to 5 and

tanol—Benzylalkohol—0,001 n-HCl—gesättigte 10 bis 13 weitgehend wirksam bleiben.tanol — benzyl alcohol — 0.001 n-HCl — saturated 10 to 13 remain largely effective.

wäßrige NaCl-Lösung (10: 5: 15: 3) 0,175 50 Die antibiotische Wirksamkeit der Ferrimycine istaqueous NaCl solution (10: 5: 15: 3) 0.175 50 The antibiotic effectiveness of Ferrimycins is

„ . , . ,. durch die eisenhaltigen Wuchsstoffe, die Ferrioxamine,". ,. ,. through the iron-containing growth substances, the ferrioxamines,

Papierchromatographie antagonisiert. In dieser Beziehung unterscheiden sichPaper chromatography antagonized. In this respect differ

Rf-Wert im System tert.-Butanol—0,004 n-HCl die Ferrimycine von allen bekannten, ebenfalls vonRf value in the system tert-butanol-0.004 n-HCl the ferrimycins of all known, also of

—gesättigte wäßrige NaCl-Lösung (2: 1: 1); What- Stämmen der Gattung Streptomyces lavendulae produman Nr. 1-Papier imprägniert mit Aceton—H₂O— 55 zierten Antibiotika.- saturated aqueous NaCl solution (2: 1: 1); What- strains of the genus Streptomyces lavendulae produman No. 1 paper impregnated with acetone-H ₂ O- 55 adorned antibiotics.

gesättigter wäßriger NaCl-Lösung (6: 3 : 1) .. 0,47 Die Salze der Ferrimycine leiten sich von densaturated aqueous NaCl solution (6: 3: 1) .. 0.47 The salts of the ferrimycins are derived from the

bekannten anorganischen und organischen Salzen ab,known inorganic and organic salts,

Die Dihydrochloride der reinen Ferrimycine A₁ beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren und A₂ besitzen bezüglich des lyophilisierten Kultur- und Phosphorsäuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, filtrates eine etwa 20000fache antibiotische Aktivität. 60 Palmitin- oder Ölsäure, der Bernsteinsäure, Zitronen-Die Ferrimycin-dihydrochloride sind sehr gut löslich säure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothenin Wasser, Methanol, 90%igem Phenol, Phenol- säure. Sie stellen neutrale oder saure Salze dar. Ihre Her-Chloroform-Gemischen, Dimethylformamid und Me- stellung erfolgt durch Einwirkung der entsprechenden thylcellosolve, löslich bis mäßig löslich in Eisessig, Säuren auf die freie Base oder durch doppelte UmAlkohol, Benzylalkohol und Pyridin und unlöslich in 65 setzung von Salzen, beispielsweise von Ferrimycin-Butanol, Chloroform, Essigester und weniger polaren sulfat mit pantothensaurem Calcium. Lösungsmitteln. Sie werden aus wäßrigen Lösungen Die Ferrimycine besitzen eine sehr hohe anti-The dihydrochlorides of the pure ferrimycins A _1, for example hydrochloric acid, sulfuric acids and A _2, have about 20,000 times the antibiotic activity with respect to the lyophilized culture and phosphoric acids, the acetic, propionic, valerian and filtrates. 60 Palmitic or oleic acid, succinic acid, lemon-The ferrimycin dihydrochloride are very soluble acid, mandelic acid, glutamic acid or pantothenin water, methanol, 90% phenol, phenolic acid. They represent neutral or acidic salts. Your Her-chloroform mixtures, dimethylformamide and Mestellung takes place by the action of the corresponding thylcellosolve, soluble to moderately soluble in glacial acetic acid, acids on the free base or by double Umalcohol, benzyl alcohol and pyridine and insoluble in 65 formation of salts, for example of ferrimycin-butanol, chloroform, ethyl acetate and less polar sulfate with pantothenic acid calcium. Solvents. They are made from aqueous solutions. The Ferrimycins have a very high anti-

mit Pikrinsäure, Ammoniumreineckat und Pikrolon- biotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Test-with picric acid, pure ammonium and picrolon - biotic effectiveness against various test

Titration (HeIv., 37,Titration (HeIv., 37, S. 1872 [1954])P. 1872 [1954]) pipi a)
b)
c)~a)
b)
c) ~ Ci₁SCCi ₁ SC Äquivalent
gewichtequivalent to
weight 4,04
7,91
11,54.04
7.91
11.5 1 10861 1086

Organismen. In der folgenden Tabelle sind die Aktivitäten von Ferrimycin A, Al und A 2 zusammengestellt. Angegeben sind die in Millimeter gemessenen Hemmzonen durchmessen, die im Agarplattentest mit Papierrondellen von 6 mm Durchmesser bei Imprägnierung mit 0,l%ig^eri Lösungen erhalten werden.Organisms. The following table summarizes the activities of ferrimycin A, Al and A 2. The measured zones of inhibition in millimeters are indicated by measure obtained in the agar plate with paper washers of 6 mm diameter at impregnation with 0, l% ig ^e ri solutions.

