DE112012001658T5

DE112012001658T5 - Entwicklung einer phytophthoraresistenten Kartoffel mit erhöhtem Ertrag

Info

Publication number: DE112012001658T5
Application number: DE112012001658.0T
Authority: DE
Inventors: Holger Schultheiss; Timo Böhme
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Priority date: 2011-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2014-01-23
Also published as: AR086540A1; US20140196174A1; AU2012260509A1; BR112013030161A2; CA2835170A1; AU2012260509B2; WO2012160528A2; CN103842499A; WO2012160528A3; MX2013012984A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Kartoffelpflanzen mit erhöhter Resistenz gegen Phytophthora infestans und einem vergleichbaren Kartoffelknollenertrag im Vergleich zu den Wildtypkartoffelpflanzen, wobei das blb1-Gen und blb2-Gen innerhalb eines spezifischen genetischen Hintergrunds in die Kartoffelpflanze integriert sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Kartoffelpflanzen mit erhöhter Resistenz gegen Phytophthora infestans und einem vergleichbaren Kartoffelknollenertrag im Vergleich zu Wildtypkartoffelpflanzen, wobei das blb1-Gen und das blb2-Gen innerhalb eines spezifischen genetischen Hintergrunds in die Kartoffelpflanze integriert sind.
Bei der Kraut- und Knollenfäule, die von den Oomyceten Phytophthora infestans verursacht wird, handelt es sich um eine der wichtigsten Bedrohungen der weltweiten Kartoffelproduktion. Trotz langjähriger Resistenzzüchtung ist der einzig wirksame Weg zum Verhindern von Ernteausfällen oder Ertragsverlusten die Ausbringung von Fungiziden, die eine Infektion durch P. infestans präventiv oder kurativ bekämpfen können. Da die Kraut- und Knollenfäulekrankheit sehr rasch voranschreitet, ist ein schlagkräftiges Fungizidbehandlungsschema erforderlich, mit dem begonnen werden muss, bevor die ersten Symptome auftreten. Außerdem scheint P. infestans ein hohes Adaptionspotential für spezifische Fungizide sowie für die Entwicklung von Resistenz aufzuweisen, wie dies bereits bei den Metalaxyl-Fungiziden beobachtet wurde (Gisi U., Cohen Y. (1996) Resistance to phenylamide fungicides: A case study with Phytophthora infestans involving mating type and race structure Annual Rev. Phytopathol. 34: 549–572).
In verschiedenen Ländern Westeuropas wird die Gesetzgebung beim Einsatz von Pflanzenschutzprodukten in Bezug auf die Ausbringung von spezifischen Fungiziden immer strenger, wodurch eine Durchführung von chemischen Bekämpfungsmaßnahmen der Krankheit und die Vorbeugung der Entwicklung von Resistenz schwieriger werden.
Ein alternativer und/oder komplementärer Ansatz zum Einsatz von Fungiziden ist die Entwicklung von Kartoffelsorten mit verbesserter Resistenz gegen P. infestans.
In den letzten Jahren wurden auf dem klassischen Züchtungsweg zwei Kartoffelsorten, die von S. bulbocastanum stammende Resistenz enthalten, entwickelt. Beide Sorten, nämlich Toluca und Bionica, enthalten ein einzelnes S. bulbocastanum-Resistenzgen, das eine vollständige Resistenz gegen P. infestans vermittelt. Vom agronomischen Standpunkt jedoch entsprechen die beiden Kartoffelsorten punkto ihres Ertragspotentials nicht einer modernen Kartoffelsorte.
Da sich die Introgression der von S. bulbocastanum stammenden Resistenz in moderne Kartoffelsorten als schwierig und zeitaufwändig erwiesen hat, besteht ein wesentlich schlagkräftigerer Ansatz in der Isolation der Gene, die in S. bulbocastanum für Phytophthoraresistenz codieren, und ihr Transfer in derzeitig verfügbare Kartoffelsorten auf biotechnologischem Weg.
Um die langzeitresistenen Kartoffelpflanzen zu erzeugen, wurden das Rpi-blb1-Gen und das Rpi-blb2-Gen unter der Kontrolle ihrer nativen Regulationselemente kombiniert. Das erhaltene Vektorkonstrukt enthielt die genomische Sequenz des Rpi-blb1-Gens unter der Kontrolle des nativen Rpi-blb1-Promoters und Rpi-blb1-Terminators, die alle von S. bulbocastanum stammen, in Kombination mit der genomischen Sequenz des Rpi-blb2-Gens unter der Kontrolle des nativen Rpi-blb2-Promoters und Rpi-blb2-Terminators, die alle aus S. bulbocastanum stammen ( WO 2008/034876 ). Die erhaltenen transgenen Kartoffeln, die blb1-Protein und blb2-Protein exprimieren, wiesen eine erhöhte Resistenz gegen Phytophthora infestans auf. Es wurde jedoch gefunden, dass der Ertrag der entwickelten Kartoffelpflanzen verringert war.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Kartoffelpflanzen mit einer verbesserten Resistenz gegen Phytophthora infestans und einem vergleichbaren Ertrag zu der Wildtypkartoffel bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und die eingeschlossenen Beispiele besser zu verstehen sein. Falls nicht anders erwähnt, sollen die hier verwendeten Fachausdrücke so verstanden werden, wie sie vom Durchschnittsfachmann üblicherweise eingesetzt werden. Zusätzlich zu den hier bereitgestellten Definitionen von Ausdrücken können Definitionen von häufigen Ausdrücken der Molekularbiologie auch bei Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5. Ausg., Berlin: Springer-Verlag; und in Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement) gefunden werden. In der Beschreibung und den Ansprüchen sollen „ein/e” je nach dem Zusammenhang, in dem das Wort verwendet wird, „ein/e oder mehrere” bedeuten. So zum Beispiel kann „eine Zelle” bedeuten, dass mindestens eine Zelle verwendet werden kann. Die hier verwendete Terminologie dient lediglich der Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen und soll nicht als einschränkend aufgefasst werden.
In der gesamten vorliegenden Anmeldung werden verschiedene Veröffentlichungen zitiert. Die Offenbarungen von allen diesen Veröffentlichungen und den in diesen Veröffentlichungen zitierten Literaturstellen werden hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, ausführlicher zu beschreiben. Standardtechniken für die Klonierung, DNA-Isolation, Amplifikation und Aufreinigung, für Enzymreaktionen unter Verwendung von DNA-Ligase, DNA-Polymerase, Restriktionsendonukleasen und dergleichen sowie verschiedene Trennungstechniken sind die bekannten und üblicherweise vom Fachmann eingesetzten Techniken. Verschiedene Standardtechniken sind beschrieben bei Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y.; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y.; Wu (Hrsg.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Hrsg.) 1979 Meth. Enzymol. 68; Wu et al., (Hrsg.) 1983 Meth. Enzymol. 100 und 101; Grossman und Moldave (Hrsg.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Hrsg.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.; Old und Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif und Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Hrsg.) 1985 DNA Cloning Bd. I und II, IRL Press, Oxford, UK; Hames und Higgins (Hrg.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; und Setlow und Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Bd. 1–4, Plenum Press, New York. Die verwendeten Abkürzungen und die verwendete Nomenklatur gelten als fachüblich und werden üblicherweise in Fachzeitschriften, wie sie im vorliegenden Text zitiert werden, verwendet.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung wird durch die Bereitstellung einer phytophthoraresistenten transgenen Kartoffelpflanze, eines Samens, einer Knolle, einer Pflanzenzelle oder eines Gewebes davon mit einer spezifischen Integrationsstelle für das blb1-Gen und das blb2-Gen erreicht.
In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine phytophthoraresistente transgene Kartoffelpflanze, Samen, Knolle, Pflanzenzelle oder Gewebe davon, vorzugsweise umfassend eine Nukleotidsequenz mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 1, bereitgestellt (vgl. 2a).
In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine phytophthoraresistente transgene Kartoffelpflanze, Samen, Knolle, Pflanzenzelle oder Gewebe davon, umfassend eine Nukleotidsequenz mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3, die von flankierenden Regionen mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 20 und/oder SEQ ID NO: 21 flankiert ist, bereitgestellt (vgl. 2b, c, e).
SEQ ID NO: 1 bezieht sich auf den Teil des in das Pflanzengenom insertierten rekombinanten Konstrukts einschließlich des blb1-Gens, des blb2-Gens und des ahas-Gens, wobei SEQ ID NO: 1 weiterhin die flankierenden genomischen Sequenzen der Pflanze beinhaltet (vgl. 2a).
SEQ ID NO: 2 bezieht sich auf den Teil des in das Pflanzengenom insertierten rekombinanten Konstrukts einschließlich des blb1-Gens, des blb2-Gens und des ahas-Gens. Vorzugsweise werden das blb1-Gen, das blb2-Gen und gegebenenfalls das ahas-Gen exprimiert, wenn eine Sequenz mit mindestens 80% Identität zu SEQ ID NO: 2 in das Pflanzengenom insertiert wird. Vorzugsweise werden das blb1-Gen, das blb2-Gen und/oder das ahas-Gen exprimiert, wenn eine Sequenz mit mindestens 80% Identität zu SEQ ID NO: 2 in das Pflanzengenom insertiert wird (vgl. 2b).
SEQ ID NO: 3 bezieht sich auf den Teil des in das Pflanzengenom insertierten rekombinanten Konstrukts, der das blb1-Gen und das blb2-Gen beinhaltet, jedoch ohne das ahas-Markergen. Vorzugsweise werden das blb1-Gen und das blb2-Gen exprimiert, wenn eine Sequenz mit mindestens 80% Identität zu SEQ ID NO: 3 in das Pflanzengenom insertiert wird (vgl. 2c).
SEQ ID NO: 2 und/oder 3 können weiter unten als Insert bezeichnet werden.
SEQ ID NO: 20 bezieht sich auf die linke flankierende Region des Inserts mit SEQ ID NO: 2 oder 3.
SEQ ID NO: 21 bezieht sich auf die rechte flankierende Region des Inserts mit SEQ ID NO: 2 oder 3.
Der Begriff „flankierende Region” bezieht sich auf die Region des Pflanzengenoms, die entweder die linke oder rechte Seite des Inserts, das in das Pflanzengenom integriert wird, flankiert.
In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine phytophthoraresistente transgene Kartoffelpflanze, ein Samen, eine Knolle, eine Pflanzenzelle oder ein Gewebe davon, umfassend

a) ein rekombinantes Konstrukt mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und
b) weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 126 und 136 Basenpaaren amplifiziert werden kann, ii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 505 und 515 Basenpaaren amplifiziert werden kann, iii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 625 und 635 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder iv) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 4752 und 4762 Basenpaaren amplifiziert werden kann,

weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
v) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 282 und 292 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
vi) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 877 und 887 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
vii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 827 und 837 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder
viii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 9905 und 9915 Basenpaaren amplifiziert werden kann,

