DE1089122B - Manufacture of pilosomycin - Google Patents

Description

DEUTSCHESGERMAN

Im Patent 1 058 216 ist ein neues wasserlösliches Antibiotikum, A 9578, beschrieben, das durch Züchtung des Actinomycetenstammes S.griseoflavusA9578 oder seiner Mutanten erhalten wird.A new water-soluble antibiotic, A 9578, is described in patent 1,058,216, which is produced by cultivation of the actinomycete strain S.griseoflavus A9578 or its mutants.

Ks wurde nun gefunden, daß man das gleiche Antibiotikum, das wir nunmehr Pilosomycin nennen, und seine Komponenten auch erhält, wenn man einen Stamm S. galilaeus n. sp. NRRL 2722 züchtet. Dieser Stamm wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung A18 822 aufbewahrt. It has now been found that one can use the same antibiotic that we now call pilosomycin, and its components are also preserved if a strain of S. galilaeus n. sp. NRRL 2722 breeds. This Strain is produced in our laboratories and in the Swiss Federal Institute of Technology, Institute for Special Botany, Zurich, kept under the name A18 822.

Streptomyces galilaeus n. sp. NRRL 2722 gehört einer neuen Art der Gattung Streptomyces an, die mit keiner der in Bergeys »Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage (1957), aufgeführten Arten identisch ist.Streptomyces galilaeus n. Sp. NRRL 2722 belongs to a new species in the genus Streptomyces that is associated with none of the species listed in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th edition (1957) is identical.

Der Organismus weist folgende Charakteristika auf: Die Sporen sind glatt; das Luftmycel ist aschgrau; die Sporenketten bilden offene regelmäßige Spiralen, sie sind monopodial verzweigt, mit langer gerader Hauptachse; auf pep tonhaltigen Nährböden tritt eine melanoide Verfärbung auf. Das Wachstum ist relativ wenig temperaturabhängig; sowohl bei 18 als auch bei 40° C entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32° C.The organism has the following characteristics: The spores are smooth; the aerial mycelium is ash gray; the spore chains form open, regular spirals, they are monopodially branched, with a long one straight main axis; A melanoid discoloration occurs on pep clay-containing nutrient media. The growth is relatively little temperature dependent; Both at 18 and 40 ° C the fungus develops well, but the optimum is between 25 and 32 ° C.

Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von S. galilaeus n. sp. NRRL 2722 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 7 sowie 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S. 361 (1952), hergestellt.For further characterization, the growth of S. galilaeus n. Sp. NRRL 2722 various nutrient media described. The nutrient media 1 to 7 and 10 were according to W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, p. 361 (1952).

1. Synthetischer Agar1. Synthetic agar

Wachstum punktförmig, hellgelb-rot; Luftmycel fehlt; Substrat wenig blaßkarmin.Growth point-like, light yellow-red; Aerial mycelium is absent; Substrate little pale carmine.

2. Synthetische Lösung2. Synthetic solution

Feine Trübung, Substrat hellgelb-rot.Fine cloudiness, substrate light yellow-red.

3. Glukose-Agar3. Glucose agar

Wachstum pustelig, hellgelb bis blaßkarmin; Luftmycel staubig bis sammetig, aschgrau.Growth pustular, light yellow to pale carmine; Aerial mycelium dusty to velvety, ash gray.

4. Glukose-Asparagin-Agar4. Glucose asparagine agar

Wachstum spärlich, pustelig, hellgelb bis hellgelbrot; Luftmycel staubig, schneeweiß. Growth sparse, pimple, light yellow to light yellow-red; Aerial mycelium dusty, snow-white.

5. Calciummalat-Agar5. Calcium malate agar

Wachstum pustelig, rötlichbraun bis kupferrot,Pustular growth, reddish-brown to copper-red,

6. Gelatinestich (18° C)6. Gelatin prick (18 ° C)

Flockiges Grundwachstum, hellgelb; Substrat wenig dunkelbraun verfärbt; Verflüssigung nach 30 Tagen 0,5 cm.Flaky basic growth, light yellow; Substrate slightly discolored dark brown; Liquefaction after 30 days 0.5 cm.

7. Stärkeplatte7. Thickness plate

Wachstum pustelig, karminrot; Hydrolyse nach 3 Tagen 0,2 cm, nach 7 Tagen 0,5 cm.Pustular, carmine-red growth; Hydrolysis after 3 days 0.2 cm, after 7 days 0.5 cm.

8. Kartoffeln8. Potatoes

Wachstum spärlich, punktförmig, hellgelbrot.Growth sparse, punctiform, light yellow-red.

Herstellung von PilosomycinManufacture of pilosomycin

Anmelder: CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)Applicant: CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Switzerland)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10Representative: Dipl.-Ing. E. Splanemann, patent attorney, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität: Schweiz vom 17. Juli 1958Claimed priority: Switzerland of July 17, 1958

Dr. Ernst Gäumann, Zürich,Dr. Ernst Gäumann, Zurich,

Dr. Hans Bickel, Binningen, Basell.,Dr. Hans Bickel, Binningen, Basell.,

und Dr. Ernst Vischer, Basel (Schweiz),and Dr. Ernst Vischer, Basel (Switzerland),

sind als Erfinder genannt wordenhave been named as inventors

9. Karotten9. Carrots

Kein Wachstum.
10. LackmusmilchNo growth.
10. Litmus milk

Wachstum als pustelige Pellikula, grünlichgrau bis hellbraun; keine Peptonisierung und teilweise Koagulation; Lackmus blau oder entfärbt. S. galilaeus n.sp. NRRL 2722 zeigt nach dem System von. Ettlinger et d., Arch. Mikrobiol., 31, S. 326 bis 358 (1958), gewisse Ähnlichkeiten mit S. hygroscopicus (Jensen) Waksman et Henri ei, S. aureofaciens Duggar und S. parvulus Waksman et Gregory, welche ebenfalls glatte Sporen, aschgraues Luftmycel und Sporenketten in Spiralen besitzen. Alle drei Arten unterscheiden sich aber von S. galilaeus dadurch, daß sie keine schwarzbraune, melanoide Verfärbung peptonhaltiger Nährböden zeigen. Des weiteren ist S. hygroscopicus verschieden durch die geschlossenen Spiralen, S. aureofaciens durch die offenen, unregelmäßigen Spiralen und schließlich S. parvulus durch die kurze gerade Hauptachse der Sporenketten. Growth as pustular pellicle, greenish-gray to light brown; no peptonization and partial Coagulation; Litmus blue or discolored. S. galilaeus n.sp. NRRL 2722 shows according to the system from. Ettlinger et d., Arch. Mikrobiol., 31, pp. 326 to 358 (1958), certain similarities with S. hygroscopicus (Jensen) Waksman et Henri ei, S. aureofaciens Duggar and S. parvulus Waksman et Gregory, which also have smooth spores, ash gray Have aerial mycelium and spore chains in spirals. However, all three species differ from S. galilaeus in that they show no black-brown, melanoid discoloration of peptone-containing nutrient media. Of furthermore S. hygroscopicus is different by the closed spirals, S. aureofaciens by the open, irregular spirals and finally S. parvulus through the short straight main axis of the spore chains.

Nach dem System von Waksman in Bergeys Manual, 7. Auflage, steht S. galilaeus n. sp. folgenden Arten am nächsten: S. californicus, S.bobiliae, S. aurantiacus, S. erythraeus und S. novaecaesareae. Diese unterscheiden sich vor allem in folgender Hinsicht von S. galilaeus:
Streptomyces californicusAccording to the system of Waksman in Bergeys Manual, 7th edition, S. galilaeus n. Sp. closest to the following species: S. californicus, S.bobiliae, S. aurantiacus, S. erythraeus and S. novaecaesareae. These differ from S. galilaeus mainly in the following ways:
Streptomyces californicus

Bildet kein lösliches Pigment auf Gelatine; Wachstum auf synthetischem Agar weinrot, kein lösliches Pigment; Peptonisierung von Lackmusmilch; Wachstum auf Kartoffeln rotbraun.Does not form soluble pigment on gelatin; growth Wine red on synthetic agar, no soluble pigment; Peptonization of litmus milk; Growth reddish brown on potatoes.