TestorganismenTest organisms

Staph. aureus Staph. aureus

Streptococcus faecalis.,Streptococcus faecalis.,

Escherichia coli Escherichia coli

Shigella sonnei Shigella sonnei

Pasteurelle pestis Pasteurelle pestis

Bac. megatherium Bac. megatherium

Klebsielle Typ A Klebsial type A

Base ABase A Base AlBase Al 2626th 2727 88th 00 10,510.5 10,510.5 13,513.5 1414th 1212th 1212th 2020th 2020th 2323 22,522.5

Base A2Base A2

26,5 9 11 14 12 20 22,526.5 9 11 14 12 20 22.5

Bebrütung hat dieKulturlösungdengrößtenHemmwert gegenüber den Testorganismen (B. subtilis, B. megatherium, Micrococcus pyogenes, var. aureus) erreicht. Man unterbricht die Kultur, bringt das pH durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure auf 4,5 und trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge der Ferrimycine enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor derIncubation, the culture solution has the greatest inhibitory value against the test organisms (B. subtilis, B. megatherium, Micrococcus pyogenes, var. aureus). The culture is interrupted, the pH is brought to 4.5 and by adding dilute sulfuric acid separates the mycelium and other solid components from those containing the majority of the ferrimycins Solution by means of filtration or centrifugation, where appropriate the culture solution before

ίο Filtration etwa 1% eines Filterhilfsmittels, z.B. »Hyflo Supercel«, zugesetzt wird. Die Filterrückstände wäscht man mit Wasser und mit wäßrigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem Kulturnitrat. ίο Filtration about 1% of a filter aid, e.g. "Hyflo Supercel" is added. The filter residue it is washed with water and with aqueous methanol and the washing liquids are combined with the culture nitrate.

Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit.If, instead of the nutrient solution given above, one uses those that per liter of tap water contain the following nutrients, culture filtrates are obtained after analogous cultivation and processing of similar high antibiotic effectiveness.

b)b)

In vivo sind die Ferrimycine ebenfalls wirksam. So werden z. B. mit Ferrimycin A, Al und A2 bei fünf- ao maliger subkutaner Verabreichung von 0,1 mg/kg an mit Staphylococcus pyogenes, var. aureus infizierte Mäuse 100% und bei einer Dosis von fünfmal 0,05 mg/kg 60% Überlebende beobachtet.The ferrimycins are also effective in vivo. So z. B. with ferrimycin A, Al and A2 at five ao single subcutaneous administration of 0.1 mg / kg to those infected with Staphylococcus pyogenes, var. aureus Mice 100% and at a dose of 0.05 mg / kg five times 60% survivors were observed.

Die Toxizität der Ferrimycine ist gering. So wird z. B. die subkutane Applikation von 1000 mg/kg von Mäusen ohne Schädigung ertragen. Höhere Dosen wurden noch nicht geprüft.The toxicity of the ferrimycins is low. So z. B. the subcutaneous application of 1000 mg / kg of Mice endured without harm. Higher doses have not yet been tested.

DasAntibiotikumFerrimycin, seine KomponentenA, Al, A2 und B, deren Salze oder Derivate können als 3° Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Träger- 35 material. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere 40 bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterili- 45 siert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Zur Isolierung der Ferrimycine aus 3001 der obigenThe antibiotic ferrimycin, its components A, Al, A2 and B, their salts or derivatives can be used as 3 ° Remedies, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These include the above Compounds in a mixture with a pharmaceutical suitable for enteral, parenteral or local administration organic or inorganic carrier material. For the same, such substances come into question, who do not respond to the new connections, such as B. gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, Talc, vegetable oils, benzyl alcohol, gum, polyalkylene glycols, petroleum jelly, cholesterol or others 40 known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. B. as tablets, coated tablets, Powders, ointments, creams, suppositories or in liquid form as solutions, suspensions or Emulsions are present. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, Stabilizing, wetting or emulsifying agents. You can also use other therapeutically useful substances to isolate the ferrimycins from 3001 of the above

Stoffe enthalten. Kulturfiltrate werden 1 Volumteil »Amberlite IRC-50«Contain substances. Culture filtrates are 1 part by volume of »Amberlite IRC-50«

Die Erfindung wird in dem nachfolgenden Beispiel 50 in der Η-Form mit 2 Volumteilen »Amberlite IRC-50«The invention is illustrated in the following example 50 in the Η-form with 2 parts by volume »Amberlite IRC-50«

näher beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsius- in der Na-Form mechanisch gemischt. 6,31 diesesdescribed in more detail. The temperatures are mechanically mixed in Celsius in the Na form. 6.31 this

graden angegeben. Gemisches werden in eine Glassäule eingefüllt. Dasdegrees indicated. Mixtures are poured into a glass column. That

_B · ■ j Höhe-Durchmesser-Verhältnis des Harzbettes be- _B · ■ j height-diameter ratio of the resin bed

^p trägt 8:1. Das Kulturfiltrat wird mit 2n-Salzsäure auf ^p carries 8: 1. The culture filtrate is treated with 2N hydrochloric acid