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine phytophthoraresistente transgene Kartoffel, ein Samen, eine Knolle, eine Pflanzenzelle oder ein Gewebe davon, umfassend

a) ein rekombinantes Konstrukt mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und
b) weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
i) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 131 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
ii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 510 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
iii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 630 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder
iv) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 4757 Basenpaaren amplifiziert werden kann,

weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus v) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 287 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vi) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 882 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
vii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 832 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder
viii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 9910 Basenpaaren amplifiziert werden kann,

Eine Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern ein Nukleotidfragment mit einer gewissen Länge amplifiziert werden kann, bedeutet das Produkt der Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern. Insbesondere bedeutet dies eine Nukleinsäuresequenz, die unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern zu einem Nukleotidfragment mit einer gewissen Länge amplifiziert worden ist.
Eine Verbindungssequenz beinhaltet entweder einen rechten oder linken Teil des in das Pflanzengenom insertierten rekombinanten Konstrukts und beinhaltet teilweise Pflanzengenomsequenzen der flankierenden Region des rechten oder linken Teils des rekombinanten Konstrukts. Insbesondere umfasst die Verbindungssequenz entweder einen linken Teil des rekombinanten Konstrukts mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder 3 und einen Teil der flankierenden Region mit mindestens 80% Identität zu SEQ ID NO: 20 oder einen rechten Teil des rekombinanten Konstrukts mit mindestens 80% Identität zu SEQ ID NO: 2 oder 3 und einen Teil der flankierenden Region mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 21. Identität in Bezug auf Partialsequenzen des rekombinanten Konstrukts bedeutet in diesem Fall Identität über die gesamte Länge des linken oder rechten Teils des rekombinanten Konstrukts (2e).
Insbesondere besteht zumindest eine teilweise Überlappung von entweder einem Teil des linken Teils des rekombinanten Konstrukt mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder 3 und der Verbindungssequenz mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 22 oder von einem Teil des rechten Teils des rekombinanten Konstrukts mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder 3 und der Verbindungssequenz mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 23. Identität in Bezug auf Partialsequenzen des rekombinanten Konstrukts bedeutet in diesem Fall Identität über die gesamte Länge des linken oder rechten Teils des rekombinanten Konstrukts (2e).
PCR bedeutet Polymerasekettenreaktion, d. h. die selektive Anreicherung von Nukleinsäuren mit definierter Länge innerhalb einer Mischung von Nukleinsäuren mit Primern mit Spezifität für die Nukleinsäure unter Verwendung der Taq-Polymerase oder dergleichen ( US 5,656,493 ; Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y.).
In einer alternativen Ausführungsform wird eine phytophthoraresistente transgene Kartoffel, ein Samen, eine Knolle, eine Pflanzenzelle oder ein Gewebe davon, umfassend

a) ein rekombinantes Konstrukt mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend

Eine transgene Kartoffelpflanze, ein Samen, eine Knolle, eine Pflanzenzelle oder ein Gewebe davon gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend das rekombinante Konstrukt, das wie oben definiert amplifizierbar ist, kann durch Vermehren oder Kreuzen einer Kartoffelpflanze mit einer von dem Samen der oben beschriebenen Pflanzen des Elite-Event D erhaltenen Kartoffelpflanze und anschließendes Selektieren der Pflanzen, die das rekombinante Konstrukt tragen, durch Nachweis mittels PCR unter Verwendung der oben definierten Primerpaare erhalten werden. Die Beeren, die das enthalten, können von Hand geerntet, extrahiert und jüngst getrocknet werden. Die Samen können bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Um die Keimruhe zu brechen und das Keimen zu fördern, können die Samen mit 0,04% GA (Gibberellinsäure) behandelt werden.
In einer Ausführungsform wird für das Kreuzen der Pollen des männlichen Elter vom Staubgefäß auf das isolierte Fruchtblatt des weiblichen Elters transferiert. Die Beeren, die reinerbige Samen tragen, werden geerntet und die Samen werden von der Schale und dem Fleisch der Beeren getrennt. Die Samen werden ausgepflanzt, zu Pflanzen herangezogen, und die Pflanzen, die das rekombinante Konstrukt tragen, werden anschließend durch Nachweisen mittels PCR unter Verwendung der oben definierten Primerpaare selektiert.
Der weibliche Kreuzungspartner und/oder der männliche Kreuzungspartner kann/können die phytophthoraresistente transgene Kartoffelpflanze gemäß der vorliegenden Erfindung sein. In einer Ausführungsform ist der weibliche Kreuzungspartner die phytophthoraresistente transgene Kartoffelpflanze gemäß der vorliegenden Erfindung und der männliche Kreuzungspartner kann eine nichttransgene Pflanze sein, die zum Beispiel aus der Gruppe bestehend aus Agria, Sarpo Mira, Cara, Valor, Innovator, Diamant und Bintje ausgewählt ist. In einer alternativen Ausführungsform ist der männliche Kreuzungspartner die phytophthoraresistente transgene Kartoffelpflanze gemäß der vorliegenden Erfindung und der weibliche Kreuzungspartner kann eine nichttransgene Pflanze sein, die zum Beispiel aus der Gruppe bestehend aus Agria, Sarpo Mira, Cara, Valor, Innovator, Diamant und Bintje ausgewählt ist.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bereitstellen einer phytophthoraresistenten transgenen Kartoffelpflanze oder eines Teils davon, umfassend die folgenden Schritte:

a) Einführen einer rekombinanten Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 in das Genom von Kartoffelpflanzenzellen,
b) Integrieren der rekombinanten Nukleinsäure in das Genom,
c) Regenerieren von Pflanzen aus den Pflanzenzellen,
d) Selektieren von Pflanzen, umfassend eine Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Sequenz mit mindestens 80% Identität zu SEQ-ID-No. 22 und/oder SEQ-ID-No. 23 bereit.

In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bereitstellen einer phytophthoraresistenten transgenen Kartoffelpflanze oder eines Teils davon, umfassend die folgenden Schritte:

a) Einführen einer rekombinanten Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 in das Genom von Kartoffelpflanzenzellen,
b) Integrieren der rekombinanten Nukleinsäure in das Genom,
c) Regenerieren von Pflanzen aus den Pflanzenzellen,
d) Selektieren von Pflanzen, umfassend eine Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und einer Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
i) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 126 und 136 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
ii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 505 und 515 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
iii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 625 und 635 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder
iv) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 4752 und 4762 Basenpaaren amplifiziert werden kann

Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Bereitstellen einer phytophthoraresistenten transgenen Kartoffelpflanze oder eines Teils davon bereit, wobei in Schritt d) Pflanzen, umfassend
eine Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und einer Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

i) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 131 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
ii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 510 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
iii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 630 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder
iv) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 4757 Basenpaaren amplifiziert werden kann,

v) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 287 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
vi) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 882 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
vii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 832 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder
viii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 9910 Basenpaaren amplifiziert werden kann,

In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Kit für den Nachweis der spezifischen Integrationsstelle, insbesondere für den Nachweis von Elite-Event D, umfassend die Primerpaare
SEQ ID NO: 4 und 5,
SEQ ID NO: 6 und 7,
SEQ ID NO: 8 und 9,
SEQ ID NO: 10 und 11,
SEQ ID NO: 12 und 13,
SEQ ID NO: 14 und 15,
SEQ ID NO: 16 und 17 und/oder
SEQ ID NO: 18 und 19
bereit.
Das Kit kann für Zwecke der Qualitätskontrolle (z. B. Reinheit von Saatgutchargen), des Nachweisens der spezifischen Integrationsstelle in Pflanzenmaterial oder Material, das Pflanzenmaterial umfasst oder von Pflanzenmaterial abgeleitet ist, wie Pommes Frites, Kartoffelmehl, Kartoffelbrei usw., verwendet werden, ist jedoch nicht auf Nahrungs- oder Futtermittelprodukte beschränkt.
Kurz beschrieben wird genomische DNA mittels PCR unter Verwendung eines Primers, der spezifisch die 5'- oder 3'-seitige flankierende Sequenz der Insertionsstelle in das Elite-Event D erkennt, amplifiziert, insbesondere die oben erwähnten Primerpaare, z. B. die Primer SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 bzw. SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 bzw. SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 bzw. SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 bzw. SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 bzw. SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 bzw. SEQ ID NO: 19. Wenn eine mit dem Pflanzenmaterial durchgeführte PCR unter Verwendung der oben erwähnten Primerkombinationen ein Fragment von
126 bis 136 Bp (131 Bp),
505 bis 515 Bp (510 Bp),
625 bis 536 Bp (630 Bp),
282 bis 292 Bp (287 Bp),
877 bis 887 Bp (882 Bp),
827 bis 837 Bp (832 Bp),
4752 bis 4762 Bp (4757 Bp) bzw.
9905 bis 9915 Bp (9910)
ergibt, so gilt als nachgewiesen, dass die transgene Pflanze die hierin definierte spezifische Integrationsstelle, z. B. das selektierte Elite-Event D, aufweist. Die Fragmentlänge kann mittels Gelelektrophorese unter Verwendung von Markern bestimmt werden, Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y.).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Nachweisverfahren für eine spezifische Integrationsstelle, vorzugsweise für die Identifikation des Elite-Event-D, umfassend die Schritte

a) Isolieren von DNA aus einer Kartoffelpflanze als Testprobe,
b) Exponieren der Testprobe, einer Positivprobe und einer Negativprobe mit einem wie oben definierten Primerpaar unter PCR-Bedingungen, und
c) Auswerten der Amplifikation eines DNA-Fragments
i) mit einer Größe zwischen 126 und 136 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5,
ii) mit einer Größe von zwischen 505 und 515 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7,
iii) mit einer Größe von 625 und 635 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 und/oder
iv) mit einer Größe von 4752 und 4762 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11

v) mit einer Größe zwischen 282 und 292 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13,
vi) mit einer Größe von 877 und 292 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15,
vii) mit einer Größe von 827 und 837 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 und/oder
viii) mit einer Größe von 9905 und 9915 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19

