DE102010025124A1 - Process for the preparation of D-amino acids, microorganism, and vector - Google Patents

Process for the preparation of D-amino acids, microorganism, and vector Download PDF

Info

Publication number
DE102010025124A1
DE102010025124A1 DE102010025124A DE102010025124A DE102010025124A1 DE 102010025124 A1 DE102010025124 A1 DE 102010025124A1 DE 102010025124 A DE102010025124 A DE 102010025124A DE 102010025124 A DE102010025124 A DE 102010025124A DE 102010025124 A1 DE102010025124 A1 DE 102010025124A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
amino acid
microorganism
racemase
gene
producers
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE102010025124A
Other languages
German (de)
Inventor
Dr. Eggeling Lothar
Prof. Dr. Bott Michael
Norma Stäbler
Tadao Oikawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority to DE102010025124A priority Critical patent/DE102010025124A1/en
Publication of DE102010025124A1 publication Critical patent/DE102010025124A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, Mikroorganismus, sowie einen Vektor. Erfindungsgemäß wird in einen eine L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismus ein für eine Aminosäureracemase kodierende DNA eingebracht, welche eine L-Aminosäure in vivo in eine D-Aminosäure racemisiert. Die D-Aminosäure wird anschließend von der L-Aminosäure getrennt.The invention relates to a method for producing D-amino acids, a microorganism, and a vector. According to the invention, a DNA coding for an amino acid racemase is introduced into a microorganism which produces an L-amino acid and which racemizes an L-amino acid in vivo into a D-amino acid. The D-amino acid is then separated from the L-amino acid.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, einen Mikroorganismus, sowie einen Vektor.The invention relates to a process for the preparation of D-amino acids, a microorganism, and a vector.

D-Aminosäuren sind für die Pharmaindustrie interessante Produkte. Entgegen den L-Aminosäuren werden sie natürlicherweise nur in Ausnahmefällen gebildet, bzw. in nicht ausreichend hohen Konzentrationen, um sie in der Pharmaindustrie als Reinsubstanz oder für Synthesezwecke verwenden zu können.D-amino acids are interesting products for the pharmaceutical industry. In contrast to the L-amino acids, they are naturally only formed in exceptional cases, or in concentrations which are not sufficiently high, in order to be able to use them in the pharmaceutical industry as a pure substance or for synthesis purposes.

Etabliert ist die Herstellung von L-Aminosäuren, die als Vorstufe zur Gewinnung von D-Aminosäuren dienen können. So werden beispielsweise die L-Aminosäuren, L-Lysin, L-Arginin, L-Serin oder L-Threonin aus billigem Zucker durch Bakterien wie Escherichia coli oder Corynebacterium glutamicum gewonnen. Die L-Aminosäuren werden nach bekannten Verfahren isoliert. Zur Herstellung der D-Aminosäure erfolgt dann eine in vitro Umwandlung der L-Aminosäure in das Racemat zur D-, L-Aminosäure.Established is the production of L-amino acids, which can serve as a precursor for the recovery of D-amino acids. For example, the L-amino acids, L-lysine, L-arginine, L-serine or L-threonine are obtained from cheap sugars by bacteria such as Escherichia coli or Corynebacterium glutamicum. The L-amino acids are isolated by known methods. To prepare the D-amino acid, an in vitro conversion of the L-amino acid into the racemate then takes place for the D, L-amino acid.