Die Züchtung des S. lavendulae, A 21510, wird nach 55 pH 4,0 eingestellt und mit einer Durchlaufgeschwindigdem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet keit von 0,21 pro Minute pro Liter Harz durch das eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Harz perkoliert, wobei sich in den oberen zwei Drittem Rapsschrot, 10g Glukose, Ig Calciumcarbonatund der Säule eine orangebraune Zone ausbildet. Das 0,2 g sek. Kaliumphosphat enthält. Die Nährlösung Harz wird anschließend mit 301 Wasser und mit 601 wird in den Impfkolben oder in den Fermentern 60 80%igem Methanol gewaschen. Der Durchlauf und während 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die die Waschflüssigkeiten enthalten nur wenig antibio-The cultivation of the S. lavendulae, A 21510, is stopped after 55 pH 4.0 and with a flow rate Submerged procedure carried out. One uses speed of 0.21 per minute per liter of resin by the a nutrient solution that percolates 20 g of resin per liter of tap water, with two thirds in the top Rapeseed meal, 10g glucose, Ig calcium carbonate and the column forms an orange-brown zone. That 0.2 g sec. Contains potassium phosphate. The resin nutrient solution is then mixed with 301 water and 601 is washed in the inoculation flasks or in the fermenters 60-80% methanol. The pass and sterilized for 20 to 30 minutes at 1 atm. The washing liquids contain little antibiotic

Glukose 10 gGlucose 10 g

Sojamehl 10 gSoy flour 10 g

Natriumchlorid 5 gSodium chloride 5 g

Natriumnitrat IgSodium nitrate Ig

Glycerin 20gGlycerin 20g

Sojamehl 10 gSoy flour 10 g

Natriumchlorid 5 gSodium chloride 5 g

Natriumnitrat IgSodium nitrate Ig

Calciumcarbonat 10 gCalcium carbonate 10 g

Glukose 10gGlucose 10g

Sojamehl 10 gSoy flour 10 g

Corn steep liquor (Maisquellwasser) 20 gCorn steep liquor (corn steep liquor) 20 g

Natriumchlorid 5 gSodium chloride 5 g

Natriumnitrat IgSodium nitrate Ig

Calciumcarbonat 10 gCalcium carbonate 10 g

d) Laktose 20gd) lactose 20g

Distillers solubles 20 gDistillers solubles 20 g

Natriumchlorid 5 gSodium chloride 5 g

Natriumnitrat IgSodium nitrate Ig

e) Corn steep liquor (Maisquellwasser) 20 ge) Corn steep liquor (corn steep liquor) 20 g

Malzextrakt 20 gMalt extract 20 g

Natriumchlorid 5 gSodium chloride 5 g

sek. Kaliumphosphat 0,2 gsec. Potassium phosphate 0.2 g

Calciumcarbonat 2 gCalcium carbonate 2 g

sterilisierte Nährlösung zeigt ein pH von 7,5 bis 8,0. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 10% einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 27°, wobei Kulturen in Fermentern mit etwa 2 Volumen steriler Luft pro Volumen Lösung in der Minute belüftet werden. Nach 48 bis 120 Stundensterilized nutrient solution shows a pH of 7.5 to 8.0. Inoculation takes place with up to 10% of a partial sporulating vegetative culture of the organism. Incubate with good shaking or stirring at 27 °, with cultures in fermenters with about 2 volumes of sterile air per volume of solution in the Minute. After 48 to 120 hours

tische Aktivität. Die Elution erfolgt in zwei Portionen mit insgesamt 371 eines Gemisches von 8 Volumteilen Methanol und 2 Volumteilen 1 n-Salzsäure.table activity. Elution takes place in two portions with a total of 371 of a mixture of 8 parts by volume Methanol and 2 parts by volume of 1N hydrochloric acid.

des erhaltenen wäßrigen Eluatkonzentrates versetzt man unter Rühren mit 1 kg »Hyflo« und innerhalb 2 Stunden mit 1,81 einer Mischung von 11 Teilen Phenol und 1 Teil Wasser. Anschließend läßt manof the aqueous eluate concentrate obtained, 1 kg of "Hyflo" is added while stirring and within 2 hours with 1.81 of a mixture of 11 parts phenol and 1 part water. Then one leaves

noch Va Stunde rühren, worauf abgenutscht wird. Das Filtrat enthält etwa 2 bis 5 7o der Aktivität und wird verworfen. Der gut ausgepreßte Filterkuchen wird zweimal mit je 41 Äther und einmal mit einer Mischung von 8 1 Aceton und 21 Äther verrührt und JS jeweils abgenutscht, worauf der Rückstand dann nacheinander auf der Nutsche mit je 51 Aceton und 4 ] Chloroform gewaschen wird. Alle Waschlösungen sind praktisch inaktiv. Der chloroformfeuchte Filterkuchen wird hierauf unter Rühren in 31 einer Mischung to Phenol—Chloroform 1: 1 (Gew./Vol.) eingetragen und 1 Stunde gerührt. Dann werden innerhalb 1 Stunde 151 Chloroform in gleichmäßigem Strom zugegeben. Das »Hyflo« wird genutscht und zweimal mit 21 Phenol—Chloroform 1: 11 (Gew./Vol.) und einmal mit 21 Chloroform ausgewaschen. Der Rückstand enthält noch 5 bis 10 7₀ der Aktivität.Stir for another hour, after which it is sucked off. The filtrate contains about 2 to 5 7o of the activity and is discarded. The well squeezed filter cake is stirred twice with ether and once with 41 of a mixture of 8 1 of acetone and ether and 21 respectively JS suction, is then washed and the residue on the filter successively with 51 per acetone and 4] chloroform. All washing solutions are practically inactive. The filter cake, moist with chloroform, is then introduced into a mixture of phenol-chloroform 1: 1 (w / v) with stirring and stirred for 1 hour. 151 chloroform are then added in a steady stream over the course of 1 hour. The "Hyflo" is sucked off and washed out twice with 21% phenol-chloroform 1:11 (w / v) and once with 21% chloroform. The residue still contains 5 to 10 7 _{0 of} the activity.

