DE10357232B3

DE10357232B3 - Artifizielle Fäkalanschmutzung

Info

Publication number: DE10357232B3
Application number: DE2003157232
Authority: DE
Inventors: Roland Dr. Breves; Erik Dr. Hattemer; Stefan Dr. Frey; Michael Dr. Dreja
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2003-12-09
Filing date: 2003-12-09
Publication date: 2005-06-30
Anticipated expiration: 2023-12-10

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen artifiziellen Fäkalienersatzstoff sowie seine Verwendung zur Herstellung von artifiziellen Fäkalanschmutzungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen artifiziellen Fäkalienersatzstoff sowie seine Verwendung zur Herstellung von artifiziellen Fäkalanschmutzungen.
Natürliche Fäkalien sind aufgrund ihres unangenehmen Geruchs sowie aufgrund von hygienischen und emotionalen Gründen nicht dazu geeignet in Tests zur Überprüfung der Reinigungsleistung beispielsweise von WC-Reinigern verwendet zu werden.
Es besteht deshalb ein Bedarf an artifiziellem Fäkalienersatz, der möglichst dieselben physikalischen Eigenschaften aufweist wie natürliche Fäkalien.
In diesem Zusammenhang wurden bereits Fäkalienersatzstoffe beschrieben.

So beschreibt DE 2855062 einen Fäkalienersatzstoff bestehend aus Wasser, einer Zellstoffkomponente, Bindemittel, Farbstoff sowie gegebenenfalls einem Streckmittel wie z. B. Polystyrol und/oder fungiziden Zusätzen.

JP 2000352101 beschreibt einen Fäkalienersatzstoff bestehend aus Fettsäuren, Fettsäureestern und -salzen sowie zusätzlich Farbstoffen und Salzen (Carbonaten, Sulfaten) als Viskositätsregulatoren.

Ferner wird im SÖFW-Journal (1998) 124, S. 1029 ein IKW-Ballastschmutz aus Speisebestandteilen (Stärke, Vollei, Tomatenketchup etc.) beschrieben, der eigentlich als Ballastschmutz für die Geschirrreinigung entwickelt wurde.

Es ist ferner bekannt, dass der Dickdarm etwa 10¹¹ bis 10¹² Bakterien pro Gramm Darminhalt beinhaltet (Journal für Ernährungsmedizin, Vol. 2, S. 6–9, 2000) und dass unlösliche Ballaststoffe den Darminhalt mechanisch lockern und unverändert wieder ausgeschieden werden (www.apoverlag.at/DieApotheke/2003_04/seiten/haupt02_laxasoft_0403.html)

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass auf einfache Weise ein Fäkalienersatzstoff reproduzierbar hergestellt werden kann, der die physikalischen Eigenschaften von natürlichen Fäkalien sehr gut abbildet.

Dieser Fäkalienersatzstoff umfasst:

a) bakterielle Biomasse,
b) Ballaststoffe aus pflanzlichem Zellwandmaterial,
c) Glycerin oder eine Substanz mit ähnlicher Viskosität und
d) eine wässrige Lösung.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Fäkalienersatzstoff im Wesentlichen und/oder ausschließlich aus den genannten Komponenten.

Der Gehalt an bakterieller Biomasse beträgt erfindungsgemäß vorzugsweise von 10–90 Gew.-%, insbesondere von 20–70 Gew.-%. Als bakterielle Biomasse kommen grundsätzlich alle Bakterien in Frage, bevorzugt solche, die auch natürlicherweise im menschlichen Darm vorkommen wie beispielsweise Enterobacteriaceae wie Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Providentia, Morganella, Hafnia, Edwardsiella, Enterococcus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus oder Serratia sowie Anaerobier wie Bacteroides, Clostridium, Bifidobacterium, Lactobacillus, Fusobacterium oder Eubacterium oder Mischungen davon. Dabei sind insbesondere Derivate der natürlichen Darmflora, die keinerlei Infektionspotential mehr aufweisen, für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet. Durch Mischungen verschiedener Species lässt sich gegebenenfalls das natürliche Vorkommen noch besser abbilden. Als bakterielle Biomasse kommen insbesondere E. coli-Bakterien, vor allem solche des Stammes K12 oder Derivate davon, in Frage.

