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TECHNISCHES GEBIET
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Die
folgende Erfindung betrifft Verfahren zum Trennen und Reinigen eines
Zielproteins, Verfahren zum Herstellen eines Zielproteins und ein
Verfahren zur biologischen Stoffumwandlung unter Verwendung eines Gesamtzell-Enzyms
(„whole
cell enzyme") oder
eines teilweise gereinigten Enzyms, bei welchen eine wirksame Menge
der sHSPs (kleine Hitzeschockproteine, „small heat shock Proteins") zugegeben wird,
um Zielprotein-Abbau
durch Proteasen zu verhindern.
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ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
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Gemäß der bemerkenswerten
Entwicklung rekombinanter DNA-Technologie
ist es möglich
geworden, eine große
Menge nützlicher
Proteine in E. coli-, Hefe-, Pilz-, Pflanzen-, Tier- und Insektenzellen
medizinisch und industriell zu produzieren, wo es in der Natur nur
in geringen Mengen erhalten werden konnte. Beispielsweise sind Proteine,
wie zum Beispiel Interferon, Interleukin 2, Kolonie-stimulierende
Faktoren, Wachstumshormon, insulinartige Wachstumsfaktoren und humanes
Serumalbumin, mittels rekombinantem E. coli (Lee, SY, Trends Biotechnol.,
14:98, 1996) erfolgreich produziert worden. Insbesondere ist die
Technologie für
E. coli-Kultur mit hoher Zelldichte gut etabliert, wobei Zielproteine
bei hoher Produktivität
in großen
Mengen produziert werden können,
so dass die Kosten der Zielproteinproduktion verringert werden können. Jedoch
nehmen, selbst wenn nützliche
Proteine in einer großen
Menge mittels eines effizienten Expressionsvektor- Systems produziert
werden, Endausbeuten von Proteinen rapide ab, wenn ein System zum
Isolieren und Reinigen von Protein nicht gut etabliert ist. Solche
Schritte zur Trennung und Reinigung werden viel bedeutsamer, wenn
es schwierig ist, Proteine zu synthetisieren, mehr Zeit und Anstrengung
erforderlich sind, oder die Menge an Proteinproduktion selbst klein
ist.
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Schritte
zum Trennen und Reinigen von Proteinen umfassen im Allgemeinen wie
folgt:
- (1) Zellextraktion: Zellen oder Gewebe
werden mittels Glashomogenisator, Mixer, Polytron und Ultraschallgerät, usw.
aufgeschlossen und dann mittels einer Zentrifugation getrennt;
- (2) Solubilisierung: Wenn unlösliche Proteine getrennt und
gereinigt werden, sollten die Proteine als erstes solubilisiert
werden. Verschiedene Arten an oberflächenaktiven Mitteln (SDS, Triton
X-100, Nonidet P-40, CHAPS etc.) werden als ein Mittel verwendet,
um ein biologisches Membranprotein zu solubilisieren; (3) Trennung,
Kondensation und Dialyse von Proteinen: Eine Ammoniumsulfat-Fällung mittels
Proteinlöslichkeit,
ein Molekulargewicht-„Cut
off"-Verfahren mittels
des Unterschieds von Proteinmolekulargewicht, ein Dialyseverfahren
mittels poröser
Cellulosemembran etc. werden verwendet, bevor Proteinprobe gereinigt wird;
und (4) Endreinigung von Proteinen: Nachdem Verfahren für das Reinigen
von Proteinen, wie in der Tabelle 1 unten gezeigt, verschieden sind,
sollte Reinigung durchgeführt
werden durch Kombinieren von Verfahren gemäß der Aufgabe des Experimentes
und der Art des Materials. Im Allgemeinen wird in einem anfänglichen
Schritt ein Verfahren ausgewählt,
das eine hohe Prozesskapazität
aufweist, obwohl Reinigungsaktivität irgendwie gering ist, und
wird, sowie sich ein letzter Schritt nähert, ein Verfahren verwendet, das
hohe Trennaktivität
aufweist.
Tabelle 1: Typische Verfahren für das Reinigen
von Protein | Verfahren | Eigenschaft | Art |
| Säulenchromatographie | – Trennung
mittels Druck (oder Fluss)
– Trennung einer Proteinmasse | – LPLC (Niedrigdruckflüssigkeitschromatographie, „low pressure liquid
chromatography")
– HPLC (Hochdruckchromatographie, „high pressure
chromatograhpy") |
| Affinitätschromatographie | – Chromatographie
unter Verwendung von Affinität
zwischen einem gewissen Material (Ligand) und einem Protein
– hohe Reinheit
und Rückgewinnungsrate | – Affinitätschromatographie
mittels Antikörper-Säule
– Affinitätschromatographie
von GST-Fusionsprotein
mittels Glutathion-Säule
– proteinspezifische
Affinitätschromatographie |
| andere
Chromatographie | – Trennung
mittels Proteinladung (isoelektrischer Punkt), physiologischer Aktivität (chemische
Reaktivität),
Molekulargewicht, Hydrophobie | – Ionenaustauschchromatographie
– Gelfiltration
– Umkehrphasenchromatographie
– hydrophobe
Chromatographie |
| Elektrophorese | – Trennung
mittels hochauflösender
Elektrophorese | – isoelektrische
Fokussierung
– SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
– zweidimensionale
Gelelektrophorese |
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Um
Proteolyse durch Protease zu verhindern, kann ein Proteaseinhibitor
gemischt und verwendet werden. Beispielsweise werden 0,4~4,0 mM
Petabloc SC (AEBSF; (4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluoridhydrochlorid),
0,1~1,0 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylchlorid) und 5~50 mM Leupeptin
gegen neutrale Serinproteasen verwendet, 0,5~5 mM EDTA gegen neutrale
Metalloproteasen verwendet, 0,1~30 mM E-64 gegen Cysteinproteasen
verwendet und 1 mM Pepstain gegen Aspartatproteasen verwendet, auch
ein Cocktail, gemischt mit verschiedenen Inhibitoren, wird allgemein
verwendet.