Die Racematbildung erfolgt in der Regel mit der isolierten L-Aminosäure und einer geeigneten Aminosäureracemase. Anschließend erfolgt eine Trennung des racemischen Gemisches. Dies kann z. B. in der präferentiellen Kristallisation eines Enantiomers bestehen, oder aber in der chemischen Umwandlung eines Enantiomers durch enzymatische Modifizierung mit anschließender Trennung der physikalisch unterschiedlichen Aminosäuren, oder auch in der Verstoffwechslung des ungewünschten L-Enantiomers durch Mikroorganismen. Im Falle der Racemisierung von L-Serin ist auch eine chemische Racemisierung beispielsweise durch Erhitzen möglich. Beispielsweise erfolgt durch einen Trypothansynthase überexprimierenden E. coli Stamm in Anwesenheit von Thiophenol die Umwandlung von L-Serin zu S-Phenyl-L-cysteine, sodass D-Serin übrig bleibt, wie es in der Schrift JP 2000253893 offenbart ist. Ähnlich lässt sich D-Serin herstellen, indem ein Tyrosinase überexprimierender E. coli Stamm spezifisch L-Serin aus dem racemischen Gemisch zu L-Tyrosin umwandelt, wie es in der Schrift JP 05091895 gezeigt wird. Auch ist die Verstoffwechslung einer L-Aminosäure aus dem racemischen Gemisch durch verschiedene Hefen und Bakterien bekannt, sodass reine D-Aminosäure übrig bleibt. Beispiele dafür werden in den Schriften JP 64002594 , JP 2008061642 (A) und US 7,186,532 gezeigt.The racemate formation is usually carried out with the isolated L-amino acid and a suitable amino acid racemase. This is followed by separation of the racemic mixture. This can be z. Example, in the preferential crystallization of an enantiomer, or in the chemical transformation of an enantiomer by enzymatic modification with subsequent separation of the physically different amino acids, or in the metabolism of the unwanted L-enantiomer by microorganisms. In the case of racemization of L-serine, a chemical racemization, for example, by heating is possible. For example, in the presence of thiophenol, the conversion of L-serine to S-phenyl-L-cysteine occurs through a trypothansynthase-overexpressing E. coli strain, leaving D-serine as described in Scripture JP 2000253893 is disclosed. Similarly, D-serine can be produced by converting a tyrosinase-overexpressing E. coli strain specifically L-serine from the racemic mixture to L-tyrosine, as described in US Pat JP 05091895 will be shown. Also, the metabolism of an L-amino acid from the racemic mixture by various yeasts and bacteria is known, so that pure D-amino acid remains. Examples of this are in the scriptures JP 64002594 . JP 2008061642 (A) and US 7,186,532 shown.

Die chemischen und enzymatischen Synthesen sind teuer und aufwendig in der Ausführung. Die enzymatisch/chemische Synthese aus Vorstufen erfordert, dass isoliertes Enzym und die chemisch synthetisierten Ausgangsstufen vorliegen. Von L-Aminosäure ausgehende Verfahren erfordern die Isolierung der L-Aminosäure und die Isolierung einer Aminosäureracemase, um die enzymatische Umwandlung zu bewirken. Die genannten Verfahren erfordern auch eine Kontrolle der Konzentrationen von Edukt und den Enzymen, bzw. Katalysatoren. Auch werden die Katalysatoren mit der Zeit inaktiv oder weniger aktiv. Die genannten Verfahren sind aufwändig und nicht kostengünstig.The chemical and enzymatic syntheses are expensive and expensive to carry out. The enzymatic / chemical synthesis from precursors requires that isolated enzyme and the chemically synthesized starting stages are present. L-amino acid derived methods require the isolation of the L-amino acid and the isolation of an amino acid racemase to effect the enzymatic conversion. The methods mentioned also require a control of the concentrations of educt and the enzymes or catalysts. Also, the catalysts become inactive or less active over time. The methods mentioned are complicated and not cost-effective.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren zur Verfügung zu stellen, welches preisgünstig und vor allen Dingen einfach und somit besser ist. Die Notwendigkeit der Konzentrationskontrolle von Edukt und Produkt soll entfallen. Weiterhin sollen ein Mirkoorganismus und Mittel zur Verfügung gestellt werden, welcher eine einfache und preiswerte Herstellung von D-Aminosäuren ermöglicht.It is therefore the object of the invention to provide a process for the preparation of D-amino acids which is cheap and above all simple and thus better. The need for concentration control of starting material and product should be eliminated. Furthermore, a microorganism and means are to be made available, which allows a simple and inexpensive production of D-amino acids.

