DE10332623A1 - Cells and methods for the fermentative production of R-alpha-lipoic acid - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von R-alpha-Liponsäure mittels Fermentation, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Zelle, die gegenüber einem Wildtyp-Stamm eine erhöhte Aktivität der Lipoyl-Protein-Ligase B besitzt und gleichzeitig eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids aufweist, in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-alpha-Liponsäure in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-alpha-Liponsäure von dem Kulturmedium abgetrennt wird.The invention relates to a process for the preparation of R-alpha-lipoic acid by fermentation, which is characterized in that a cell which has an increased activity of lipoyl protein ligase B compared to a wild-type strain and at the same time increased compared to the wild type Concentration of a lipoylatable polypeptide is cultured in a culture medium, wherein the cell excretes enantiomerically pure R-alpha-lipoic acid in the culture medium and the enantiomerically pure R-alpha-lipoic acid is separated from the culture medium.

Description

Die Erfindung betrifft Zellen und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von R-α-Liponsäure.The The invention relates to cells and to a process for fermentative production of R-α-lipoic acid.

R-α-Liponsäure ist in einer Vielzahl von Pro- und Eukaryonten ein essentieller Cofaktor bestimmter Multienzymkomplexe. Dabei ist die R-α-Liponsäure mit seiner Carboxylgruppe unter Bildung eines so genannten Lipoamids jeweils kovalent an die ε-Aminogruppe eines spezifischen Lysin-Rests des entsprechenden Enzyms gebunden. Auf diese Weise ist die R-α-Liponsäure ein Teil der E2-Untereinheit der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) [EC 2.3.1.12] bzw. der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase (KGDH)[EC 2.3.1.61] und spielt dort als Redoxpartner und Acylgruppenüberträger eine entscheidende Rolle bei der oxidativen Decarboxylierung von α-Ketosäuren. Außerdem fungiert R-α-Liponsäure als Aminomethyl-Carrier in Glycin-Cleavage Enzymsystemen.R-α-lipoic acid is an essential cofactor in a variety of pro- and eukaryotes certain multi-enzyme complexes. In this case, the R-α-lipoic acid with its carboxyl group covalently attached to the ε-amino group to form a so-called lipoamide bound to a specific lysine residue of the corresponding enzyme. In this way, the R-α-lipoic acid is a Part of the E2 subunit of pyruvate dehydrogenase (PDH) [EC 2.3.1.12] or α-ketoglutarate dehydrogenase (KGDH) [EC 2.3.1.61] and plays there as redox partner and acyl group carrier crucial role in the oxidative decarboxylation of α-keto acids. In addition, acts R-α-lipoic acid as Aminomethyl Carrier in Glycine Cleavage Enzyme Systems.

Die physiologisch und genetisch am besten charakterisierte α-Ketosäure-Dehydrogenase ist der Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex von Escherichia coli. Die drei Untereinheiten E1 (Pyruvat-Dehydrogenase), E2 (Dihydrolipoamid-Acetyltransferase) und E3 (Dihydrolipoamid-Dehydrogenase) werden von einem Operon bestehend aus den Genen aceE, aceF und lpd codiert und formen einen Multienzymkomplex, welcher sich aus 24 E1-, 24 E2- und 12 E3-Untereinheiten zusammensetzt. Dabei bilden die 24 E2-Untereinheiten das Kernstück des Komplexes.The Physiologically and genetically best characterized α-keto acid dehydrogenase is the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex of Escherichia coli. The three subunits E1 (pyruvate dehydrogenase), E2 (dihydrolipoamide acetyltransferase) and E3 (dihydrolipoamide dehydrogenase) are composed of an operon from the genes aceE, aceF and lpd and form a multi-enzyme complex, which consists of 24 E1, 24 E2 and 12 E3 subunits. The 24 E2 subunits form the core of the complex.

Das E2-Monomer der PDH (E2p) ist wiederum modular aus verschiedenen Domänen aufgebaut, die über flexible Linkerregionen miteinander verbunden sind (s. 1). Der N-Terminus des Proteins enthält drei so genannte Lipoyl-Domänen bestehend aus jeweils ca. 80 Aminosäureresten, wobei jede dieser Domänen genau ein Molekül R-α-Liponsäure wie oben beschrieben binden kann. Diese drei Lipoyl-Domänen der PDH weisen untereinander jeweils eine sehr hohe Sequenzidentität (> 66 %) auf. An die N-terminale Region des Proteins schließt sich die kleine zentrale E3-Bindedomäne an, die wiederum mit dem C-terminalen Be reich, der die katalytischen Domäne (Acetyl-Transferase) enthält, verbunden ist.The E2 monomer of the PDH (E2p) is in turn built up modularly from different domains, which are connected to each other via flexible linker regions (s. 1 ). The N-terminus of the protein contains three so-called lipoyl domains consisting of approximately 80 amino acid residues, each of which can bind exactly one molecule of R-α-lipoic acid as described above. These three lipoyl domains of PDH each have a very high sequence identity (> 66%). The N-terminal region of the protein is followed by the small central E3 binding domain, which in turn is linked to the C-terminal region containing the catalytic domain (acetyl transferase).

Die E2-Untereinheit der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase (E2o) wird vom sucB-Gen codiert und ist ebenfalls modular aufgebaut, besitzt aber im Gegensatz zum E2-Protein der PDH nur eine Lipoyl-Domäne. Die Sequenz der E2o-Lipoyl-Domäne zeigt mit nur etwa 22 % eine relativ schwache Identität zu den E2p-Lipoyl-Domänen, die räumliche Struktur der Lipoyl-Domänen beider E2-Proteine ist allerdings sehr ähnlich (Reche und Perham, 1999, EMBO J. 18: 2673-2682).The E2 subunit of α-ketoglutarate dehydrogenase (E2o) is encoded by the sucB gene and is also modular in structure, However, in contrast to the E2 protein of PDH has only one lipoyl domain. The sequence the E2o-lipoyl domain shows with only about 22% a relatively weak identity to the E2p lipoyl domains, the spatial Structure of lipoyl domains both E2 proteins is very similar though (Reche and Perham, 1999, EMBO J. 18: 2673-2682).

Ein bezüglich der Sequenz zu den Lipoyl-Domänen der E2-Proteine auch nur mäßig homologes, strukturell aber ebenfalls sehr ähnliches Protein ist die Biotinyl-Domäne des Biotin-Carboxyl-Carrier-Proteins (BCCP). Das BCCP wird normalerweise posttranslational mittels der Biotinyl-Protein-Ligase BirA an einem spezifischen Lysin-Rest biotinyliert. Es gibt allerdings verschiedene spezifisch mutierte BCCP-Varianten, die mittels einer Lipoyl-Protein-Ligase an diesem speziellen Lysin-Rest nun auch alternativ oder sogar ausschließlich lipoyliert werden können (Reche und Perham, 1999, EMBO J. 18: 2673-2682).One in terms of the sequence to the lipoyl domains the E2 proteins even moderately homologous, structurally but also very similar Protein is the biotinyl domain of the biotin-carboxyl carrier protein (BCCP). The BCCP is usually post-translationally using the Biotinyl protein ligase BirA biotinylated at a specific lysine residue. However, there are several specifically mutated BCCP variants, by means of a lipoyl-protein ligase on this particular lysine residue now also alternatively or even exclusively lipoyliert can be (Reche and Perham, 1999, EMBO J. 18: 2673-2682).

α-Liponsäure ist ein optisch aktives Molekül mit einem Chiralitätszentrum am Kohlenstoffatom C6. Dabei stellt die R-Konfiguration der α-Liponsäure das natürlich vorkommende Enantiomer dar. Nur diese Form zeigt physiologische Aktivität als Cofaktor der entsprechenden Enzyme. α-Liponsäure kann sowohl in einer oxidierten (5-[1,2]-Dithiolan-3-yl-Pentansäure) als auch in einer reduzierten Form (6,8-Dimercapto-Oktansäure) vorkommen. Im Folgenden sind unter der Bezeichnung "α-Liponsäure" beide Formen sowie die jeweiligen Salze der α-Liponsäure, wie z. B. das Calcium-, Kalium-, Magnesium-, Natrium- oder das Ammoniumsalz zu verstehen.α-lipoic acid is an optically active molecule with a chirality center at the carbon atom C6. The R-configuration of the α-lipoic acid represents the Naturally occurring enantiomers. Only this form shows physiological activity as cofactor of the corresponding enzymes. α-lipoic acid can be oxidized in both (5- [1,2] -Dithiolan-3-yl-pentanoic acid) as well as in a reduced form (6,8-dimercapto-octanoic acid) occur. In the following, under the name "α-lipoic acid" both forms as well the respective salts of α-lipoic acid, such as z. As the calcium, potassium, magnesium, sodium or ammonium salt to understand.