Die vereinigten aktiven Filtrate (221) werden bei 25° auf 41 konzentriert und das Konzentrat innerhalb 30 Minuten in eine Mischung von 41 Äther, 8 1 Petrol- ao äther und 400 g »Hyflo« eingetropft. Nach weiteren 30 Minuten wird abgenutscht. Der Filterkuchen wird mit 21 Äther und zweimal mit 11 Aceton ausgewaschen. Alle Filtrate enthalten nur Spuren an Aktivität. «5The combined active filtrates (221) are at 25 ° concentrated to 41 and the concentrate within 30 minutes in a mixture of 41 ether, 8 1 petrol ao dripped in ether and 400 g of "Hyflo". After a further 30 minutes, suction is applied. The filter cake will Washed out with 21 ether and twice with 11 acetone. All filtrates contain only traces of activity. «5

Der Filterkuchen wird dreimal während 10 Minuten mit je 1,51 Methanol verrührt, abgenutscht und zum Schluß noch mit 0,51 Methanol auf der Nutsche nachgewaschen. Das ausgewaschene »Hyflo« enthält keine Aktivität mehr.The filter cake is stirred three times for 10 minutes with 1.5 l of methanol each time, suction filtered and for Finally washed with 0.51 methanol on the suction filter. The washed-out "Hyflo" does not contain any Activity more.

Die dunkelbraunen Filtrate (4 bis 4,51) werden bei 20 bis 30° am Wasserstrahlvakuum schonend zur Trockene eingedampft. Man trocknet den noch klebrigen Rückstand im Hochvakuum während 20 Stunden. Es resultieren 75 bis 88 g eines rotbraunen, stark aktiven Ferrimycinpräparates. Die Aktivitätsausbeute, bezogen auf das Ausgangsmaterial, beträgt 90 7o·The dark brown filtrates (4 to 4.51) are gently turned at 20 to 30 ° in a water jet vacuum Evaporated dry. The still sticky residue is dried in a high vacuum for 20 hours. This results in 75 to 88 g of a red-brown, highly active ferrimycin preparation. The activity yield, based on the starting material, is 90 7o

6 g des erhaltenen Ferrimycinpräparates, das, bezogen auf das lyophilisierte Kulturfiltrat, eine etwa lOOOfache antibiotische Aktivität besitzt und sowohl FerrimycinA als auch Ferrimycin B enthält, wird über 115 Stufen nach Craig gegenstromverteilt. Die Apparatur besteht aus 120 Einheiten. Sie wird pro Einheit beschickt mit 100 cm³ oberer und 100 cm³ unterer Phase eines bei 19° äquilibrierten Gemisches von Benzylalkohol (200 Volumteile), n-Butanol (100 Volumteile), 1 n-Salzsäure (6 Volumteile), Wasser(200 Volumteile) und bei 19° gesättigter, wäßriger Natriumchloridlösung (60 Volumteile). Die ersten zwei Einheiten enthalten lediglich Lösungsmittel. In den folgenden drei Einheiten werden je 2 g Substanz eingetragen und hierauf 115mal bei 19° verteilt. Die Zahl der Schüttelbewegungen pro Verteilung beträgt dreißig, die Zeitdauer der Ruhepausen 15 Minuten.6 g of the ferrimycin preparation obtained, which, based on the lyophilized culture filtrate, has an approximately 1000-fold antibiotic activity and contains both ferrimycin A and ferrimycin B, is distributed countercurrently over 115 levels according to Craig. The apparatus consists of 120 units. It is charged per unit with 100 cm ³ upper and 100 cm ³ lower phase of a mixture equilibrated at 19 ° of benzyl alcohol (200 parts by volume), n-butanol (100 parts by volume), 1N hydrochloric acid (6 parts by volume), water (200 parts by volume ) and at 19 ° saturated, aqueous sodium chloride solution (60 parts by volume). The first two units contain only solvent. In each of the following three units, 2 g of substance are entered and then distributed 115 times at 19 °. The number of shaking movements per distribution is thirty, the duration of the pauses is 15 minutes.