009 607/362009 607/362

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Streptomyces bobiliae Zur Isolierung des Antibiotikums Pilosomycin kön-Rasche Gelatineverflüssigung; Wachstum auf syn- nen z. B. folgende Verfahren dienen: Man trennt das thetischem Agar korallenrot bis dunkelrot; keine Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge Koagulation von Lackmusmilch, dafür aber Pepto- des Antibiotikums' im Kulturfiltrat gefunden wird. Es nisierung. . \ 5 bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Anti-Streptomyces aurantiacus biotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteil-Schwache Peptonisierung, aber keine Koagulation haft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich von Lackmusmilch; lösliches braunes Pigment auf Wasser und wäßrige organische Lösungsmittel, wie Kartoffeln. Alkohole, z. B. wäßriges Methanol.
Streptomyces erythraeus io Um das Antibiotikum dem Kulturfiltrat zu entWachstum auf synthetischem Agar weiß bis hell- ziehen und zu reinigen, sind verschiedene Methoden gelb; Kolonien auf Stärke-Agar cremefarben mit geeignet, die einzeln oder in Kombination miteinander grünlichem Stich; Wachstum auf Glukose-Agar angewandt werden können. Es hat sich als vorteilhaft cremefarben bis braun; Peptonisierung von Lack- erwiesen, die Kulturlösung während dieser Operatiomusmilch; Wachstum auf Kartoffeln hellgelb. 15 nen auf einem p_H zwischen 3 und 5 zu halten.
Streptomycesnovaecaesareae 1. Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z.B. Wachstum auf synthetischem Agar grau bis bläu- Aktivkohlen, wie Norit, aktivierte Erden, wie Fullerlich, gefurcht, Luftmycel weiß; Wachstum auf erde oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Kartoffeln cremefarben bis gelblich, gefurcht; auf Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmäßig mit Gelatine Oberflächenwachstum, kleine Kolonien, 20 Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen Peptonisierung von Lackmusmilch. Lösungsmitteln mit Wasser oder wäßrigen Säuren, Streptomyces galilaeus n. sp. NRRL 2722 zeigt, z. B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridin-, vernach der Methodik von T. G. Pridham und D. Gott- dünnten Essigsäure-Methanol- oder Wasser-Methanollieb, J. Bacteriology, 56, S. 107 (1948), untersucht, Eisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteilhaft bei Verwendung der folgenden Kohlenstoffquellen 25 für die Elution eines Noritadsorbates hat sich das gutes Wachstum: L-Xylose, L-Arabinose, L-Rhamnose, Gemisch von Wasser (2 Volumteile), Methanol (1 Vo-Saccharose, Raffinose, Inulin, D-Mannit, D-Sorbit, lumteil), Eisessig (1 Volumteil) und Butanol (2Vo-Mesoinosit, Salicin, D-Fruktose. lumteile) erwiesen.Streptomyces bobiliae For the isolation of the antibiotic pilosomycin, rapid gelatin liquefaction; Growth on syn- ne z. B. serve the following procedures: The thetic agar is separated from coral red to dark red; no mycelium from the culture filtrate, after which the main amount of coagulation of litmus milk, but pepto of the antibiotic, is found in the culture filtrate. It nization. . However, significant amounts of the anti-Streptomyces aurantiacus biotikums remain adsorbed on the mycelium. It is therefore advantageous, weak peptonization, but no coagulation, to wash out the latter well. Litmus milk is suitable for this; soluble brown pigment on water and aqueous organic solvents such as potatoes. Alcohols e.g. B. aqueous methanol.
Streptomyces erythraeus io In order to remove the antibiotic from the culture filtrate and to purify it from white to light-colored growth on synthetic agar, various methods are yellow; Colonies on starch agar are cream-colored with a suitable greenish tinge, either individually or in combination with one another; Growth on glucose agar can be applied. It has been found to be beneficial from cream to brown; Peptonization of lacquer has been shown to be the culture solution during this operation milk; Growth on potatoes light yellow. 15 nen on a p _H between 3 and 5 hold.
Streptomycesnovaecaesareae 1. Adsorbents can be used, for example growth on synthetic agar gray to blue- activated charcoal, such as Norit, activated earth, such as Fullerlich, furrowed, aerial mycelium white; Growth on earth or floridine, or resin adsorbers such as Asmit. Potatoes cream-colored to yellowish, furrowed; The elution of the adsorbates is expediently carried out with gelatin surface growth, small colonies, mixtures of water-miscible organic peptonization of litmus milk. Solvents with water or aqueous acids, Streptomyces galilaeus n. Sp. NRRL 2722 shows e.g. B. with water-methanol, water-pyridine, neglect the methodology of TG Pridham and D. Gott-thin acetic acid-methanol or water-methanollieb, J. Bacteriology, 56, p. 107 (1948), examined, glacial acetic acid -Butanol mixtures. The good growth has proven to be particularly advantageous when using the following carbon sources 25 for the elution of a noritol adsorbate: L-xylose, L-arabinose, L-rhamnose, mixture of water (2 parts by volume), methanol (1% by volume sucrose, raffinose, inulin , D-mannitol, D-sorbitol, lumteil), glacial acetic acid (1 volume part) and butanol (2Vo-meso-inositol, salicin, D-fructose, lumteil).

Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung 2. Eine zweite Methode zur Abtrennung des Anti-The present invention is what the manufacture 2. A second method for separating the anti-

des Antibiotikums Pilosomycin anbelangt, nicht auf 3° biotikums aus dem Kulturfiltrat besteht darin, daßAs far as the antibiotic pilosomycin is concerned, not to 3 ° biotic from the culture filtrate is that

die Verwendung des Streptomyces galilaeus n. sp. man das Antibiotikum an Kationenaustauschern ad-the use of Streptomyces galilaeus n. sp. the antibiotic is added to cation exchangers

NRRL 2722 oder anderer der Beschreibung ent- sorbiert, wobei besonders Säuregruppen enthaltendeNRRL 2722 or others of the description desorbed, especially those containing acid groups

sprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch Harze, wie Amberlite IRC-50, geeignet sind. Letzteresspeaking strains, but also includes resins such as Amberlite IRC-50, which are suitable. The latter

die Verwendung von Varianten dieser Organismen, kann sowohl in der Säureform als auch in der Na-the use of variants of these organisms, both in the acid form and in the Na-

wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, 35 triumform verwendet werden, doch hat sich ein Ge-how they z. B. by selection or mutation, 35 triumform can be used, but a genus has

insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- misch dieser beiden Formen im Volumenverhältnis 1:2especially under the action of ultraviolet mixing of these two forms in a volume ratio of 1: 2

oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen besonders bewährt. Die Elution geschieht zweckmäßigor X-rays or nitrogen mustard oils. The elution is expedient

gewonnen werden. mit verdünnten Säuren, z. B. mit methanolischer SaIz-be won. with dilute acids, e.g. B. with methanolic salt

Zur Erzeugung des Antibiotikums Pilosomycin säure.For the production of the antibiotic pilosomycin acid.

wird ein der obigen Beschreibung entsprechender 40 3. Weiter kann das basische Antibiotikum auch di-is one of the above description corresponding 40 3. Furthermore, the basic antibiotic can also di-

Streptomycetenstamm in wäßriger, eine Kohlenstoff- rekt aus dem Kulturfiltrat ausgefällt werden, z. B.Streptomycetenstamm be precipitated in aqueous, a carbon rect from the culture filtrate, z. B.

und Stickstoff quelle und gegebenenfalls Wachstums- mittels Umsetzung mit einer organischen Säure vomand nitrogen source and optionally growth means reaction with an organic acid from

fördernde Stoffe enthaltender Nährlösung aerob ge- Typus der Pikrinsäure. Durch Behandlung dieser Fäl-Aerobic nutrient solution containing promoting substances. Picric acid type. By treating these cases

züchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wir- lungen mit Salzen organischer Basen, z. B. mit Tri-breeds until it has a substantial antibacterial effect with salts of organic bases, e.g. B. with tri-

kung zeigt, und das Antibiotikum Pilosomycin hier- 45 äthylammoniumsulfat, oder mit vedünnten Säurenand the antibiotic pilosomycin here- 45 ethylammonium sulfate, or with diluted acids

auf isoliert. wird das Antibiotikum in Form des entsprechendenon isolated. will the antibiotic in the form of the appropriate

Als Kohlenstoffquelle kommen z. B. assimilierbare Salzes erhalten. Man kann dabei sowohl in wäßrigemAs a carbon source z. B. obtained assimilable salt. You can do this both in aqueous

Kohlenhydrate, wie Glukose, Saccharose, Laktose, Medium als auch in einem mit Wasser mischbarenCarbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, medium as well as in a water-miscible medium

Mannit, Stärke sowie Glycerin, in Frage. Als stick- Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, arbeiten,Mannitol, starch and glycerin are in question. As a stick solvent, such as methanol or acetone, work

stoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls Wachstums- 50 Diese Überführung der schwerlöslichen Salze inSubstance-containing nutrients and possibly growth 50 This conversion of the poorly soluble salts into

fördernde Stoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide leichtlösliche Salze des Antibiotikums wird entwederpromoting substances are mentioned: amino acids, peptides easily soluble salts of the antibiotic is either

und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Pepton mit Mineralsäuren oder an Ionenaustauscherharzen,and proteins and their breakdown products, such as peptone with mineral acids or on ion exchange resins,

oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche ζ B. an Amberlite IRA-400, durchgeführt.or tryptone, also meat extracts, water-soluble ζ B. on Amberlite IRA-400 carried out.

Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, 4. Eine Anreicherung des Antibiotikums wird auchProportions of cereal grains, such as corn and wheat, 4. A fortification of the antibiotic is also used

von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, 55 dadurch erreicht, daß man wäßrige oder alkoholisch-of distillation residues from alcohol production, 55 achieved by using aqueous or alcoholic

von Hefe, Bohnen, insbesondere der Soyapflanze, von wäßrige Lösungen des Salzes mit einem Überschußof yeast, beans, especially the soya plant, of aqueous solutions of the salt with an excess

Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber von organischen, mit Wasser mischbaren Lösungs-Seeds, for example of the cotton plant etc., but from organic, water-miscible solutions

auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen an- mitteln, wie Aceton, Dioxan usw., versetzt, wobei diealso ammonium salts and nitrates. By means of others, such as acetone, dioxane, etc., added, whereby the

organischen Salzen kann die Nährlösung beispiels- Salze in fester Form ausgefällt werden,organic salts, the nutrient solution can be precipitated in solid form, for example salts,

weise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erd- 60 5. Eine weitere Methode der Anreicherung des Anti-wise chlorides, carbonates, sulphates of alkalis, earth 60 5. Another method of enriching the anti-

alkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan ent- biotikums besteht darin, daß man wäßrige LösungenAlkalis, magnesium, iron, zinc and manganese entbiotikums consists in the fact that one aqueous solutions

halten. desselben mit Lösungen von Phenol in Chloroformkeep. the same with solutions of phenol in chloroform

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in extrahiert, wobei sowohl das p_H der wäßrigen LösungCultivation is carried out aerobically, for example, in extracted, and both the p _H of the aqueous solution

ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise sub- als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösungresting surface culture or preferably sub- and the phenol content of the chloroform solution

mers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder 65 variiert werden. So befindet sich das Antibiotikumbe varied with shaking or stirring with air or 65. This is where the antibiotic is located

Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fer- z. B. bei einer Verteilung zwischen einer Lösung, dieOxygen in shake flasks or the well-known Fer- z. B. in a distribution between a solution that

mentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwi- auf 100 cm³ Chloroform 100 g Phenol enthält, undmentern. A suitable temperature is between 100 g of phenol for ^{every 100 cm 3 of chloroform, and}

sehen 18 und 40° C. Eine wesentliche antibakterielle einer wäßrigen Phase von pg 1 bis 6 fast ausschließ-see 18 and 40 ° C. A substantial antibacterial of an aqueous phase from pg 1 to 6 almost exclusively

W^Tirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen lieh in der organischen Phase, während es bei derW ^T MPACT shows the nutrient solution are in general lent in the organic phase, while in the

nach IV2 bis 5 Tagen. 70 Verwendung, die auf 100 cm³ Chloroform nur 33 gafter IV2 to 5 days. 70 use that per 100 cm ^{3 of} chloroform only 33 g

Phenol enthält, der wäßrigen Phase lediglich bei einem p_H zwischen 4 und 6 annähernd vollständig entzogen wird. Versteht man unter dem Verteilungskoeffizienten des Antibiotikums das Verhältnis von Konzentration in der organischen Phase zur Konzentration in der wäßrigen, so geht aus den obigen Angaben hervor, daß der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinkendem p_H der wäßrigen Phase abnimmt. Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoefnzienten des Antibiotikums in diesem System einzustellen, kann man durch Kombination von wenigen Verteilungsoperationen einen Großteil inaktiver Verunreinigungen abtrennen.Contains phenol, the aqueous phase is removed completely from approximately only at a p _H 4-6 Is meant by the distribution coefficient of the antibiotic, the ratio of concentration in the organic phase to the concentration in the aqueous, it is apparent from the above data that the distribution coefficient increases with increasing phenolic content of the organic phase and decreases with decreasing p _H of the aqueous phase. Since it is thus possible to set any arbitrary distribution coefficient of the antibiotic in this system, a large number of inactive impurities can be separated off by combining a few distribution operations.

6. Eine andere Anreicherungsmethode für das Antibiotikum stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z.B. an Norit, Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikaten, SiO₂, Calciumsulfat, sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Starke, SiO₂ u.dgl. als Trägersubstanzen oder aber Chromatographie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Dowex 50, Amberlite IRC-50 u dgl. Beispielsweise hat sich die Verteilungschromatographie an Cellulose unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Butanol (4 Volumteile), Eisessig (1 Volumteil) und Wasser (5 Volumteile) besonders bewährt.6. Another enrichment method for the antibiotic is chromatography, such as adsorption chromatography on various materials, e.g. on norite, aluminum oxide, magnesium silicate, SiO ₂ , calcium sulfate, and partition chromatography with cellulose, starch, SiO ₂ and the like as carrier substances or chromatography on ion exchange resins, e.g. B. Dowex 50, Amberlite IRC-50 and the like. For example, partition chromatography on cellulose using the solvent system butanol (4 parts by volume), glacial acetic acid (1 part by volume) and water (5 parts by volume) has proven particularly useful.

7. Weiter kann das Antibiotikum durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden. Folgende Lösungsmittelsysteme haben sich dabei besonders bewährt:7. Further, the antibiotic cannot, due to the countercurrent distribution according to Craig between two, not miscible solvent phases are enriched. The following solvent systems have proven particularly useful proven:

a) sek.Butanola) secondary butanol

Vio N-Ammoniumacetatpuffer vom p_H 4,68;Vio N-ammonium acetate buffer of p _H 4.68;

b) Vio N-Ammoniumacetatpuffer vom p_H 4,6
10%ige Lösung von Phenol in Chloroform.b) Vio N-ammonium acetate buffer with a _{pH of} 4.6
10% solution of phenol in chloroform.

Der Verteilungskoeffizient des Antibiotikums im System b) und damit die Lage des Aktivitätsmaximums in der Verteilung kann einerseits durch Änderung des p_H der Pufferlösung und andererseits durch Variierung des Phenolgehaltes der organischen Phase beliebig verändert werden.The distribution coefficient of the antibiotic in the system b) and thus the position of the activity peak in the distribution on the one hand by altering the p _H of the buffer solution on the other hand by varying the phenol content of the organic phase be changed arbitrarily.

Zur Herstellung eines weitgehend reinen Präparates hat sich folgende Kombination der aufgeführten Anreicherungsverfahren bewährt: Aus dem Kulturnitrat wird das Antibiotikum am gepufferten Ionenaustauscher Amberlite IRC-50 adsorbiert und mittels methanolischer Salzsäure eluiert. Die Eluate werden bei p_H 5 im Vakuum konzentriert, wobei ein wäßrigesTo produce a largely pure preparation, the following combination of the listed enrichment processes has proven itself: The antibiotic is adsorbed from the culture nitrate on the buffered ion exchanger Amberlite IRC-50 and eluted using methanolic hydrochloric acid. The eluates are concentrated at p _H 5 in vacuo to afford an aqueous

ίο Konzentrat des Antibiotikums erhalten wird, das volumenmäßig ungefähr einem Hundertstel der Kulturlösung entspricht. Dieses wird gemäß der obenerwähnten Methode 5 einige Male zwischen Penol-Chloroform-Gemischen einerseits und wäßrigen Lösungen von variierendem p_H anderseits verteilt, wobei nach Gefriertrocknung ein Präparat erhalten wird, das in bezug auf das Kulturfiltrat eine um den Faktor 500 bis 1000 erhöhte spezifische Wirksamkeit besitzt. Durch Behandlung eines solchen Präparates gemäßίο Concentrate of the antibiotic is obtained, which corresponds in volume to approximately one hundredth of the culture solution. According to the above-mentioned method 5, this is distributed a few times between penol-chloroform mixtures on the one hand and aqueous solutions of varying p _H on the other hand, a preparation being obtained after freeze-drying which has a specific effectiveness increased by a factor of 500 to 1000 with respect to the culture filtrate owns. By treating such a preparation according to

ao der oben aufgeführten Methode 6 (Verteilungschromatographie an Cellulose) und Methode 7 kann das basische, weitgehend einheitliche Antibiotikum Pilosomycin vorzugsweise in Form eines Salzes erhalten werden. .ao of the above method 6 (partition chromatography on cellulose) and method 7, the basic, largely uniform antibiotic pilosomycin are preferably obtained in the form of a salt. .

Wie aus papierchromatographischen Untersuchungen hervorgeht, besteht das Antibiotikum Pilosomycin aus mindestens zwei Komponenten, nämlich der Hauptkomponente A und der Nebenkomponente B. Diese werden im Verlauf des beschriebenen Anreicherungsprozesses weitgehend voneinander getrennt, speziell bei der Verteilungschromatographie an Cellulose und bei der Gegenstromverteilung.As from paper chromatographic examinations As can be seen, the antibiotic pilosomycin consists of at least two components, namely the Main component A and the secondary component B. These are in the course of the enrichment process described largely separated from each other, especially in partition chromatography on cellulose and with countercurrent distribution.

Die beiden Komponenten von Pilosomycin werden papierchromatographisch definiert durch einen direkten Vergleich ihrer Rf-Werte mit den R_f-Werten, einer Reihe von bekannten Antibiotika (2 bis 11) in den Systemen A bis G. Beim System H wird durchlaufend chromatographiert. Die angegebenen Zahlen sind dort die in Zentimetern gemessenen Laufstrecken der Antibiotika nach löstündiger Chromatogrammdauer. Der Nachweis der Antibiotika erfolgt autobiographisch mit Staphylococcus aureus oder Bacillus subtilis.The two components of pilosomycin are defined by paper chromatography by direct comparison of their Rf values with the R _f values of a number of known antibiotics (2 to 11) in systems A to G. System H is continuously chromatographed. The numbers given are the distances the antibiotics have traveled, measured in centimeters, after an hour-long chromatogram. The antibiotics are detected autobiographically with Staphylococcus aureus or Bacillus subtilis.