Die Biosynthese von R-α-Liponsäure wurde besonders an dem Bakterium Escherichia coli intensiv untersucht (s. 2). Hier dient Oktansäure, die an das Acyl-Carrier-Protein (ACP) kova lent gebunden ist, als spezifische Vorstufe bei der Liponsäure-Synthese. In einer komplexen Reaktion werden zwei Schwefelatome auf die derart aktivierte Oktansäure (Oktanoyl-ACP) übertragen, wobei R-α-Lipoyl-ACP entsteht. Diese Reaktion wird von der Liponsäure-Synthase [EC 2.8.1.-], dem lipA-Genprodukt, katalysiert. Als Schwefeldonor dient dabei letztendlich die Aminosäure L-Cystein. Der anschließende Transfer der R-α-Liponsäure von R-α-Lipoyl-ACP auf die E2-Untereinheit der α-Ketosäure-Dehydrogenasen wird von der Lipoyl-Protein-Ligase B [EC 6.-.-.-], dem lipB-Genprodukt, katalysiert, ohne dass dabei jedoch R-α-Lipoyl-ACP oder R-α-Liponsäure als freie Zwischenprodukte auftreten (Miller et al., 2000, Biochemistry 39:15166-15178).The biosynthesis of R-α-lipoic acid has been extensively studied, especially on the bacterium Escherichia coli (s. 2 ). Here, octanoic acid, which is bound to the acyl carrier protein (ACP) kova lent, serves as a specific precursor in lipoic acid synthesis. In a complex reaction, two sulfur atoms are transferred to the thus-activated octanoic acid (octanoyl-ACP) to form R-α-lipoyl-ACP. This reaction is catalyzed by lipoic acid synthase [EC 2.8.1.-], the lipA gene product. The sulfur donor is ultimately the amino acid L-cysteine. Subsequent transfer of R-α-lipoic acid from R-α-lipoyl-ACP to the E2 subunit of α-keto acid dehydrogenases is mediated by lipoyl-protein ligase B [EC 6.-.-.-], the lipB Gene product, but without the presence of R-α-lipoyl-ACP or R-α-lipoic acid as free intermediates (Miller et al., 2000, Biochemistry 39: 15166-15178).

E. coli kann aber auch freie R-α-Liponsäure aus dem umgebenden Medium aufnehmen und für die Bildung funktioneller α-Ketosäure-Dehydrogenasen verwenden. Dazu wird R-α-Liponsäure zunächst mittels ATP zu R-α-Lipoyl-AMP aktiviert und anschließend auf die entsprechenden Enzym-Untereinheiten übertragen (s. 3). Beide Aktivitäten werden von der Lipoyl-Protein-Ligase A [EC 6.-.-.-], dem lplA-Genprodukt, katalysiert. Diese LplA-Aktivität ist für Wildtypstämme von E. coli allerdings nicht essentiell, wenn die endogene Liponsäure-Synthese und der Transfer der Lipoyl-Gruppe über den LipA/LipB-Weg erfolgt. So wurden beispielsweise lplA-Mutanten beschrieben, die keine nachweisbare Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität mehr besitzen, deren Phänotyp aber unter normalen Wachstumsbedingungen nicht von einer Wildtyp-Zelle zu unterscheiden ist (Morris et al., 1995, J. Bacteriol. 177: 1-10).E. coli can also absorb free R-α-lipoic acid from the surrounding medium and for the Use formation of functional α-keto acid dehydrogenases. For this purpose, R-α-lipoic acid is first activated by ATP to R-α-lipoyl-AMP and then transferred to the corresponding enzyme subunits (s. 3 ). Both activities are catalyzed by lipoyl protein ligase A [EC 6.-.-.-], the lplA gene product. However, this LplA activity is not essential for E. coli wild-type strains when endogenous lipoic acid synthesis and transfer of the lipoyl group occurs via the LipA / LipB pathway. Thus, for example, lplA mutants have been described which no longer have detectable lipoyl protein ligase A activity but whose phenotype can not be distinguished from a wild-type cell under normal growth conditions (Morris et al., 1995, J. Bacteriol : 1-10).

Über die Biosynthese von R-α-Liponsäure in Eukaryonten ist wenig bekannt. Es wird aber vermutet, dass die R-α-Liponsäure-Synthese sowie der Transfer auf die entsprechenden Enzyme in den Mitochondrien eukaryontischer Zellen auf ähnliche Weise wie in Bakterien erfolgt.About the Biosynthesis of R-α-lipoic acid in eukaryotes is little known. However, it is believed that the R-α-lipoic acid synthesis and the Transfer to the corresponding enzymes in the mitochondria eukaryotic Cells on similar ones As in bacteria.

Neben ihrer Relevanz als essentieller Bestandteil von Enzymen mit einer zentralen Rolle im Stoffwechsel, wurde schon früh die Bedeutung der α-Liponsäure für die Pharmakotherapie sowie für die Nahrungsmittelergänzung (Nutraceutical) erkannt: α-Liponsäure besitzt aufgrund ihrer beiden Thiolgruppen eine ausgeprägte Wirksamkeit als Antioxidans und kann deshalb den Organismus vor schädlichen Prozessen, die durch oxidativen Stress induziert werden, schützen. Außerdem ist α-Dihydroliponsäure, die reduzierte Form der α-Liponsäure, aufgrund ihrer Eigenschaft als starkes Reduktionsmittel in der Lage, andere oxidierte natürliche Antioxidationsmittel im Körper wie Ascorbinsäure oder α-Tocopherol direkt oder indirekt zu regenerieren oder bei deren Mangel diese auch zu ersetzen. Entsprechend kommt der α-Liponsäure im Zusammenspiel mit Ascorbinsäure, α-Tocopherol und Glutathion, dem so genannten "Netzwerk der Antioxidantien", eine zentrale Bedeutung zu. α-Liponsäure wird außerdem zur Prävention und Bekämpfung von Diabetes mellitus Typ II und dessen Folgeschäden, wie z. B. Polyneuropathie, Cataract oder Kardiovaskularleiden eingesetzt.Next their relevance as an essential component of enzymes with a Central role in metabolism, was early on the importance of α-lipoic acid for pharmacotherapy also for the food supplement (Nutraceutical) recognized: α-lipoic acid possesses due to their two thiol groups a pronounced effectiveness as an antioxidant and therefore can prevent the organism from damaging processes by protect oxidative stress. In addition, α-dihydrolipoic acid, the reduced form of α-lipoic acid, due their capacity as a strong reducing agent capable others oxidized natural Antioxidant in the body like ascorbic acid or α-tocopherol to regenerate directly or indirectly or in their absence also to replace. Accordingly, the α-lipoic acid comes in conjunction with ascorbic acid, α-tocopherol and glutathione, the so-called "network of antioxidants", a central importance to. α-lipoic acid is Furthermore for prevention and combat diabetes mellitus type II and its sequelae such. B. polyneuropathy, Cataract or cardiovascular disease used.

Die unterschiedliche biologische Aktivität beider Enantiomere der α-Liponsäure ist derzeit Gegenstand intensiver Untersuchungen, wobei sich allerdings immer mehr herauskristallisiert, dass die Applikation des reinen R-Enantiomers der α-Liponsäure deutliche Vorteile gegenüber der S-Form aufweist. So wurde im in vitro-Versuch gezeigt, dass nur die natürliche R-α-Liponsäure zur Bildung funktioneller α-Ketosäure-Dehydrogenasen führt. Das S-Enantiomer hatte dagegen sogar einen inhibierenden Effekt auf die Stimulierung der Enzymaktivität durch R-α-Liponsäure. Die Reduktion von α-Liponsäure und damit die Regeneration der antioxidativ wirksamen α-Dihydroliponsäure in den Mitochondrien ist für die Zelle von essentieller Bedeutung. Die mitochondriale NADH-abhängige Lipoamid-Reduktase von Säugern zeigt mit dem R-Enantiomer eine fast 20-fach höhere Aktivität als mit der S-Form. Des weiteren hat R-α-Liponsäure verglichen mit dem S-Enantiomer einen deutlich stärkeren Effekt auf die insulin-vermittelte Glucose-Aufnahme und den Glucose-Metabolismus von Skelettmuskelzellen insulin-resistenter Ratten. Im Tierversuch zeigte die R-Form außerdem einen antiphlogistischen Effekt, während die S-Form eher eine analgetische Wirkung hatte. Um unerwünschte Nebeneffekte zu vermeiden, ist es daher äußerst wünschenswert, α-Liponsäure jeweils nur in der enantiomerenreinen Form zu applizieren.The different biological activity of both enantiomers of α-lipoic acid is currently being the subject of intensive research, although more and more crystallized that the application of pure R-enantiomers of α-lipoic acid distinct Advantages over having the S-shape. Thus, it was shown in the in vitro experiment that only the natural one R-α-lipoic acid for Formation of functional α-keto acid dehydrogenases leads. In contrast, the S-enantiomer even had an inhibiting effect on the stimulation of enzyme activity by R-α-lipoic acid. The reduction of α-lipoic acid and so that the regeneration of the antioxidant α-dihydrolipoic acid in the Mitochondria is for the cell of essential importance. Mammalian mitochondrial NADH-dependent lipoamide reductase shows with the R-enantiomer an almost 20-fold higher activity than with the S-shape. Furthermore, R-α-lipoic acid has been compared with the S-enantiomer a significantly stronger effect on the insulin-mediated Glucose uptake and glucose metabolism of skeletal muscle cells insulin-resistant Rats. In animal experiments, the R-form also showed an anti-inflammatory Effect while the S-form had an analgesic effect. To unwanted side effects Therefore, it is highly desirable to use α-lipoic acid, respectively to be applied only in the enantiomerically pure form.