Nach beendigter Verteilung werden die erhaltenen 118 Fraktionen bei —10° aufgehoben. Aus jeder dritten Fraktion entnimmt man zum Zwecke der Testierung 10 cm³ oberer und 10 cm³ unterer Phase und schüttelt diese mit 50 cm³ Petroläther. Die abgetrennte wäßrige Phase (10 cm³), die nun das gesamte hydrophile Material enthält, wird durch kurzes Evakuieren von noch anhaftenden organischen Lösungsmitteln befreit. Die so gewonnenen Testlösungen dienen einerseits zur kolorimetrischen Auswertung (Extinktion bei 425 ηιμ in 1-cm-Kuvetten [vgl. Fig. 6, Kurve I]) und für die Ninhydrinfarbreaktion. Für die Ausführung der letzteren werden 0,5 cm³ Testlösung und 0,5 cm⁸ Ninhydrinreagens, zubereitet nach Vorschrift von S. Moore und W. H. Stein, J. Biol. Chem., 211, S. 907 (1954), gemischt, 15 Minuten auf 100° erhitzt, mit 5 cm³ Alkohol—Wasser (1: 1) verdünnt und hierauf im Spektrophotometer bei 570 ηιμ gemessen (Kurve 2). Für die biologische Testierung werden die Testlösungen 1: 50 verdünnt. In Kurve 3 sind die im Plattendiffusionstest in bezug auf einen willkürlichen Standard erhaltenen in-vitro-Aktivitäten gegen Staphylococcus aureus aufgeführt. Die aktiven Fraktionen 40 bis 70 enthalten, wie sich papierchromatographisch zeigen läßt, Ferrimycin A, während sich das Ferrimycin B in den Fraktionen 75 bis 100 befindet. Es kann eine wesentliche Anreicherung erreicht werden. Die antibiotisch aktiven Fraktionen 25 bis 39,40 bis 48, 49 bis 55, 56 bis 70 und 71 bis 95 werden vereinigt und mit dem gleichen Volumen Petroläther geschüttelt. Die rotgefärbten Inhaltsstoffe werden dabei in die wäßrigen Phasen getrieben. Aus diesen werden sie in der in Beispiel 12 geschilderten Weise mit Phenol— Chloroform isoliert. Die dabei erhaltenen Mengen sowie die in Bezug auf das Ausgangsmaterial erzielten Anreicherungen und Ausbeuten an antibiotischer Aktivität sind nachfolgend tabellarisch zusammengestellt. When the distribution is complete, the 118 fractions obtained are stored at -10 °. For the purpose of testing, 10 cm ^{3 of the} upper and 10 cm ^{3 of the} lower phase are removed from every third fraction and these are shaken with 50 cm ^{3 of} petroleum ether. The separated aqueous phase (10 cm ³ ), which now contains all of the hydrophilic material, is freed from any organic solvents still adhering to it by brief evacuation. The test solutions obtained in this way are used, on the one hand, for colorimetric evaluation (extinction at 425 μm in 1 cm cuvettes [see FIG. 6, curve I]) and for the ninhydrin color reaction. To carry out the latter, 0.5 cm ^{3 of} test solution and 0.5 cm ^{8 of} ninhydrin reagent, prepared according to the instructions of S. Moore and WH Stein, J. Biol. Chem., 211, p. 907 (1954), mixed, 15 Heated to 100 ° for minutes, ^{diluted with 5 cm 3 of} alcohol-water (1: 1) and then measured in a spectrophotometer at 570 μm (curve 2). For biological testing, the test solutions are diluted 1:50. Curve 3 shows the in vitro activities against Staphylococcus aureus obtained in the plate diffusion test with respect to an arbitrary standard. The active fractions 40 to 70 contain, as can be shown by paper chromatography, ferrimycin A, while the ferrimycin B is in fractions 75 to 100. A substantial enrichment can be achieved. The antibiotically active fractions 25 to 39, 40 to 48, 49 to 55, 56 to 70 and 71 to 95 are combined and shaken with the same volume of petroleum ether. The red colored ingredients are driven into the aqueous phases. They are isolated from these in the manner described in Example 12 using phenol-chloroform. The amounts obtained and the concentrations and yields of antibiotic activity achieved in relation to the starting material are tabulated below.

Fraktionfraction Menge
in mglot
in mg An
reicherungs-
faktorAt
enriching
factor Aktivitäts
ausbeuteActivity
yield Ferri
mycinFerri
mycin ,₀ 25 bis 39
40 bis 48
49 bis 55
56 bis 70
71 bis 95, ₀ 25 to 39
40 to 48
49 to 55
56 to 70
71 to 95 492
254
211
257
938492
254
211
257
938 0,55
4,77
9,22
3,49
1,720.55
4.77
9.22
3.49
1.72 4,6%
20,4%
32,8%
15,1%
27,2%4.6%
20.4%
32.8%
15.1%
27.2% A
BA.
B.