Die bakterielle Biomasse kann durch eine dem Fachmann bekannte Weise der Kultivierung erhalten werden, beispielsweise durch Anzucht in LB-Medium, vorzugsweise jedoch durch Anzucht in einem Medium, das Material härterer Konsistenz wie etwa Sojamehl, Weizenmehl, Beef Protein oder Pülpe oder Mischungen davon, enthält und/oder die Erzeugung hoher Zelldichten, insbesondere größer als 1 × 10⁹ ml^–1, zulässt. Die Anzucht erfolgt vorzugsweise in laborüblichen Schüttelkolben, zur Erzueugung größerer Mengen ist aber etwa auch die Anzucht unter kontrollierten Bedingungen im Fermenter möglich.

Der Gehalt an Ballaststoffen beträgt vorzugsweise von 10–40, insbesondere von 15–25 Gew.-%. Als Ballaststoffe aus pflanzlichem Zellwandmaterial werden vorzugsweise Zellwandpolysaccharide eingesetzt, insbesondere solche, die im Verdauungstrakt nicht oder nur unvollständig gespalten werden. Hierbei kann es sich beispielsweise um Xylan, Cellulose, Xyloglucan, Pectine oder andere Hemicellulosen oder Mischungen der genannten Komponenten handeln.

Der Feuchtigkeitsgehalt beträgt vorzugsweise von 50–90 Gew.-%, besonders bevorzugt von 60–80 Gew.-%. Zum Einstellen des Feuchtigkeitsgehalts wird vorzugsweise eine wässrige Lösung, besonders bevorzugt eine gepufferte wässrige Lösung verwendet. Hierbei kann es sich beispielsweise um einen Phosphat-Puffer, insbesondere PBS, um einen Tris-Puffer oder um einen Citratpuffer handeln.

Der pH-Wert der wässrigen Lösung und ebenso der des Fäkalienersatzes beträgt vorzugsweise zwischen 5,8 und 8,5, vor allem zwischen 6,8 und 8,0.

Als Alternativen zu Glycerin kommen alle Substanzen in Frage, die eine ähnliche Viskosität wie Glycerin aufweisen, insbesondere solche mit einer dynamischen Viskosität η von 1000–2000, insbesondere von etwa 1500 mPa·s bei 20°C. Als Beispiel sind insbesondere Polyethylenglykole zu nennen.

Der Gehalt des erfindungsgemäßen Mittels an Glycerin bzw. an Substanzen mit ähnlicher Viskosität liegt in einer bevorzugten Ausführungsformen zwischen 3–30 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 5–20 Gew.-%.

Der Fäkalienersatz kann beispielsweise auf folgende Weise hergestellt werden:

a) Mikroorganismen der Species E. coli werden in einem Nährmedium kultiviert und vermehrt, das insbesondere Sojamehl enthalten kann, bis die Keimzahl mehr als 10⁹, insbesondere etwa 4·10⁹ Keime pro ml beträgt,
b) die Biomasse wird durch Zentrifugation geerntet und gegebenenfalls durch Autoklavieren inaktiviert,
c) die Abwesenheit vermehrungsfähiger E. coli-Keime wird gegebenenfalls durch Ausplattieren auf Tetracyclin-haltigem Medium überprüft,
d) die Biomasse (bspw. ca. 100 Teile; „Teile" bezieht sich im folgenden jeweils auf das Gewicht) wird mit pflanzlichem Zellwandmaterial (bspw. ca. 49,5 Teilen Xylan), Glycerin (bspw. ca. 33 Teilen) und gepufferter wässriger Lösung (bspw. ca. 61,5 Teilen PBS) portionsweise vermischt, so dass sich eine homogene Masse mit einer leicht viskos tropfenden bis teigigen, gerade noch streichfähigen Konsistenz ergibt.