Derzeit erfolgt die großtechnische Herstellung von α-Liponsäure ausschließlich mittels chemischer Verfahren, wobei immer das Razemat aus R- und S-Form als Endprodukt gebildet wird (Y-adav et al., 1990, J. Sci. Ind. Res. 49: 400-409). Zur Gewinnung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure wurden verschiedene Verfahren entwickelt. Beispielsweise kann das Razemat der α-Liponsäure oder eines der Syntheseintermediate entweder chemisch mittels chiraler Hilfssubstanzen (Walton et. al, 1954, J. Amer. Chem. Soc. 76: 4748; DE 4137773 ) oder enzymatisch (Adger et al., 1995, J. Chem. Soc., Chem. Commun.: 1563-1564) aufgespalten werden. In anderen Verfahren unterbleibt die Entstehung eines Razemats aufgrund eines enantioselektiven Syntheseschritts, wobei das neue Chiralitätszentrum entweder chemisch ( DE 3629116 ; DE 19533881 ; Bringmann et al., 1999, Z. Naturforsch. 54b: 655-661; DE 10036516 ) oder durch eine stereospezifische Biotransformation mittels Mikroorganismen eingeführt werden kann (Gopalan und Jacobs, 1989, Tetrahedron Lett. 30: 5705-5708; Dasaradhi et al., 1990, J. Chem. Soc., Chem. Commun.: 729-730; DE 10056025 ). Andere Prozesse wiederum starten die chemische Synthese von enantiomerenreiner α-Liponsäure mit einem natürlich vorkommenden chiralen Edukt wie z. B. S-Maleinsäure oder D-Mannitol (Brookes und Golding, 1988, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I: 9-12; Rama Rao et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28, 2183-2186). Wegen z. T. aufwendiger Syntheseschritte, geringer Ausbeuten und hoher Materialkosten sind alle bekannten Methoden zur Herstellung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure derzeit nicht wirtschaftlich.At present, the large-scale production of α-lipoic acid takes place exclusively by means of chemical processes, the racemate always being formed from R and S form as end product (Y-adav et al., 1990, J. Sci. Ind. Res. 49: 400 -409). To obtain enantiomerically pure R-α-lipoic acid, various methods have been developed. For example, the racemate of the α-lipoic acid or one of the synthesis intermediates can be prepared either chemically by means of auxiliary chiral substances (Walton et al, 1954, J. Amer. Chem. Soc., 76: 4748; DE 4137773 ) or enzymatically (Adger et al., 1995, J. Chem. Soc., Chem. Commun.: 1563-1564). In other processes, the formation of a racemate is omitted due to an enantioselective synthesis step, where the new center of chirality is either chemically ( DE 3629116 ; DE 19533881 ; Bringmann et al., 1999, Z. Naturforsch. 54b: 655-661; DE 10036516 ) or by a stereospecific biotransformation by means of microorganisms (Gopalan and Jacobs, 1989, Tetrahedron Lett 30: 5705-5708; Dasaradhi et al., 1990, J. Chem. Soc., Chem. Commun .: 729-730; DE 10056025 ). Other processes in turn start the chemical synthesis of enantiomerically pure α-lipoic acid with a naturally occurring chiral starting material such. S-maleic acid or D-mannitol (Brookes and Golding, 1988, J.Chem.Soc.Perkin Trans. I: 9-12; Rama Rao et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28, 2183-2186). Because of z. T. elaborate synthetic steps, low yields and high material costs are all known methods for the preparation of enantiomerically pure R-α-lipoic acid currently not economical.

Die großtechnische Herstellung vieler niedermolekularer Naturstoffe, wie z.B. Antibiotika, Vitamine oder Aminosäuren erfolgt heute oftmals mittels eines fermentativen Verfahrens unter Verwendung verschiedener Stämme von Mikroorganismen.The large-scale Preparation of many low molecular weight natural products, e.g. antibiotics, Vitamins or amino acids is often done today by means of a fermentative process Use of different strains of microorganisms.

Die Patentanmeldungen am Deutschen Patent- und Markenamt mit den Aktenzeichen 10235270, 10245993 und 10258127 beschreiben verschiedene Zellen, die enantiomerenreine R-α-Liponsäure sekretieren sowie Verfahren, bei denen die Produktion von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure ausschließlich in einem Fermentationsprozeß erfolgt. Dabei werden Zellen eingesetzt, die entweder ein Liponsäure-Synthase-Gen bzw. ein Lipoyl-Protein-Ligase B-Gen einzeln oder auch in Kombination überexprimieren oder Zellen, die eine verminderte Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität aufweisen. Die Produktion von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure mit Hilfe dieser Zellen erfolgt allerdings in noch sehr beschränktem Ausmaß, so dass diese fermentativen Verfahren derzeit noch nicht mit der chemischen Synthese konkurrieren können.The Patent applications at the German Patent and Trademark Office with the file number 10235270, 10245993 and 10258127 describe different cells, secrete the enantiomerically pure R-α-lipoic acid and processes in which the production of enantiomerically pure R-α-lipoic acid exclusively in a fermentation process takes place. It uses cells that are either a lipoic acid synthase gene or a lipoyl protein ligase B overexpress individually or in combination or cells that have a decreased lipoyl protein ligase A activity. The production of enantiopure R-α-lipoic acid with Help of these cells, however, is still very limited, so that These fermentative processes are currently not yet with the chemical Synthesis can compete.

Nur in seltenen Fällen führt eine einzige genetische Manipulation im Zuge des so genannten "metabolic engineering" eines Wildtypstammes zur Überproduktion der gewünschten Verbindung in ausreichendem Umfang. Vielmehr ist dazu eine Kombination von mehreren gezielten genetischen Manipulationen notwendig, oftmals noch ergänzt durch klassische Mutagenese/Screening-Ansätze.Just In rare cases leads one only genetic manipulation in the course of the so-called "metabolic engineering" of a wild-type strain to overproduction the desired Sufficient connection. Rather, it is a combination of several targeted genetic manipulations necessary, often still added through classical mutagenesis / screening approaches.

Entsprechend ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, leistungsfähige Zellen, welche enantiomerenreine R-α-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretieren, bereitzustellen.Corresponding it is the object of the present invention to provide efficient cells, which enantiomerically pure R-α-lipoic acid in a Secretory culture medium to provide.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Zelle, die enantiomerenreine R-α-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine gegenüber einem Wildtyp-Stamm erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B Aktivität besitzt und gleichzeitig eine im Vergleich zu dem Wildtyp-Stamm erhöhte Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids aufweist.These Task is solved by a cell secreting enantiomerically pure R-α-lipoic acid into a culture medium, characterized in that it has a relative to a wild-type strain increased lipoyl protein ligase B activity and at the same time one compared to the wild-type strain increased Concentration of a lipoylatable polypeptide has.

Aus physiologischen und biochemischen Daten geht hervor, dass Liponsäure in Wildtyp-Zellen nahezu ausschließlich in gebundener Form vorkommt, da bereits die Synthese der R-α-Liponsäure vollständig proteingebunden erfolgt (vgl. 1) (Herbert und Guest, 1975, Arch. Microbiol. 106: 259-266; Miller et al., 2000, Biochemistry 39:15166-15178). Erstaunlicherweise ist die Verstärkung einer Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität einer Wildtyp-Zelle ausreichend, damit es zur Ausscheidung von R-α-Liponsäure in das Kulturmedium kommt ( DE 10245993 ). Im Rahmen dieser Erfindung wurde nun völlig überraschend gefunden, dass eine Verstärkung der Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität kombiniert mit einer Erhöhung der intrazellulären Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids zu einer deutlich gesteigerten Anhäufung enantiomerenreiner R-α-Liponsäure im Kulturmedium dieser Zellen führt.Physiological and biochemical data show that lipoic acid occurs almost exclusively in bound form in wild-type cells since the synthesis of R-α-lipoic acid is already completely protein-bound (cf. 1 (Herbert and Guest, 1975, Arch. Microbiol 106: 259-266; Miller et al., 2000, Biochemistry 39: 15166-15178). Surprisingly, the enhancement of lipoyl protein ligase B activity of a wild-type cell is sufficient to cause the excretion of R-α-lipoic acid into the culture medium ( DE 10245993 ). In the context of this invention, it has now been found, completely surprisingly, that an increase in the lipoyl-protein ligase B activity combined with an increase in the intracellular concentration of a lipoylatable polypeptide leads to a significantly increased accumulation of enantiomerically pure R-α-lipoic acid in the culture medium of these cells.

In einem E. coli Wildtyp-Stamm sind normalerweise alle Lipoyl-Bindestellen der E2-Proteine (spezifische Lysinreste) mit R-α-Liponsäure abgesättigt, d.h. mit Liponsäure modifiziert, (Packman et al., 1991, Biochem. J. 277: 153-158), da die de novo-Synthese der R-α-Liponsäure und der anschließende Transfer vom R-α-Lipoyl-ACP auf die entsprechenden Lipoyl-Domänen gut aufeinander abgestimmt sind. Die vermehrte Präsenz eines lipoylierbaren Polypeptids in einer Zelle hat nun verschiedene Konsequenzen:

• – Es kommt zur Akkumulation von unmodifizierten, d.h. nicht-lipoylierten Lipoyl-Akzeptorproteinen, da die Liponsäure-Synthese-Kapazität der Zelle nicht mehr für eine vollständige Beladung aller potentiell lipoylierbaren Polypeptide ausreicht (Miles und Guest, 1987, Biochem. J. 245: 869-874; Ali und Guest, 1990, Biochem. J. 271: 139-145).
• – Zellen mit einer erhöhten Konzentration von unmodifizierten Lipoyl-Akzeptorproteinen können im Vergleich zu Wildtyp-Zellen extern supplementierte R-α-Liponsäure vermehrt aufnehmen und an Lipoyl-Akzeptorproteine binden (Morris et al., 1995, J. Bacteriol. 177: 1-10).
• – Die Exkretion von R-α-Liponsäure wird bei einem Liponsäure-Produktionsstamm drastisch vermindert (siehe Stamm W3110ΔlplA pGS331 in Beispiel 3), wahrscheinlich deshalb, weil die de novo synthetisierte R-α-Liponsäure nun an die vermehrt zur Verfügung stehenden Lipoyl-Akzeptorproteine fi xiert werden kann, wodurch eine Ausscheidung verhindert wird.