Systemsystem lala IbIb 22 33 44th 55 66th 77th 88th 99 1010 1111 AA. 00 00 00 00 00 00 00 00 00 0,920.92 0,070.07 00 BB. 0,490.49 0,630.63 0,050.05 0,050.05 0,170.17 0,020.02 0,020.02 0,660.66 0,550.55 0,920.92 0,320.32 0,220.22 CC. 0,340.34 0,580.58 0,220.22 00 0,020.02 0,220.22 0,030.03 0,720.72 0,620.62 0,930.93 0,390.39 0,110.11 DD. 0,050.05 0,150.15 00 00 00 00 00 XX XX 0,920.92 00 EE. 0,320.32 0,320.32 00 0,100.10 0,220.22 00 00 XX XX 0,860.86 0,120.12 FF. 0,470.47 0,470.47 0,220.22 0,140.14 0,120.12 0,040.04 0,050.05 0,490.49 0,420.42 0,910.91 0,430.43 0,360.36 GG 0,740.74 0,740.74 0,070.07 0,020.02 XX XX 0,940.94 0,610.61 0,690.69 HH 2,72.7 7,67.6 00 00 00 00 00 (14,5)(14.5) (8,8)(8.8) 2727 11

A wassergesättigtes Butanol,A water-saturated butanol,

B Butanol—Eisessig—Wasser (4:1:5, obereB butanol — glacial acetic acid — water (4: 1: 5, upper

Phase),
C wassergesättigtes Butanol + 2 % p-Toluolsulfosäure, Phase),
C water-saturated butanol + 2% p-toluenesulphonic acid,

D wassergesättigtes Butanol + 2 % Piperidin,
E Butanol—Pyridin—Wasser (6:4:3),
F 80% Äthanol + 1,5% Natriumchlorid, Whatman Nr. 4, ■ imprägniert mit 0,-95molarem Natriumsulfat + 0,05molarem Natriumhydrosulfat,
G Butanol—Äthanol—Wasser (1 :1:2),'
H Butanol—Butylacetat—Eisessig·—Wasser
(10:3 :1,3 :14,3, obere Phase),D water-saturated butanol + 2% piperidine,
E butanol — pyridine — water (6: 4: 3),
F 80% ethanol + 1.5% sodium chloride, Whatman No. 4, ■ impregnated with 0. -95 molar sodium sulfate + 0.05 molar sodium hydrosulfate,
G butanol — ethanol — water (1: 1: 2), '
H butanol — butyl acetate — glacial acetic acid · —water
(10: 3: 1.3: 14.3, upper phase),

lala Pilosomycin Base A,Pilosomycin base A, IbIb Pilosomycin Base B,Pilosomycin base B, 22 Streptomycin,Streptomycin, 33 Ristocetin A,Ristocetin A, 44th Ristocetin B,Ristocetin B, 55 Neomycin B,Neomycin B, 66th Viomycin,Viomycin, 77th Chlortetracyclin,Chlortetracycline, 88th Oxytetracyclin,Oxytetracycline, 99 Actinomycin J,Actinomycin J, 1010 Cycloserin,Cycloserine, 1111 Grisein,Grisiness, XX Antibiotikum über ganze Laufstrecke verteilt,Antibiotics distributed over the entire course, OO Position unscharf.Position out of focus.

7 87 8

Bei der Papierelektrcphorese in 0,1 molarem Aceat- kutane Applikation von 500 mg/kg von Mäusen ohne puffer vom p_H 4,6 wandert das Antibiotikum Piloso- Schädigung ertragen.In the Papierelektrcphorese in 0.1 molar Aceat- cutaneous administration of 500 mg / kg of mice without a buffer p _H 4.6 migrates the antibiotic Piloso- damage to bear.

mycin gegen die Kathode. Die Wanderungsgeschwin- Das Antibiotikum Pilosomycin, seine Komponenten,mycin against the cathode. The rate of migration - the antibiotic pilosomycin, its components,

digkeit ist etwa halb so groß wie diejenige des Strepto- seine Salze oder Derivate können als Heilmittel, z. B.diness is about half as great as that of strepto- its salts or derivatives can be used as remedies, e.g. B.

mycins. 5 in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung fin-mycins. 5 in the form of pharmaceutical preparations, can be used

Die Komponente A des Antibiotikums Pilosomycin den. Diese enthalten die genannten Verbindungen in ist ein orangegelbes Pulver, das sich leicht in Wasser, Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder gut in Methanol und schwer in den meisten orga- lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen Lösungsmitteln löst. nischen oder anorganischen Trägermaterial. Für das-Component A of the antibiotic pilosomycin den. These contain the compounds mentioned in is an orange-yellow powder that dissolves easily in water, mix with any for enteral, parenteral or pharmaceutical organic well suited in methanol and difficult in most orga- local application Solvents dissolves. niche or inorganic carrier material. For the-

Die Base A gibt folgende Farbreaktionen: FeCl₃; io selbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit denThe base A gives the following color reactions: FeCl ₃ ; io same substances come into question that with the

braunrot,FeCl3-K₃Fe(CN)₆:blau,Nmhydrin:schwach neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z.B. GeIa-brown-red, FeCl3-K ₃ Fe (CN) ₆ : blue, Nmhydrin: weakly new compounds do not react, such as gelatin

violett; der Sakaguchi-, Maltol- und Ehrlich-Morgan- tine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk,violet; the Sakaguchi, Maltol and Ehrlich Morgan- tine, lactose, starch, magnesium stearate, talc,

Test sind negativ. Die Substanz enthält neben Kohlen- pflanzliche Öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylen-Test are negative. In addition to carbon, the substance contains vegetable oils, benzyl alcohol, rubber, polyalkylene

stoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff auch Eisen, glykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekanntesubstance, hydrogen, nitrogen and oxygen also iron, glycols, petrolatum, cholesterol or other known ones

Eine wäßrige Lösung der Komponente A zeigt im 15 Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen PräparateAn aqueous solution of component A shows in 15 drug carrier. Pharmaceutical preparations

UV-Spektrum Absorptionsmaxima bei 215 ηιμ (Ei*_m können ζ. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben,UV spectrum absorption maxima at 215 ηιμ (egg * _m can ζ. B. as tablets, coated tablets, powder, ointments,

= 312) und bei 315 ηιμ (EJ*_ra — 42). Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form als= 312) and at 315 ηιμ (EJ * _ra - 42). Creams, suppositories, or in liquid form as

Die freie Base des Antibiotikums Pilosomycin ist Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen,The free base of the antibiotic pilosomycin is solutions, suspensions or emulsions,

leicht aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder ent-easily accessible from their salts, from the sulphate. If necessary, they are sterilized and / or

z. B. durch Umsetzung in wäßrigem Medium mit 20 halten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisie-z. B. by reacting in an aqueous medium with 20 keep auxiliaries, such as preservatives, stabilizers

Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen rungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie könnenBarium hydroxide, neutralization of the excess, wetting or emulsifying agent. You can

Baryts mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe ent-Barite with carbon dioxide as well as separation of other therapeutically valuable substances

Bariumcarbonat- und -Sulfatniederschlages und Isolie- halten.Barium carbonate and sulphate precipitate and isolation.

rung der freien Base mittels Gefriertrocknung. Ein- Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielention of the free base by means of freeze drying. The invention is illustrated in the following examples

fächer erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter 25 beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung desfan is the production from the salts described under 25, without thereby restricting the

Verwendung eines stark basischen Anionenaus- Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Tempe-Use of a strongly basic anion from the subject matter of the invention is intended. The tempe-

tauschers, z.B. der OH-Form des unter der Bezeich- raturen sind in Celsiusgraden angegeben,exchanger, e.g. the OH form of the under the designations are given in degrees Celsius,

nung Dowex-2 im Handel befindlichen Produktes. . -I₁ Nung Dowex-2 commercially available product. . -I ₁

Eine der auffallendsten Eigenschaften des Anti- Beispiel 1One of the most striking properties of the anti-example 1

biotikums Pilosomycin ist ein ausgeprägtes Stabili- 3° Die Züchtung des S. galilaeus n. sp. NRRL 2722biotikums Pilosomycin is a pronounced stabilization 3 ° The cultivation of S. galilaeus n. sp. NRRL 2722

tätsminimum zwischen pg 7 und 11. Lösungen des wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Manminimum between pg 7 and 11. Solutions of the is carried out according to the submerged method. Man

Antibiotikums verlieren bei 20° C und bei einem p_H verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungs-Antibiotic lose at 20 ° C and used at a p _H a nutrient solution which contains per liter management

von 8 bis 10 innerhalb 48 Stunden den größten Teil wasser 20 g Sojamehl und 20 g Mannit enthält. Diefrom 8 to 10 within 48 hours most of the water contains 20 g soy flour and 20 g mannitol. the

ihrer Aktivität, während sie bei der gleichen Tempe- Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fer-their activity while they are at the same temperature.

ratur und bei p_H-Werten von 1 bis 5 vollständig und 35 mentern während 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterili-temperature and at _pH values 1-5, and 35 completely mentern for 20 to 30 minutes at 1 atm sterilized

bei einem p_H von 6 bis 7 und größer als 11 teilweise siert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein pjj vonat a p _H 6-7 and greater than 11 partially Siert. The sterilized nutrient solution shows a pjj of

wirksam bleiben. 7,5 bis 8,0. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 10°/oremain effective. 7.5 to 8.0. The inoculation takes place with up to 10%