Ausgehend vorn Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.Starting from the preamble of claim 1, the object is achieved by the features specified in the characterizing part of claim 1.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.Advantageous developments of the invention are specified in the subclaims.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird in einem eine L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismus eine Aminosäureracemase gegenüber der Wildform des Mikroorganismus verstärkt exprimiert, die die L-Aminosäure in vivo racemisiert, das Racemat wird getrennt und die D-Aminosäure mit bekannten Verfahren von der L-Aminosäure getrennt.According to the method of the present invention, in an L-amino acid producing microorganism, an amino acid racemase is more intensely expressed to the wild type of the microorganism which racemizes the L-amino acid in vivo, the racemate is separated and the D-amino acid is separated from the L-amino acid by known methods ,

Bevorzugt wird ein Mikroorganismus eingesetzt, der nicht-natürliche D-Aminosäuren toleriert, bzw. der durch D-Aminosäuren nicht in seiner Lebensfähigkeit eingeschränkt wird.Preferably, a microorganism is used which tolerates non-natural D-amino acids, or is not limited by D-amino acids in its viability.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und den Mikroorganismen können grundsätzlich alle D-Aminosäuren, insbesondre jedoch, D-Serin, D-Lysin, D-Arginin, D-Methionin D-Valin, D-Glutamat, D-Threonin, D-Isoleucin und D-Tryptophan hergestellt werden.With the method according to the invention and the microorganisms it is possible in principle to use all D-amino acids, but especially D-serine, D-lysine, D-arginine, D-methionine D-valine, D-glutamate, D-threonine, D-isoleucine and D- Tryptophan are produced.

Dabei wird in einer Ausführungsform ein eine L-Aminosäure produzierender Mikroorganismus eingesetzt, der in seiner Wildform keine D-Aminosäuren produziert. In one embodiment, an L-amino acid-producing microorganism is used which does not produce D-amino acids in its wild form.

Als Mikroorganismen können Bakterien, beispielsweise Enterobakterien oder coryneforme Bakterien eingesetzt werden.As microorganisms bacteria, for example enterobacteria or coryneform bacteria can be used.

Als Wirtsbakterium wird ein L-Aminosäure produzierender Mikroorganismus benutzt. Bevorzugt werden Mikroorganismen, die sich von E. coli oder C. glutamicum ableiten.As the host bacterium, an L-amino acid-producing microorganism is used. Preferred are microorganisms derived from E. coli or C. glutamicum.

Hierzu können beispielhaft aber nicht beschränkend folgende Mikroorganismen eingesetzt werden.For this purpose, by way of example but not limitation, the following microorganisms can be used.

L-Lysin Produzenten, wie Corynebacterium glutamicum DM1729 und DM1933, Corynebacterium glutamicum B-6, Corynebacterium glutamicum DM1800 ΔgltAΔprpC1-Sup11, oder Methylophilus methylotrophus AS1, L-Arginin oder L-Citrullin Produzenten, wie Corynebacterium glutamicum A-27, I-30, L-Serin Produzenten, wie Corynebacterium glutamicum ΔpabABCΔsdaA (pserACB), L-Methionin Produzenten, wie MH20-22B/hom(FBR)/delta thrB, L-Valin Produzenten, wie Corynebacterium glutamicum ΔaceE(pJC4ilvBNCE), L-Glutamat Produzenten, wie Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, L-Threonin Produzenten, wie Escherichia coli E. coli B-3996 und B-5318 oder L-Isoleucin Produzenten, wie Corynebacterium glutamicum SM13, L-Lysin Produzenten, wie Escherichia coli WC196.L-lysine producers such as Corynebacterium glutamicum DM1729 and DM1933, Corynebacterium glutamicum B-6, Corynebacterium glutamicum DM1800 ΔgltAΔprpC1-Sup11, or Methylophilus methylotrophus AS1, L-arginine or L-citrulline producers such as Corynebacterium glutamicum A-27, I-30, L-serine producers, such as Corynebacterium glutamicum ΔpabABCΔsdaA (pserACB), L-methionine producers, such as MH20-22B / hom (FBR) / delta thrB, L-valine producers, such as Corynebacterium glutamicum ΔaceE (pJC4ilvBNCE), L-glutamate producers, such as Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, L-threonine producers, such as Escherichia coli E. coli B-3996 and B-5318 or L-isoleucine producers, such as Corynebacterium glutamicum SM13, L-lysine producers, such as Escherichia coli WC196.