In an E. coli wild-type strain, normally all lipoyl binding sites of the E2 proteins (specific lysine residues) are saturated with R-α-lipoic acid, ie, modified with lipoic acid (Packman et al., 1991, Biochem J. 277: 153 -158), since the de novo synthesis of R-α-lipoic acid and the subsequent transfer of R-α-lipoyl-ACP to the corresponding lipoyl domains are well coordinated. The increased presence of a lipoylatable polypeptide in a cell now has several consequences:

• Accumulation of unmodified, ie, non-lipoylated, lipoyl acceptor proteins occurs because the lipoic acid synthesis capacity of the cell is no longer sufficient for complete loading of all potentially lipoylatable polypeptides (Miles and Guest, 1987, Biochem J. 245: 869 Ali and Guest, 1990, Biochem J. 271: 139-145).
• Cells with an increased concentration of unmodified lipoyl acceptor proteins can increasingly take up externally supplemented R-α-lipoic acid and bind to lipoyl acceptor proteins compared to wild-type cells (Morris et al., 1995, J. Bacteriol 177: 1-10 ).
• The excretion of R-α-lipoic acid is drastically reduced in a lipoic acid production strain (see strain W3110ΔlplA pGS331 in Example 3), probably because the de novo synthesized R-α-lipoic acid now targets the abundant lipoyl acceptor proteins can be fi xed, whereby a precipitation is prevented.

Entsprechend dieser Befunde würde der Fachmann a priori vermuten, dass durch eine erhöhte Präsenz eines unmodifizierten lipoylierbaren Polypeptids in der Zelle die Exkretion von R-α-Liponsäure auch bei anderen Liponsäure-Produktionsstämmen, wie z. B. dem Stamm W3110 pBAD-lipB, der eine erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität aufweist ( DE 10245993 ), vermindert wird. Durch die Überexpression des lipB-Gens verfügen die erfindungsgemäßen Zellen zwar über eine erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität, aber durch eine gleichzeitige Bereitstellung von unbeladenen lipoylierbaren Polypeptiden wäre ausreichend Substrat für die Lipoyl-Protein-Ligase-Reaktion vorhanden, so dass die gesamte de novo gebildete R-α-Liponsäure an diesen Proteinen intrazellulär fixiert werden können sollte. Dennoch wird erstaunlicherweise unter diesen Bedingungen die R-α-Liponsäure vermehrt ausgeschieden.According to these findings, the skilled person would a priori suspect that by an increased presence of an unmodified lipoylatable polypeptide in the cell, the excretion of R-α-lipoic acid in other lipoic acid production strains, such. Strain W3110 pBAD-lipB, which has increased lipoyl protein ligase B activity ( DE 10245993 ) is reduced. Although the overexpression of the lipB gene, the cells of the invention have an increased lipoyl protein ligase B activity, but by the simultaneous provision of unloaded lipoylatable polypeptides sufficient substrate for the lipoyl-protein ligase reaction would be present, so that the Whole de novo R-α-lipoic acid formed on these proteins should be able to be fixed intracellularly. Nevertheless, surprisingly, under these conditions, the R-α-lipoic acid is increasingly excreted.

Unter der Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität ist im Rahmen dieser Erfindung vorzugsweise die vom lipB-Gen codierte Lipoyl-Protein-Ligase-Aktivität einer Zelle zu verstehen, welche eine strikte Präferenz für R-α-Lipoyl-ACP gegenüber freier R-α-Liponsäure als Substrat aufweist (s. 2).Among the lipoyl-protein ligase B activity in the context of this invention is preferably the of lipB gene encoded lipoyl protein ligase activity of a cell which has a strict preference for R-α-lipoyl-ACP over free R-α-lipoic acid as substrate (s. 2 ).

Unter einer gegenüber einem Wildtyp-Stamm erhöhten Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität ist im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zu verstehen, dass diese Aktivität mindestens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5 gesteigert ist.Under one opposite a wild-type strain increased Lipoyl protein ligase B activity is to be understood within the meaning of the present invention preferably that this activity at least by a factor of 2, preferably by at least a factor of 5 is increased.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem lipB-Gen um ein Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, das für ein Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 codiert oder um ein Gen codierend für eine funktionelle Variante des lipB-Genprodukts mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 2 größer 35 %.Preferably if the lipB gene is a gene with the sequence SEQ ID NO: 1, for a Protein encoded with the sequence SEQ ID NO: 2 or coding for a gene for one functional variant of the lipB gene product having a sequence identity to SEQ ID NO: 2 greater than 35%.

Besonders bevorzugt sind funktionelle Varianten des lipB-Genprodukts mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 2 größer 55 %, ganz besonders bevorzugt mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 2 größer 80 %.Especially preferred are functional variants of the lipB gene product having a sequence identity to SEQ ID NO: 2 greater than 55%, most preferably having a sequence identity to SEQ ID NO: 2 greater than 80%.

Unter einer funktionellen Variante des lipB-Genprodukts ist im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein Protein mit einer Aminosäure-Sequenz zu verstehen, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz ableitet, wobei die enzymatische Aktivität der durch dieses Gen codierten Lipoyl-Protein-Ligase B erhalten bleibt.Under a functional variant of the lipB gene product is within the meaning of present invention preferably a protein having an amino acid sequence to be understood by deletion, insertion or substitution of nucleotides derived from the sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein the enzymatic activity the encoded by this gene lipoyl protein ligase B is retained.

Unter einem "lipoylierbaren Polypeptid" sind im Rahmen dieser Erfindung Peptide oder Proteine zu verstehen, an die mindestens ein Molekül R-α-Liponsäure kovalent gebunden werden kann. Dabei erfolgt diese Bindung bevorzugt zwischen der Carboxylgruppe der R-α-Liponsäure und der ε-Aminogruppe eines Lysin-Restes des Polypeptids unter Bildung eines so genannten Lipoamids. Die Knüpfung einer solchen Lipoamid-Bindung wird in der Zelle vorzugsweise von einer Lipoyl-Protein-Ligase katalysiert.Under a "lipoylatable Polypeptide "are in the context of this invention, to understand peptides or proteins the at least one molecule Covalent R-α-lipoic acid can be tied. In this case, this bond is preferably carried out between the carboxyl group of R-α-lipoic acid and the ε-amino group a lysine residue of the polypeptide to form a so-called lipoamide. The weave Such lipoamide binding is preferred in the cell catalyzed by a lipoyl-protein ligase.

Unter einer im Vergleich zu dem Wildtyp-Stamm erhöhten Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids ist im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zu verstehen, dass die Menge dieses Polypeptids in einer Zelle mindestens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5 gesteigert ist.Under increased compared to the wild-type strain concentration of a lipoylatable Polypeptide is for the purposes of the present invention preferably to understand that the amount of this polypeptide in a cell at least increased by a factor of 2, preferably at least by a factor of 5 is.

Ein Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, umfasst vorzugsweise ein DNA-Fragment mit der Sequenz SEQ ID NO: 3, welches für ein Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 codiert oder ein DNA-Fragment, das für eine funktionelle Variante dieses Polypeptids mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 größer 20 % codiert.One Gene that for a lipoylatable polypeptide encodes preferably comprises DNA fragment having the sequence SEQ ID NO: 3, which is a polypeptide coded with the sequence SEQ ID NO: 4 or a DNA fragment, the for one functional variant of this polypeptide having a sequence identity to SEQ ID NO: 4 greater than 20% coded.

Besonders bevorzugt sind Gene codierend für Varianten eines lipoylierbaren Polypeptids mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 größer 40 %, ganz besonders bevorzugt sind Gene codierend für Polypeptid-Varianten mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 größer 70 %.Especially preferred are genes coding for Variants of a lipoylatable polypeptide having a sequence identity to SEQ ID NO: 4 greater than 40%, Very particularly preferred are genes coding for polypeptide variants with a sequence identity to SEQ ID NO: 4 greater than 70%.

Als Alternativen für Gene, die für ein lipoylierbares Polypeptid codieren, können auch Allele von Genen eingesetzt werden, die ursprünglich für ein biotinylierbares Polypeptid (z.B. BCCP) codieren, jedoch nach geringfügiger Sequenzvariation nun auch lipoyliert werden können (z.B. BCCP-DASMEP). Ein derartiges Gen umfasst ein DNA-Fragment mit der Sequenz SEQ ID NO: 5, welches für ein Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 codiert oder ein DNA-Fragment das für eine funktionelle Variante dieses Polypeptids mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 6 größer 75 % codiert.When Alternatives for Genes for can encode a lipoylatable polypeptide, alleles of genes can also be used be that originally for a biotinylatable polypeptide (e.g., BCCP), but with slight sequence variation can now be lipoylated (e.g., BCCP-DASMEP). Such a gene comprises a DNA fragment with the sequence SEQ ID NO: 5, which is for a polypeptide having the sequence SEQ ID NO: 6 encodes or a DNA fragment for a functional variant this polypeptide with a sequence identity to SEQ ID NO: 6 greater than 75% coded.

Unter einer funktionellen Variante eines lipoylierbaren Polypeptids ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Protein mit einer Aminosäure-Sequenz zu verstehen, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus den in SEQ ID NO: 3 oder in SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenzen ableitet, wobei die Eigenschaft der Lipoylierbarkeit durch eine Lipoyl-Protein-Ligase erhalten bleibt.Under a functional variant of a lipoylatable polypeptide in the context of the present invention, a protein having an amino acid sequence to be understood by deletion, insertion or substitution of nucleotides from those shown in SEQ ID NO: 3 or in SEQ ID NO: 5 Derived sequences, the property of lipoylation by a lipoyl-protein ligase is retained.