Die Salze des Antibiotikums Pilosomycin und einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des seiner Komponente leiten sich von den bekannten an- Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln organischen und organischen Salzen ab, beispielsweise 4° oder Rühren bei 27°, wobei Kulturen in Fermentern von der Salzsäure, den Schwefelsäuren und Phosphor- mit etwa 2 Volumen steriler Luft pro Volumen Lösäuren, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Mandel- sung in der Minute belüftet werden. Nach 48 bis säure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen 120 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den neutrale oder saure Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt größten Hemmwert gegenüber den Testorganismen durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf die 45 (B. subtilis, B. megatherium, Micrococcus pyogenes, freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen, var. aureus) erreicht. Man unterbricht die Kultur, beispielsweise von Pilosomycinsulfat mit pantothen- bringt das p_H durch Zugabe von verdünnter Schwefelsaurem Calcium. säure auf 4,5 und trennt das Mycel sowie andere festeThe salts of the antibiotic pilosomycin and a partially sporulating vegetative culture of its component are derived from the well-known an- organism. Organic and organic salts are incubated with vigorous shaking, for example 4 ° or stirring at 27 °, cultures in fermenters of hydrochloric acid, sulfuric acids and phosphorus with about 2 volumes of sterile air per volume of soluble acids, succinic acid, citric acid, almond solution must be ventilated per minute. After 48 bis acid, glutamic acid or pantothenic acid. They represent 120 hours of incubation, the culture solution has the neutral or acidic salts. It is produced with the greatest inhibition value against the test organisms by the action of the corresponding acids on the 45 (B. subtilis, B. megatherium, Micrococcus pyogenes, free base or by double conversion of Salts, var. Aureus). Interrupting the culture, for example with Pilosomycinsulfat pantothenic brings the p _H by addition of dilute calcium sulphate. acid to 4.5 and separates the mycelium as well as other solid

Das Antibiotikum Pilosomycin besitzt eine sehr BestandteilevonderdieHauptmengedesAntibiotikums hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiede- 5° enthaltenden Losung mittels Filtration oder Zentrinen Testorganismen. Im sogenannten Agarquerstrich- fugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung test ist es aktiv gegen folgende Testorganismen: vor der Filtration etwa 1% eines Filterhilfsmittels, Microccccus pyogenes, var. aureus.Streptococcus vivi- z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird. Die Filterrückdaus, Streptococcus, faecalis, Corynebacterium diph- stände wäscht man mit Wasser und mit wäßrigem theriae, Escherichia, coli, Bacillus megatherium und 55 Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit Bacillus subtilis. dem Kulturfiltrat.The antibiotic pilosomycin has very components of the major amount of the antibiotic high antibiotic effectiveness against different solutions containing 5 ° by means of filtration or centrines Test organisms. In the so-called agar cross-line fugation, with the culture solution if necessary test, it is active against the following test organisms: before filtration about 1% of a filter aid, Microccccus pyogenes, var. Aureus, Streptococcus vivi- z. B. Hyflo Supercel is added. The filter depressions, Streptococcus, faecalis, Corynebacterium diphts are washed with water and with aqueous solution theriae, Escherichia, coli, Bacillus megatherium and 55 methanol and combines the washing liquids with Bacillus subtilis. the culture filtrate.

In vivo ist das Antibiotikum Pilosomycin sowie die Verwendet man an Stelle der oben angegebenenIn vivo, the antibiotic is pilosomycin as well as the one used in place of the above

Komponente A und B ebenfalls wirksam. Bei fünf- Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser dieComponents A and B also effective. At five-nutrient solution those that per liter of tap water

maliger subkutaner Verabreichung der Komponente A folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nachone time subcutaneous administration of component A contain the following nutrients, one obtains after

von 1 mg/kg an mit Staphylococcus pyogenes, 60 analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturnitratefrom 1 mg / kg with Staphylococcus pyogenes, 60 analogous cultivation and processing of culture nitrates

var. aureus, mit Pneumococcus Typ III oder mit von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit.var. aureus, with Pneumococcus type III or with a similarly high antibiotic effectiveness.

Streptococcus haemolyticus infizierte Mäuse werden a) Glukose 10 gStreptococcus haemolyticus infected mice become a) Glucose 10 g

80 bis 100% und bei einer Dosis von fünfmal Soyamehl 10 g80 to 100% and at a dose of five times soy flour 10 g

0,1 mg/kg 60% Überlebende beobachtet. Bei peroraler Natriumchlorid 5 g0.1 mg / kg 60% survivors observed. With peroral sodium chloride 5 g

Applikation wird der gleiche Effekt mit zehnmal 65 Natriumnitrat IgApplication will have the same effect with ten times 65 sodium nitrate Ig

höheren Dosen erzielt. Die Komponente B zeigt gegen- b) Glycerin 20 ghigher doses achieved. Component B shows against b) glycerine 20 g

über Pneumococcus Typ III die gleich hohe antibio- Soyamehl 10 gover Pneumococcus type III the same high antibiotic soy meal 10 g

tische Wirksamkeit in vivo. Natriumchlorid 5 gefficacy in vivo. Sodium chloride 5 g

Die Toxizität des Antibiotikums und seiner Korn- Natriumnitrat IgThe toxicity of the antibiotic and its grain sodium nitrate Ig

ponenten A und B ist gering. So wird z. B. die sub- 7° Calciumcarbonat 10 gcomponents A and B is low. So z. B. the sub- 7 ° calcium carbonate 10 g

9 109 10

c) Glukose 10g Beispiel 5c) Glucose 10g Example 5

Soyamehl 10 gSoy flour 10 g

Corn steep liquor (Maisquellwasser) ..2Og 301 eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen KulturfiltratesCorn steep liquor (corn steep liquor) ..2Og 301 of a culture filtrate obtained according to Example 1

Natriumchlorid 5 g werden auf p_H 4,5 gebracht und dann in einem Dünn-Sodium chloride are brought to p _H 4.5 5 g and then in a thin

Natriumnitrat Ig 5 schichteneindampfer auf 21 eingeengt. Das KonzentratSodium nitrate Ig 5 layer evaporator concentrated to 21. The concentrate

Calciumcarbonat 10 g bringt man durch Zugabe von verdünnter NatronlaugeCalcium carbonate 10 g is added by adding dilute sodium hydroxide solution

d) Laktose 20 g auf p_H 8 und filtriert es unter Zugabe, von Celit. Dasd) Lactose 20 g to p _H 8 and is filtered with the addition of Celite. That

Distillers solubles 20 g klare Filtrat wird auf p_H 5 gebracht und unter Rüh-Distillers solubles 20 g clear filtrate is brought to p _H 5 and Rüh-

Natriumchlorid 5 g rung mit 1,5 1 einer heißen, 5%igen wäßrigen Pikrin-Sodium chloride 5 g tion with 1.5 l of a hot, 5% aqueous picrine

Natriumnitrat Ig *° säurelösung versetzt. Der entstandene NiederschlagSodium nitrate Ig * ° acid solution added. The resulting precipitate

wird nach mehrstündigem Stehen bei 0° unter Zugabe Beispiel 2 ^von 50g Celit abfiltriert. Das Filtrat ist antibiotischis filtered off after standing for several hours at 0 ° with addition of Example 2 ^of 50 g Celite. The filtrate is antibiotic

nur sehr schwach aktiv. Der Filterrückstand wirdonly very weakly active. The filter residue will

3 1 eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates hierauf dreimal mit je 800 cm³ kaltem Aceton auswerden durch Zugabe von verdünnter Natronlauge 15 gerührt und filtriert. Man engt das Filtrat im Vakuum auf p_H 7,5 gebracht und mit 50 g Aktivkohle (NoritA) auf 80 cm³ ein, wobei das Pikrat des Antibiotikums versetzt. Man läßt während einer Stunde mechanisch und überschüssige Pikrinsäure ausfallen. Nach Abrühren, wobei die gesamte antibiotisch wirksame Sub- trennung erhält man 8,59 Trockensubstanz,
stanz von der Kohle adsorbiert wird. Letzteres wird Zur Isolierung des Antibiotikums als Hydrochlorid3 liters of a culture filtrate obtained according to Example 1 are then ^{stirred three times with 800 cm 3 of} cold acetone each time by adding dilute sodium hydroxide solution 15 and filtered. The filtrate is concentrated in vacuo to 7.5 brought p _H and wherein the picrate of the antibiotic admixed with 50 g of activated carbon (NORITA) to 80 cm ³ a. Excess picric acid is allowed to precipitate mechanically and excessively for one hour. After stirring, the entire antibiotic effective sub-separation is obtained 8.59 dry matter,
punch is adsorbed by the carbon. The latter is used to isolate the antibiotic as the hydrochloride

durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von etwas 20 werden 2,5 g der erwähnten Trockensubstanz in 30 cm³ Filterhilfsmittel, wie z.B. Hyflo Supercel, von der Methanol gelöst. Man gibt hierauf zuerst eine Mischung vollständig inaktiven Lösung abgetrennt. Die Kohle von 1 cm³ konzentrierter Salzsäure und 10 cm³ Aceton wird darauf in 500 cm³ einer Mischung von 4 Volum- und dann 500 cm³ Äther zu, wobei das Hydrochlorid teilen Wasser und 1 Volumteil Pyridin eingetragen, quantitativ ausgefällt wird. Durch wiederholtes Lösen die Mischung V2 Stunde mechanisch gerührt und dann 25 des Niederschlages in salzsaurem Methanol und Ausfiltriert, worauf der Kohlerückstand noch einmal in fällen mit Äther können die letzten Reste Pikrinsäure gleicher Weise extrahiert wird. Die Eluate enthalten daraus entfernt werden. Schließlich wird das Hydrodie gesamte antibiotische Aktivität. chlorid in möglichst wenig Methanol gelöst, filtriertby filtration, advantageously with the addition of about 20, 2.5 g of the dry substance mentioned are ^{dissolved from the methanol in 30 cm 3 of} filter aid, such as Hyflo Supercel, for example. A mixture of completely inactive solution is then first added. The coal of 1 cm ³ of concentrated hydrochloric acid and 10 cm ³ of acetone is subsequently cm ³ of a mixture of 4 Volum- and then 500 cm ³ of ether, the hydrochloride parts water and 1 part by volume of pyridine was added, is precipitated quantitatively in 500th By repeatedly dissolving the mixture mechanically stirred for 2 hours and then 25 of the precipitate in hydrochloric acid methanol and filtered out, whereupon the carbon residue can be extracted again, in cases with ether, the last residues of picric acid can be extracted in the same way. The eluates contain to be removed from it. Eventually, the hydrody will have total antibiotic activity. chloride dissolved in as little methanol as possible, filtered

und im Vakuum eingedampft. Man erhält 714 mg des Beispiel 3 ³° Hydrochloride des Antibiotikums Pilosomycin, dasand evaporated in vacuo. 714 mg of Example 3 ³ ° hydrochloride of the antibiotic pilosomycin are obtained

antibiotisch sehr aktiv ist.antibiotic is very active.