Dazu gehören Escherichia coli Stämme oder Corynebacterium glutamicum Stämme, die zur Produktion der natürlichen Aminosäuren eingesetzt werden, wie z. B. L-Glutamat, L-Lysin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Arginin, L-Serin, und weiterhin L-Methionin, L-Valin, L-Isoleucin und L-Tryptophan.These include Escherichia coli strains or Corynebacterium glutamicum strains that are used for the production of natural amino acids, such as. L-glutamate, L-lysine, L-threonine, L-tryptophan, L-arginine, L-serine, and also L-methionine, L-valine, L-isoleucine and L-tryptophan.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wird ein Mikroorganismus eingesetzt, der L-Aminosäuren gegenüber seiner Wildform verstärkt produziert.In a preferred embodiment of the method according to the invention, a microorganism is used which produces L-amino acids reinforced compared to its wild form.

Die Mikroorganismen werden genetisch so verändert, dass sie in der Lage sind eine Aminosäureracemase zu exprimieren.The microorganisms are genetically engineered to be able to express an amino acid racemase.

Hierzu können beispielsweise Gene, die für eine Aminosäureracemase kodieren in das Genom des Mikroorganismus inseriert werden.For this purpose, for example, genes which code for an amino acid racemase can be inserted into the genome of the microorganism.

Weiterhin können Vektoren, wie Plasmide, die das Aminosäureracemasegen beinhalten, in den Mikroorganismus eingebracht werden. Beispielhaft kann ein Vektor nach Seq. Nr. 32 und/oder 33 in den Mikroorganismus eingebracht werden.Furthermore, vectors such as plasmids containing the amino acid racemase gene can be introduced into the microorganism. By way of example, a vector according to Seq. Nos. 32 and / or 33 are introduced into the microorganism.

Grundsätzlich können alle Aminosäureracemasen und die dafür kodierende DNA für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden.In principle, all amino acid racemases and the DNA coding therefor can be used for the method according to the invention.