In der vorliegenden Erfindung beziehen sich alle Werte zur Sequenzidentität von DNA- und Aminosäure-Sequenzen auf Ergebnisse, die mit dem Algorithmus BESTFIT (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin) erhalten werden.In In the present invention, all values relate to the sequence identity of DNA and amino acid sequences to results obtained with the BESTFIT algorithm (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin).

Erfindungsgemäße Zellen, die neben einer verstärkten Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität eine gegenüber dem Wildtyp erhöhte Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids aufweisen, können mit Standardtechniken der Molekularbiologie erzeugt werden.Cells according to the invention, the next to a reinforced Lipoyl protein ligase B activity one opposite the wild type increased Concentration of a lipoylatable polypeptide can, with Standard techniques of molecular biology are generated.

Verfahren zur Steigerung der Aktivität der Lipoyl-Protein-Ligase B in einer Zelle sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in der Patentanmeldung DE 10245993 beschrieben, auf die insoweit ausdrücklich Bezug genommen wird.Methods for increasing the activity of lipoyl protein ligase B in a cell are known in the art Technique known and for example in the patent application DE 10245993 to which express reference is made.

Die Erhöhung des Spiegels eines lipoylierbaren Polypeptids in erfindungsgemäßen Zellen wird beispielsweise durch eine verstärkte Expression eines Gens, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, erreicht. Dabei kann die Kopienzahl eines solchen Gens in den Zellen erhöht sein und/oder es kann durch geeignete Promotoren die Expression dieses Gens verstärkt sein.The increase the level of a lipoylatable polypeptide in cells of the invention is exemplified by increased expression of a gene, that for a lipoylatable polypeptide encoded achieved. It can the Copy number of such a gene can be increased in the cells and / or it can by suitable promoters enhance the expression of this gene.

Unter verstärkter Expression ist dabei vorzugsweise zu verstehen, dass das Gen für ein lipoylierbares Polypeptid im Vergleich zur jeweiligen Wildtyp-Zelle, aus der dieses Gen gewonnen wurde, mindestens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5 vermehrt exprimiert wird.Under reinforced Expression is preferably to be understood that the gene for a lipoylatable polypeptide compared to the respective wild-type cell from which this gene is obtained was at least a factor of 2, preferably at least by a factor 5 is expressed more.

Eine Erhöhung der Kopienzahl des Gens codierend für ein lipoylierbares Polypeptid in Zellen kann mit dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen werden. So kann zum Beispiel ein solches Gen in Plasmid-Vektoren mit mehrfacher Kopienzahl pro Zelle (für Escherichia coli z.B. pUC19, pBR322, pACYC184 oder Derivaten davon) kloniert und in die Zellen eingebracht werden. Alternativ kann ein solches Gen mehrfach in das Chromosom des Wirtsorganismus integriert werden. Als Integrationsverfahren können die bekannten Systeme mit temperenten Bakteriophagen, integrative Plasmide oder die Integration über homologe Rekombination genutzt werden (z.B. Hamilton et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 4617-4622).A increase the copy number of the gene coding for a lipoylatable polypeptide in cells can be made by methods known in the art. For example, such a gene can be expressed in multiple-plasmid vectors Copy number per cell (for Escherichia coli e.g. pUC19, pBR322, pACYC184 or derivatives thereof) be cloned and introduced into the cells. Alternatively, a such gene several times integrated into the chromosome of the host organism become. As integration method, the known systems with temperate bacteriophages, integrative plasmids or integration via homologous Recombination (e.g., Hamilton et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 4617-4622).

Bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl durch Klonierung eines Gens codierend für ein lipoylierbares Polypeptid in einen Plasmid-Vektor unter Kontrolle eines Promotors. Besonders bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl durch Klonierung eines solchen Gens in Plasmid-Vektoren aus der pUC-Familie oder der pBR322-Familie, wie z. B. ptac85 (Ali und Guest, 1990, Biochem. J. 271: 139-145).Prefers is the increase the copy number by cloning a gene coding for a lipoylatable Polypeptide in a plasmid vector under the control of a promoter. Particularly preferred is the increase in Copy number by cloning such a gene into plasmid vectors from the pUC family or the pBR322 family, such as. Ptac85 (Ali and Guest, 1990, Biochem. J. 271: 139-145).

Als Kontrollregion für die Expression eines Gens für ein lipoylierbares Polypeptid kann die natürliche Promotor- und Operatorregion dieses Gens dienen, die verstärkte Expression eines solchen Gens kann jedoch insbesondere auch mittels anderer Promotoren erfolgen. Entsprechende Promotorsysteme wie beispielsweise in Escherichia coli der konstitutive Promotor des gapA-Gens oder die induzierbaren lac-, tac-, trc-, λ-, ara- oder tet-Promotoren sind dem Fachmann bekannt (Makrides S. C., 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538). Konstrukte, die ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid unter der Kontrolle eines der oben genannten Promotoren enthalten, können in an sich bekannter Weise auf Plasmiden oder chromosomal verwendet werden.When Control region for the expression of a gene for a lipoylatable polypeptide may be the natural promoter and operator region serve this gene, which strengthened However, expression of such a gene can in particular also by means of other promoters. Corresponding promoter systems such as in Escherichia coli is the constitutive promoter of the gapA gene or the inducible lac, tac, trc, λ, ara or tet promoters are known in the art (Makrides S.C., 1996, Microbiol. 60: 512-538). Constructs that are a gene for a lipoylatable polypeptide contained under the control of one of the promoters mentioned above, can used in a conventional manner on plasmids or chromosomally become.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten erfindungsgemäße Zellen ein Plasmid, das ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid unter der Kontrolle eines Promotors enthält, ausgewählt aus der Gruppe gapA-, lac-, tac-, trc-, λ-, ara- oder tet-Promotor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform befindet sich ein solches Gen unter der Kontrolle des Isopropyl-β-D-Thiogalactosid/lacI-regulierbaren tac-Promotors.In a preferred embodiment contain cells according to the invention a plasmid that is a gene for a lipoylatable polypeptide under the control of a promoter contains selected from the group gapA, lac, tac, trc, λ, ara or tet promoter. In a particularly preferred embodiment Such a gene is under the control of the isopropyl-β-D-thiogalactoside / lacI-regulatable tac promoter.

Des weiteren kann eine verstärkte Expression dadurch erreicht werden, dass Translationsstartsignale, wie z. B. die Ribosomenbindestelle oder das Startcodon des Gens, in optimierter Sequenz auf dem jeweiligen Konstrukt vorhanden sind oder dass gemäß der „codon usage" seltene Codons gegen häufiger vorkommende Codons ausgetauscht werden.Of another can be a reinforced one Expression can be achieved by translational start signals, such as z. B. the ribosome binding site or the start codon of the gene, in optimized sequence are present on the respective construct or that according to the "codon usage "rare codons against more often occurring codons are exchanged.

Die Klonierung eines Gens, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, in Plasmid-Vektoren erfolgt beispielsweise durch Amplifikation des Gens mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion unter Einsatz von spezifischen Primern, die das komplette Gen, oder zumindest den Teil des Gens, der für ein lipoylierbares Polypeptid codiert (z.B. die Lipoyl-Domäne eines Proteins), erfassen, und anschließende Ligation mit Vektor-DNA-Fragmenten.The Cloning of a gene for a lipoylatable polypeptide encoded, for example, in plasmid vectors by amplification of the gene by the polymerase chain reaction using specific primers containing the complete gene, or at least the part of the gene that is responsible for a lipoylatable polypeptide encoded (e.g., the lipoyl domain of a protein), and subsequent ligation with vector DNA fragments.

Die Erzeugung eines Gens für ein lipoylierbares Hybridpolypeptids, welches sich z. B. aus Teilen zweier verschiedener Lipoyl-Domänen des E2-Proteins zusammensetzt, sowie dessen Klonierung in einen Plasmid-Vektor, ist mit Standardmethoden der Molekularbiologie möglich und bei Miles und Guest (1987, Biochem. J.245: 869-874) beispielsweise beschrieben.The Generation of a gene for a lipoylatable hybrid polypeptide which is e.g. B. from parts two different lipoyl domains composed of the E2 protein, as well as its cloning into a Plasmid vector, is possible with standard methods of molecular biology and Miles and Guest (1987, Biochem J.245: 869-874), for example described.

Als bevorzugte Vektoren für die Klonierung eines Gens codierend für ein lipoylierbares Polypeptid werden Plasmide verwendet, die bereits Promotoren zur verstärkten Expression enthalten, beispielsweise den hitze-induzierbaren λP_LP_R-Promotor oder den Isopropyl-β-D-Thiogalactosid/lacI-regulierbaren synthetischen tac-Promotor von Escherichia coli.As preferred vectors for the cloning of a gene encoding a lipoylatable polypeptide, plasmids are already used which already contain promoters for enhanced expression, for example the heat-inducible λP _L P _R promoter or the isopropyl-β-D-thiogalactoside / lacI-regulatable synthetic tac promoter of Escherichia coli.