3 1 eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates3 1 of a culture filtrate obtained according to Example 1

werden durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf Beispiel 6are based on example 6 by adding dilute sodium hydroxide solution

Ph 7j5 gebracht und dann sofort mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 0,5 1/Std. auf eine Säule von 35 600 1 eines nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates Amberlite IRC-50 (Η-Form) gebracht, deren Länge werden 5,5 kg eines Filterhilfsmittels verrührt, mit bzw. Durchmesser 30 bzw. 5 cm beträgt. Das Anti- 2,5 1 2n-Salzsäure auf einen p_H-Wert von 4,0 einbiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Die Säule gestellt und hierauf filtriert. Den Filterrückstand wird mit 3 1 Wasser gewaschen. Zur Elution verwen- wäscht man mit 100 1 Wasser. Das klare Filtrat wird det man 11 0,4 η-Salzsäure. Die ersten 500 cm³ des 40 mit 7 kg vorbehandeltem Norit während 45 Minuten Eluates sind antibiotisch unwirksam, während die verrührt. Die Vorbehandlung des Norits erfolgt durch zweiten 500 cm³ die gesamte Aktivität enthalten. Die- mehrmaliges Ausrühren mit 1 η-Salzsäure und anses aktive Eluat wird zur Entfernung der überschüssi- schließendem Neutralwaschen mit Wasser. Der mit gen Salzsäure durch eine Säule von Amberlite IR-4B Antibiotikum beladene Norit wird abfiltriert. Das perkoliert. Durch Gefriertrocknung des Perkolates er- 45 Filtrat enthält keine antibiotische Aktivität. Das hält man das angereicherte Antibiotikum Pilosomycin Noritadsorbat wird zweimal mit 200 1 Wasser durch in Form eines hochwirksämen amorphen Pulvers. Rühren und Filtrieren gewaschen. Die Waschflüssig-Ph 7j5 brought and then immediately at a flow rate of 0.5 1 / hour. placed on a column of 35,600 l of an Amberlite IRC-50 (Η-shape) culture filtrate obtained according to Example 1, the length of which is stirred up to 5.5 kg of a filter aid, with a diameter of 30 or 5 cm. The anti- 2.5 1 2 N hydrochloric acid to a _pH value of 4.0 einbiotikum is thereby completely adsorbed. The column is set and then filtered. The filter residue is washed with 3 l of water. For elution, it is washed with 100 liters of water. The clear filtrate is det one 11 0.4 η-hydrochloric acid. The first 500 cm ^{3 of} the 40 norit pretreated with 7 kg for 45 minutes of eluate are antibiotic ineffective, while the stirred. The pretreatment of the norite is carried out by a second 500 cm ³ containing the entire activity. The repeated stirring with 1 η-hydrochloric acid and an active eluate is used to remove the excess, closing neutral wash with water. The Norit loaded with hydrochloric acid through a column of Amberlite IR-4B antibiotic is filtered off. That percolates. Freeze-drying of the percolate resulted in the filtrate not having any antibiotic activity. This holds the fortified antibiotic pilosomycin noritadsorbate is twice with 200 l of water by in the form of a highly effective amorphous powder. Stir and filter washed. The washing liquid

„ . · 1 λ keit enthält keine Aktivität. Die Elution erfolgt durch". · 1 λ does not contain any activity. Elution takes place through

.Beispiel 4 zweimaliges lstündiges Ausrühren der Aktivkohle mit.Example 4 stirring the activated charcoal with twice for 1 hour

6 1 eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates 5° einem Gemisch von n-Butanol—Methanol—Eisessig— werden durch Zugabe von verdünnter Natronlauge Wasser im Volumenverhältnis von 2:1:1:2, wobei die auf p_H 7,5 gebracht und dann sofort durch eine Säule Aktivkohle durch Filtration abgetrennt wird. Die vervon Harzadsorber, z.B. Asmit 173, perkoliert, die einigten Eluate (1401 + 461) werden mit 961 n-Butyl-14 cm lang ist und einen Durchmesser von 4,5 cm hat. acetat gut durchmischt. Die sich abscheidende wäßrige Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. 55 Phase wird abgetrennt und die organische Phase mit Man wäscht das Adsorberharz hierauf mit 5 1 Wasser 1,2 1 Wasser nachgewaschen. Die vereinigten wäßri- und, eluiert das Antibiotikum mit 11 einer Mischung gen Phasen (65,5 1) werden sukzessive mit 72 1 eines von Methanol und 1 n-Essigsäure (1 : 1). Das Eluat, Gemisches vonn-Butanol—n-Butylacetat im Volumendas die gesamte Aktivität enthält, wird im Vakuum verhältnis von 1:2, 48 1 Essigester und schließlich mit bei 35° auf 15 cm³ konzentriert. Man versetzt diese 60 24 1 Äther durch Ausrühren gewaschen. Die orga-Lösung mit 75 cm³ methanolischer 0,25 η-Salzsäure nischen Phasen werden verworfen. Die verbleibende und gießt das Gemisch in 10 1 Aceton, wobei das wäßrige Phase (44,1), die die gesamte antibiotische Hydrochlorid des Antibiotikums ausfällt. Es wird Aktivität enthält, wird im Quickfitt-Verdampfer bei filtriert und mit Aceton gewaschen. Zur weiteren Rei- höchstens 30° auf ein Volumen von 5,45 1 konzennigung löst man es in 150 cm³ Methanol und filtriert 65 triert. Aus diesem hochaktiven, schwarzbraungefärbdie etwas trübe Lösung unter Zugabe von Filterhilfs- ten Konzentrat erhält man das Antibiotikum durch mittel, ζ. B. Celit. Nach Eindampfen des Filtrates im Gefriertrocknung in Form von 509 g eines braunen Vakuum bei 25° erhält man das Hydrochlorid des Pulvers. Dieses Material zeigt in bezug auf das Antibiotikums Pilosomycin in Form eines amorphen Kulturfiltrat eine 30- bis 50fache spezifische antibio-Pulvers. 70 tische Aktivität.6 1 of a culture filtrate obtained in Example 1 5 ° to a mixture of n-butanol-methanol-glacial acetic acid by the addition of dilute sodium hydroxide solution water in a volume ratio of 2: 1: 1: 2, with the brought to p _H 7.5 and then is immediately separated by filtration through a column of activated carbon. The vervon resin adsorber, for example Asmit 173, percolated, the unified eluates (1401 + 461) with 961 n-butyl are 14 cm long and 4.5 cm in diameter. acetate well mixed. The deposited aqueous antibiotic is completely adsorbed. 55 phase is separated off and the organic phase is washed with the adsorber resin is then washed with 5 liters of water and 1.2 liters of water. The combined aqueous and antibiotic elutes with 11 of a mixture of phases (65.5 liters) are successively mixed with 72 liters of methanol and 1 n-acetic acid (1: 1). The eluate, a mixture of n-butanol-n-butyl acetate in volume that contains the entire activity, is concentrated ^{in a vacuum ratio of 1: 2, 48 liters of ethyl acetate and finally with at 35 ° to 15 cm 3.} This is mixed with 60 24 l of ether and washed by stirring. The organic solution with 75 cm ^{3 of} methanolic 0.25 η-hydrochloric acid phases are discarded. The remaining and pour the mixture into 10 1 acetone, whereby the aqueous phase (44.1), which precipitates the entire antibiotic hydrochloride of the antibiotic. It will contain activity, is filtered in the Quickfitt evaporator and washed with acetone. For a further purification at most 30 ° to a volume of 5.45 liters concentration, it is dissolved in 150 cm ^{3 of} methanol and filtered. The antibiotic is obtained from this highly active, black-brown-colored, somewhat cloudy solution with the addition of filter aid concentrate, ζ. B. Celite. After evaporating the filtrate by freeze drying in the form of 509 g of a brown vacuum at 25 °, the hydrochloride of the powder is obtained. With respect to the antibiotic pilosomycin in the form of an amorphous culture filtrate, this material shows a 30- to 50-fold specific antibiotic powder. 70 tables of activity.