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Jedoch
kann Proteolyse selbst mit Verwendung von Proteaseinhibitoren nicht
vollständig
inhibiert werden. Insbesondere ist der Verlust an Proteinen sehr
stark, wenn Zielproteine getrennt und gereinigt werden in Pflanzenextrakten,
oder Tierorganen wie zum Beispiel Bauchspeicheldrüse, Magen,
Leber oder Milz, in welchen verschiedene Proteasen reich sind, oder
Zielproteine selbst leicht von Proteasen attackiert werden.
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Indessen
sind sHSPs Hitzeschockproteine („heat shock proteins") (HSPs) mit einem
niedrigen Molekulargewicht von 12-43 kDa, welche durch Stress, wie
zum Beispiel Hitzeschock oder die Überproduktion gewisser Proteine,
induziert werden. Eines oder mehrere der sHSPs sind in allen Organismen
von Eukaryoten bis Prokaryoten vorhanden, und die bis jetzt bekannten
sHSPs sind in der Tabelle 2 unten angegeben.
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ATP-abhängige sHSPs
führen
die Funktion des Verhinderns von Proteinaggregation irreversibel
aus, indem sie an Proteine, die unter Hitzestress denaturiert sind,
binden, und mit ATP-abhängigen Hitzeschockproteinen
kooperieren, um denaturierte Proteine dazu zu bringen, dadurch korrekt
zurückzufalten,
was die denaturierten Proteine zum Originalzustand zurückbringt.
Beispielsweise haben Kitagawa et al. berichtet, dass IbpA und IbpB,
die aus E. coli stammen, Inaktivierung von Citratsynthase durch
Hitze oder Oxidantien verhindert (
Kitagawa et a1., Eur.
J. Biochem., 269:2907, 2002), und Lee et al. haben berichtet,
dass HSP18.1, das aus der Erbse stammt, Aggregation von denaturierten
Proteinen, wie zum Beispiel von Malatdehydrogenase (MDH), Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
(„glyceraldehydes-3-phosphate
dehydrogenase")
unter Hitzestress verhindert (
Lee et al., EMBO J., 16:659,
1997). Horwitz et al. haben berichtet, dass α-Kristallin,
das aus dem Menschen stammt, Proteinaggregation verhindert, um beim
korrekten Rückfalten
von Zielproteinen in einem Dialyseprozess von denaturierten Zielproteinen
zu helfen (
Horwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10449,
1992). Es wurde berichtet, dass sHSPs, die aus Badyrbizobium
japonicum stamen, Citratsynthase-Aggregation durch Hitze verhindern
(
Studer und Narberhaus, J. Biol. Chem., 275:37212, 2000).
Es wurde berichtet, dass, weil Pfu-sHSP, gereinigt in einem Organismus,
welcher unter Hitze stabil ist, Proteine von Zellen unter Hitzestress
schützt
(
WO 01/79250 A1 ),
es Taq-Polymerase und andere Enzyme bei hoher Temperatur während PCR
stabilisierte. Außerdem
haben Ehrnsperger et al. berichtet, dass sHSP 25, das aus der Maus stammt,
Proteine oder Peptide stabilisiert, welche in diagnostischem Assay
instabil sind (
Ehrnsperger et al., Anal. Biochem., 259:218.
1998).
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Solche
sHSPs weisen eine konservierte Region in Evolutionsprozessen auf
und hat so im Wesentlichen ähnliche
Funktionen erfüllt.
Die genannten Erfinder haben eine Anmeldung für ein Patent eingereicht, das eine
Zusammensetzung für
das Schützen
von Proteinabbau, enthaltend die sHSPs, und ein Verfahren von zweidimensionaler
Gelelektrophorese unter Verwendung der sHSPs betrifft (PCT/KR03/02539).
Jedoch gab es bis jetzt keinen Bericht über wirksame Prävention
von Zielprotein-Abbau durch Proteasen in einem Kultivierungsprozess
für das
Her stellen von Zielproteinen, einem Prozess zum Trennen und Reinigen
von Zielproteinen und einem Reaktionsprozess unter Verwendung von
Gesamtzell-Enzymen oder teilweise gereinigten Enzymen. Tabelle 2: Die HSPs–Familie
| Herkunft | sHSPs |
| Agrobacterium
tumefaciens Stamm C58 (U. Washington) | IbpA |
| Arabidopsis
thaliana | sHSPs |
| Bradyrbizobium
japonicum | HSPB,
HSPH, HSPC, HSPF |
| Brucella
suis 1330 | IbpA |
| Buchnera
aphidicola Plasmid pBPS1 | sHSPs |
| Buchnera
aphidicola Stamm APS (Acyrthosiphon pisum) | IbpA |
| Citrus
tristeza-Virus | sHSPs |
| Escherichia
coli CFT073 | IbpA,
IbpB |
| Escherichia
coli K12 | IbpA,
IbpB |
| Escherichia
coli O157:H7 EDL933 | IbpA,
IbpB |
| Escherichia
coli O157:H7 | IbpA,
IbpB |
| Helicobacter
pylori 26695 | IbpB |
| Mensch | HSP27, α,β-Kristallin |
| Methanococcus
jannaschii | HSP16.5 |
| Methanopyrus
kandleri AV19 | IbpA |
| Maus | HSP25 |
| Mycobacterium
leprae Stamm TN | sHSPs |
| Mycobacterium
tuberculosis | HSP16.3 |
| Pirellula
sp. | IbpB |
| Pisum
sativum (Erbse) | HSP18.1 |
| Plasmodium
falciparum 3D7 | sHSPs |
| Pseudomonas
aeruginosa PA01 | IbpA |
| Pseudomonas
putida KT2440 | IbpA |
| Saccharomyces
cerevisiae | HSP26 |
| Salmonella
enterica subsp. enterica serovar Typhi | IbpA,
IbpB |
| Salmonella
typhimurium LT2 | IbpA,
IbpB |
| Shewanella
oneidensis MR-1 | IbpA |
| Shigella
flexneri 2a Stamm 2457T | IbpA,
IbpB |
| Shigella
flexneri 2a Stamm 301 | IbpA,
IbpB |
| Sinorhizobium
meliloti 1021 | IbpA |
| Sinorhizobium
meliloti Plasmid pSymA | IbpA |
| Streptococcus
pyogenes | IbpA |
| Streptomyces
coelicolor A3(2) | sHSPs |
| Sulfolobus
solfataricus | sHSPs |
| Synechococcus
vulcanus | HSP16 |
| Thermoanaerobacter
tengcongensis Stamm MB4T | IbpA |
| Thermoplasma
acidophilum | IbpA |
| Yersinia
pestis KIM | sHSPs,
IbpA, IbpB |
| Yersinia
pestis Stamm CO92 | IbpA,
IbpB |
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Dementsprechend
haben die genannten Erfinder intensive Studien durchgeführt, um
ein Verfahren zum Verhindern von Zielprotein-Abbau durch Proteasen
in einem Kultivierungsprozess zum Herstellen von Zielproteinen,
einem Prozess zur Trennung und Reinigung, und einer Enzymreaktion
unter Verwendung eines Zielproteins als Biokatalysator zu entwickeln,
und haben infolge dessen gefunden, dass der Verlust an Zielproteinen
durch Proteasen verhindert werden kann, wenn die sHSPs verwendet
werden, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Eine
Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zum Trennen
und Reinigen von Zielproteinen bereitzustellen, in welchem eine
wirksame Menge der sHSPs in einem Prozess zur Trennung und Reinigung
zugegeben wird, in dem Zielprotein-Abbau durch Proteasen auftritt.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zum
Herstellen von Zielproteinen bereitzustellen, in welchem eine wirksame
Menge der sHSPs zugegeben wird in einem Kultivierungsprozess, in
dem Zielprotein-Abbau durch Proteasen auftritt.