2 g des erhaltenen Ferrimycin-A-Präparates (Fraktionen 49 bis 55), das, bezogen auf das lyophilisierte Kulturfiltrat, eine etwa 9000fache antibiotische Wirksamkeit besitzt, werden an einer 70 cm · 7,14-cm³-Säule eines stark sauren Ionenaustauschers »Dowex 50 WX₂« (100/200 mesh) chromatographiert. Der Ionenaustauscher wird vorgängig nach Vorschrift von Hirs et al., J. Biol. Chem., 219, S. 623 (1956), gereinigt und nach Überführung in die Ammoniumform während 3 Tagen mit 0,2molarem Ammoniumacetatpuffer von pH 4,50 bei 17° bei einer Durchlauf geschwindigkeit von 100 cm³ pro Stunde äquilibriert. Hierauf wird die Substanz in 20 cm³ Pufferlösung gelöst, vorsichtig auf die Säule aufgetragen und anschließend mit derselben Pufferlösung und Durchlaufgeschwindigkeit eluiert. Nach einer Elutionsdauer von 20 Stunden wird auf Gradientelution umgestellt. Dabei wird der in die Säule eintretende 0,2molare Ammoniumacetatpuffer in einer 1-1-Mischkammer durch einen gleich großen Zufluß von 2molarem Ammoniumacetatpuffer von pH 4,50 kontinuierlich aufkonzentriert und damit in seiner Elutionswirkung kontinuierlich verstärkt. Das Eluat wird in Fraktionen zu 40 cm³ auf einem automatischen Fraktionensammler aufgefangen. Die Auswertung des Chromatogramms erfolgt durch Extinktionsmessung bei 425 ΐημ, Papierchromatographie und biologische Testierung. Die gemäß dieser Auswertung zusammengefaßten Fraktionen werden in der geschilderten Weise mit Phenol—Chloroform aufgearbeitet. Aus den Fraktionen 195 bis 216 erhält man 44 mg FerrimycinA, das in bezug auf das lyophilisierte Kulturfiltrat eine etwa 1600Ofache antibiotische Aktivität aufweist, als braunrotes Pulver.2 g of the ferrimycin A preparation obtained (fractions 49 to 55), which, based on the lyophilized culture filtrate, has an antibiotic activity that is about 9000 times higher, are placed on a 70 cm x 7.14 cm ³ column of a strongly acidic ion exchanger » Dowex 50 WX ₂ "(100/200 mesh) chromatographed. The ion exchanger is cleaned beforehand according to the instructions of Hirs et al., J. Biol. Chem., 219, p. 623 (1956), and after conversion into the ammonium form for 3 days with 0.2 molar ammonium acetate buffer of pH 4.50 at 17 ° equilibrated at a flow rate of 100 cm ³ per hour. The substance is then dissolved in 20 cm ^{3 of} buffer solution, carefully applied to the column and then eluted with the same buffer solution and flow rate. After an elution period of 20 hours, the system is switched to gradient elution. The 0.2 molar ammonium acetate buffer entering the column is continuously concentrated in a 1-1 mixing chamber by an equally large inflow of 2 molar ammonium acetate buffer at pH 4.50 and its elution effect is continuously increased. The eluate is collected in fractions of 40 cm ³ on an automatic fraction collector. The chromatogram is evaluated by measuring the extinction at 425 ΐημ, paper chromatography and biological testing. The fractions combined according to this evaluation are worked up in the manner described with phenol-chloroform. From fractions 195 to 216, 44 mg of ferrimycin A are obtained, which has an antibiotic activity that is about 16,000 times greater than that of the lyophilized culture filtrate, as a brown-red powder.

MikroanalyseMicroanalysis

C 48,65%, H 7,09%, N 12,95%, Fe 4,5(Γ%, Cl 6,10%, (C)CH₃ 1,99% (Roth—Kulm), Amino-N 2,33% (Van Slyke).C 48.65%, H 7.09%, N 12.95%, Fe 4.5 (Γ%, Cl 6.10%, (C) CH ₃ 1.99% (Roth-Kulm), amino-N 2.33% (Van Slyke).

TitrationTitration

pK&cs (HeIv., 37, S. 1872 [1954]): 4,18; 7,88 Äquivalentgewicht: 1106pK & cs (HeIv., 37, p. 1872 [1954]): 4.18; 7.88 Equivalent weight: 1106

AbsorptionsspektrumAbsorption spectrum

λη,α,χ 228ηιμ, Eil 282
Amas 219 ΐημ, E il 28,2
Xmax 425 ΐημ, E il 22,6 λη, α, χ 228ηιμ, Eil 282
Amas 219 ΐημ, E il 28.2
Xmax 425 ΐημ, E il 22.6

»Reduktionswert« nach C. S. Hanes, Biochem. J., 23, S. 99 (1929)"Reduction value" according to C. S. Hanes, Biochem. J., 23, p. 99 (1929)

1,7 cm³ Vioo n-Natriumthiosulfat1.7 cm ^{3 of} Vioo n sodium thiosulfate

Gebundenes Hydroxylamin nach T. Emery und _ao J. B. Neilands, Nature, 184, S. 1632 (1959)Bound hydroxylamine according to T. Emery and _ao JB Neilands, Nature, 184, p. 1632 (1959)

0,83 Mol NH₂OH pro Atom Fe.0.83 moles of NH ₂ OH per atom of Fe.