11 1211 12

Beispiel 7 Chloroform enthält. Die vereinigten Phenol-Chloro-Zur Isolierung des Antibiotikums Pilosomycin aus form-Extrakte werden mit 750 ml 1 η-Salzsäure aus-3001 eines nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates geschüttelt und hierauf durch eine Schicht von Celite werden 1 Volumteil Amberlite IRC-50 in der Η-Form filtriert. Das klare rotbraune Filtrat wird unter Rühmit 2 Volumteilen Amberlite IRC-50 in der Na-Form 5 ren mit 600 ml Wasser, 41 Äther und schließlich mit mechanisch gemischt. 6,3 1 dieses Gemisches werden 41 Petroläther versetzt. Die wäßrige Phase wird abin eine Glassäule eingefüllt. Das Höhe-Durchmesser- getrennt und die organische Phase mit zweimal 200 ml Verhältnis des Harzbettes beträgt 8:1. Das Kultur- Wasser nachextrahiert. Die vereinigten wäßrigen filtrat wird mit 2n-Salzsäure auf p_H 4,0 eingestellt Phasen (11) werden zweimal mit 1 1 Äther gewaschen undmiteinerDurchlaufgeschwindigkeitvon0',21/Min./1 io _un<j hierauf lyophilisiert. Man erhält 136 g eines Harz durch das Harz perkoliert, wobei sich in den oberen braunen Pulvers, das in bezug auf das Ausgangszwei Dritteln der Säule eine orangebraune Zone aus- material eine um den Faktor 2 erhöhte spezifische antibildet. Das Harz wird anschließend mit 30 1 Wasser biotische Aktivität aufweist,
und mit 60 1 8Q°/oigem Methanol gewaschen. DerExample 7 contains chloroform. The combined phenol-chloro-To isolate the antibiotic pilosomycin from form extracts are shaken with 750 ml 1 η-hydrochloric acid from-3001 of a culture filtrate obtained according to Example 1 and then 1 part by volume of Amberlite IRC-50 in the Η -Filtered shape. The clear red-brown filtrate is stirred with 2 parts by volume of Amberlite IRC-50 in the Na form 5 ren with 600 ml of water, 41 ether and finally mixed mechanically. 6.3 l of this mixture are added to 41 petroleum ether. The aqueous phase is poured into a glass column. The height-diameter separated and the organic phase with twice 200 ml ratio of the resin bed is 8: 1. The culture water is re-extracted. The combined aqueous filtrate is adjusted with 2N hydrochloric acid to p _H 4.0 phases (11) are washed twice with 1 1 of ether undmiteinerDurchlaufgeschwindigkeitvon0 ', 21 / min. / 1 io _{un <j} then lyophilized. 136 g of a resin percolated through the resin are obtained, with a specific anti-formation which is increased by a factor of 2 in the upper brown powder, which is an orange-brown zone of material in relation to the starting two-thirds of the column. The resin is then exhibited biotic activity with 30 l of water,
and washed with 60 1 8Q% methanol. Of the

Durchlauf und die Waschflüssigkeiten enthalten nur 15 Beispiel 9
wenig antibiotische Aktivität. Die Elution erfolgt in 550 mg eines nach Beispiel 11 erhaltene, stark akzwei Portionen mit insgesamt 371 eines Gemisches tiven Antibiotikumpräparates (Base A) werden in von 8 Volumteilen Methanol und 2 Volumteilen 55 _ml eines V₁₀ n-Ammoniumacetatpuffers vom p_H 4,60 1 η-Salzsäure. Beide Portionen werden mit 5 η-Natron- gelöst und mit viermal 20 ml eines Phenol-Chlorolauge auf p_H 5,0 gestellt, vereinigt und hierauf im 20 form-Gemisches, das 100 g Phenol in 400 ml Chloro-Zirkulationsverdampfer bei höchstens 30° auf 2 1 kon- form enthält, extrahiert. Die organischen Extrakte zentriert. Das wäßrige Konzentrat wird auf p_H 5,6 werden mit zweimal 15 ml Pufferlösung zurückgestellt und zwecks Entfernung von wenig unlös- gewaschen. Der das Antibiotikum enthaltende orgalichem Material durch ein Filterhilfsmittel filtriert. nische Extrakt (80 ml) wird mit 40 ml Chloroform Dieses Filtrat (2,3 1) enthält annähernd die gesamte 25 _ver(iünnt, noch einmal mit 60 ml Pufferlösung geantibiotische Aktivität der Kulturlösung. Es wird in waschen und hierauf durch ein doppeltes Faltenfilter vier Portionen mit insgesamt 500 ml eines Phenol- filtriert. Das tief rotgefärbte Filtrat extrahiert man mit Chloroform-Gemisches, das 100 g Phenol in 100 ml 30+20+10 ml 0,2 η-Salzsäure. Die das Antibiotikum Chloroform enthält, extrahiert. Die wäßrige Phase enthaltende Säurelösung wird mit 50 ml Wasser verwird verworfen. Der Phenol-Chloroform-Extrakt 30 dünnt und mit einem Phenol-Chloroform-Gemisch, (500 ml) wird mit 1 1 Chloroform verdünnt und das 100 g Phenol in 100 ml Chloroform enthält, ermit dreimal 500 ml V10n-Ammoniumacetatpuffer von schöpfend extrahiert (2-20+lOml). Die vereinigten p_H 4,60 ausgeschüttelt, wobei der organischen Phase Phenol-Chloroform-Extrakte werden durch ein dopgefärbte, antibiotisch inaktive Verunreinigungen ent- peltes Faltenfilter filtriert und mit 20 ml Wasser, zogen werden. Die Chloroformphase wird nun mit 35 2OO ml Äther und 100 ml Petroläther geschüttelt. Nach 300+ zweimal 100 ml Vw η-Salzsäure extrahiert. Der dem Abtrennen der wäßrigen Phase wird die orgatiefrotgefärbte Säureextrakt, der das Antibiotikum nische Phase mit zweimal 15 ml Wasser nachextraenthält, wird mit Kaliumbicarbonat auf p_H 3,5 ge- hiert. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden zweibracht und mit vier 50-ml-Potionen Phenol-Chloro- _mal mit 50 ml Äther und einmal mit 50 ml Benzol geform-Gemisch (100 g: 100 ml) zurückextrahiert. Man 40 waschen und hierauf lyophilisiert. Man erhält 117 mg filtriert den Phenol-Chloroform-Extrakt durch Celite. eines braunroten Pulvers, das in bezug auf das Aus-Das klare, rotgefärbte Filtrat (200 ml) wird unter gangsmaterial eine annähernd 5fache Anreicherung starkem Schütteln mit 50 ml Wasser, 500 ml Äther der antibiotischen Aktivität aufweist,
und 300 ml Petroläther versetzt. Nach dem AbtrennenRun-through and wash liquids contain only 15 Example 9
little antibiotic activity. Elution is carried out in a 550 mg of Example 11 obtained strongly akzwei portions with a total of 371 of a mixture tive antibiotic preparation (base A) are dissolved in 8 parts by volume of methanol and 2 parts by volume of 55 _m l of a ₁₀ V n-ammonium acetate p _H 4.60 1 η-hydrochloric acid. Both portions are dissolved with 5 η-sodium hydroxide solution and four times with 20 ml of a phenol-Chlorolauge to p _H 5.0 provided, combined and then in the 20 form mixture containing 100 g of phenol in 400 ml of chloro-circulation evaporator at most 30 ° contains 2 1 compliant, extracted. The organic extracts centered. The aqueous concentrate is applied to p _H 5.6 to be reset twice with 15 ml of buffer solution and washed in order to remove insoluble by little. The organic material containing the antibiotic is filtered through a filter aid. African extract (80 ml) is added approximately 40 ml of chloroform This filtrate (2.3 1) contains the entire 25 _{ver (iünnt,} again geantibiotische with 60 ml of buffer solution activity of the culture solution. It is used in washing and then by a double folded filter four Portions with a total of 500 ml of a phenol filtered. The deep red colored filtrate is extracted with a chloroform mixture containing 100 g of phenol in 100 ml of 30 + 20 + 10 ml of 0.2 η-hydrochloric acid, which contains the antibiotic chloroform Acid solution containing the aqueous phase is discarded with 50 ml of water. The phenol-chloroform extract is diluted 30 and with a phenol-chloroform mixture (500 ml) is diluted with 1 l of chloroform and contains 100 g of phenol in 100 ml of chloroform, ermit three times 500 ml of ammonium acetate buffer V10n-exhaustively extracted (2-20 + lOml). the combined p _H 4.60 shaken, the organic phase phenol-chloroform extracts are prepared by a dopgefärbte, antibiotic inactive Verunreinig Filtered the folded filter and added 20 ml of water. The chloroform phase is then shaken with 35 200 ml of ether and 100 ml of petroleum ether. After 300+, 100 ml of Vw η-hydrochloric acid were extracted twice. The separation of the aqueous phase is the orgatiefrotgefärbte acid extract nachextraenthält the antibiotic African phase with twice 15 ml of water is hiert with potassium bicarbonate to p _H 3.5 overall. The combined aqueous extracts are two introduced and (g 100: 100 ml), with four 50 ml Potionen phenol-chloroform _ma l with 50 ml of ether, and once with 50 ml of benzene geform mixture back extracted. Wash and then lyophilize. 117 mg are obtained, the phenol-chloroform extract is filtered through Celite. of a brownish-red powder which, with respect to the off-The clear, red-colored filtrate (200 ml) is enriched almost 5 times under normal material, vigorous shaking with 50 ml of water, 500 ml of ether of antibiotic activity,
and 300 ml of petroleum ether are added. After detaching

der wäßrigen Phase wird die organische Phase mit 45 Beispiel 10the aqueous phase is the organic phase with 45 Example 10

zweimal 50 ml Wasser nachgewaschen. Die vereinig- 700 mg eines nach Beispiel 7 erhaltenen Anti-washed twice with 50 ml of water. The combined 700 mg of an anti-

ten wäßrigen Extrakte werden zweimal mit 500 ml biotikumpräparates werden an 127 g Whatman-Nr.-l-th aqueous extracts are added twice with 500 ml of biotic preparations to 127 g of Whatman no.-l-

Äther und einmal mit 500 ml Benzol ausgeschüttelt Cellulosepulver chromatographiert. Als ElutionsmittelEther and cellulose powder extracted once with 500 ml of benzene. As an eluent

und hierauf lyophilisiert. Man erhält 2,60 g eines verwendet man die obere Phase eines Gemisches vonand then lyophilized. 2.60 g of a mixture are obtained, if the upper phase of a mixture is used

antibiotisch hochwirksamen, orangebraungefärbten 50 4 Teilen Butanol, 1 Teil Eisessig und 5 Teilen Wasser.antibiotic highly effective, orange-brown colored 50 4 parts of butanol, 1 part of glacial acetic acid and 5 parts of water.