Um eine synchrone Überexpression eines lipB-Gens mit einem Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, zu erreichen, können oben genannte Maßnahmen, die zur Überexpression eines Einzelgens führen, auch miteinander kombiniert werden. So können die beiden relevanten Gene beispielsweise auf verschiedenen Plasmiden enthalten sein und die Expression jeweils unter der Kontrolle verschiedener Promotorsysteme liegen. Es ist aber auch möglich, dass beide Gene als künstliches Operon auf demselben Plasmid liegen und die Expression beider Gene somit synchron durch denselben Promotor reguliert wird. Des weiteren können das lipB-Gen und das Gen für ein lipoylierbares Polypeptid auch auf demselben Plasmid lokalisiert sein, wobei jedes Gen von einem eigenen Promotor reguliert wird. Dabei können die beiden Promotoren entweder demselben oder aber einem unterschiedlichen Typ angehören.To obtain a synchronous overexpression of a lipB gene with a gene encoding a lipoylatable poly peptide-encoded, the above-mentioned measures which lead to the overexpression of a single gene can also be combined with one another. For example, the two relevant genes can be contained on different plasmids and the expression can be under the control of different promoter systems. However, it is also possible that both genes are located as an artificial operon on the same plasmid and thus the expression of both genes is regulated synchronously by the same promoter. Furthermore, the lipB gene and the gene for a lipoylatable polypeptide may also be located on the same plasmid, each gene being regulated by its own promoter. The two promoters may belong to either the same or a different type.

Plasmide, die sowohl ein lipB-Gen als auch ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.plasmids which is both a lipB gene and a gene for a lipoylatable polypeptide are also included in the present invention.

In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich die beiden Gene auf demselben Plasmid jeweils unter der Kontrolle eines eigenen Isopropyl-β-D-Thiogalactosid/lacI-regulierbaren tac-Promotors.In a preferred embodiment the two genes are on the same plasmid each under the control of its own isopropyl-β-D-thiogalactoside / lacI-regulatable tac promoter.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Plasmid, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein lipB-Gen sowie ein Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, jeweils unter Kontrolle eines Promotors trägt.The The invention thus also relates to a plasmid characterized is that it is a lipB gene as well as a gene that is responsible for a lipoylatable polypeptide coded, each carrying under control of a promoter.

Durch eine gängige Transformationsmethode (z.B. Elektroporation) werden die Plasmide, die ein lipB-Gen und/oder ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthalten, in eine Ausgangszelle eingebracht und beispielsweise mittels Antibiotika-Resistenz auf plasmid-tragende Klone selektiert.By a common one Transformation method (e.g., electroporation), the plasmids, the one lipB gene and / or a gene for a lipoylatable polypeptide included, introduced into a starting cell and, for example selected by antibiotic resistance to plasmid-carrying clones.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass in eine Ausgangszelle ein Plasmid, das ein lipB-Gen und ein Plasmid, das ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthält oder ein erfindungsgemäßes Plasmid eingebracht werden.The The invention thus also relates to a process for the preparation of a cell of the invention, characterized in that in a starting cell a plasmid, a lipB gene and a plasmid containing a gene for a lipoylatable polypeptide contains or a plasmid according to the invention be introduced.

In einer Vielzahl von pro- und eukaryontischen Zellen bzw. Organismen konnten Gene, die für lipoylierbare Polypeptide codieren (z. B. aceF, sucB) sowie Gene, die für die de novo-Synthese von R-α-Liponsäure benötigt werden (z. B. lipA, lipB), identifiziert werden. Erfindungsgemäße Zellen lassen sich somit vorzugsweise aus Zellen von pro- oder eukaryontischen Organismen herstellen, die in der Lage sind, R-α-Liponsäure selbst zu synthetisieren (Ausgangszelle), die rekombinanten Verfahren zugänglich sind und die durch Fermentation kultivierbar sind. Auch pflanzliche oder tierische Zellen, die in Zellkultur züchtbar sind, sind somit zur Herstellung erfindungsgemäßer Zellen geeignet.In a variety of pro- and eukaryotic cells or organisms could genes for encode lipoylatable polypeptides (eg aceF, sucB) as well as genes, the for the de novo synthesis of R-α-lipoic acid are needed (eg, lipA, lipB). Cells according to the invention can thus be preferably from cells of pro- or eukaryotic Produce organisms capable of self-synthesizing R-α-lipoic acid (Starting cell), which are accessible by recombinant methods and by fermentation are cultivable. Also, plant or animal cells that are in Culturable cell culture are thus suitable for the production of cells according to the invention.

Zur Herstellung erfindungsgemäßer Zellen können solche Ausgangszellen verwendet werden, die bisher noch keinerlei Manipulation unterzogen wurden. Des weiteren ist es jedoch möglich, die erfindungsgemäßen Zellen auch mit Maßnahmen zu kombinieren, die bereits zu einer verbesserten Produktion von R-α-Liponsäure führen. So sind beispielsweise solche Zellen besonders geeignet, die durch eine verstärkte Expression des li pA-Gens bereits über eine erhöhte Liponsäure-Synthase-Aktiviät verfügen und/oder nur noch eine abgeschwächte, vorzugsweise völlig ausgeschaltete Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität aufweisen. Verfahren zur Herstellung von Zellen mit einer verstärkten Liponsäure-Synthase-Aktivität und/oder einer abgeschwächten Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität sind in den Patentanmeldungen DE 10235270 und DE 10258127 beschrieben.For the production of cells according to the invention, it is possible to use those starting cells which have hitherto not undergone any manipulation. Furthermore, however, it is also possible to combine the cells according to the invention with measures which already lead to an improved production of R-α-lipoic acid. Thus, for example, those cells are particularly suitable which already have an increased lipoic acid synthase activity through increased expression of the lipa gene and / or have only an attenuated, preferably completely switched-off lipoyl protein ligase A activity. Methods of producing cells having enhanced lipoic acid synthase activity and / or attenuated lipoyl protein ligase A activity are described in the patent applications DE 10235270 and DE 10258127 described.

Bevorzugt handelt es sich bei den Zellen um Mikroorganismen, wie zum Beispiel Hefe- oder Bakterienstämme. Besonders bevorzugt handelt es sich um Bakterienstämme aus der Familie der Enterobacteriaceae, ganz besonders bevorzugt um Stämme der Art Escherichia coli.Prefers If the cells are microorganisms, such as Yeast or bacterial strains. Particularly preferred are bacterial strains the family of Enterobacteriaceae, most preferably around strains of the species Escherichia coli.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Zelle in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-α-Liponsäure in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-α-Liponsäure vom Kulturmedium abgetrennt wird.The The invention further relates to a process for fermentative production of enantiomerically pure R-α-lipoic acid. This Method is characterized in that a cell according to the invention is cultured in a culture medium, the cell being enantiomerically pure R-α-lipoic acid in the Culture medium precipitates and the enantiomerically pure R-α-lipoic acid from Culture medium is separated.

Die Ausscheidung von R-α-Liponsäure aus den erfindungsgemäßen Zellen in das Kulturmedium erlaubt eine einfache Isolierung des Produkts aus dem Kulturmedium nach Abtrennung der Biomasse, ohne dass die Zellen zuvor aufgebrochen werden müssen, bzw. ohne dass die R-α-Liponsäure durch einen aufwendigen und verlustreichen Hydrolyseschritt vom daran gebundenen Trägerprotein (ACP oder die E2-Untereinheit der α-Ketosäure-Dehydrogenasen) abgespalten werden muss. Die Gewinnung von R-α-Liponsäure aus dem Kulturmedium kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie beispielsweise Zentrifugation des zellhaltigen Kulturmediums zur Abtrennung der Zellen und durch anschließende Extraktion und/oder Präzipitation des Produkts erfolgen.The Excretion of R-α-lipoic acid the cells of the invention in the culture medium allows easy isolation of the product from the culture medium after separation of the biomass without the Cells must be broken before, or without the R-α-lipoic acid by an elaborate and lossy hydrolysis step from it bound carrier protein (ACP or the E2 subunit of α-keto acid dehydrogenases) must be cleaved. The recovery of R-α-lipoic acid The culture medium can according to the expert known methods, such as For example, centrifugation of the cell-containing culture medium for Separation of the cells and subsequent extraction and / or precipitation of the product.

Die Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellen zur Produktion von R-α-Liponsäure erfolgt in gängigen Kulturmedien, vorzugs weise in einem aus der Literatur bekannten Minimalsalzmedium (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).The Cultivation of the cells according to the invention to produce R-α-lipoic acid in common culture media, preference, in a known from the literature Minimalsalzmedium (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).

Als Kohlenstoffquelle können prinzipiell alle verwertbaren Zucker, Zuckeralkohole oder organische Säuren bzw. deren Salze verwendet werden. Dabei werden bevorzugt Asparaginsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Glucose, Glycerin oder Oxalessigsäure eingesetzt. Besonders bevorzugt sind Bernsteinsäure und Oxalessigsäure. Auch ist eine kombinierte Fütterung mehrerer verschiedener Kohlenstoffquellen möglich. Des weiteren können kurzkettige Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C2-C8, bevorzugt mit einer Kettenlänge von C6-C8 (Hexan- bzw. Oktansäure) als spezifische Vorstufen für die α-Liponsäure-Synthese dem Medium zugesetzt werden. Dabei beträgt die Konzentration der zugesetzten Kohlenstoffquelle vorzugsweise 0,1-30 g/l.When Carbon source can in principle all usable sugars, sugar alcohols or organic acids or their salts are used. Aspartic acid, malic acid, succinic acid, pyruvic acid, fumaric acid, glutamic acid, glucose, Glycerol or oxaloacetic acid used. Particularly preferred are succinic acid and oxaloacetic acid. Also is a combined feeding several different carbon sources possible. Furthermore, short-chain fatty acids with a chain length of C2-C8, preferably with a chain length of C6-C8 (hexane or Octane acid) as specific precursors for the α-lipoic acid synthesis be added to the medium. The concentration is the added Carbon source preferably 0.1-30 g / l.

Die Inkubation der erfindungsgemäßen Zellen erfolgt vorzugsweise unter aeroben Kultivierungsbedingungen über einen Zeitraum von 16 – 150 h und im Bereich der für die jeweiligen Zellen optimalen Wachtumstemperatur.The Incubation of the cells according to the invention is preferably carried out under aerobic cultivation conditions via a Period of 16 - 150 h and in the area of for the respective cells optimal Wachtumstemperatur.