In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet Auswerten im Schritt e) die Amplifikation eines Nukleotidfragments, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleotidfragment

i) mit einer Größe von 131 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5,
ii) mit einer Größe von 510 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7,
iii) mit einer Größe von 630 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 und/oder
iv) mit einer Größe von 4757 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11

einem Nukleotidfragment, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleotidfragment
v) mit einer Größe von 287 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13,
vi) mit einer Größe von 882 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15,
vii) mit einer Größe von 832 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 und/oder
viii) mit einer Größe von 9910 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19,

Die Testprobe umfasst aus transformiertem Pflanzenmaterial, z. B. aus Pflanzen, Samen, Knollen, Pflanzenzellen oder einem Gewebe davon, isolierte genomische DNA. Die Positivprobe ist eine Probe, die aus Pflanzen umfassend SEQ ID NO: 1 isolierte genomische DNA umfasst. Die Negativprobe ist eine Probe, die aus der für die Transformation verwendeten nichttransgenen ursprünglichen Sorte, z. B. der Sorte Fontane, isolierte genomische DNA umfasst.
Die PCR-Reaktion kann mit verschiedenen DNA-Polymerasen erfolgen, wie der Pfu Ultra, Pfu Turbo oder Herculase DNA-Polymerase (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Die Zusammensetzung für das Protokoll der Pfu Ultra, Pfu Turbo oder Herculase DNA-Polymerase kann wie folgt sein: 1 × PCR-Puffer, jeweils 0,2 mM dNTP, 1 μg genomische DNA der Probe, 50 pmol Forward-Primer, 50 pmol Reverse-Primer, 1 u Pfu Ultra, Pfu Turbo oder Herculase DNA-Polymerase.
Die Amplifikationszyklen können wie folgt sein:
1 Zyklus von 60 Sekunden bei 98°C, gefolgt von 35 Zyklen mit jeweils 10 Sekunden bei 98°C, 30 Sekunden bei der in der Tabelle unten angegebenen Annealing-Temperatur, und 60 Sekunden pro 1000 Bp Produktlänge (siehe Tabelle unten) bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 10 Minuten bei 72°C, dann 4°C. Tabelle 1
In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Pflanze, eine Knolle, ein Samen, die bzw. der mit dem oben definierten Kit oder mit dem oben definierten Nachweisverfahren nachweisbar ist, bereitgestellt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Polynukleotid, umfassend

a) eine rekombinante Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und
b) weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
i) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 126 und 136 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
ii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 505 und 515 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
iii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 625 und 635 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder
iv) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 4752 und 4762 Basenpaaren amplifiziert werden kann,

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Polynukleotid, umfassend

a) eine rekombinante Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und
b) weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
i) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 131 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
ii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 510 Basenpaaren amplifiziert werden kann,
iii) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 630 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder
iv) einer Nukleinsäuresequenz, mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 4757 Basenpaaren amplifiziert werden kann,

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Polynukleotid mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 22 oder 23 bereitgestellt.
Eine bevorzugte Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 1, vorzugsweise stabil in einen Kartoffelpflanzenzellkern integriert.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestenst 98%, mindestens 99% oder mit 100% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 44, vorzugsweise stabil in das Genom einer Kartoffelpflanzenzelle integriert.
In einer weiteren Ausführungsform wiederum umfasst das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mit 100% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1, 2, 3, 44 und/oder 45 und umfassend das blb1-Gen und das blb2-Gen, stabil in das Genom einer Kartoffelpflanzenzelle integriert. Das Polynukleotid kann auch noch eine oder mehrere der SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 und/oder 19 in den die Inserts flankierenden Regionen umfassen.
In einer Ausführungsform umfasst das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz mit mindestens 80% Identität zu SEQ ID NO: 1, 44 und/oder 45 und umfasst das blb1-Gen und das blb2-Gen und eine oder mehrere von SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 und/oder 19 in den die Inserts flankierenden Regionen.
„Polynukleotide” gemäß der vorliegenden Erfindung können isolierte Polynukleotide und/oder rekombinante Polynukleotide sein. Rekombinante Polynukleotide oder rekombinantes Konstrukt bedeuten jegliches Polynukleotid, das durch gentechnische Modifikation, z. B. vom Menschen, erzeugt wurde. Die Gentechnikmodifikation kann das Transformieren einer Pflanzenzelle mit einer Nukleotidsequenz, vorzugsweise unter Einsatz von Agrobakterien, sein.

„Identität” zwischen zwei Nukleinsäuren und/oder bezieht sich jeweils über die gesamte Länge der Nukleinsäuren. So zum Beispiel kann die Identität mit der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal-Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments an a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2): 151–1) unter Einstellung der folgenden Parameter berechnet werden: Multiple alignment parameter:

Gap opening penalty	10
Gap extension penalty	10
Gap separation penalty range	8
Gap separation penalty	off
% identity for alignment delay	40
Residue specific gaps	off
Hydrophilic residue gap	off
Transition weighing	0

Pairwise alignment parameter:

FAST algorithm	on
K-tuple size	1
Gap penalty	3
Window size	5
Number of best diagonals	5

Alternativ dazu kann die Identität nach Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13): 3497–500, Internetseite: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html und den folgenden Parametereinstellungen bestimmt werden:

DNA Gap Open Penalty	15.0
DNA Gap Extension Penalty	6.66
DNA Matrix	Identity
Protein Gap Open Penalty	10.0
Protein Gap Extension Penalty	0.2
Protein matrix	Gonnet
Protein/DNA ENDGAP	–1
Protein/DNA GAPDIST	4