Beispielhaft können folgende DNA-Sequenzen, kodierend für folgende Aminosäureracemasen eingesetzt werden.
vanT (kodierend für Serine racemase) aus Enterococcus gallinarum (Seq. Nr. 1),
srr (kodierend für Serine racemase) aus Pyrobaculum islandicum (Seq. Nr. 2),
racE1 (kodierend für glutamate racemase) aus Bacillus anthracis (Seq. Nr. 3),
racE2 (kodierend für glutamate racemase) aus Bacillus anthracis (Seq. Nr. 4),
DNA kodierend für Prolin Racemase aus Clostridium difficile (Seq. Nr. 5),
DNA kodierend für Lysin Racemase aus Pseudomonas putida (Seq. Nr. 6),
alr (kodierend für Alanine Racemase) aus Methanococcus maripaludis (Seq. Nr. 7),
ddl (kodierend für Serin Racemase) aus Clostridium innocuum (Seq. Nr. 8),
DNA kodierend für Ornithin Racemase aus Clostridium sticklandii (Seq. Nr. 9),
argR (kodierend für Arginine Racemase) aus Pseudomonas taetrolens (Seq. Nr. 10),
BAR, DNA kodierend für Lysin Racemase aus Pseudomonas putida (Seq. Nr. 11),
mSR (kodierend für Serine racemase) aus Eukaryonten, mus muculus (Seq. Nr. 12).By way of example, the following DNA sequences coding for the following amino acid racemases can be used.
vanT (encoding serine racemase) from Enterococcus gallinarum (SEQ ID NO: 1),
srr (encoding serine racemase) from Pyrobaculum islandicum (SEQ ID NO: 2),
racE1 (encoding glutamate racemase) from Bacillus anthracis (Seq # 3),
racE2 (encoding glutamate racemase) from Bacillus anthracis (Seq No. 4),
DNA coding for proline racemase from Clostridium difficile (Seq No. 5),
DNA encoding lysine racemase from Pseudomonas putida (SEQ ID NO: 6),
alr (encoding Alanine racemase) from Methanococcus maripaludis (Seq No. 7),
ddl (encoding serine racemase) from Clostridium innocuum (SEQ ID NO: 8),
DNA coding for ornithine racemase from Clostridium sticklandii (Seq No. 9),
argR (coding for arginine racemase) from Pseudomonas taetrolens (Seq No. 10),
BAR, DNA encoding lysine racemase from Pseudomonas putida (SEQ ID NO: 11),
mSR (encoding serine racemase) from eukaryotes, mus muculus (SEQ ID NO: 12).

Aminosäureracemasegene, die exprimiert werden können, sind beispielsweise IFO 12996 (Seq. Nr. 13) ( Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007; 73 (6): 1299 ), oder auch jede andere Aminosäureracemase, wie beispielsweise eine Lysinracemase, gewonnen aus dem Metagenom (Seq. Nr. 14) ( Appl. Environ Microbiol. 2009; 75 (15): 5161 ). Die Aminosäureracemasegene werden in dem Wirtsbakterium das das L-Enantiomer der gewünschten D-Aminosäure produziert exprimiert.Amino acid racemase genes which can be expressed are, for example, IFO 12996 (SEQ ID NO: 13) ( Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007; 73 (6): 1299 ), or any other amino acid racemase, such as a lysine racemase, obtained from the metagenome (SEQ ID NO: 14) ( Appl. Environ Microbiol. 2009; 75 (15): 5161 ). The amino acid racemase genes are expressed in the host bacterium that produces the L-enantiomer of the desired D-amino acid.

Als Wirtsbakterium wird ein L-Aminosäure produzierender Mikroorganismus benutzt. As the host bacterium, an L-amino acid-producing microorganism is used.

In einer Ausführungsform kann ein Mikroorganismus eingesetzt werden, der bereits in seiner Wildform ein Aminosäureracemasegen beinhaltet, das gegenüber seiner Wildform überexprimiert wird oder dessen Kopienzahl gegenüber der Wildform erhöht ist.In one embodiment, it is possible to use a microorganism which already contains in its wild form an amino acid racemase gene which is overexpressed compared with its wild-type or whose copy number is elevated compared to the wild-type.

Die für eine Aminosäureracemase kodierende DNA kann mit und ohne Signalsequenz eingesetzt werden.The DNA coding for an amino acid racemase can be used with and without a signal sequence.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Aminosäureracemasegene ohne Signalsequenz benutzt sodass die Aminosäureracemasen nicht in ein unerwünschtes zelluläres Kompartiment transportiert werden, wie z. B. dem Periplasma, sondern das sie im Cytosol verbleiben wo die L-Aminosäure im Mikroorganismus aus dem Zucker synthetisiert wird.In a preferred embodiment, amino acid racemase genes are used without signal sequence so that the amino acid racemases are not transported into an undesired cellular compartment, such as e.g. As the periplasm, but that they remain in the cytosol where the L-amino acid is synthesized in the microorganism from the sugar.