400 mg so erhaltenes Ferrimycin A werden an einer mit 830 g Whatman Cellulosepulver trocken gestopften as Säule (87 cm · 23,8 cm²) chromatographiert. Zur Vorbereitung des Chromatogramms werden vorerst im Verlauf von 70 Stunden 5,3 1 Methanol-Wasser-gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung-(5 : 2: 3)-Gemisch und anschließend innerhalb 70 Stunden 3 1 der organischen Phase eines Gemisches von tert.-Butanol—0,02 n-Salzsäure—gesättigte Natriumchloridlösung (2: 1: 1) durch die Säule durchlaufen gelassen. Anschließend äquilibriert man die Säule während 6 Tagen bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 30 ml/Std. mit der als Fließmittel dienenden organischen Phase eines Gemisches von tert-Butanol—0,001 η-Salzsäure—gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung (2:1: 1). Die Substanz verreibt man im Mörser mit 5 g gewaschenem Cellulosepulver und 30 ml Fließmittel zu einem homogenen Brei, den man auf die Säule aufträgt. Im Verlauf des Chromatogramms (75 Stunden) entwickeln sich drei gefärbte Zonen. Kurz vor Austritt der ersten Zone beginnt man das Eluat in Fraktionen zu 10 ml im automatischen Fraktionensammler aufzufangen. Vorzone: Fraktion Nr. 20bis 37; Hauptzone: FraktionNr. 38bis 65; Nachzone: Fraktion Nr. 75 bis 95. Die vereinigten Eluatfraktionen werden mit 10 Volumprozent Wasser und dem gleichen Volumen Äther geschüttelt. Aus den wäßrigen Phasen extrahiert man die tiefrotgefärbten Inhaltsstoffe mit Phenol—Chloroform (1: 1), wäscht die Extrakte ausgiebig mit 10% Kochsalz enthaltender 0,01 η-Salzsäure, trocknet die Extrakte durch Passage über Celite und fällt die Inhaltsstoffe aus den trockenen Extrakten durch Zugabe von Äther—Petroläther unter gutem Rühren und bei tiefer Temperatur auf »Hyflo Supercel«. Die auf das »Hyflo Supercel« aufgefällten Substanzen werden ausgiebig mit Äther durch Rühren und Abnutschen gewaschen und hierauf mit wenig Methanol eluiert. Die methanolischen Lösungen engt man am Vakuum schonend zur Trockne ein. Aus der Vorzone (20 bis 37) erhält man derart 37 mg eines Gemisches von Ferrimycin A₁ und eines inaktiven Nebenproduktes, aus der Hauptzone (38 bis 65) 291 mg reines Ferrimycin Aj-Dihydrochlorid und aus der Nachzone 5 mg reines Ferrimycin A_a-Dihydrochlorid in Form braunroter Pulver. Zur Analyse wird während 50 Stunden bei 25°/0,001 Torr über Phosphorpentoxyd—Kaliumhydroxyd getrocknet. Die ermittelten Daten sind nachfolgend tabellarisch zusammengestellt.400 mg of ferrimycin A obtained in this way are chromatographed on a column (87 cm × 23.8 cm ² ) packed dry with 830 g of Whatman cellulose powder. To prepare the chromatogram, first 5.3 liters of methanol-water-saturated aqueous sodium chloride solution (5: 2: 3) mixture are added over the course of 70 hours and then 3 liters of the organic phase of a mixture of tert-butanol over the course of 70 hours. Pass 0.02 N hydrochloric acid saturated sodium chloride solution (2: 1: 1) through the column. The column is then equilibrated for 6 days at a flow rate of 30 ml / hour. aqueous sodium chloride solution (2: 1: 1) saturated with the organic phase of a mixture of tert-butanol — 0.001 η-hydrochloric acid — serving as a mobile phase. The substance is rubbed in a mortar with 5 g of washed cellulose powder and 30 ml of superplasticizer to form a homogeneous paste, which is applied to the column. Three colored zones develop over the course of the chromatogram (75 hours). Shortly before the exit of the first zone, the eluate begins to be collected in fractions of 10 ml in the automatic fraction collector. Prezone: Fraction No. 20 to 37; Main zone: parliamentary group no. 38 to 65; Post zone: Fraction No. 75 to 95. The combined eluate fractions are shaken with 10 percent by volume of water and the same volume of ether. The deep red-colored ingredients are extracted from the aqueous phases with phenol-chloroform (1: 1), the extracts are washed extensively with 0.01 η-hydrochloric acid containing 10% sodium chloride, the extracts are dried by passage over Celite and the ingredients are precipitated from the dry extracts by adding ether-petroleum ether with thorough stirring and at low temperature to "Hyflo Supercel". The substances precipitated on the "Hyflo Supercel" are washed extensively with ether by stirring and suction filtration and then eluted with a little methanol. The methanolic solutions are gently concentrated to dryness in a vacuum. _{37 mg of a mixture of ferrimycin A 1} and an inactive by-product are obtained from the pre-zone (20 to 37), 291 mg of pure ferrimycin Aj dihydrochloride from the main zone (38 to 65) and 5 mg of pure ferrimycin A _a - from the post-zone Dihydrochloride in the form of a brown-red powder. For analysis, it is dried over phosphorus pentoxide-potassium hydroxide at 25 ° / 0.001 torr for 50 hours. The data determined are summarized in the following table.