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Eine
noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren
zum Herstellen von Zielproteinen bereitzustellen, in welchem rekombinante
Mikroorganismen, enthaltend ein sHSP-Gen, kultiviert werden.
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Eine
noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren
zur biologischen Stoffumwandlung unter Verwendung von Gesamtzell-Enzymen
oder teilweise gereinigten Enzymen bereitzustellen, in welchem eine
wirksame Menge der sHSPs zugegeben wird.
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Um
die obigen Aufgaben zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung
in einem Aspekt ein Verfahren zum Trennen und Reinigen eines Zielproteins
aus einer Zelle, in welcher das Zielprotein exprimiert wird, oder einer
Kulturbrühe
davon bereit, wobei eine wirksame Menge der sHSPs in einem Prozess
zur Trennung und Reinigung zugegeben wird, um den Zielprotein-Abbau
durch Proteasen zu verhindern.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Herstellen eines Zielproteins mittels Zellkultivierung bereit,
wobei eine wirksame Menge der sHSPs in einem Kultivierungsprozess
zugegeben wird, um Zielprotein-Abbau durch Proteasen zu verhindern.
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In
einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zum Herstellen eines Zielproteins durch Zellkultivierung
bereit, wobei die Zelle, rekombiniert mit einem sHSP-Gen, verwendet
wird, um Zielprotein-Abbau durch Proteasen in Kultivierungsprozessen
zu verhindern.
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In
der vorliegenden Erfindung ist die Zelle, rekombiniert mit dem sHSP-Gen,
eine Zelle, in ein Chromosom derer das sHSP-Gen insertiert ist,
oder eine Zelle, transformiert mit rekombinantem Vektor, enthaltend das
sHSP-Gen, und außerdem
eine Zelle, welche rekombiniert ist, so dass das sHSP-Gen und ein
Zielprotein-Gen als Fusionsproteinform coexprimiert werden.
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In
einem weiterhin anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung
ein Verfahren zum Trennen und Reinigen eines Zielproteins aus einer
Zelle, in welcher das Zielprotein exprimiert wird, oder Kulturbrühe davon unter
Verwendung von Chromatographie bereit, wobei Chromatographie verwendet
wird, die eine wirksame Menge an sHSPs, fixiert auf Harz oder Kügelchen
davon, aufweist, um Zielprotein-Abbau durch Proteasen zu verhindern.
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In
noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zum Herstellen eines Zielmaterials aus einem Substrat
durch eine Reaktion unter Verwendung eines Gesamtzell-Enzyms oder
eines teilweise gereinigten Enzyms bereit, wobei eine wirksame Menge
an sHSPs in Enzymreaktions-Prozessen
zugegeben wird, um Enzymabbau durch Proteasen zu verhindern.
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In
noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
bereit, wobei die sHSPs in einem Prozess verwendet werden, der sich
mit Zielproteinen beschäftigt,
um Zielprotein-Abbau durch Proteasen zu verhindern.
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In
der vorliegenden Erfindung sind die sHSPs vorzugsweise eines oder
mehrere, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus IbpA, das aus Agrobacterium tumefaciens
stammt, sHSPs, die aus Arabidopsis thaliana stammen, HSPB, HSPH,
HSPC und HSPF, die aus Bradyrbizobium japonicum stammen, IbpA, das
aus Brucella suis stammt, sHSPs, die aus Bruchnera aphidicola stammen,
IbpA, das aus Bruchnera aphidicola (Acyrthosiphon pisum) stammt,
sHSPs, die aus Citrus tristeza-Virus stammen, IbpA und IbpB, die
aus E. coli stammen, IbpB, das aus Helicobacter pylori stammt, HSP27
und α,β-Kristallin,
die aus dem Menschen stammen, HSP16.5, das aus Methanococcus jannaschii
stammt, IbpA, das aus Methanopyrus kandleri stammt, HSP25, das aus
der Maus stammt, sHSPs, die aus Mycobacterium leprae stammen, HSP16.3,
das aus Mycobacterium tuberculosis stammt, IbpB, das aus Pirellula
sp. stammt, HSP18.1, das aus Pisum sativum (Erbse) stammt, sHSPs,
die aus Plasmodium falciparum stammen, IbpA, das aus dem Genus Pseudomonas
stammt, HSP26, das aus Saccharomyces cerevisiae stammt, IbpA und
IbpB, die aus Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi
stammen, IbpA und IbpB, die aus Salmonella typhimurium stammen,
IbpA, das aus Shewanella oneidensis stammt, IbpA und IbpB, die aus
Shigella flexneri stammen, IbpA, das aus Sinorhizobium meliloti
stammt, IbpA, das aus Streotocuccus pyogenes stammt, sHSPs, die
aus Streptomyces coelicolor stammen, sHSPs, die aus Sulfolobus solfataricus
stammen, HSP16, das aus Synechococcus vulcanus stammt, IbpA, das
aus Thermoanaerobacter tengcongensis stammt, IbpA, das aus Thermoplasma
acidophilum stammt, IbpA und IbpB, die aus Yersinia pestis stammen,
und perfekter eines oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus IbpA, IbpB und IbpAB, die aus E. coli stammen, und IbpA, das
aus dem Genus Pseudomonas stammt, und HSP26, das aus Saccharomyces
cerevisiae stammt.