Alle im vorliegenden Text erwähnten Nukleinsäuresequenzen können auf bekannte Weise mittels chemischer Synthese aus den Nukleotidbausteinen erzeugt werden, zum Beispiel durch Fragmentkondensation von einzelnen überlappenden, komplementären Nukleinsäurebausteinen der Doppelhelix. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann zum Beispiel auf bekannte Weise nach dem Phosphoamiditverfahren erfolgen (Voet, Voet, 2. Ausgabe, Wiley Press, New York, S. 896–897). Die Akkumulation von synthetischen Oligonukleotiden und das Auffüllen von „Gaps” mit dem DNA-Polymerase-Klenow-Fragment und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungstechniken sind bei Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben.
Die Sequenzidentität kann optimiert werden durch Sequenzvergleich und Alignment-Algorithmen, die fachbekannt sind (siehe Gribskov und Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991 und darin genannte Literaturstellen), und Berechnen des prozentualen Unterschieds zwischen den Nukleotidsequenzen nach zum Beispiel dem Smith-Waterman-Algorithmus, wie dies beim BESTFIT-Softwareprogramm unter Einsatz von Default-Parametern erfolgt (z. B. University of Wisconsin Genetic Computing Group). Mindestens 80% Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens 85% Sequenzidentität, besonders bevorzugt mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% Sequenzidentität oder sogar 100% Sequenzidentität mit der Nukleinsäure mit SEQ ID NO: 1, 2, 3, 20, 21, 22, 23, 44 und/oder 45 ist bevorzugt.
Das rekombinante Konstrukt kann Nukleotide mit Nukleinsäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu der jeweiligen nichtmodifizierten Nukleinsäure umfassen, wobei das von solchen Nukleinsäuren codierte Protein eine ähnliche oder höhere funktionelle Aktivität als das unmodifizierte Protein, das von der unmodifizierten Nukleinsäure, von der sie abstammen, codiert wird, aufweist. Die Substitutionen können auf dem degenerierten Aminosäure-Code beruhen.
Eine „Deletion” bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein oder auf die Entfernung von einer oder mehreren Nukleinsäuren aus DNA.
Eine „Insertion” bezieht sich auf die Einführung von einer oder mehreren Nukleinsäureresten an eine vorbestimmte Stelle in der Nukleinsäure.
Verfahren zum Manipulieren von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind in der Fachwelt gut bekannt. So zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann gut bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen in vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), „QuickChange Site Directed”-Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), die PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder andere Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese ein.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „rekombinantes Konstrukt” auf eine Expressionskassette mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 und/oder 3. In einer Ausführungsform weisen Homologe der Expressionskassette auf DNA-Niveau mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Identität über die gesamte DNA-Region von SEQ ID NO:. 2 und/oder 3 auf. Vorzugsweise umfasst das rekombinante Konstrukt das blb1-Gen einschließlich des blb1-Pomoters und des blbl-1-Terminators sowie das blb2-Gen einschließlich des blb2-Promoters und des blbl-2-Terminators wie im Folgenden definiert, sowie ein mutiertes ahas-Gen einschließlich des p-nos-Promoters und des t-nos-Promoters, die vorzugsweise fähig sind, das blb1-Gen und das blb2-Gen und gegebenenfalls das ahas-Gen zu exprimieren. Das rekombinante Konstrukt kann durch gentechnische Verfahren, zum Beispiel Transformation mit Agrobakterien, in eine Pflanzenzelle eingeführt werden.
In einer Ausführungsform umfasst das rekombinante Konstrukt bzw. die rekombinante Expressionskassette oder transgene Pflanze die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 44 und/oder 45.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „blb1-Gen” auf ein Gen mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 46. In einer Ausführungsform weisen Homologe des blb1-Gens auf DNA-Niveau mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Identität über die gesamte DNA-Region von SEQ ID NO: 46 auf.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „blb2-Gen” auf ein Gen mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 47. In einer Ausführungsform weisen Homologe des blb2-Gens auf DNA-Niveau mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Identität über die gesamte DNA-Region von SEQ ID NO: 47 auf.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „mutiertes ahas-Gen” auf ein Gen mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 48. In einer Ausführungsform weisen Homologe des mutierten ahas-Gens auf DNA-Niveau mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Identität über die gesamte DNA-Region von SEQ ID NO: 48 auf.
Vorzugsweise exprimiert die phythphthoraresistente transgene Kartoffelpflanze, der Samen, die Knolle, die Pflanzenzelle oder das Gewebe davon ein funktionelles Protein, das dem blb1-Gen und dem blb2-Gen entspricht, und gegebenenfalls das ahas-Gen. Vorzugsweise exprimiert die phythphthoraresistente transgene Kartoffelpflanze, der Samen, die Knolle, die Pflanzenzelle oder das Gewebe davon SEQ ID NO: 46 und 47 und gegebenenfalls SEQ ID NO: 48 und/oder das entsprechende Protein (vgl. 2h).
Die transgene Pflanze, der Samen, die Knolle, die Pflanzenzelle oder das Gewebe davon gemäß der vorliegenden Erfindung weisen eine Phytophthoraresistenz im Vergleich zu der Wildtyppflanze auf.
Die Wildtyppflanze ist eine Pflanze mit einem ähnlichen, stärker bevorzugt identischen, Genotyp wie die transgene Pflanze mit erhöhter Resistenz gegen die Phytophthoraresistenz, umfasst jedoch nicht eine rekombinante Nukleinsäure, umfassend das blb1-Gen und das blb2-Gen, die vorzugsweise von ihren jeweiligen natürlichen Promotern und Terminatoren reguliert werden.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „Phytophthoraresistenz” oder „phytophthoraresistent” das Reduzieren oder Vorbeugen einer Infektion durch Phytophthora infestans. Phytophthoraresistenz impliziert nicht, dass die Pflanze zwingenderweise 100% Resistenz gegen die Infektion aufweist. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Resistenz gegen Infektion durch Phytophthora infestans in einer resistenten Pflanze höher als 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% im Vergleich zu einer Wildtyppflanze, die nicht gegen Phytophthora infestans resistent ist.
Der Begriff „Phytophthoraresistenz” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf die Fähigkeit einer Pflanze, im Vergleich zu einer Wildtyppflanze Infektion durch Phytophthora infestans zu vermeiden, von Phytophthora infestans abgetötet zu werden, die Entwicklung, das Wachstum und/oder die Vermehrung von Phytophthora infestans zu hemmen, zu reduzieren, zu verzögern, zu stoppen. Das Ausmaß der Phytophthora-infestans-Resistenz einer Pflanze kann auf verschiedene Weise bestimmt werden, zum Beispiel durch Bonitieren/Messen der infizierten Blattfläche im Vergleich zu der Blattfläche insgesamt. Eine weitere Möglichkeit, das Resistenzniveau zu bestimmen, besteht darin, die Anzahl der Phytophthora-infestans-Kolonien auf der Pflanze zu zählen oder die von diesen Kolonien produzierte Sporenmenge zu messen. Eine weitere Möglichkeit, das Ausmaß des Pilzbefalls zu bestimmen, besteht darin, die Phytophthora-infestans-Menge mittels quantitativer (q) PCR spezifisch zu messen (z. B. Llorente et al. (2010) A quantitative real-time PCR method for in planta monitoring of Phytophthora infestans growth. Lett. Appl. Microbiol. 51(6): 603–10).
Weiterhin stellt die transgene Pflanze, der Samen, die Knolle, die Pflanzenzelle oder das Gewebe davon gemäß der vorliegenden Erfindung einen „vergleichbaren Ertrag” im Vergleich zu der Wildtyppflanze, dem Samen, der Knolle, der Pflanzenzelle oder dem Gewebe davon bereit.
Der Begriff „vergleichbarer Ertrag” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf die Fähigkeit der transgenen Kartoffelpflanze, im Vergleich zur Wildtyppflanze eine ähnliche Knollenmenge bereitzustellen. Eine ähnliche Knollenmenge bedeutet, dass der relative Ertrag der transgenen Knollen in Bezug auf den Ertrag der Wildtypknollen pro ha (kg/ha) mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% des Ertrags der Wildtypknollen pro ha oder stärker bevorzugt derselbe Ertrag Wildtypknollen pro ha oder mehr ist.
Der prozentuale relative Ertrag wird folgendermaßen berechnet: % = transgene Knollen (kg/ha) × 100%/Wildtypknollen (kg/ha).
Der Begriff „Pflanze” soll Pflanzen zu jeglichem Reife- oder Entwicklungsstadium umfassen, sowie beliebige Gewebe oder Organe (Pflanzenteile), die von diesen Pflanzen entnommen wurden oder stammen, falls aus dem Zusammenhang nicht anders ersichtlich. Zu Pflanzenteilen zählen, jedoch ohne Einschränkung, Pflanzenzellen, Stengel, Wurzeln, Blüten, Ovula, Staubblätter, Samen, Blätter, Embryonen, Meristemregionen, Kallusgewebe, Antherenkulturen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen, Mikrosporen, Protoplasten, Haarwurzelkulturen und/oder dergleichen. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet eine „Pflanzenzelle”, jedoch ohne Einschränkung, einen Protoplasten, eine gametenproduzierende Zelle und eine Zelle, die sich zu einer ganzen Pflanze regeneriert. Gewebekulturen von verschiedenen Pflanzengeweben und die Regeneration von Pflanzen hieraus ist in der Fachwelt gut bekannt und wird breit eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch von den Pflanzen der vorliegenden Erfindung produzierte Samen. Vorzugsweise umfassen die Samen eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 1. Die regenerierten transformierten Pflanzen können durch Klonieren oder durch traditionelle Züchtungstechniken vermehrt werden.