Die Konsistenz bzw. das rheologische Verhalten des Fäkalienersatzes ist vorzugsweise von leicht viskos tropfend bis gerade noch streichfähig, besonders bevorzugt von zäh tropfend bis gut streichfähig und wird je nach Anforderung insbesondere durch Variation des Feuchtigkeitsgehalts eingestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt hierbei die Viskosität des Fäkalienersatzes bei 20°C bei einer Scherrate von 10 s^–1 zwischen 10 und 400 Pa, bei einer Scherrate von 30 s^–1 zwischen 5 und 120 Pa und bei einer Scherrate von 100 s^–1 zwischen 1 und 50 Pa. Beispielhafte Viskositäten bei unterschiedlichen Scherraten für einen gut streichfähigen und einen zäh tropfenden Fäkalienersatz sind der folgenden Tabelle zu entnehmen.

Da der Fäkalienersatz in Konsistenz und Anhaftungsverhalten weitgehend natürlichen Fäkalien entspricht, ist er als Testsubstrat zur Bewertung der Leistung von Reinigungsmitteln, insbesondere von WC-Reinigern, hervorragend geeignet, hierbei insbesondere zur Bewertung der Entfernung von Fäkalien oder der Verhinderung der Anlagerung von Fäkalien auf WC-Materialien, die insbesondere aus Keramik, Edelstahl oder Kunststoff bestehen können. Darüber hinaus kann er verwendet werden zur Beurteilung des Strömungsverhaltens in der Entwicklung von WC-Spülanlagen, -Becken und -Abläufen. Aber auch als künstliche Anschmutzung in der Entwicklung von Waschmitteln, insbesondere für die Hospitalhygiene oder von Windelerzeugnissen ist die Substanz geeignet.

Die chemische Zusammensetzung des Fäkalienersatzstoffs entspricht weitestgehend der natürlicher Fäkalien (siehe Roche Lexikon Medizin, 4. Auflage, Urban & Fischer Verlag München oder Römpp Online, Georg Thieme Verlag) und entsprechend sind auch die physikalischen Eigenschaften weitestgehend ähnlich. Diese können ferner durch Variation der Menge der unterschiedlichen Komponenten den Anforderungen entsprechend variiert werden, ohne dass künstliche, die rheologischen Eigenschaften modulierende Zusatzstoffe erforderlich sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fäkalienersatzes handelt es sich bei der verwendeten bakteriellen Biomasse um hygienisch unbedenkliche nicht-pathogene Zellen, insbesondere um E. coli-Zellen eines Derivates des K12-Stammes, die gegebenenfalls zusätzlich durch Autoklavieren inaktiviert werden können.

Ein Infektionsrisiko durch versehentlich nicht vollständig abgetötete Biomasse besteht hierbei insbesondere für E. coli K12-Derivate nicht, da diese Derivate in die biologische Sicherheitsstufe S1 (ohne Gefährdungspotential) eingestuft sind. Eine intensive anaerobe Fermentation und Zersetzung der Nährstoffe, wie sie normalerweise im Darm vorkommt, findet bei der Herstellung der Substanz nicht statt, so dass auch die üblicherweise enthaltenen Geruch hervorrufenden Schwefelverbindungen und biogenen Amine nicht übermäßig stark enthalten sind.

Gegenüber natürlichen Fäkalien ist daher der Fäkalienersatz vorteilhafterweise gesundheitlich unbedenklich und weist bei erfindungsgemäßer Handhabung keine unangenehme Geruchsentwicklung und auch keine vermehrungsfähigen Keime mehr auf. Daher kann er ohne zusätzliche Schutz- und Sicherheitsmaßnahmen, z. B. nach der BioStoffVO, für eine Produktentwicklung verwendet werden. Er ist außerdem in seiner Zusammensetzung definiert und konstant.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Anschmutzung ist, dass sie durch Gefriertrocknung konserviert werden kann, wobei durch Zugabe der durch Gefriertrocknung entfernten Wassermenge die Eigenschaften des Fäkalienersatzes wieder hergestellt werden können. Aus diesem Grund können die Proben sehr gut und praktisch unbeschränkt gelagert und ebenso transportiert werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch gefriergetrockneter Fäkalienersatz, der durch Gefriertrocknung des erfindungsgemäßen Fäkalienersatzes erhältlich ist.