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In
der vorliegenden Erfindung ist die Menge der sHSPs, die zur Prävention
von Proteinabbau durch Proteasen zugegeben wird, vorzugsweise in
einem Bereich von 0,1 bis 50 Gewichtsteilen und stärker bevorzugt
0,5 bis 20 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Gewichtsteile des gesamten
Proteins. Wenn die sHSPs bei der Menge von weniger als 0,1 Gewichtsteilen
zugegeben werden, ist es absolut unzureichend für die Verhinderung von Proteinabbau,
und wenn sie bei der Menge von mehr als 20 Gewichtsteilen zugegeben
werden, interferiert ein Oberschuss der sHSPs entweder mit der Trennung
und Reinigung von Zielproteinen, oder er verursacht einen nachteiligen
Effekt im Hinblick auf die Kosten der sHSPs.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine Genkarte von Plasmid pTac99IbpAH.
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2 ist
eine Genkarte von Plasmid pTac99IpbBH.
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3 ist
eine Genkarte von Plasmid pTac99PPIbpAH.
-
4 ist
eine Genkarte von Plasmid pTac99HSP26H.
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5 ist
ein elektrophoretisches Bild, das das Ergebnis der Proteinreinigung
von IbpA, IbpB, ppIbPA oder HSP26, exprimiert
aus rekombinantem E. coli XL1-Blue, transformiert mit rekombinantem
Plasmid pTac99IbpAH, pTac991bpBH, pTac99PPIbpAH
bzw. pTac99HSP26H, zeigt. In (A) zeigt Spur M Molekulargewichtsstandard,
zeigen Spuren 1 und 2 gereinigtes IbpA, zeigen Spuren 3 und 4 gereinigter
IbpB, zeigen Spuren 5 und 6 gerinigtes ppIbpA.
In (B) zeigt Spur M Molekulargewichtsstandard, zeigen Spuren 1 bis
3 gereinigtes HSP26.
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6.
ist ein elektrophoretisches Bild, das den Effekt von Proteaseinhibition
durch sHSPs in Lyse-Lösungen
zeigt, in welchen humanes Serumalbumin zugegeben ist. (A) stellt
eine Lyse-Lösung
ohne sHSPs als eine Kontrolle dar, Spur M zeigt Molekulargewichtsstandard,
Spur 1 zeigt eine Lyse-Lösung
mit nur 0,5 μg/μl zugegebenem
humanem Serumalbumin, Spur 2 zeigt eine Lösung, in welcher 0,05 μg/μl Trypsin
zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 3 zeigt eine Lösung, in welcher 0,025 μg/μl Trypsin
zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 4 zeigt eine Lösung, in welcher 0,017 μg/μl Trypsin
zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, und Spur 5 zeigt eine Lösung, in
welcher 0,01 μg/μl Trypsin
zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind. (B), (C) und (D) zeigen Lyse-Lösungen,
in welchen IbpA, IbpB bzw. HSP26 zugegeben sind, Spur M zeigt Molekulargewichtsstandard,
Spur 1 zeigt eine Lyse-Lösung,
in welcher nur 0,005 μg/μl sHSPs zu
0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 2 zeigt eine Lösung, in welcher 0,05 μg/μl Trypsin
und 0,005 μg/μl sHSPs zu
0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 3 zeigt eine Lösung, in welcher 0,025 μg/μl Trypsin
und 0,005 μg/μl sHSPs zu
0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 4 zeigt eine Lösung, in welcher 0,017 μg/μl Trypsin
und 0,005 μg/μl sHSPs zu
0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, und Spur 5 zeigt eine Lösung, in
welcher 0,01 μg/μl Trypsin
und 0,005 μg/μl sHSPs zu
0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind. (E) ist eine Lyse-Lösung, in welcher verschiedene
Proteaseinhibitoren zugegeben sind, Spur M zeigt Molekulargewichtsstandard,
Spur 1 zeigt eine Lyse-Lösung,
in welcher nur 0,5 μg/μl humanes
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 2 zeigt eine Lösung, in welcher 0,05 μg/μl Trypsin
zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 3 zeigt eine Lösung, in welcher 0,025 μg/μl Trypsin
zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 4 zeigt eine Lösung, in welcher 0,05 μg/μl Trypsin
und 1 mM PMSF zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, und Spur 5 zeigt eine Lösung, in
welcher 0,025 μg/μl Trypsin
und 1 mM PMSF zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 6 zeigt eine Lösung, in welcher 0,05 μg/μl Trypsin
und 4 mM Pefablock SC zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 7 zeigt eine Lösung, in welcher 0,025 μg/μl Trypsin
un 4 mM Pefablock SC zu 0,5 μg/μl humanem.