Für die Zwecke der Erfindung bedeutet „rekombinantes Konstrukt” oder „rekombinante Nukleinsäure” eine Expressionskassette oder ein Vektorkonstrukt, umfassend das blb1-Gen und das blb2-Gen in Kombination mit ihren natürlichen Promotern und Terminatoren. Die Expressionskassette, umfassend das blb1-Gen, das blb2-Gen, den blb1-Promoter, den blb2-Promoter, den blb1-Terminator und den blb2-Terminator sind oben definiert.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „transgen” vorzugsweise auf eine beliebige Pflanze, eine beliebige Pflanzenzelle, eine beliebige Knolle, einen beliebigen Kallus, ein beliebiges Pflanzengewebe oder einen beliebigen Pflanzenteil, die/der/das das rekombinante Konstrukt oder einen Teil davon enthält, welches/welcher durch im Wesentlichen nichtbiologische Verfahren, vorzugsweise Transformation mit Agrobakterien, eingeführt wird. Das rekombinante Konstrukt oder ein Teil davon ist in ein Chromosom stabil integriert, so dass es durch Klonierung, vegetative Vermehrung oder geschlechtliche Vermehrung an Folgegenerationen weitergegeben wird. Die Folgegenerationen sind ebenfalls transgen. Im Wesentlichen biologische Verfahren können das Kreuzen von Pflanzen und/oder die natürliche Rekombination sein.
Unter einer transgenen Kartoffelpflanze, Samen, Knolle, Pflanzenzelle oder Gewebe davon versteht man also für die Zwecke der Erfindung, dass sich die rekombinante Kassette in das Genom integriert hat. Vorzugsweise sind das blb1-Gen und/oder das blb2-Gen und/oder das ahas-Gen im Genom der Ursprungspflanze nicht vorhanden und sind vorzugsweise im Genom der transgenen Pflanze nicht an ihrem natürlichen Locus des Genoms der Ursprungspflanze vorhanden.
Natürlicher Locus bedeutet die Lage auf einem spezifischen Chromosom, vorzugsweise die Lage zwischen bestimmten Genen, stärker bevorzugt derselbe Sequenzhintergrund wie in der Ursprungspflanze, die transformiert wird.
Vorzugsweise exprimiert die transgene Kartoffelpflanze, Samen, Knolle, Pflanzenzelle oder Gewebe davon das blb1-Gen und das blb2-Gen. Der Begriff „Expression” oder „exprimieren” bedeutet das Transkribieren eines spezifischen Gens oder von spezifischen Genen oder eines spezifischen genetischen Vektorkonstrukts. Der Begriff „Expression” oder „exprimieren” bedeutet insbesondere die Transkription eines Gens oder von Genen oder eines genetischen Vektorkonstrukts in Struktur-RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA, wobei letztere vorzugsweise anschließend in ein Protein translatiert wird.
Der Begriff „erhöhte Expression” oder „Überexpression” oder „Erhöhung des Gehalts” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine beliebige Form der Expression, die zusätzlich zu dem ursprünglichen Wildtypexpressionsniveau ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung könnte das ursprüngliche Wildtypexpressionsniveau auch null sein (Fehlen von Expression oder Fehlen des/der entsprechenden Gens/Gene).
Die Wildtyppflanzenzellen können mit einem der oben beschriebenen rekombinanten Konstrukte transformiert werden. Geeignete Verfahren zum Transformieren von Wirtszellen, darunter Pflanzenzellen, sind auf dem Gebiet der pflanzlichen Biotechnologie gut bekannt. Zum Hineintransformieren des rekombinanten Expressionsvektors in Pflanzenzellen, um zu den transgenen Pflanzen der Erfindung zu gelangen, kann jegliches Verfahren verwendet werden. Die Wildtyppflanzenzellen können zum Beispiel von Fontane, Agria, Bientje, Sarpo Mira, Cara, Valor, Innovator, Diamant stammen.
Die Transformation kann auch durch Bakterieninfektion mittels Agrobacterium (zum Beispiel EP 0 116 718 ), Virusinfektion mittels Virusvektoren ( EP 0 067 553 ; US 4,407,956 ; WO 95/34668 ; WO 93/03161 ) oder mittels Pollen ( EP 0 270 356 ; WO 85/01856 ; US 4,684,611 ) erfolgen. Transformationstechniken auf Agrobacterium-Basis sind in der Fachwelt gut bekannt. Der Agrobakterium-Stamm (z. B. Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes) umfasst ein Plasmid (Ti- oder Ri-Plasmid) und ein T-DNA-Element, das nach Infektion mit Agrobacterium in die Pflanze transferiert wird. Die T-DNA (transferierte DNA) wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert. Die T-DNA kann sich auf dem Ri- oder dem Ti-Plasmid befinden oder liegt separat in einem sogenannten binären Vektor vor. Verfahren für die Agrobakterium-vermittelte Transformation werden z. B. in Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229 beschrieben. Die Transformation von Kartoffeln mittels Agrobakterien wird zum Beispiel in WO 2008/034876 beschrieben). Die Transformation kann zu transienter oder stabiler Transformation und Expression führen. Obwohl eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in eine beliebige Pflanze und Pflanzenzelle, die innerhalb dieser weiten Klassen fällt, insertiert werden kann, ist die Insertion in Kartoffelpflanzenzellen besonders nützlich.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Methoden finden sich in den oben genannten Publikationen von S. D. Kung und R. Wu (White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 128–143) Potrykus (Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205–225.) oder von Höfgen und Willmitzer (Höfgen R., Willmitzer L. (1988) Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucleic Acids Res. 16: 9877).
Das rekombinante Konstrukt kann ein mutiertes ahas-Gen als Selektionsmarker umfassen. Pflanzen, die das Konstrukt aufweisen, sind gegen Imidazoline resistent. Für die Selektion der transgenen Kartoffelpflanzen können chemische Verbindungen, die das Enzym AHAS hemmen, verwendet werden. Nützliche Verbindungen sind die Herbizide des Imidazolintyps. Besonders nützliche Verbindungen sind aus der Gruppe bestehend aus Imazethapyr (Pursuit^®), Imazamox (Raptor^®), Imazamethabenz (Assert^®), Imazapyr (Arsenal^®), Imazapic (Cadre^®) und Imazaquinon (Scepter^®) ausgewählt. Für die Selektion von transgenen Pflanzen können chemische Verbindungen wie in dem Übersichtsartikel von Duggleby, R. G. und Pang, S. S. in Journal of Biochemistryand Molecular Biology 33(1), 1–36 (2000) beschrieben verwendet werden.
Das transformierte Pflanzengewebe kann gegenüber 0,5 μM Imazamox exponiert werden, wodurch das Pflanzenmaterial, das das Konstrukt trägt, selektiert wird.
Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können auch mutmaßlich transformierte Pflanzen auf das Vorhandensein des ganzen rekombinanten Konstrukts, auf Kopienzahl und/oder auf Genomorganisation ausgewertet werden, zum Beispiel unter Einsatz der Southern-Analyse.
Das Gen-Targeting in Pflanzen ist möglich, stellt jedoch ein relativ seltenes Ereignis dar (Hanin & Paszkowski 2003 Current Opinion Plant Biol. 6(2): 157–62). Der Fachmann wird jedoch wissen, wie die Gen-Trageting-Frequenz zu verbessern ist. So zum Beispiel könnte man die Gen-Targeting-Frequenz durch das Exprimieren von Proteinen, die den Vorgang der homologen Rekombination erleichtern, wie Hefe-RAD54 (Shaked et al. 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(34): 12265–9) erhöhen. Ein weiterer Ansatz besteht darin, den Nachweis von Linien mit Gen-Targeting durch ein starkes Positiv-Negativ-Selektionssystem (Iida & Terada 2005 Plant Mol. Biol. 59: 205–219) zu erleichtern. Bei solch einem Ansatz wird ein negativer Selektionsmarker außerhalb der homologen Sequenzen auf dem Transformationskonstrukt platziert. Das Ergebnis ist, dass nur die transgenen Pflanzen mit einer zufallsmäßigen Insertion der transgenen Sequenzen den negativen Selektionsmarker enthalten, während die transgenen Linien, die mittels Gen-Targeting erhalten wurden, den negativen Selektionsmarker nicht umfassen.
Weiterhin kann die Gen-Targeting-Frequenz drastisch dadurch erhöht werden, dass man einen DNA-Doppelstrangbruch an oder in der Nähe der gewünschten Insertionsstelle einführt. Der Fachmann weiß, wie dies durchgeführt werden kann. So zum Beispiel können natürlich vorkommende „Homing”-Endonukleasen (auch Meganukleasen genannt, z. B. I-CreI) so modifiziert werden, dass sie eine neue DNA-Sequenz, d. h. die Sequenz bei oder in der Nähe der gewünschten Insertionsstelle im Genom, erkennen und schneiden ( WO 07/047859 , WO 07/049156 ). Alternativ dazu könnte man sogenannte Zinkfingernukleasen entwickeln, die eine unspezifische Nukleasedomäne (die üblicherweise von der FokI-Nuklease stammt) in Verbindung mit dinem Zinkfinger, der die gewünschte DNA-Sequenz spezifisch erkennt, umfassen (vgl. zum Beispiel Trends Biotechnol. 2005 23(12): 567–9; Cell Mol. Life Sci. 2007 64(22): 2933–44; WO 08/021207 ). Ein weiteres Verfahren ist der Einsatz von TAL(Transcription Activator Like)-Effektoren in Verbindung mit einer DNA-spezifischen Nuklease (z. B. Fok1) wie bei Mahfouz et al. 2011. De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks; PNAS 108(6)2623–2628 beschrieben. Bei Einsatz dieses Verfahrens kann eine TAL-Effektorvariante, die an die gewünschte Target-Sequenz bindet, leicht dadurch erzeugt werden, dass man die gut definierten Aminosäuren, die an die DNA binden, verändert (der Code findet sich in WO/2010/079430 ).