Des weiteren lässt sich die Viskosität des Fäkalienersatzes durch Zugabe oder Entfernen von Wasser beliebig einstellen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung des artifiziellen Fäkalienersatzes zur Herstellung einer künstlichen Fäkalanschmutzung.

Die Auftragung des Fäkalienersatzes kann hierbei beispielsweise in Abhängigkeit von der eingestellten Konsistenz des Fäkalienersatzes mit Hilfe einer Lochschablone erfolgen, die z. B. aus Blech bestehen und einen Durchmesser von 10 mm und eine Blechstärke von 0,1 mm besitzen kann oder aber der Auftrag kann mit Hilfe einer Pipette erfolgen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist hierbei insbesondere die Verwendung des artifiziellen Fäkalienersatzes zur Durchführung von Tests zur Überprüfung der Reinigungsleistung von WC-Reinigern, Waschmitteln, Windelerzeugnissen und/oder WC-Spülanlagen. Das Verfahren kann hierbei beispielsweise durchgeführt werden, wie in den Ausführungsbeispielen angegeben.

Abbildungen

In 1 wurden Anschmutzungen mit natürlichen Faeces und erfindungsgemäßem Fäkalienersatzstoff durchgeführt und diese anschließend einem standardisierten Spülprozess unterzogen (s. Beispiel 3). Es wurde spaltenweise alternierend Fäkalienersatzstoff und natürlicher Faeces aufgetragen, beginnend mit Fäkalienersatzstoff.

Ausführungsbeispiele
Die Abk. "upm" steht im Folgenden für die Einheit U/min.
Beispiel 1: Präparation bakterieller Biomasse
Zur Anzucht wird ein Medium verwendet bestehend aus:

Sojamehl 30 g/l

MOPS 10 g/l

K₂HPO₄ 10 g/l

Glucose 30 g/l

MgSO₄·7H₂O 1 g/l

MnSO₄ 50 mg/l

FeSO₄·7H₂O 50 mg/l

pH = 7,4
Zur Anzucht wird eine Vorkultur des Stammes Escherichia coli XL-1 (Fa. Stratagene, #200268) für ca 16 h in Vollmedium (z.B Luria-Bertani-Broth) angezogen und 1%ig (bezogen auf das Gesamtkulturvolumen) dem zuvor sterilisierten oben beschriebenen Medium zugesetzt. Die Inkubation erfolgt in mit 500 ml Kultur befüllten 2 l Glasschüttelkolben mit je 4 Schikanen für 48 Stunden bei 37°C und 130 upm. Die Keimzahl wird zur Kontrolle durch Ausplattieren bestimmt und beträgt in einem typischen Experiment 4·10⁹ Keime pro ml. Die Biomasse wird durch Zentrifugation bei 12.000 upm (z.B Sorvall-Zentrifuge RC 5B, GSA-Rotor) abgetrennt und anschließend durch Autoklavieren inaktiviert. Die Abwesenheit vermehrungsfähiger E. coli – Keime kann durch Ausplattieren auf Tetracyclin-haltigem Medium überprüft werden. Die Ausbeute an Biomasse (Feuchtgewicht) beträgt ca. 60 bis 70 g je Liter Kulturvolumen.
Beispiel 2: Herstellung des Fäkalienersatzstoffs
Aus der Biomasse von Beispiel 1 wird dann ein Fäkalienersatzstoff hergestellt. Dazu werden 100 g Biomasse mit 49,5 g Xylan (Oat spelts, Sigma No. X0627), 33 g Glycerin und 61,5 g phosphatgepufferte Saline (PBS pro Liter 0,21 g KH₂PO₄, 9,00 g NaCl, 0,726 g Na₂HPO₄·7H₂O) portionsweise vermischt, so dass sich eine homogene Masse mit einer teigigen, streichfähigen Konsistenz ergibt. Da der Feuchtigkeitsanteil der Biomasse variieren kann, muss ggf. der Flüssigkeitsanteil durch Zugabe von PBS angepasst werden.
Beispiel 3: Vergleich von Anschmutzungen mit natürlichen Faeces und Fäkalienersatzstoff
In 1 ist ein Vergleich der Modellanschmutzung mit Faeces humanen Ursprungs zu sehen. Jeweils 3 unterschiedliche Mengen von 50 μl bis 250 μl wurden auf eine Keramikkachel aufgetragen und 5 aufeinander folgenden Spülzyklen unterzogen. Gut zu erkennen ist in Abhängigkeit der aufgetragenen Menge eine unterschiedlich starke Ablösung durch die Spülvorgänge.
Insbesondere bei größeren Mengen ist ein weitgehend gleiches Ablösungsverhalten zwischen natürlichen Faeces und Faekalienersatzstoff zu beobachten.
Beispiel 4: Herstellung eines gefriergetrockneten Fäkalienersatzstoffs
Ein Fäkalienersatzstoff mit der Zusammensetzung von Beispiel 2 wird mittels Gefriertrocknung entwässert. Der Wasserverlust beträgt 54%. Man erhält ein rieselfähiges Pulver ohne klebrige Eigenschaften. Durch Zugabe der zuvor entzogenen Wassermenge wird eine Anschmutzung erhalten, die sich nicht von der Anschmutzung aus Beispiel 2 unterscheidet. Zudem kann durch Variation des Wasseranteils die Viskosität exakt eingestellt werden. Die Durchführung der Anschmutzungstests aus Beispiel 3 mit einer Anschmutzung aus Beispiel 2 und 4 ergibt identische Ergebnisse.