Pulvers. Dieses Material zeigt in bezug auf das Aus- Der abgetrennten oberen Phase werden 10 Volumpro-Powder. This material shows with respect to the separation of the separated upper phase 10 volume pro-

gangsmaterial eine 500-bis lOOOfache spezifische anti- zent reines Butanol zugesetzt. Die Substanz wird mit500 to 1,000 times the specific anti- pure butanol was added to the starting material. The substance is with

biotische Aktivität (Aktivität pro Gewichtseinheit der lOfachen Menge Cellulosepulver verrieben und alsBiotic activity (activity per unit weight of 10 times the amount of cellulose powder ground and expressed as

Trockensubstanz). Auf Whatman-Nr.-1-Papier zeigt Pulver auf die Säule aufgetragen. Die Durchlaufge-Dry matter). Whatman # 1 paper shows powder applied to the column. The throughput

dieses Material im System n-Butanol—n-Butyl- 55 schwindigkeit beträgt 15 bis 20 ml/Std. Es werdenthis material in the n-butanol-n-butyl system is at a rate of 15 to 20 ml / hour. It will

acetat—Eisessig—Wasser = 10:3:1,3:14,3 bei der Fraktionen zu 40 ml aufgefangen. Die einzelnenacetate — glacial acetic acid — water = 10: 3: 1.3: 14.3 collected from the 40 ml fractions. The single ones

autobiographischen Entwicklung mit Staphylococcus Fraktionen werden mit 50 ml Petroläther geschüttelt,autobiographical development with Staphylococcus fractions are shaken with 50 ml petroleum ether,

aureus zwei Substanzflecken. Die langsamer wan- Die ausgeschiedene wäßrige Phase wird mit Benzolaureus two spots of substance. The slower wan The precipitated aqueous phase is with benzene

dernde antibiotische Substanz wird als Base A, die gewaschen und lyophilisiert. Die Hauptmenge der anti-changing antibiotic substance is called base A, which is washed and lyophilized. The bulk of the anti-

zweieinhalbmal schneller wandernde Substanz als 60 biotischen Aktivität befindet sich in den Fraktionen 7Substance that migrates two and a half times faster than 60 biotic activity is found in fractions 7

BaseB bezeichnet. Die Base A gibt auf dem Papier und 8 (121 mg) und 10 bis 13 (142 mg). GemäßBaseB designated. The base A gives on paper and 8 (121 mg) and 10 to 13 (142 mg). According to

beim Besprühen mit Fe Cl₃+K₃ Fe C N₆ eine blaue papierchromatographischen Untersuchungen enthaltenwhen sprayed with Fe Cl ₃ + K ₃ Fe CN ₆ contain a blue paper chromatographic analysis

Farbreaktion. die Fraktionen 7 und 8 vorwiegend Base B, dieColor reaction. the fractions 7 and 8 predominantly base B, the

Beispiel 8 Fraktionen 10 bis 13 vorwiegend Base A.Example 8 Fractions 10 to 13 predominantly base A.

338 g eines nach Beispiel 6 erhaltenen Antibiotikum- Beispiel 11338 g of an antibiotic obtained according to Example 6 - Example 11

Präparates werden in 1,5 1 Wasser gelöst. Man setzt 3 g eines nach Beispiel 8 erhaltenen Antibiotikum-Preparations are dissolved in 1.5 l of water. 3 g of an antibiotic obtained according to Example 8 are used

150 g kristallines Ammcniumsulfat zu und extrahiert präparates werden in einer Craigschen Verteilungs-150 g of crystalline ammonium sulfate and extracted preparations are in a Craig distribution

die Lösung mit 11 und zweimal 500 ml eines Phenol- apparatur im System sek.Butanol—0,1 n-Ammon-the solution with 11 ml and twice 500 ml of a phenol apparatus in the system sec-butanol-0.1 n-ammonia

Chloroform-Gemisches, das 100 g Phenol in 100 ml 70 acetatpuffer, p_H 4,68, über 100 Stufen verteilt. JedeChloroform mixture, the 100 g of phenol in 100 ml of 70 acetate buffer, p _H 4.68, distributed over 100 steps. Every

Einheit enthält je 100 ml obere und untere Phase. Die Substanz wird in die Einheit Nr. 3 eingefüllt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Versetzen des Gemisches der beiden Phasen mit dem doppelten Volumen Petroläther und Lyophilisation der wäßrigen Phase. Die dunkelgefärbten Fraktionen 3 bis 11 enthalten nur wenig antibiotische Aktivität. Die orangegelbgefärbten Fraktionen 12 bis 20 (631 mg) enthalten den Hauptteil der antibiotischen Aktivität (vorwiegend Base A). Die gelbgefärbten Fraktionen 21 bis 40 sind schwächer aktiv und enthalten ein Gemisch von Base A und B, in dem die letztere überwiegt.Unit contains 100 ml each of the upper and lower phase. the Substance is poured into unit No. 3. Working up is carried out by adding the mixture of the two phases with twice the volume of petroleum ether and lyophilization of the aqueous phase. the dark colored fractions 3 to 11 contain little antibiotic activity. The orange-yellow ones Fractions 12 to 20 (631 mg) contain most of the antibiotic activity (predominantly base A). the yellow-colored fractions 21 to 40 are less active and contain a mixture of base A and B, in which the latter predominates.

Beispiel 12Example 12

200 mg eines nach Beispiel 10^! erhaltenen Antibiotikumpräparates (Base A) werden in einer Craigschen Verteilungsapparatur im System V₂₀ n-Ammoniumacetatpuffer, p_H 4,58—10% Phenol in Chloroform über 29 Stufen verteilt. Jede Stufe enthält je 10 ml obere und untere Phase. Die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität befindet sich in den Fraktionen 6 bis 15. Diese werden vereinigt (etwa 200 ml), mit 400 ml Äther und 300 ml Petroläther versetzt und geschüttelt. Die abgetrennte, orangerotgefärbte, wäßrige Phase wird mit Chloroform gewaschen und mit 20+ dreimal 10 ml eines Gemisches von 100 g Phenol in 100 ml Chloroform extrahiert. Den Phenol-Chloroform-Extrakt versetzt man unter Schütteln mit 20 ml Wasser, 300 ml Äther und 200 ml Petroläther. Die rotgefärbe wäßrige Phase wird abgetrennt, mit viel Äther und Benzol gewaschen und lyophilisiert. Man erhält 86,4 mg der Base A in Form eines gelben wasserlöslichen Pulvers.200 mg of one according to example 10 ^! antibiotic preparation (base A) obtained are distributed in a Craig's distribution apparatus in the system V ₂₀ n-ammonium acetate buffer, p _H from 4.58 to 10% phenol in chloroform over 29 stages. Each stage contains 10 ml each of the upper and lower phases. The bulk of the antibiotic activity is found in fractions 6 to 15. These are combined (about 200 ml), mixed with 400 ml of ether and 300 ml of petroleum ether and shaken. The separated, orange-red colored, aqueous phase is washed with chloroform and extracted three times with 20+ 10 ml of a mixture of 100 g of phenol in 100 ml of chloroform. The phenol-chloroform extract is mixed with 20 ml of water, 300 ml of ether and 200 ml of petroleum ether while shaking. The red colored aqueous phase is separated off, washed with a lot of ether and benzene and lyophilized. 86.4 mg of base A are obtained in the form of a yellow, water-soluble powder.

UV-Spektrum in Wasser :l_max 215 ΐημ (EJ *_m = 312), πιμ (EJl= 42).UV spectrum in water : l _max 215 ΐημ (EJ * _m = 312), πιμ (EJl = 42).

Farbreaktionen:Color reactions:

FeCl₃: Brau'nrot; Fe Cl₃ + K₃ Fe (C N) ₆ : blau; Ninhydrin: schwach positiv;FeCl ₃ : brow red; Fe Cl ₃ + K ₃ Fe (CN) ₆ : blue; Ninhydrin: weakly positive;

negativ: Sakaguchi, Maltol, Elson-Morgan.negative: Sakaguchi, Maltol, Elson-Morgan.

Die Substanz enthält neben Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff auch Eisen.In addition to carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen, the substance also contains iron.

Claims (1)

Patentanspruch:Claim: Die Verwendung von Streptomyces galilaeus n. sp. NRRL 2722 oder eines dessen Eigenschaften aufweisenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces zur Herstellung des Antibiotikums Pilosomycin bzw. seiner Komponenten durch übliche biologische Züchtung, Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat, Reindarstellung und Herstellung von dessen Salzen.The use of Streptomyces galilaeus n. Sp. NRRL 2722 or one of its properties having microorganism of the genus Streptomyces for the production of the antibiotic Pilosomycin or its components by conventional biological breeding, extraction of the antibiotic from the culture filtrate, pure preparation and production of its salts. © 009 607/362 9.60© 009 607/362 9.60