Das Gen-Targeting kann auch dazu eingesetzt werden, um eine Linie mit Ähnlichkeit zu dem Elite-Event D zu erhalten, und zwar durch Einführen eines transgenen Konstrukts, das das rekombinante Konstrukt umfasst, an im Wesentlichen derselben Insertionsstelle wie bei dem Elite-Event D. Der Fachmann weiß, dass sich die Insertionsstelle um einige wenige Basenpaare oder bis zu einigen wenigen Kilobasenpaaren unterscheiden kann, wobei man jedoch trotzdem zu einer ähnlichen Linie mit ähnlichen nutzbringenden Merkmalen gelangt. Das Gen-Targeting kann insbesondere dazu verwendet werden, um eine Linie mit Ähnlichkeit zu dem Elite-Event D in einer Kartoffelsorte, bei der es sich nicht um Fontane handelt, zu etablieren. Das Etablieren solch einer entsprechenden Linie, die auf anderen Sorten beruht, die sich für die Umweltbedingungen, die in unterschiedlichen Kartoffelanbauregionen auftreten, besonders eignen, kann von Interesse sein.
Figuren
1: Vektorkarte VCPMA 16
2: Sequenzen der vorliegenden Anmeldung
3: Übersicht über die Primer
4: Aufstellung der relativen Erträge der Events A bis D, Bintje (Standardsorte) gegenüber Fontane (weiblicher Elter der Events A bis D). Der durchschnittliche Ertrag/ha von Fontane, Events A-D und Bintje wurde in einem dreijährigen Feldversuch an 15 Orten gemessen. Der durchschnittliche Ertrag/ha der Sorte Fontane wurde gleich 100% gesetzt, und die relativen Erträge der Events A-D und Bintje wurden dementsprechend berechnet.
5: Die Grafik zeigt das Ergebnis des Phytophthora-Screening von Fontane im Vergleich zu den Events A bis D und Bientje. Die befallene Blattfläche wurde auf dem Feld nach natürlicher Infektion bonitiert. Der weibliche Elter Fontane wurde gleich 100% gesetzt. Bei allen Events wurde vollständige Resistenz gegen Phytophthora infestans beobachtet.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sollen den Umfang der Ansprüche der Erfindung nicht einschränken, sondern dienen als Beispiele für bestimmte Ausführungsformen. Beliebige Variationen in den beispielhaft angeführten Verfahren, die für den Fachmann erdenklich sind, sollen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen.
Beispiel 1: Allgemeine Verfahren
Die Klonierungsschritte, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wie zum Beispiel Restriktionsspaltungen, Agarosegel-Elektrophorese, Aufreinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose und Nylonmembranen, Verbinden von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli-Zellen, Bakterienkulturen, Phagenvermehrung und Sequenzanalyse von rekombinanter DNA, werden wie von Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann zum Beispiel auf bekannte Weise unter Einsatz des Phosphoamiditverfahrens durchgeführt werden (Voet, Voet, 2. Ausgabe, Wiley Press New York, S. 896–897). Das Sequenzieren der rekombinanten DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenziergerät von MWG-Licor gemäß dem Handbuch des Herstellers nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977).
Beispiel 2: Klonieren des Transformationsvektors VC-PMA16
Als Hintergrund für die Konstruktion von VCPMA16 wurde pSUNAHASmod verwendet. pSUNAHASmod basiert auf dem Plasmid pSUN1 ( WO 02/00900 ). Die T-DNA von pSUNAHASmod enthält ein mutiertes AHAS(Acetohydroxyacid-Synthase)-Gen (S653N), das die Resistenz der transformierten Pflanze gegen Imidazolinonherbizide (z. B. Imazamox: (R/S)-2-(4-Isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl)-5-methoxymethylnikotinsäure) verstärkt. Der Einsatz des mutierten AHAS-Gens als Selektionsmarker ist bei Andersson et al. (2003) Plant Cell Rep. 22: 261–267 und in WO 2004/005516 beschrieben. Die AHAS-Selektionskassette wurde durch Fusionieren des nos-Promoterfragments aus pGPTVKan (Becker et al., Molecular plant Biology 20, 1195–1197), des mutierten AHAS-Gens aus Arabidopsis und des nos-Terminators aus pGPTVKan (Becker et al., 1992 Molecular plant Biology 20, 1195–1197) konstruiert.
Das blb1-Genfragment, einschließlich der 1173 Bp großen blb1-Promoterregion und der 406 Bp großen blb1-Terminatorregion, wurde unter Verwendung der XbaI-Restriktionsstelle in pSUNAHASmod ligiert.
Die blb2-Genexpressionskassette umfasst das Rpi-blb2-Gen (3890 Bp), die blb2-Promotersequenz (1530 Bp) und die 2530 Bp große blb2-Terminationssequenz. Um die blb2-Expressionskassette in den blb1 enthaltenden pSUNAHASmod zu insertieren, wurde der Vektor mit PstI geschnitten. Die entstandenen klebrigen Restriktionsstellen wurden stumpf gemacht, und die blb2-Expressionskassette wurde in eine Stumpf-Ligation insertiert. Der entstandene Vektor erhielt die Bezeichnung VCPMA16 (1).
Beispiel 3: Transformation von Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) mit VCPMA16
Das Konstrukt VCPMA16 wurde mittels direkter Transformation wie bei Walkerpeach & Velten (Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: co-integrate and binary vector systems, Gelvin SB, Schilperoot RA (Hrsg.), Plant Molecular Biology Manual, 2. Ausg., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Niederlande, S. B1/1–B1/19, 1994) in die A. tumifaciens-Stämme LBA4404, AGL0 oder AGL1 transformiert. Die Anzucht der transformierten Bakterien erfolgte auf YEB-Agarplatten, die 1 μg/ml Spectinomycin enthielten.
Beispiel 4: Kultivieren unter Transformation der Kartoffelsorte Fontane mit A. tumefaciens
Die Kartoffelsorte Fontane wurde unter Verwendung der agrobakteriumvermittelten Transformation wie bei Visser (Visser RGF, 1991, „Regeneration and transformation of potato by Agrobacterium tumefaciens.” In Lindsey K (Hrsg.), ”Plant Culture Manual”, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Niederlande. Seiten B5/1–B5/9) beschrieben mit VCPMA16 transformiert, wobei jedoch Imazamox als Selektionsmarker verwendet wurde ( WO 2004/005516 ; Andersson et al., 2003, Plant Cell Rep. 22: 2261–267).
Kartoffelblatt- oder -sprossabschnitte wurden 1–3 Tage lang auf MC-Platten (M300-Platten (4,4 g/l MS-Medium, 2 mg/l NAA, 1 mg/l BAP, 30 g/l Saccharose, pH 5,2), die mit 1,5–2 ml flüssigem M100-Medium (4,4 g/l MS-Medium, 30 g/l Saccharose, 0,5 mg/ml Thiamin-Hydrochlorid, 0,5 mg/ml Pyridoxin-Hydrochlorid, 1 mg/l Nicotinsäure, 0,5 mg/l Kinetin, 29,8 mg/l FeSO₄·7H₂O, 1 mg/l 2,4-D, 2 g/l Casein-Hydrolysat, pH 6,5) überschichtet waren und mit einem sterilen Papierfilter abgedeckt waren, inkubiert.
Nach 1–3 Tagen wurden die Gewebesegmente mit A. tumefaciens (das VCPMA16 enthielt) in MS10-Medium (4,4 g/l MS-Medium, 10 g/l Saccharose, pH 5,8) inkubiert. Nach 8–10 Minuten wurden die Gewebeabschnitte auf M300-Platten (siehe oben) umgesetzt. Nach 1–3 Tagen wurden die Gewebeabschnitte auf MS400-Platten (4,4 g/l MS-Medium, 2 mg/l Zeatine, 0,01 mg/l NAA, 0,1 mg/l GA3, 10 g/l Saccharose, 400 mg/l Claforan oder Carbenicillin, pH 5,8) umgesetzt und 3–5 Tage weiter inkubiert.
Beispiel 5: Selektion der transformierten Kartoffelpflänzchen
Nach 3–5 Tagen wurden die Gewebeabschnitte auf MS400-Platten (siehe oben), die 0,5 μmol Imazamox als Selektionsmittel enthielten, umgesetzt. Alle zwei Wochen wurden die Gewebeabschnitte auf frische MS400-Platten, die 0,5 μmol Imazamox enthielten, passagiert. Wachsende (regenerierte) Sprosse wurden geerntet und auf MS30-Platten (4,4 g/l MS-Medium, 30 g/l Saccharose, 200 mg/l Claforan, pH 5,8) zum Weiterkultivieren umgesetzt.
Beispiel 6: Extraktion von DNA aus transformierten Kartoffelsprossen
Mit dem Kit Wizard Magnetic 96 DNA Plant System (Promega, Mannheim) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers DNA aus mutmaßlichen transgenen Sprossen extrahiert.
Beispiel 7: Nachweis von Rpi-blb1 und Rpi-blb2 in transformierten Kartoffelpflanzen mittels Echtzeit-PCR
Zum Nachweisen des Vorliegens von blb1 und blb2 wurde unter Verwendung der DNA aus mutmaßlichen transgenen Kartoffelsprossen (siehe oben) als Matrize eine Echtzeit-PCR durchgeführt. Es wurden die folgenden Primer eingesetzt:
Die Proben wurden unter Verwendung von 20–50 ng genomischer DNA, 900 mM PCR-Primer (siehe oben), 200 nM Sonde (siehe oben) in einem 1 × LightCycler 480 Probe Master (für detailliertes Protokoll, siehe Handbuch des Herstellers) unter Verwendung eines Roche Lightcycler 480 analysiert.
Die Amplifikationszyklen der PCR lauteten:
1 Zyklus von 15 min bei 95°C zum Denaturieren, gefolgt von 40 Zyklen mit jeweils 10 Sekunden bei 95°C (Anstieg 4,8°C/s) und 30 s bei 60°C (Anstieg 2,5°C/s).
Führte die PCR von beiden Fragmenten zu einem positiven Signal, so wurden die Sprosse in das Gewächshaus umgesetzt, um Phytophthora-Resistenztests durchzuführen.
Beispiel 8: Bestimmung des Resistenzniveaus von blb1- und blb2-haltigen transgenen Kartoffelsprossen gegen Phytophthora infestans
Die blb1- und blb2-haltigen transgenen Kartoffelsprosse (wie oben bestimmt) wurden in Erde umgesetzt und zwei Tage bei 22°C und einer Tageslänge von 12 h und 100% Feuchtigkeit in einer Wachstumskammer (Binder KBW 400) an Erde akklimatisieren gelassen. Danach wurden die Pflanzen unter ähnlichen Bedingungen, jedoch bei 70% Feuchtigkeit, im Gewächshaus oder in Pflanzenkammern herangezogen.
Nach 4 Wochen wurden die Pflanzen mit Phytophthora-infestans-Sporen inokuliert. Um die von blb1 und blb2 verliehene Breitspektrumresistenz nachzuweisen, wurden verschiedenste unterschiedliche Phytophthora-Isolate, z. B. Blue13, Us-22 und viele lokal gesammelte Stämme, die auf der ganzen Welt gesammelt wurden, entweder als Mischungen oder als Einzelisolate getestet.