Als optimaler Temperaturbereich werden 15 – 55 °C bevorzugt. Besonders bevorzugt ist eine Temperatur zwischen 30 und 37 °C.When optimum temperature range 15-55 ° C are preferred. Especially preferred is a temperature between 30 and 37 ° C.

Der Nachweis und die Quantifizierung der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten R-α-Liponsäure erfolgt beispielsweise mittels eines Bioassays unter Verwendung eines liponsäureauxotrophen Indikatorstammes (lipA-Mutante). Diese Art der turbidimetrischen Quantifizierung von R-α-Liponsäure ist aus der Literatur bekannt (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272). Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Indikatorstamm W1485lip2 (ATCC 25645), würde allerdings auch ohne supplementierte R-α-Liponsäure wachsen, wenn das Medium neben Glucose auch noch Acetat und Succinat enthält. Um ein falschpositives Wachstum des Indikatorstammes im Bioassay bei der Bestimmung der produzierten R-α-Liponsäure zu vermeiden – beispielsweise verursacht durch einen Eintrag von Glucose und den vom Produktionsstamm zusätzlich zur R-α-Liponsäure ausgeschiedenen Säuren Acetat und Succinat – erfolgt bereits die Anzucht des R-α-Liponsäure-Produzenten bevorzugt mit Succinat als einziger Kohlenstoffquelle. Dieser Stamm wird mit dem Kulturüberstand einer erfindungsgemäßen Zellanzucht supplementiert; anhand des Wachstums des Indikatorstammes kann dann der Liponsäure-Gehalt im Kulturmedium bestimmt werden.Of the Detection and quantification of the method according to the invention produced R-α-lipoic acid occurs for example, by means of a bioassay using a Liponsäureauxotrophic Indicator strain (lipA mutant). This type of turbidimetric Quantification of R-α-lipoic acid is known from the literature (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272). The used in the context of the present invention Indicator strain W1485lip2 (ATCC 25645), but would also grow without supplemented R-α-lipoic acid, if the medium also contains acetate and succinate in addition to glucose. To be a false positive Growth of the indicator strain in the bioassay in determining the to avoid producing R-α-lipoic acid - for example caused by an entry of glucose and the production strain additionally excreted to R-α-lipoic acid acids Acetate and succinate - takes place already the cultivation of the R-α-lipoic acid producer preferably with succinate as sole carbon source. This strain will with the culture supernatant a cell cultivation according to the invention supplemented; based on the growth of the indicator strain can then the lipoic acid content be determined in the culture medium.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Der Bakterienstamm Escherichia coli W3110/pKP560/pGS331, der für die Ausführung der Beispiele verwendet wurde, wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 15661 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.The The following examples serve to further explain the invention. Of the Bacterial strain Escherichia coli W3110 / pKP560 / pGS331, which is responsible for the execution of the Examples used was at the DSMZ (Deutsche Sammlung for microorganisms and cell cultures GmbH, D-38142 Braunschweig) under the number DSM 15661 according to Budapest Contract deposited.

Der Stamm W3110ΔlplA, eine Deletionsmutante im lplA-Gen, welches für die Lipoyl-Protein-Ligase A codiert, ist in der Patentanmeldung DE 10258127 des gleichen Anmelders beschrieben. Das Plasmid pACYC184 ist bei Chang und Cohen (1978, J. Bacteriol. 134: 1141-1156), das lipB-Expressionsplasmid pBAD-lipB ist in der Patentanmeldung DE 10245993 beschrieben.The strain W3110ΔlplA, a deletion mutant in the lplA gene which codes for the lipoyl protein ligase A, is in the patent application DE 10258127 described by the same applicant. The plasmid pACYC184 is in Chang and Cohen (1978, J. Bacteriol 134: 1141-1156), the lipB expression plasmid pBAD-lipB is in the patent application DE 10245993 described.

Für die Expression des Gens, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, wurde das Plasmid pGS331 verwendet (Ali et al., 1990, Biochem. J. 271: 139-145). Dieses Plasmid enthält neben dem Ampicillin-Resistenzgen ein subgenes Fragment des aceF-(E2p)-Gens von Escherichia coli, welches für eine Lipoyl-Domäne codiert und das sich unter der Expressionskontrolle des tac-Promotors befindet. Das Gen für diese Lipoyl-Domäne ist in diesem Fall ein Hybrid, zusammengesetzt aus den Codons für die Aminosäurereste 1-33 der ersten Lipoyl-Domäne und den Resten 238-289 der dritten Lipoyl-Domäne des E2p-Proteins.For the expression of the gene that is for a lipoylatable polypeptide encoded, the plasmid pGS331 was used (Ali et al., 1990, Biochem J. 271: 139-145). This plasmid contains beside the ampicillin resistance gene is a subgenic fragment of the aceF (E2p) gene of Escherichia coli, which is for encodes a lipoyl domain and which is under the expression control of the tac promoter. The gene for this lipoyl domain is in this case a hybrid composed of the codons for the amino acid residues 1-33 of the first lipoyl domain and residues 238-289 of the third lipoyl domain of the E2p protein.

Beispiel 1: Konstruktion des lipB-Expressionsplasmids pKP560Example 1: Construction of the lipB expression plasmid pKP560

Der Plasmidvektor pACYC184 wurde zunächst mit der Restriktionsendonuklease AvaI unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen geschnitten. Die dabei erzeugten 5'-überhängenden Enden des restringierten Vektors wurden nach Herstellerangaben mittels der Klenow-Polymerase aufgefüllt, der Vektor anschließend mit der Restrikionsendonuklease ClaI geschnitten und danach durch Behandlung mit Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Der gesamte Restriktionsansatz wurde dann in einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Das 2,8 kb lange DNA-Fragment, das neben dem Replikationsursprung p15A auch noch das Chloramphenicol-Resistenzgen enthält, wurde anschließend mittels des QIAquick Gel Extraktion Kits (Qiagen GmbH, Hilden) nach Herstellerangaben aus dem Agarosegel isoliert und gereinigt. Das lipB-Gen unter Kontrolle des arabinose-induzierbaren ara-BAD-Promotors (pBAD) wurde aus dem Plasmid pBAD-lipB gewonnnen, welches zunächst mit der Restrikionsendonuklease XbaI unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen geschnitten wurde. Die dabei erzeugten 5'-überhängenden Enden des restringierten Vektors wurden dann nach Herstellerangaben mittels der Klenow-Polymerase aufgefüllt und der Vektor wurde anschließend mit der Restrikionsendonuklease ClaI geschnitten. Der gesamte Restriktionsansatz wurde dann in einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Das 2 kb lange DNA-Fragment, das die Regulationssequenzen des Arabinose-Operons von E. coli (araC-Gen, araBAD-Promotorregion) und außerdem das lipB-Gen unter der Kontrolle des araBAD-Promotors enthält, wurde anschließend wie für das Vektorfragment von pACYC184 beschrieben aus dem Agarosegel isoliert und gereinigt.The plasmid vector pACYC184 was first cut with the restriction endonuclease AvaI under the conditions specified by the manufacturer. The generated 5'-overhanging ends of the restricted vector were filled according to the manufacturer by means of Klenow polymerase, the vector was then cut with the Restrikionsendonuklease ClaI and then dephosphorylated by treatment with alkaline phosphatase. The entire restriction mixture was then electrophoresed in an agarose gel. The 2.8 kb DNA fragment, which also contains the chloramphenicol resistance gene in addition to the replication origin p15A, was then isolated from the agarose gel using the QIAquick gel extraction kit (Qiagen GmbH, Hilden) and purified according to the manufacturer's instructions. The lipB gene under Kon Control of the arabinose-inducible ara-BAD promoter (pBAD) was obtained from the plasmid pBAD-lipB, which was first cut with the restriction endonuclease XbaI under the conditions given by the manufacturer. The generated 5'-overhanging ends of the restricted vector were then filled in according to the manufacturer's instructions by means of Klenow polymerase and the vector was then cut with the Restrikionsendonuklease ClaI. The entire restriction mixture was then electrophoresed in an agarose gel. The 2 kb DNA fragment containing the regulatory sequences of the arabinose operon of E. coli (araC gene, araBAD promoter region) and also the lipB gene under the control of the araBAD promoter was then used as for the vector fragment of pACYC184 isolated and purified from the agarose gel.

Die Ligation des araC-pBAD-lipB-Fragments mit dem 2,8 kb langen Vektorfragment von pACYC184 erfolgte mittels der T4-DNA-Ligase. Die Transformation von E. coli-Zellen des Stammes DH5α mit dem Ligationsansatz erfolgte durch Elektroporation in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise. Der Transformationsansatz wurde dann auf LB-Chloramphenicol-Agarplatten (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 15 g/l Agar, 20 mg/l Chloramphenicol) ausgebracht und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die gewünschten Transformanden wurden nach einer Plasmidisolierung mittels des GFX^TM Micro Plasmid Prep Kits (Amersham Biosciences GmbH, Freiburg) durch eine Restriktionsanalyse identifiziert. Der so erhaltene Vektor trägt die Bezeichnung pKP560 (4).Ligation of the araC-pBAD-lipB fragment with the 2.8 kb vector fragment of pACYC184 was carried out by means of T4 DNA ligase. The transformation of E. coli cells of the strain DH5α with the ligation mixture was carried out by electroporation in a manner known to those skilled in the art. The transformation mixture was then applied to LB-chloramphenicol agar plates (10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl, 15 g / l agar, 20 mg / l chloramphenicol) and incubated overnight at 37 ° C , The desired transformants were identified by plasmid isolation using the GFX ^™ Micro Plasmid Prep Kit (Amersham Biosciences GmbH, Freiburg) by restriction analysis. The vector thus obtained is designated pKP560 ( 4 ).