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Serumalbumin
zugegeben sind, Spur 8 zeigt eine Lösung, in welcher 0,05 μg/μl Trypsin
und Cocktailinhibitor (7 ml/Tablette) zu 0,5 μg/μl humanem Serumalbumin zugegeben
sind, Spur 9 zeigt eine Lösung,
in welcher 0,025 μg/μl Trypsin
und Cocktailinhibitor (7 ml/Tablette) zu 0,5 μg/μl humanem Serumalbumin zugegeben sind
und Spur 10 zeigt eine Lösung,
in welcher 0,05 μg/μl Trypsin
und 1 mM EDTA zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, und Spur 11 zeigt eine Lösung, in
welcher 0,025 μg/μl Trypsin
und 1 mM EDTA zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind. Die Pfeile stellen humanes Serumalbumin
dar.
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7 ist
ein elektrophoretisches Bild, das den Effekt von Protease-Inhibition
durch sHSPs in Lyse-Lösungen
zeigt, in welchen humanes Serumalbumin zugegeben ist. (A) stellt
eine eine Lyse-Lösung
ohne sHSPs als eine Kontrolle dar, Spur M zeigt Molekulargewichtsstandard,
Spur 1 zeigt eine Lyse-Lösung, in
welcher nur 0,5 μg/μl humanes
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 2 zeigt eine Lösung, in welcher 1,5 × 10-3 μg/μl Proteinase
K zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 3 zeigt eine Lösung, in welcher 0,5 × 10-3 μg/μl Proteinase
K zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 4 zeigt eine Lösung, in welcher 1,5 × 10-4 μg/μl Proteinase
K zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind, und Spur 5 zeigt eine Lösung, in
welcher 0,5 × 10-4 μg/μl Proteinase
K zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin zugegeben sind. (B), (C) und (D) stellen Lyse-Lösungen dar,
in welchen IbpA, IbpB bzw. HSP26 zugegeben sind, Spur M zeigt Molekulargewichtsstandard,
Spur 1 zeigte eine Lyse-Lösung,
die nur 0,005 μg/μl sHSPs,
zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin, aufweist, Spur 2 zeigt eine Lösung, die 1,5 × 10-3 μg/μl Proteinase
K und 0,005 μg/μl sHSPs,
zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin, aufweist, Spur 3 zeigt eine Lösung, die 0,5 × 10-3 μg/μl Proteinase
K und 0,005 μg/μl sHSPs,
zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin, aufweist, Spur 4 zeigt ei ne Lösung, die 1,5 × 10-4 μg/μl Proteinase
K und 0,005 μg/μl sHSPs,
zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin, aufweist, und Spur 5 zeigt eine Lösung, die 0,5 × 10-4 μg/μl Proteinase
K und 0,005 μg/μl sHSPs,
zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin, aufweist. Die Pfeile stellen humanes Serumalbumin
dar. (E) stellt eine Lyse-Lösung
dar, bei der verschiedene Proteaseinhibitoren zugegeben sind, Spur M
zeigt Molekulargewichtsstandard, Spur 1 zeigt eine Lösung, bei
der nur 0,5 μg/μl humanes
Serumalbumin zugegeben sind, Spur 2 zeigt eine Lösung, die 0,5 × 10-3 μg/μl Proteinase
K und 4 mM Pefablock SC, zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem Serumalbumin, aufweist,
Spur 3 zeigt eine Lösung,
die 1,5 × 10-4 μg/μl Proteinase K
und 4 mM Pefablock SC, zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem Serumalbumin, aufweist,
Spur 4 zeigt eine Lösung,
die 0,5 × 10-3 μg/μl Proteinase
K und Cocktailinhibitor (7 ml/Tablette), zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem Serumalbumin,
aufweist, Spur 5 zeigt eine Lösung,
die 1,5 × 10-4 μg/μl Proteinase
K und Cocktailinhibitor (7 ml/Tablette), zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem
Serumalbumin, aufweist, Spur 6 zeigt eine Lösung, die 0,5 × 10-3 μg/μl Proteinase
K und 1 mM EDTA, zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem Serumalbumin, aufweist,
und Spur 7 zeigt eine Lösung,
die 1,5 × 10-4 μg/μl Proteinase
K und 1 mM EDTA, zugegeben zu 0,5 μg/μl humanem Serumalbumin, aufweist.
Die Pfeile stellen humanes Serumalbumin dar.
-
8 ist
ein schematisches Diagramm zu der Verhinderung bzw. Prävention
von Zielprotein-Abbau mittels sHSPs in einem Isolierungs- und Reingungsprozess.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Nachfolgend
wird die vorliegende Erfindung in weiterem Detail anhand von Beispielen
beschrieben werden. Es wird jedoch für einen Fachmann auf dem Gebiet
offensichtlich sein, dass diese Beispiele nur zu einem veranschaulichenden
Zweck bereitge stellt sind und nicht ausgelegt werden sollen, um
den Umfang der vorliegenden Erfindung einzugrenzen.
-
Insbesondere
sollen die Beispiele hierin IbpA und IbpB, die aus E. coli stammen,
IbpA, das aus dem Genus Pseudomonas stammt und HSP26, das aus Saccharomyces
cerevisiae stammt, als sHSPs veranschaulichen, jedoch sollte berücksichtigt
werden, dass die sHSPs von Tabelle 2 ohne Einschränkung für die vorliegende
Erfindung verwendet werden können.
-
Beispiel 1: Herstellung von rekombinatem
Plasmid, enthaltend ibpA-, ibpB- oder HSP26-Gen
-
Chromosomale
DNAs von E. coli W3110 (ATCC 39936), Pseudomonas putida KT2440 (ATCC
47054) und Saccharomyces cerevisiae wurden gemäß dem Verfahren von Sambrook
et al. (Molecular Cloning, 2. Aufl., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, NY, 1989) isoliert und gereinigt.
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E.
coli W3110, Pseudomonas putida KT2440 und Saccharomyces cerevisiae
wurden in 500 ml LB (Luria-Bertani)-Medium jeweils 24 Stunden lang
kultiviert. Die Stämme
in früher
exponentieller Wachstumsphase wurden mittels Zentrifugation geerntet
und dann in 50 ml TE-Lösung
suspendiert (10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,6), die 10 mg/ml Lysozym
(Sigma Co., USA) enthielt. Die Stammsuspensionen wurden bei Raumtemperatur 24
Stunden bei langsamem Rühren
kultiviert.