Alle Phytophthora-Isolate wurden auf Erbsenagar wie in Tabelle 2 beschrieben kultiviert. Table 2. Herstellung von Erbsenagar.

Erbsenagar:	- 150 g Erbsen
	- 1000 ml Millipore-Wasser
	- 75 min im Dämpfer kochen
	- ~1 Stunde abkühlen, 24 h bei RT inkubieren
	- Medium abseihen und mit 11 Millipore-Wasser auffüllen
	- mit 5 g Glukose und 20 g Agar-Agar versetzen
	- pH auf 6,5 einstellen
	- 15 min autoklavieren
	- unter sterilen Bedingungen Plattengießen

Die Pflanzen wurden mit einer Sporendichte von 2,5 × E05 Sporen/ml inokuliert. Die Sporendichte wurde mit einer Thoma-Zählkammer ausgewertet. Zum Inokulieren wurde die ganze Pflanze mit Sporensuspension besprüht und in eine dunkle Nebelkammer gestellt. Nach 12–18 Stunden wurden die Pflanzen für eine Woche ins Gewächshaus (21°C, 12 h Licht, > 90% Feuchtigkeit) umgestellt.
Die ersten Krankheitssymptome traten nach ungefähr einer Woche auf. Die Bonitur der Krankheitssymptome erfolgte durch geschultes Personal, das die befallene Blattfläche, Nekroseflecken, Chloroseflecken und die eventuelle Sporulation von P. infestans auswertete.
Diese Werte wurden zu einer Krankheitsbonitur von 0 bis 100% integriert. In dem Bonitursystem bedeutet 0% Befall keine makroskopisch sichtbaren Symptome, und 100% bedeutet, dass alle inokulierten Blätter völlig braun und mit Myzel bedeckt sind, so dass die Pflanze im Wesentlichen abgestorben ist. Ein Inokulieren des anfälligen weiblichen Elters, der Kartoffelsorte Fontane, führte im Allgemeinen zu einer starken Infektion von allen Blättern. Alle Blätter sind stark infiziert, und grünes Gewebe tritt selten auf. Im Gegensatz dazu führt ein Inokulieren des transformierten Fontane-Events A-D immer zu völlig gesunden Pflanzen mit einer Krankheitsbonitur von 0% bei allen verwendeten Phytophthora-Isolaten. Als anfällige Kontrolle wurde die Standardsorte Bintje verwendet, von der bekannt ist, dass sie völlig gegenüber Phytophthora-Infektion anfällig ist.
Beispiel 9: DNA-Isolation und quantitative Auswertungsverfahren für die FST-Identifikation
Junges Blattgewebe der pilzresistenten Kartoffel-Events wurde für die DNA-Isolation und -Charakterisierung gesammelt. Beim Sammeln wurden die Blattgewebe mit flüssigem Stickstoff gefroren und lyophilisiert.
Die DNA wurde aus Kartoffelblattgewebe mit einem modifizierten Cetyltrimethylammoniumbromid(CTAB)-Verfahren (Carlson et al., 1991) isoliert. Trockenes Blattgewebe wurde gemörsert. Das gemörserte Gewebe wurde mit vorerwärmtem Extraktionspuffer bestehend aus 2% (w/v) CTAB, 100 mM Tris-HCl, 1,4 M NaCl, 1% (w/v) Polyvinylpyrrolidon (PVP), 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 9,5 (5 ml/1 g frisches Blattgewebe) und beta-Mercaptoethanol (2,5 μl/ml Puffer) 20 Minuten lang bei 74°C inkubiert. Nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 2440 × g wurde der Überstand zweimal mit einem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die DNA wurde mit 0,7 Volumen Isopropanol gefällt und in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) mit 0,5 mg/ml RNase A (Invitrogen; Carlsbad, CA 92008 USA), die auf eine Endkonzentration von ungefähr 500 ng/μl hinzugefügt worden war, gelöst. Die isolierte DNA wurde mit dem Farbstoff Hoechst 33258 (Invitrogen) unter Verwendung von Kälberthymus-DNA (Invitrogen) als DNA-Standard entsprechend den Anweisungen des Fluorometerverwenderhandbuchs auf einem FLx800^TM-Mikroplattenlesegerät (BioTek Instruments, Winooski, VT 05404, USA) quantitativ bestimmt.
Beispiel 10: Tail-PCR-Amplifikation der flanierenden Sequenzen
Oligonukleotid-Primer. Es wurden T-DNA-spezifische Primer, die zu der AHAS-Codiersequenz bzw. der Blb2-Promoterregion in VC-PMA16 komplementär waren, synthetisiert (Tabelle 3). Tabelle 3 T-DNA-spezifische Primer für das Klonieren der flankierenden Sequenzen unter Einsatz von Tail-PCR

LB = links flankierender Primer, RB = rechts flankierender Primer
Zusätzlich wurden vier willkürliche degenerierte (AD-)Primer gemäß Liu et al 1995 synthetisiert: TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3' (AD') (SEQ ID NO: 61), AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA (A/T)AGG-3' (AD2) (SEQ ID NO: 62), CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3' (AD3, I bedeutet Inosin) (SEQ ID NO: 63) und TC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA-3' (AD4) (SEQ ID NO: 64). Diese AD-Primer weisen gemäß Berechnung mit der Formel 69,3 + 0,41(%GC) – 650/L berechnete durchschnittliche TM-Werte von 47–48°C auf, wobei L die Primer-Länge bedeutet (vgl. 21).
Die Tail-PCR erfolgte im Prinzip gemäß der Vorgehensweise von Liu et al. (Liu et al 1995). Die primären TAIL-PCR-Reaktionen (20 μl) enthielten 1 × PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 oder 2,0 mM MgCl₂, 0,001% Gelatine), jeweils 200 μM von jedem dNTPs, 25 ng genomische DNA, 1 Einheit Taq-Polymerase (Invitrogen), 0,2 μM T-DNA-spezifische Primer (07-038_P25 und 07-038_P26) sowie einen vorgegebenen AD-Primer (2 μM für AD1, 3 μM für AD2 oder 4 μM für AD3 und AD4). Die primäre TAIL-PCR wurde gemäß dem PCR-Programm in Liu et al (1995) in Thermocyclern des Typs 9700 von Perkin-Elmer durchgeführt. Aliquote Mengen (1 μl) von 50-fachen Verdünnungen des Primär-PCR-Produkts wurden direkt in Sekundär-TAIL-PCR-Reaktionen (20 μl), welche 1 × PCR-Puffer, 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase, jeweils 200 μM von jedem dNTPs, 0,2 μM T-DNA-spezifische Primer (07-038_P27 und 07-038_P28) und denselben AD-Primer, der in der Primärreaktion verwendet worden war (1,5 μM für AD1, 2,0 μM für AD2 und AD3 und AD4), enthielten, aufgetragen. Nach Amplifikation mit 12 Super-Zyklen wurden die Sekundär-TAIL-PCR-Produkte (aliquote Menge von 1 μl der 10-fachen Verdünnung) in 50 μl Tertiärreaktionen mit 20 Zyklen mit reduzierter Stringenz reamplifiziert. Die Komponenten und ihre Konzentrationen waren die gleichen wie bei der Sekundärreaktion, mit der Ausnahme, dass ein anderer „Nested”-PCR-Primer verwendet wurde (07-038_P29 für LB und 07-038_P30 für RB). Die amplifizierten Produkte der Reaktionen wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Stark amplifizierte Produkte wurden gewonnen und mit dem Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, CA 92614, USA) aufgereinigt. Die aufgereinigte DNA wurde mit dem Farbstoff Hoechst 33258 (Invitrogen) unter Verwendung von Kälberthymus-DNA (Invitrogen) als DNA-Standard entsprechend den Anweisungen des Fluorometerverwenderhandbuchs auf einem FLx800^TM-Mikroplattenlesegerät (BioTek Instruments, Winooski, VT 05404, USA) quantitativ bestimmt.
Beispiel 11: DNA Sequenzierung
Die aufgereinigten tertiären PCR-Produkte wurden mittels Sequenzieren nach Sanger unter Einsatz des BigDye Terminator v3.0-Kits entsprechend der Vorschrift des Herstellers (Applied Biosystems, Kalifornien 92008, USA) sequenziert. Für das Sequenzieren wurde derselbe spezifische Primer, der in der Tertiär-PCR (nicht markiert) verwendet worden war, verwendet.
Beispiel 12: Identifizieren von spezifischen Events mittels PCR
Falls nicht anders erwähnt, werden Standardmethoden verwendet, wie sie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press beschrieben sind.
Genomische DNA wurde aus den jeweiligen Kartoffel-Events unter Einsatz des DNeasy Plant-Mini Kits (Quiagen) für die Verarbeitung von Einzelproben und des DNeasy 96 Plant-Kits (Quiagen) für die Verarbeitung von Proben im 96-Well-Format präpariert. Beide Kits wurden entsprechend den im Handbuch beschriebenen Anweisungen eingesetzt. Die Verbindungsstelle zwischen flankierender Region und T-DNA-Insert wurde von der cDNA mittels PCR wie im Protokoll der Phusion hot-start, Pfu Ultra, Pfu Turbo oder Herculase DNA-Polymerase (Stratagene, Santa Clara, CA, US) beschrieben amplifiziert.
Die Zusammensetzung für das Protokoll der Pfu Ultra, Pfu Turbo oder Herculase DNA-Polymerase lautete folgendermaßen: 1 × PCR-Puffer, jeweils 0,2 mM von jedem dNTP, 100 ng cDNA von Arabidopsis thaliana (Var. Columbia-0), 50 pmol Vorwärts-Primer, 50 pmol Rückwärts-Primer, 1 u Pfu Ultra, Pfu Turbo oder Herculase DNA-Polymerase.
Die Amplifikationszyklen lauteten folgendermaßen:
1 Zyklus von 60 Sekunden bei 98°C, gefolgt von 35 Zyklen von jeweils 10 Sekunden bei 98°C, 30 Sekunden bei einer spezifischen Annealing-Temperatur (siehe Tabelle) und 60 Sekunden bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 10 Minuten bei 72°C, dann 4°C. Für die spezifische Amplifikation der eventspezifischen FST-T-DNA-Verbindungsstellen wurden die folgenden Primersequenzen und Annealing-Temperaturen verwendet: Tabelle 4
Die erhaltenen PCR-Produkte wurden auf einem 1,5%igen Agarosegel analysiert. Es treten PCR-Produkte auf, die das Event spezifisch identifizieren. Detaillierte Bedingungen sind in Tabelle 4 angegeben.
Beispiel 13: Ertragsbestimmung durch Feldversuche
Die verschiedenen Kartoffel-Events wurden in Feldversuchen geprüft, um ihr Ertragspotential zu bestimmen. Der Ertrag der Events A, B und C und des Elite-Events D, die alle vollständige Phytophthora-Resistenz aufweisen, wurde mit der nichttransgenen weiblichen Elternlinie Fontane und anderen Standardkartoffelsorten, wie z. B. Bintje, unter krankheitsfreien Bedingungen (volles Pflanzenschutzprogramm der transgenen Events und der Kontrollsorten entsprechend der Guten Agrarpraxis) verglichen.
An mehr als 15 Orten wurden dreijährige (2008–2010) Ertragsversuche durchgeführt. Für jeden Versuch wurde eine randomisierte Blockanlage mit 3–5 Blockwiederholungen verwendet. Jeder Block wies eine Größe von ungefähr 10–15 m² auf und wurde mit 4–6 Kartoffelpflanzen pro m² bepflanzt.
Die Kartoffeln wurden entsprechend den örtlichen Bedingungen im April oder Mai gepflanzt. Alle Kulturmaßnahmen, einschließlich Pflanzenschutzmaßnahmen, erfolgten auf Grundlage der Guten Agrarpraxis (GAP). Kartoffelknollen wurden zwei Wochen nach dem Krautabtöten im September/Oktober geerntet. Das Ernten erfolgte entweder von Hand oder mechanisch. Der Knollenertrag/ha wurde durch Wägen der frischgeernteten Kartoffelknollen am Ernteort bestimmt. Als Kontrolle wurde die Kartoffelsorte Bintje eingesetzt. Der Ertrag/ha der Standardkartoffelsorte Fontane wurde gleich 100% gesetzt, und der relative Ertrag der nichttransgenen Linie Bintje und der transformierten Fontane-Events A bis D wurde berechnet. Nur das Elite-Event D wies denselben Ertrag/ha im Vergleich zu der nichttransgenen weiblichen Elternlinie auf, während bei den anderen Events (z. B. A, B, C) ein ~10%iger Ertragsabfall beobachtet wurde (vgl. 4).
Beispiel 14: Bestimmung der Phytophthora-Resistenz durch Feldversuche
Die verschiedenen Kartoffel-Events wurden in Feldversuchen geprüft, um ihren Resistenzphänotyp gegen Phytophthora infestans zu bestimmen. Alle Events und die nichttransgenen Kontrollen (Fontane als nichttransgene weibliche Elternlinie und Bintje als anfällige Standardsorte) wurden im Feld ohne jegliche Fungizidbehandlung, die auf Phytophthora infestans abzielt, herangezogen. Es wurden 5-jährige (2006–2010) Resistenzversuche an mehr als 20 Orten durchgeführt. Für jeden Versuch wurde eine randomisierte Blockanlage mit 3–5 Blockwiederholungen verwendet. Jeder Block wies eine Größe von ungefähr 1–15 m² auf und wurde mit 4–6 Kartoffelpflanzen pro m² bepflanzt. Die Kartoffeln wurden entsprechend den örtlichen Bedingungen im April oder Mai gepflanzt. Alle Kulturmaßnahmen, einschließlich Pflanzenschutzmaßnahmen, erfolgten auf Grundlage der Guten Agrarpraxis (GAP). Phytophthora-Infektion findet auf natürliche Weise statt. Die Bonitur der Krankheitssymptome erfolgt durch geschultes Personal, das die befallene Blattfläche, Nekroseflecken, Chloroseflecken und das eventuelle Sporulieren von P. infestans auswertete.
Diese Werte wurden zu einer Krankheitsbonitur von 0 bis 100% integriert. In dem Bonitursystem bedeutet 0% Befall keine makroskopisch sichtbaren Symptome und 100% bedeutet, dass alle inokulierten Blätter völlig braun und mit Mycel bedeckt sind, so dass die Pflanze im Wesentlichen abgestorben ist. Der weibliche Elter Fontane wies im Allgemeinen eine starke Infektion auf allen Blättern auf. Alle Blätter sind stark infiziert und grünes Gewebe tritt selten auf. Im Gegensatz dazu führte das Inokulieren von allen Events A bis D zu völlig gesunden Pflanzen mit einer Krankheitsbonitur von 0%. Als anfällige Kontrolle wurde die Standardsorte Bintje verwendet, von der bekannt ist, dass sie für Phytophthora-Infektion ganz anfällig ist und bei der starke Infektion beobachtet wurde (5).