Auch können über die DNA Sequenzen von Genen, insbesondere der genannten Gene, mittels DNA Hybridisierungen nach bekannten Verfahren Aminosäureracemasegene isoliert und benutzt werden, und auch durch Reduzierung der Stringenz der Hybridisierung unspezifischere Aminosäureracemasegene gewonnen werden. Damit kann ein breiteres Anwendungsspektrum von Aminosäureracemasen erreicht werden. Für das erfindungsgemäße Verfahren können daher auch Aminosäureracemasegene verwendet werden, die eine Homologie von mindestens 90% gegenüber ihrer Naturform haben. Insbesondere können Aminosäureracemasegene nach den Sequenzen Nr. 1 bis Nr. 14 eingesetzt werden, die mindestens eine Homologie von 90% aufweisen.Also DNA sequences of genes, in particular of the genes mentioned, can be isolated and used by DNA hybridizations according to known methods Aminosäureacemasegene, and also be obtained by reducing the stringency of the hybridization nonspecific Aminosäureacemasegene. Thus, a wider range of applications of amino acid racemases can be achieved. For the method according to the invention, it is therefore also possible to use amino acid racemase genes which have a homology of at least 90% compared to their natural form. In particular, amino acid racemase genes can be used after the sequences Nos. 1 to No. 14, which have at least a homology of 90%.

Anleitungen zur Hybridisierung von Nukleinsäuren bzw. Polynukleotiden findet der Fachmann unter anderem im Handbuch ”The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255–260 (1991)) . Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen die Sonde d. h. ein Polynukleotid umfassend die zu den Aminosäureracemasegenen, insbesondere den Aminosäureracemasegenen nach den Sequenzen Nr. 1 bis Nr. 14 komplementäre Nukleotidsequenz und die Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten bzw. identifizierten Polynukleotide, mindestens 90% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung, einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt ( Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996 ).Instructions for the hybridization of nucleic acids or polynucleotides will be found in the handbook, inter alia, in the handbook "The DIG System Users Guide to Filter Hybridization" by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) and at Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)) , The hybridization takes place under stringent conditions, that is, only hybrids are formed in which the probe, ie a polynucleotide comprising the nucleotide sequence complementary to the amino acid racemase genes, in particular the amino acid racemase genes according to Sequence Nos. 1 to 14, and the target sequence, ie the polynucleotides treated or identified with the probe are at least 90% identical. It is known that the stringency of the hybridization, including the washing steps, is influenced or determined by varying the buffer composition, the temperature and the salt concentration. The hybridization reaction is generally carried out at a relatively low stringency compared to the washing steps ( Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996 ).

Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5·SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50[deg.]C–68[deg.]C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 90% Identität zur Nukleotidsequenz der eingesetzten Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2·SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5·SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50[deg.]C–68[deg.]C, ca. 52[deg.]C–68[deg.]C, ca. 54[deg.]C–68[deg.]C, ca. 56[deg.]C–68[deg.]C, ca. 58[deg.]C–68[deg.]C, ca. 60[deg.]C–68[deg.]C, ca. 62[deg.]C–68[deg.]C, ca. 64[deg.]C–68[deg.]C, ca. 66[deg.]C–68[deg.]C eingestellt wird. Temperaturbereiche von ca. 64[deg.]C–68[deg.]C oder ca. 66[deg.]C–68[deg.]C werden bevorzugt. Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2·SSC oder 0,1·SSC zu senken. Gegebenenfalls enthält der SSC-Puffer Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration von 0,1%. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2[deg.]C von 50[deg.]C auf 68[deg.]C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die mindestens 90% oder mindestens 91%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 93% oder mindestens 94% oder mindestens 95% oder mindestens 96% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% Identität zur Sequenz bzw. komplementären Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen und für ein Polypeptid mit Aminosäureracemaseaktivität kodieren. Die Nukleotidsequenz des auf diese Weise erhaltenen Polynukleotids wird mit bekannten Methoden bestimmt. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb. von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558).For the hybridization reaction, for example, a buffer corresponding to 5 × SSC buffer at a temperature of about 50 ° C-68 ° C. may be used. In this case, probes can also hybridize with polynucleotides which have less than 90% identity to the nucleotide sequence of the probe used. Such hybrids are less stable and are removed by washing under stringent conditions. This can be achieved, for example, by lowering the salt concentration to 2 × SSC and optionally subsequently 0.5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995), a temperature of about 50 ° C. being reached 52 ° C-68 ° C, ca. 54 ° C-68 ° C, ca. 56 ° C-68 ° C C-68 [deg.] C, ca. 58 ° C-68 ° C, ca. 60 ° C-68 ° C, ca. 62 ° C 68 ° C, about 64 ° C-68 ° C, about 66 ° C-68 ° C. Temperature ranges of about 64 ° C-68 ° C or about 66 ° C-68 ° C are preferred. It may be possible to lower the salt concentration to a concentration corresponding to 0.2 × SSC or 0.1 × SSC. Optionally, the SSC buffer contains sodium dodecyl sulfate (SDS) at a concentration of 0.1%. By gradually increasing the hybridization temperature in steps of about 1-2 ° C. from 50 ° C. to 68 ° C., it is possible to isolate polynucleotide fragments which contain at least 90% or at least 91%, preferably at least 92%. or at least 93% or at least 94% or at least 95% or at least 96%, and most preferably at least 97% or at least 98% or at least 99% have identity to the sequence or complementary sequence of the probe used and encode a polypeptide having amino acid racemase activity. The nucleotide sequence of the polynucleotide thus obtained is determined by known methods. Further instructions for hybridization are available on the market in the form of so-called kits (eg DIG Easy Hyb. From Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 1603558).

Die Aminosäureracemasegene werden in dem Wirtsbakterium, das das L-Enantiomer der gewünschten D-Aminosäure produziert, exprimiert.The amino acid racemase genes are expressed in the host bacterium that produces the L-enantiomer of the desired D-amino acid.

Beispielsweise wird ein Serinracemasegen, Glutamatracemasegen, Prolinracemasegen, Lysinracemasegen, Alaninracemasegen, Ornithinracemasegen, Argininracemasegen, Threoninracemasegen, Tryptophanracemasegen, Valinracemasegen, Isoleucinracemasegen und/oder Methioninracemasegen gegenüber der Wildform verstärkt exprimiert. For example, a serine racemase gene, glutamate racemase gene, proline racemase gene, lysine racemase gene, alanine racemase gene, ornithine racemase gene, arginine racemase gene, threonine racemase gene, tryptophan racemase gene, valine racemase gene, isoleucine racemase gene and / or methionine racemase gene are expressed more prominently against the wild type.

Die Expression erfolgt über Vektoren, vorzugsweise Plasmide, durch die Gen eigenen oder Vektor eigenen Promotoren, oder auch plasmidfrei durch Integration der Gene zusammen mit Promotoren in das Wirtsgenom.Expression takes place via vectors, preferably plasmids, by the gene's own or vector's own promoters, or else plasmid-free by integration of the genes together with promoters into the host genome.