Ferrimycin Aj.-Dihydrochlorid MikroanalyseFerrimycin Aj. dihydrochloride Microanalysis

C 46,70%, 46,44%C 46.70%, 46.44%

H 6,79%, 6,77%H 6.79%, 6.77%

N 12,73%, 12,80%N 12.73%, 12.80%

Fe 5,27%, 5,34%Fe 5.27%, 5.34%

Cl 6,43%, 6,31%Cl 6.43%, 6.31%

(C)CH₃ 1,95%, 2,15%(C) CH ₃ 1.95%, 2.15%

TitrationTitration (HeJv.,(HeJv., 37, S.37, p. 1872 [1954])1872 [1954]) Äquivalent
gewichtequivalent to
weight PKi₁CPKi ₁ C 11291129 a)
b)
c) ~a)
b)
c) ~ 4,11
7,92
-11,44.11
7.92
-11.4

UV-Absorption (H₂O)UV absorption (H ₂ O)

l_max 229m[i, Eil 317
λτηαχ 319 πιμ, E ü 28,3
λνιαχ 430 ΐημ, Ε if» 26,4 l _m ax 229m [i, Eil 317
λτηαχ 319 πιμ, E ü 28.3
λνιαχ 430 ΐημ, Ε if »26.4

IR-Apsorption (KBr)
Vergleiche Fig. 7IR absorption (KBr)
Compare FIG. 7

Craigsche VerteilungCraig distribution

Verteilungskoeffizient bei 25° im System n-Butanol—Benzylalkohol—0,001 n-HCl—gesättigte wäßrige NaCl-Lösung (10:5:15:3) 0,372Partition coefficient at 25 ° in the n-butanol — benzyl alcohol system — 0.001 n-HCl — saturated aqueous NaCl solution (10: 5: 15: 3) 0.372

PapierchromatographiePaper chromatography

Rf-Wert im System tert.-Butanol—0,004 n-HCl— gesättigte wäßrige NaCl-Lösung (2:1:1); Whatman Nr. 1-Papier imprägniert mit Aceton— H_aO—gesättigte wäßrige NaCl-Legierung (6:3:1) 0,59Rf value in the system tert-butanol — 0.004 n-HCl — saturated aqueous NaCl solution (2: 1: 1); Whatman No. 1 paper impregnated with acetone _{— H a} O — saturated aqueous NaCl alloy (6: 3: 1) 0.59

Ferrimycin A₂-DihydrochloridFerrimycin A ₂ dihydrochloride

C 45,78%C 45.78%

H H

N N

Fe Fe

α α

(QCH₃ (QCH ₃

12,75% 5,29% 6,237ο 2,16 V₀ 12.75% 5.29% 6.237ο 2.16 V ₀

TitrationTitration (HeIv.,(HeIv., 37, S.37, p. >> 1872 [1954])1872 [1954]) Äquivalent
gewichtequivalent to
weight PK^_£ PK ^ _£ ί 1086ί 1086 a)
b)
c) ~a)
b)
c) ~ 4,04
7,91
-11,54.04
7.91
-11.5

UV-Apsorption (H₂O)UV absorption (H ₂ O)

Imax 231 ηιμ, Ε i?„ 328 Imax 231 ηιμ, Ε i? "328

Xuax 319 ηιμ, E }1 30 Xuax 319 ηιμ, E} 1 30

Xmax 435 ηιμ, E ü 26,2 Xmax 435 ηιμ, E ü 26.2

IR-ApsorptionIR absorption

Vergleiche Fig. 8Compare FIG. 8

Craigsche VerteilungCraig distribution

Verteilungskoeffizient bei 25° im System n-Butanol—Benzylalkohol—0,001 n-HCl—gesättigte wäßrige NaCl-Lösung (10: 5:15: 3) 0,175Partition coefficient at 25 ° in the n-butanol — benzyl alcohol system — 0.001 n-HCl — saturated aqueous NaCl solution (10: 5:15: 3) 0.175

PapierchromatographiePaper chromatography

Rf-Wert im System tert.-Butanol—0,004 n-HCl— gesättigte wäßrige NaCl-Lösung (2:1:1); Whatman Nr. 1-Papier imprägniert mit Aceton— H₂O-gesättigte wäßrige NaCl-Lösung (6:3:1) 0,47Rf value in the system tert-butanol — 0.004 n-HCl — saturated aqueous NaCl solution (2: 1: 1); Whatman No. 1 paper impregnated with acetone-H ₂ O-saturated aqueous NaCl solution (6: 3: 1) 0.47

IO Die Dihydrochloride der reinen Ferrimycine A₁ und A₂ besitzen bezüglich des lyophilisierten Kulturfiltrates eine etwa 20000fache antibiotische Aktivität. IO The dihydrochlorides of the pure ferrimycins A ₁ and A ₂ have an antibiotic activity about 20,000 times that of the lyophilized culture filtrate.

Claims (1)

PATENTANSPRUCH:PATENT CLAIM: Die Verwendung von Streptomyces lavendulae A 21510 zur Herstellung des Antibiotikums Ferrimycin bzw. seiner Komponenten durch übliche biologische Züchtung, Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat, Reindarstellung und Herstellung von dessen Salzen.The use of Streptomyces lavendulae A 21510 for the production of the antibiotic ferrimycin or its components by conventional biological breeding, extraction of the antibiotic from the culture filtrate, pure preparation and production of its salts. In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Auslegeschrift Nr. 1 058 216.Considered publications:
German interpretation document No. 1 058 216. Hierzu 3 Blatt ZeichnungenIn addition 3 sheets of drawings © 309 749/371 11.63© 309 749/371 11.63