Claims

Phytophthora-resistente transgene Kartoffelpflanze, Samen, Knolle, Pflanzenzelle oder Gewebe davon, umfassend eine Nukleotidsequenz mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 1.
Phytophthora-resistente transgene Kartoffelpflanze, Samen, Knolle, Pflanzenzelle oder Gewebe davon, umfassend a) ein rekombinantes Konstrukt mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und b) weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 126 und 136 Basenpaaren amplifiziert werden kann, ii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 505 und 515 Basenpaaren amplifiziert werden kann, iii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 625 und 635 Basenpaaren amplifiziert werden kann und/oder iv) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 4752 und 4762 Basenpaaren amplifiziert werden kann und/oder weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus v) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 282 und 292 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vi) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 877 und 887 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 827 und 837 Basenpaaren amplifiziert werden kann und/oder viii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 9905 und 9915 Basenpaaren amplifiziert werden kann.
Phytophthora-resistente transgene Kartoffel, Samen, Knolle, Pflanzenzelle oder Gewebe davon nach Anspruch 1, umfassend a) ein rekombinantes Konstrukt mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und b) weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 131 Basenpaaren amplifiziert werden kann, ii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 510 Basenpaaren amplifiziert werden kann, iii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 630 Basenpaaren amplifiziert werden kann und/oder iv) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 4757 Basenpaaren amplifiziert werden kann und/oder weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus v) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 287 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vi) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 882 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 832 Basenpaaren amplifiziert werden kann und/oder viii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 9910 Basenpaaren amplifiziert werden kann.
Verfahren zum Bereitstellen einer Phytophthora-resistenten transgenen Kartoffelpflanze, umfassend die folgenden Schritte: a) Einführen einer rekombinanten Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 in das Genom von Kartoffelpflanzenzellen, b) Integrieren der rekombinanten Nukleinsäure in das Genom, c) Regenerieren von Pflanzen aus den Pflanzenzellen, d) Selektieren von Pflanzen, umfassend eine Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und einer Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 126 und 136 Basenpaaren amplifiziert werden kann, ii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 505 und 515 Basenpaaren amplifiziert werden kann, iii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 625 und 635 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder iv) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 4752 und 4762 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus v) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 282 und 292 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vi) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 877 und 887 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 827 und 837 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder viii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 ein Nukleotidfragment mit einer Größe zwischen 9905 und 9915 Basenpaaren amplifiziert werden kann.
Verfahren zum Bereitstellen einer Phytophthora-resistenten transgenen Kartoffelpflanze nach Anspruch 4, wobei in Schritt d) eine Pflanze, umfassend eine Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und einer Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 131 Basenpaaren amplifiziert werden kann, ii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 510 Basenpaaren amplifiziert werden kann, iii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 630 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder iv) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 4757 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus v) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 287 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vi) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 882 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 832 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder viii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 9910 Basenpaaren amplifiziert werden kann, ausgewählt wird.
Kit, umfassend die Primerpaare für den Nachweis der spezifischen Integrationsstelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 4 und 5, SEQ ID NO: 6 und 7, SEQ ID NO: 8 und 9, SEQ ID NO: 10 und 11, SEQ ID NO: 12 und 13, SEQ ID NO: 14 und 15, SEQ ID NO: 16 und 17 und/oder SEQ ID NO: 18 und 19.
Nachweisverfahren für den Nachweis der spezifischen Integrationsstelle, das Folgendes umfasst: a) Isolieren einer Nukleinsäuresequenz aus einer Kartoffelpflanze, einem Samen, einer Knolle, einer Pflanzenzelle oder eines Gewebes davon als Testprobe, b) Exponieren der Testprobe, einer Positivprobe und einer Negativprobe gegenüber einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus mindestens einem in Anspruch 6 definierten Satz von Primerpaaren, unter PCR-Bedingungen, und c) Auswerten der Amplifikation eines Nukleotidfragments, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleotidfragment i) mit einer Größe zwischen 126 und 136 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5, ii) mit einer Größe von zwischen 505 und 515 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7, iii) mit einer Größe von zwischen 625 und 635 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 und/oder iv) mit einer Größe von zwischen 4752 und 4762 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und/oder ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleotidfragment v) mit einer Größe zwischen 282 und 292 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13, vi) mit einer Größe von zwischen 877 und 292 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15, vii) mit einer Größe von zwischen 827 und 837 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 und/oder viii) mit einer Größe von zwischen 9905 und 9915 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 im Vergleich zu der Positivkontrolle und der Negativkontrolle.
Nachweisverfahren nach Anspruch 7 zum Auswerten der Amplifikation eines Nukleotidfragments, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleotidfragment i) mit einer Größe von 131 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5, ii) mit einer Größe von 510 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7, iii) mit einer Größe von 630 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 und/oder iv) mit einer Größe von 4757 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 und/oder zum Auswerten der Amplifikation eines Nukleotidfragments, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleotidfragment v) mit einer Größe von 287 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13, vi) mit einer Größe von 882 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 vii) mit einer Größe von 832 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 und/oder viii) mit einer Größe von 9910 Basenpaaren bei Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 im Vergleich zu der Positivkontrolle und der Negativkontrolle.
Pflanze, Samen, Knolle, Pflanzenzelle oder Gewebe davon, die/der/das mit dem Kit nach Anspruch 6 oder mit dem Nachweisverfahren nach den Ansprüchen 7 oder 8 nachweisbar ist.
Polynukleotid, umfassend a) eine rekombinante Nukleinsäure mit mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 und b) weiterhin umfassend eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 131 Basenpaaren amplifiziert werden kann, ii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 510 Basenpaaren amplifiziert werden kann, iii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 ein Nukleotidfragment mit einer Größe 630 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder iv) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 4757 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder v) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 287 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vi) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 882 Basenpaaren amplifiziert werden kann, vii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 832 Basenpaaren amplifiziert werden kann, und/oder viii) einer Nukleinsäuresequenz mit der unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 ein Nukleotidfragment mit einer Größe von 13234 Basenpaaren amplifiziert werden kann, als stabile Integration in einen Kartoffelpflanzenzellkern.
Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz mit mindestens 80% Identität zu SEQ ID NO: 1, stabil in einen Kartoffelpflanzenzellkern integriert.
Polynukleotid nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Nukleotidsequenz mit mindestens 80% Identität zu SEQ ID NO: 1 das blb1-Gen und das blb2-Gen umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 12, wobei die Polynukleotidsequenz weiterhin eine oder mehrere von SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 und/oder 19 umfasst.
Phytophthora-resistente transgene Kartoffelpflanze, Samen, Knolle, Pflanzenzelle oder Gewebe davon, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 10, 11, 12 oder 13.
Phytophthora-resistente transgene Kartoffelpflanze, Samen, Knolle, Pflanzenzelle oder Gewebe davon nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Nukleotidsequenz oder das rekombinante Konstrukt das blb1-Gen und das blb2-Gen umfasst.