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Um
die Stämme
aufzuschließen
und Proteine zu entfernen, wurde die Kulturbrühe mit 16 ml 10% SDS (Natriumdodecylsulfat)-Lösung und 570 μl 20 mg/ml
Proteinase K (Sigma Co., USA) versetzt, gefolgt von einer Reaktion
bei 37°C
für 1 Stunde.
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Als
nächstes
wurden 14 ml 5 M NaCl-Lösung
und 10,66 ml 10% CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid, Sigma Co.,
USA), gelöst
in 0,7 M NaCl-Lösung,
zu der Reaktionslösung
gegeben und dann bei 65°C
10 Minuten lang reagieren gelassen. Danach wurde Chloroform:Isoamylalkohol
(24:1) des gleichen Volumens wie die Reaktionslösung zu der Reaktionslösung gegeben
und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang vorsichtig gemischt. Die gemischte
Lösung
wurde bei 6.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand
wurde in einen Becher transferiert, zu welchem gekühltes Ethanol,
das zweimal das Volumen des Überstands
ist, langsam zugegeben wurde, um chromosomale DNA auszufällen. Die
gefällte
DNA wurde um einen Glasstab herumgewickelt und herausgenommen. Der
Glasstab wurde luftgetrocknet, um Ethanol zu entfernen und die chromosomale
DNA wurde in 1 ml TE-Lösung
gelöst.
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RNase
(Sigma Co., USA) wurde zu der DNA-Lösung zu einer Endkonzentration
von 50 μg/ml
gegeben, gefolgt von einer Reaktion bei 37°C für 1 Stunde. Nach der Reaktion
wurde Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) des gleichen Volumens wie
die Reaktionslösung
zugegeben, und es wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang vorsichtig
gemischt.
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Die
gemischte Lösung
wurde bei 6.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand
wurde in einen Becher transferiert, zu welchem gekühltes Ethanol,
das zweimal das Volumen des Überstands
ist, langsam zugegeben wurde, um chromosomale DNA auszufällen. Die
gefällte
DNA wurde um einen Glasstab herumgewickelt und herausgenommen. Der
Glasstab wurde luftgetrocknet, um Ethanol zu entfernen, und schließlich wurden
die chromosomalen DNAs von gereinigtem E. coli W3110, Pseudomonas
putida KT2440 und Saccharomyces cerevisiae in jeweils 1 ml TE-Lösung gelöst.
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Um
die Expression und Reinigung von IbpA-, IbpB- PPIbpA-
oder HSP26-Protein leicht zu machen, wurden die rekombinanten Plasmide
pTac99IbpAH, pTac99IbpBH, pTac99PPIbpAH
und pTac99HSP26H wie folgt konstruiert.
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Unter
Verwendung der chromosomalen DNA von E. coli W3110 als eine Matrize
wurde PCR durchgeführt
mit Primern von SEQ ID NOs: 1 und 2 und Primern von SEQ ID NOs:
3 und 4, um ibpA-6his-
und ibpB-6his-Gene zu erhalten, die aus E. coli abgeleitet sind.
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Weiterhin
wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA von Pseudomonas putida
KT2440 als eine Matrize PCR durchgeführt mit Primern von SEQ ID
NOs: 5 und 6, um PPibpA-6his-Gen zu erhalten,
das aus Pseudomonas putida abgeleitet ist. Im Pseudomonas putida
KT2440-Genom ist das ibpB-Gen bis jetzt nicht bekannt gewesen.
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Unter
Verwendung der chromosomalen DNA von Saccharomyces cerevisiae als
eine Matrize wurde PCR durchgeführt
mit Primern von SEQ ID NOs: 7 und 8, um HSP26-6his-Gen zu erhalten,
das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist.
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Alle
PCRs wurden bei den folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche
Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten;
30 Zyklen an Denaturierung bei 95°C
für 50
Sekunden, Anlagerung („annealing”) bei 55°C für 1 Minute
und Erweiterung („extension") bei 72°C für 1 Minute
und 30 Sekunden; und letzte Erweiterung bei 72°C für 5 Minuten. Jedes der erhaltenen
ibpA-6his-, ibpB-6his-, PPibpA-6his- und
HSP26-6his-Gene wurde in rekombinantes Plasmid pTac99A, verdaut
mit EcoRI und HindIII, insertiert, um Plasmide pTac99IbpAH, pTac99IbpBH,
pTac99PPIbpAH bzw. pTac99HSP26H zu konstruieren
(1, 2, 3 und 4).
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Das
rekombinante Plasmid pTac99A ist ein Plasmid, (bei) welchem der
trc-Promotor von pTrc99A (Pharmacia Biotech., Uppsala, Schweden)
in den tac-Promotor von pKK223-3 (Pharmacia Biotech., Uppsala, Schweden)
umgewandelt ist, und es wird konstruiert durch Verdauen von trc-Promotor
von pTrc99A mit Restriktionsenzymen PvuII und EcoRI, um tac-Promotor
von pKK233-3 zu erhalten, und Insertieren des Genfragments des tac-Promotors
in pTrc99A, verdaut mit den gleichen Restriktionsenzymen.
SEQ
ID NO. 1: 5'-ggaattcatgcgtaactttgatttatccccg-3'
SEQ ID NO.
2: 5'-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttgatttcgatacggcgcgg-3'
SEQ ID NO.
3: 5'-ggaattcatgcgtaacttcgatttatccccactg-3'
SEQ ID NO.
4: 5'-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggctatttaacgcgggacgttcgct-3'
SEQ ID NO.
5: 5' -ggaattcatgaccatgactactgctttc-3'
SEQ ID NO.
6: 5'-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttcagcgctggttttt-3'
SEQ ID NO.
7: 5'-ggaattcatgtcatttaacagtccatttt-3'
SEQ ID NO.