Beispiel 2: Herstellung von R-α-Liponsäure-ProduzentenExample 2: Preparation of R-α-lipoic acid producers

Das lipB-Überexpressionsplasmid pKP560 bzw. das Lipoyl-Domänen-Plasmid pGS331 wurden mittels Elektroporation in die E. coli-Stämme W3110 bzw. W3110ΔlplA transformiert und nach Selektion auf LB-Agarplatten mit 20 mg/l Chloramphenicol bzw. 100 mg/l Ampicillin wurden die Plasmide aus jeweils einer der Transformanden reisoliert, mit Restriktionsendonukleasen gespalten und überprüft. Mit dem Kontrollplasmid pACYC184 wurde in analoger Weise verfahren.The lipB overexpression pKP560 or the lipoyl domain plasmid pGS331 were electroporated into E. coli strains W3110 or W3110ΔlplA transformed and after selection on LB agar plates with 20 mg / l Chloramphenicol or 100 mg / l ampicillin were the plasmids in each case one of the transformants is reisolated, with restriction endonucleases split and checked. With The control plasmid pACYC184 was processed in an analogous manner.

Für die gemeinsame Überexpression des lipB-Gens mit dem Lipoyl-Domänen-Gen wurden die Stämme W3110 pKP560 bzw. W3110ΔlplA pKP560 mit dem Plasmid pGS331 wie oben beschrieben transformiert und die erhaltenen Transformanden mittels Restriktionsanalyse überprüft.For common overexpression of the lipB gene with the lipoyl domain gene were the tribes W3110 pKP560 or W3110ΔlplA pKP560 transformed with the plasmid pGS331 as described above and the resulting transformants were checked by restriction analysis.

Beispiel 3: Fermentative Produktion von R-α-LiponsäureExample 3: Fermentative Production of R-α-lipoic acid

Für die fermentative Produktion von R-α-Liponsäure wurden die in Beispiel 2 durch Transformation mit den entsprechenden Plasmiden erzeugten Stämme verwendet. Als Vorkultur für die Produktionsanzucht wurden zunächst 5 ml LB-Flüssigmedium, das zur Stabilisierung von Plasmiden 100 mg/l Ampicillin und/oder 20 mg/l Chloramphenicol enthielt, mit dem jeweiligen Stamm beimpft und für 16 h bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit dem entsprechenden Volumen steriler Saline (0,9 % NaCl) gewaschen. Mit den auf diese Weise vorbereiteten Zellen wurden schließlich 15 ml BS-Medium (7 g/l K₂HPO₄; 3 g/l KH₂PO₄; 1 g/l (NH₄)₂SO₄; 0,1 g/l MgSO₄ × 7 H₂O; 0,5 g/l Na₃Citrat × 3 H₂O; 1% säurehydrolysiertes Casein (vitaminfrei); 13,5 g/l Na₂Succinat × 6 H₂O; pH 6,8 mit HCl eingestellt), das außerdem 100 mg/l Ampicillin und/oder 20 mg/l Chloramphenicol enthielt, im Verhältnis 1:100 angeimpft. Die Inkubation der Produktionskulturen erfolgte bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler. Die Expression des Lipoyl-Protein-Ligase B-Gens in den Stämmen, die das Plasmid pKP560 enthielten, wurde durch Zugabe von 2 g/l L-Arabinose nach ca. 4 h Inkubation induziert. Zum gleichen Zeitpunkt wurde auch die Expression der E2-Domäne in den Stämmen mit dem Plasmid pGS331 durch Zugabe von 0,05 g/l Isopropyl-β-D-Thiogalactosid indu ziert. Nach 24 h Inkubation wurden Proben entnommen und die Zellen durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt. Die darin enthaltene R-α-Liponsäure wurde mittels des bekannten turbidimetrischen Bioassays (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A: 269-272) quantifiziert. Tabelle 1 zeigt die erzielten Gehalte von R-α-Liponsäure im jeweiligen Kulturüberstand nach 24 h Inkubation: Tabelle 1:

SEQUENCE LISTING

For the fermentative production of R-α-lipoic acid, the strains produced in Example 2 by transformation with the corresponding plasmids were used. As preculture for the production cultivation, initially 5 ml of LB liquid medium containing 100 mg / l ampicillin and / or 20 mg / l chloramphenicol for stabilizing plasmids were inoculated with the respective strain and incubated for 16 h at 37 ° C. and 160 rpm incubated in a shaker. Subsequently, the cells were harvested by centrifugation and washed twice with the appropriate volume of sterile saline (0.9% NaCl). Finally, 15 ml of BS medium (7 g / l K ₂ HPO ₄ , 3 g / l KH ₂ PO ₄ , 1 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.1 g / l of the cells prepared in this way were used. MgSO ₄ .7H ₂ O; 0.5 g / l Na ₃ citrate × 3 H ₂ O; 1% acid hydrolyzed casein (vitamin-free) 13.5 g / l Na ₂ succinate × 6 H ₂ O; pH 6; 8 adjusted with HCl), which also contained 100 mg / l ampicillin and / or 20 mg / l chloramphenicol, seeded in the ratio 1: 100. The incubation of the production cultures was carried out at 37 ° C and 160 rpm on a shaker. The expression of the lipoyl protein ligase B gene in the strains containing the plasmid pKP560 was induced by addition of 2 g / l L-arabinose after approximately 4 h of incubation. At the same time, expression of the E2 domain in the strains was also induced by the addition of 0.05 g / L isopropyl-β-D-thiogalactoside to the plasmid pGS331. After incubation for 24 h, samples were taken and the cells separated from the culture medium by centrifugation. The R-α-lipoic acid contained therein was quantified by the known turbidimetric bioassay (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A: 269-272). Table 1 shows the obtained contents of R-α-lipoic acid in the respective culture supernatant after 24 h incubation: Table 1:

SEQUENCE LISTING

Claims (10)

Zelle, die enantiomerenreine R-α-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine gegenüber einem Wildtyp-Stamm erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B Aktivität besitzt und gleichzeitig eine im Vergleich zu dem Wildtyp-Stamm erhöhte Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids aufweist.Cell which secretes enantiomerically pure R-α-lipoic acid in a culture medium, characterized in that it has a relation to a wild-type strain increased lipoyl protein ligase B activity and at the same time has an increased compared to the wild-type strain concentration of a lipoylatable polypeptide , Zelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Mikroorganismus, wie zum Beispiel einen Hefe- oder Bakterienstamm handelt.Cell according to claim 1, characterized in that It is a microorganism, such as a yeast or Bacterial strain acts. Zelle nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Bakterienstamm aus der Familie der Enterobacteriaceae, bevorzugt um einen Stamm der Art Escherichia coli handelt.Cell according to claim 2, characterized in that it is a bacterial strain of the family Enterobacteriaceae, preferably is a strain of the species Escherichia coli. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität mindestens um den Faktor 2 gesteigert ist.Cell according to one of claims 1 to 3, characterized that lipoyl-protein ligase B activity at least by the factor 2 is increased. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des lipoylierbaren Polypeptids mindestens um den Faktor 2 gesteigert ist.Cell according to one of claims 1 to 4, characterized that the concentration of the lipoylatable polypeptide is at least increased by a factor of 2. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es sowohl ein lipB-Gen als auch ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthält.Plasmid, characterized in that it is both a lipB gene as well as a gene for contains a lipoylatable polypeptide. Plasmid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es ein lipB-Gen sowie ein Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, jeweils unter Kontrolle eines Promotors trägt.Plasmid according to claim 6, characterized that it is a lipB gene as well as a gene coding for a lipoylatable polypeptide coded, each carrying under control of a promoter. Verfahren zur Herstellung einer Zelle gemäß Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in eine Ausgangszelle ein Plasmid, das ein lipB-Gen enthält und ein Plasmid, das ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthält eingebracht werden, oder ein Plasmid gemäß Anspruch 6 oder 7 eingebracht wird.A method of manufacturing a cell according to claim 1 to 5, characterized in that in an output cell a Plasmid containing a lipB gene and a plasmid that is a gene for a lipoylatable polypeptide can be introduced, or a plasmid according to claim 6 or 7 is introduced. Verfahren zur fermentativen Herstellung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-α-Liponsäure in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-α-Liponsäure vom Kulturmedium abgetrennt wird.Process for the fermentative preparation of enantiomerically pure R-α-lipoic acid, thereby in that a cell according to one of claims 1 to 3 is cultured in a culture medium, wherein the cell is enantiomerically pure R-α-lipoic acid in the Culture medium precipitates and the enantiomerically pure R-α-lipoic acid from Culture medium is separated. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der Zellen in einem Minimalsalzmedium erfolgt, wobei als Kohlenstoffquelle Asparaginsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Glucose, Glycerin oder Oxalessigsäure eingesetzt werden und Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C2-C8, bevorzugt mit einer Kettenlänge von C6-C8 (Hexan- bzw. Oktansäure) als spezifische Vorstufen für die α-Liponsäure-Synthese dem Medium zugesetzt werden.A method according to claim 9, characterized in that the cultivation of the cells takes place in a minimal salt medium, being used as the carbon source aspartic, malic, succinic, pyruvic acid, fumaric acid, glutamic acid, glucose, glycerol or oxaloacetic acid and fat acids having a chain length of C 2 -C 8, preferably having a chain length of C 6 -C 8 (hexane or octanoic acid) may be added to the medium as specific precursors for the α-lipoic acid synthesis.