Claims

Fäkalienersatzstoff enthaltend: a) bakterielle Biomasse, b) Ballaststoffe aus pflanzlichem Zellwandmaterial, c) Glycerin oder eine Substanz ähnlicher Viskosität und d) eine wässrige Lösung.
Fäkalienersatzstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die bakterielle Biomasse E. coli enthält.
Fäkalienersatzstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den E. coli-Bakterien um einen nicht-pathogenen E. coli-Stamm handelt.
Fäkalienersatzstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Ballaststoffen aus pflanzlichem Zellwandmaterial um Zellwandpolysaccharide handelt.
Fäkalienersatzstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Zellwandpolysaccharid um Xylan handelt.
Fäkalienersatzstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der wässrigen Lösung um einen Puffer handelt.
Fäkalienersatzstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an bakterieller Biomasse von 10–90 Gew.-% beträgt.
Fäkalienersatzstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Ballaststoffen aus pflanzlichem Zellwandmaterial von 10–40 Gew.-% beträgt.
Fäkalienersatzstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Feuchtigkeitsgehalt von 50–90 Gew.-% beträgt.
Fäkalienersatzstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Glyceringehalt von 3–30 Gew.-% beträgt.
Fäkalienersatzstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert zwischen 5,8 und 8,5 liegt.
Fäkalienersatzstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Konsistenz von leicht viskos tropfend bis gerade noch streichfähig ist.
Verwendung eines Fäkalienersatzstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung einer künstlichen Fäkalanschmutzung.
Verwendung eines Fäkalienersatzstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Überprüfung der Reinigungsleistung von WC-Reinigern, Waschmitteln, Windelerzeugnissen und/oder WC-Spülanlagen.
Verfahren zur Herstellung eines Fäkalienersatzstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 12, folgende Schritte umfassend: a) Mikroorganismen der Species E. coli werden in einem Nährmedium kultiviert und vermehrt, bis die Keimzahl mehr als 10⁹ Keime pro ml beträgt, b) die Biomasse wird durch Zentrifugation geerntet, c) die Biomasse wird mit Ballaststoffen aus pflanzlichem Zellwandmaterial, Glycerin oder einer Substanz ähnlicher Viskosität und mit einer wässrigen Lösung portionsweise vermischt, so dass sich eine homogene Masse mit einer leicht viskos tropfenden bis teigigen, gerade noch streichfähigen Konsistenz ergibt.
Verfahren zur Konservierung eines Fäkalienersatzstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Fäkalienersatzstoff der Gefriertrocknung unterzogen wird.
Gefriergetrockneter Fäkalienersatzstoff, erhältlich durch Gefriertrocknung eines Fäkalienersatzstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 12.