8: 5'-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttaccccacgattcttgaga-3'
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Beispiel 2: Reinigung von IbpA-, IbpB-
und HSP26-Proteinen
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Der
rekombinante E. coli XL1-Blue (Stratagene, USA), transformiert mit
rekombinanten Plasmiden pTac99IbpAH, pTac99IbpBH, pTac99PPIbpAH und pTac99HSP26H, enthaltend das
Gen, codierend IbpA-, IbpB- oder HSP26-Protein, hergestellt in dem
Beispiel 1, wurde in LB-Medium (Hefeextrakt 5 g/l, Tryptophan 10 g/l,
NaCl 10 g/l), jeweils enthaltend 50 mg/l Ampicillin, kultiviert.
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Die
Expressionen von IbpA-, IbpB-, PPIbpA- und
HSP26-Proteinen
wurden durch Zugeben von 1 mM IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid) induziert, wenn die
optische Dichte (O.D.) bei 600 nm mittels Spektrophotometer 0,7
war. 4 Stunden nach Induktion wurde 1 ml jeder Kulturbrühe genommen
und bei 4°C und
6.000 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert, und dann wurde das erhaltene
Präzipitat
einmal mit 0,5 ml TE-Lösung
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA; pH 8,0) gewaschen und bei 4°C und 6.000
UpM 5 Minuten lang zentrifugiert, um ein Präzipitat zu erhalten. Das Präzipitat
wurde in 0,2 ml Gleichgewichts-Lösung
(8 M Harnstoff, 100 mM NaH2PO4,
10 mM Tris; pH 8,0) suspendiert und Ultraschall-Aufschluss und Fraktionierung
unterzogen.
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Die
obige suspendierte Lösung
wurde bei 4°C
und 10.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand
wurde gesammelt und durch Ni-NTA-Sein-Säule (Qiagen, USA), voräquilibriert
mit der Gleichgewichts-Lösung,
geleitet. Und dann wurde die Lösung
bei 2.000 UpM 2 Minuten lang zentrifugiert. Zweimal wurden 600 μl Waschlösung (8
M Harnstoff, 100 mM NaH2PO4,
10 mM Tris; pH 6,3) durch die Säule
geleitet. 200 μl
Elutionsmittel (8 M Harnstoff, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris; pH 4,5) wurden in die Säule eingebracht,
um IbpA-, IbpB- und HSP26-Proteine
zu reinigen.
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200 μl jeder der
Lösungen,
enthaltend die gereinigten IbpA-, IbpB- und HSP26-Proteine, wurden
genommen und mit 50 μl
SDS-PAGE-Probenlösung (25%
Glycerin, 2% SDS, 14,4 mM 2-Mercaptoethanol,
0,1% Bromphenolblau, 60 mM Tris-HCl) gemischt. Die gemischte Lösung wurde
10 Minuten lang gekocht und wurde SDS-PAGE-Gelelektrophorese in
12% Trenngel unterzogen. Als nächstes
wurde das Gel in Färbelösung (Methanol
40%, Essigsäure
10%, 0,25 g/l Coomassie Brilliant Blue R) über 2 Stunden lang eingeweicht,
um gefärbt zu
werden, und zweimal in einer entfärbenden Lösung (40% Methanol, 7% Essigsäure) jeweils über 2 Stunden lang
eingeweicht, um entfärbt
zu werden.
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5 ist
ein elektrophoretisches Bild, das das Ergebnis der Proteinreinigung
von IbpA, IbpB, PPIbpA und HSP26, exprimiert
von rekombinantem E. coli XL-1 Blue, transformiert mit rekom binantem
Plasmid pTac99IbpAH, pTac99IbpBH, pTac99PPIbpAH
bzw. pTac99HSP26H, zeigt. Wie in 5 gezeigt,
war die Reinheit der gereinigten IbpA-, IbpB-, PPIbpA-
und HSP26-Proteine nahezu 100%.
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Beispiel 3: Der Effekt von sHSPs auf Zielprotein-Abbau
durch Trypsin
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Nachdem
Zielproteine durch Protease in einer Lyse-Lösung von Zellen leicht attackiert
werden, ist der Verlust an Zielproteinen ernst. In diesem Beispiel
wurde humanes Serumalbumin als ein Zielprotein in einer Lyse-Lösung verdünnt und
dann mit Trypsin verschiedener Konzentration als Protease 2 Stunden
lang bei Raumtemperatur kultiviert. Die Konzentration an Protease
wurde auf 0, 1/10, 1/20, 1/30 und 1/50 relativ zum Zielprotein geändert. IbpA
und IbpB, die aus E. coli stammen, und HSP26, das aus Saccharomyces
cerevisiae stammt, wurden als sHSPs verwendet.
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6 ist
ein elektrophoretisches Bild, das den Effekt von Proteaseinhibition
durch die sHSPs in einer Lyse-Lösung,
die zugegebenes humanes Serumalbumin aufweist, zeigt. Wie in 6 gezeigt,
wurde ein Zielprotein, humanes Serumalbumin, in einer Lösung mit
sHSPs kaum abgebaut, auf der anderen Seite wurden in einer Kontrolle
die meisten der humanen Serumalbumine durch einen Protease-Angriff
abgebaut. In einem Vergleich von Spuren 2 in 6(A) bis 6(D) wurden humane Serumalbumine vollständig durch
Trypsin abgebaut, während
es in einer Lösung
mit einer kleinen Menge an sHSP kaum abgebaut wurde. Außerdem wurde in
einem Vergleich von Spuren 2 und 3 in 6(B)–6(D) und Spuren 4 bis 11 in 6(E) bestätigt, dass die sHSPs Zielprotein-Abbau
durch Protease viel effektiver verhindern als dies traditionelle
Proteaseinhibitoren tun.
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Beispiel 4: Der Effekt von sHSPs auf Zielprotein-Abbau
durch Proteinase K
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In
diesem Beispiel wurde unter Verwendung einer anderen Protease, Proteinase
K, das gleiche Experiment wie das oben durchgeführt. Humanes Serumalbumin als
ein Zielprotein wurde in einer Lyse-Lösung verdünnt und mit Proteinase K variierter
Konzentration 2 Stunden lang bei Raumtemperatur kultiviert. Die
Konzentration an Protease wurde auf 0, 1/300, 1/1000, 1/3000 und
1/10000 relativ zum Zielprotein variiert. IbpA und IbpB, die aus
E. coli stammen, und HSP26, das aus Saccharomyces cerevisiae stammt,
wurden als sHSPs verwendet.
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7 ist
ein elektrophoretisches Bild, das den Effekt an Proteaseinhibition
durch sHSPs in einer Lyse-Lösung,
die zugegebenes humanes Serumalbumin aufweist, zeigt. Wie in 7 gezeigt,
wurde ein Zielprotein, humanes Serumalbumin, in einer Lösung mit
sHSPs kaum abgebaut, auf der anderen Seite wurden in einer Kontrolle
die meisten der humanen Serumalbumine durch einen Protease-Angriff
abgebaut. In einem Vergleich von jeweils Spuren 3 und 4 in 7(A) bis 7(D) wurden
die meisten der humanen Serumalbumine durch Proteinase K abgebaut,
während
es in einer Lösung
mit geringer Menge an sHSP kaum abgebaut wurde.
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Außerdem wurde
in einem Vergleich von Spuren 3 in 7(B)–7(D) und Spuren 2, 4 und 6 in 7(E) bestätigt, dass die sHSPs Zielprotein-Abbau
durch Protease viel effektiver verhindern, als dies traditionelle Proteaseinhibitoren
tun.
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Indirektes Beispiel
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In
den obigen Beispielen ist veranschaulicht, dass die sHSPs Zielprotein-Abbau
durch Protease verhindern, wenn die sHSPs in einem Prozess zum Trennen
und Reinigen von Zielproteinen zugegeben wurden. Jedoch wird es
angesichts der Tatsache, dass Protease produziert und freigesetzt
wird, wenn die meisten der Mikroorganismen kultiviert werden, für einen
Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass der Zielprotein-Abbau durch Protease
selbst verhindert werden kann, wenn die sHSPs in einem Kultivierungsprozess zum
Herstellen eines Zielproteins zugegeben werden, oder wenn sHSPs
und ein Zielprotein simultan durch Transformieren einer Zelle zum
Herstellen eines Zielproteins mit sHSP-Gen und anschließendes Kultivieren coexprimiert
werden.
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Dementsprechend
zeigte die vorliegende Erfindung ein schematisches Diagramm in der 8,
um Zielprotein-Abbau in einem Prozess zum Isolieren und Reinigen
von Organismen zu minimieren. Wie in der 8 gezeigt,
beinhaltet es ein Verfahren, in welchem die gereinigten sHSPs in
jedem Schritt des Prozesses zur Trennung und Reinigung eines Zielproteins
zugegeben werden, oder ein Verfahren, in welchem die sHSPs mit einem
Zielprotein in vivo in anfänglichem
Schritt coexprimiert werden. Wenn die sHSPs mit einem Zielprotein
in einer Zelle coexprimiert werden, können die sHSPs exprimiert werden
durch Insertieren in ein Chromosom einer Zelle oder Insertieren
in einer Form eines Plasmids oder durch Herstellen in einer Form
eines Fusionsproteins mit einem Zielprotein unter Verwendung eines
direkter Linker-Peptids.
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Auch
wird es für
die Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass der Zielprotein-Abbau
durch Protease verhindert werden kann, wenn die sHSPs in einem Reaktionsprozess
unter Verwendung eines Gesamtzell-Enzyms oder eines teilweise gereinigten
Enzyms zugegeben werden, weil das Gesamtzell-Enyzm oder das teilweise
gereinigte Enzym eine Protease enthält.
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Während die
vorliegende Erfindung beschrieben worden ist mit Bezugnahme auf
die spezielle veranschaulichende Ausführungsform, darf sie nicht
durch die Ausführungsform,
sondern nur durch die beigefügten Ansprüche, beschränkt werden.
Dementsprechend ist zu verstehen, dass die Fachleute auf dem Gebiet
die Ausführungsform ändern oder
modifizieren können,
ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung und vom Erfindungsgedanken
der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
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INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
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Wie
oben detailliert beschrieben, hat die vorliegende Erfindung den
Effekt des Bereitstellens eines Verfahrens zum Verhindern von Zielprotein-Abbau
durch Protease, bei welchem sHSPs bei Kultivierungs-, Trennungs-
und Reinigungsprozessen zum Herstellen eines Zielproteins, und einem
Enzymreaktionsprozess unter Verwendung des Zielproteins als einen
Biokatalysator, verwendet werden. Durch einen Prozess zur Trennung und
Reinigung eines Organismus unter Verwendung der sHSPs, wie zum Beispiel
IbpA, IbpB, IbpAB, HSP26 gemäß der vorliegenden
Erfindung, kann der Verlust an Zielproteinen durch Protease verhindert
werden, und die sHSPs verhindern Zielprotein-Abbau durch Protease
wesentlich effizienter, als dies die teuren traditionellen Proteaseinhibitoren
tun. Deshalb wird erwartet, dass die vorliegende Erfindung nützlich beim
Verbessern von Verfahren zum effektiven Herstellen und Einsetzen
von Zielproteinen nützlich
sein wird.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die
folgende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Trennen und Reinigen
eines Zielproteins, ein Verfahren zum Herstellen eines Zielproteins,
und ein Verfahren zur biologischen Stoffumwandlung mittels eines
Gesamtzell-Enzyms oder eines teilweise gereinigten Enzyms. Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann, wenn die sHSPs in Kultivierungs-, Trennungs- und
Reinigungsprozessen zum Herstellen eines Zielproteins zugegeben werden,
das Zielprotein durch Verhindern des Verlusts an Protein durch Proteasen
in hohen Ausbeuten erhalten werden. Auch kann, wenn sHSPs in einem
Reaktionsprozess unter Verwendung eines Gesamtzell-Enzyms oder eines
teilweise gereinigten Enzyms zugegeben werden, die Ausbeute von
biologischer Stoffumwandlung unter Verwendung von Enzym durch Verhindern
des Verlusts an Enzym durch Proteasen erhöht werden.
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Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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des DPMA heruntergeladen werden.