In einer Ausführungsform macht das erfindungsgemäße Verfahren von der chromosomalen Genamplifikation Gebrauch. Bei dieser Methode wird mindestens eine Kopie des Aminosäureracemasegens oder dessen Allel in das Chromosom eines Mikroorganismus, wie z. B. des coryneformen Bakteriums inseriert, wie es beispielsweise in der WO 03/040373 offenbart ist. Um in einer weiteren Ausführungsform Überexpression zu erreichen wird das Aminosäureracemasegen mit einem Promoter oder einer Expressionskassette fusioniert. Geeignete Promotoren sind beispielsweise in Journal of Biotechnology 104 (1–3), 311–323 (2003) beschrieben. Es ist auch möglich die Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc zu benutzen, die schon lange bekannt sind und bei Amann et al. (Gene 69 (2), 301–315 (1988)) und Amann und Brosius (Gene 40 (2–3), 183–190 (1985) beschrieben sind.In one embodiment, the method of the invention makes use of chromosomal gene amplification. In this method, at least one copy of the amino acid racemase gene or its allele into the chromosome of a microorganism, such. B. the coryneform bacterium, as it is for example in the WO 03/040373 is disclosed. In another embodiment, to achieve overexpression, the amino acid racemase gene is fused to a promoter or an expression cassette. Suitable promoters are, for example, in Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003) described. It is also possible to use the promoters T3, T7, SP6, M13, lac, tac and trc, which have been known for a long time and at Amann et al. (Gene 69 (2), 301-315 (1988)) and Amann and Brosius (Gene 40 (2-3), 183-190 (1985) are described.

Durch die Expression von für eine Aminosäureracemase kodierende Gene wird die gewünschte Aminosäureracemaseaktivität erreicht. Dies wird in einer Ausführungsform beispielsweise durch Erhöhung der Kopienzahl des Aminosäureracemasegens bewirkt. Häufig wird dazu das Gen in einen Leervektor eingebaut, vorzugsweise ein Plasmid, welches in coryneformen Bakterien oder Enterobakterien repliziert. Geeignete Leervektoren sind z. B. pZl ( Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549–554 ) oder die pSELF Vektoren ( Journal of Biotechnology 99, 79–91 (2002) ). Eine Übersicht über coryneforme Bakterien findet sich in Journal of Biotechnology 104, 27–40 (2003) .By expression of genes coding for an amino acid racemase, the desired amino acid racemase activity is achieved. In one embodiment, for example, this is effected by increasing the copy number of the amino acid racemase gene. Frequently, the gene is incorporated into an empty vector, preferably a plasmid, which replicates in coryneform bacteria or enterobacteria. Suitable empty vectors are z. B. pZl ( Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554 ) or the pSELF vectors ( Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002) ). An overview of coryneform bacteria can be found in Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003) ,

Die Aktivität der Aminsäureracemasegne kann dadurch verstärkt werden, dass gegenüber der Wildform verstärkte Promotoren eingesetzt werden. Der Einsatz von gegenüber der Wildform verstärkten Promotoren ist sowohl in der chromosomalen DNS, als auch in einem Vektor möglich.The activity of Aminsäureracemasegne can be enhanced by the fact that promoters are used against the wild form promoters. The use of wild-type promoters is possible both in chromosomal DNA and in a vector.

Durch die Expression der Aminosäureracemase-DNA können beispielsweise aber nicht beschränkend Aminosäureracemasen intrazellulär mit folgenden Aminosäuresequenzen bereitgestellt werden.
Serin Racemase aus Enterococcus gallinarium (Seq. Nr. 15),
Serin Racemase aus Pyrobaculum islandicum (Seq. Nr. 16),
rac E1 Glutamat Racemase aus Bacillus anthracis (Seq. Nr. 17),
rac E2 Glutamat Racemase aus Bacillus anthracis (Seq. Nr. 18),
Prolin Racemase aus Clostridium difficile (Seq. Nr. 19),
Lysin Racemase aus Pseudomonas putida (Seq. Nr. 20),
Alanin Racemase aus Methanococcus maripaludis (Seq. Nr. 21),
Serin Racemase aus Clostridium innocuum (Seq. Nr. 22),
Ornithine Racemase aus Clostridium sticklandii (Seq. Nr. 23),
Arginin Racemase aus Pseudomonas taetrolens (Seq. Nr. 24),
BAR (Lysin Racemase) aus Pseudomonas putida (Seq. Nr. 25).By the expression of the amino acid racemase DNA, for example, but not limited to, amino acid racemases may be provided intracellularly with the following amino acid sequences.
Serine racemase from Enterococcus gallinarium (Seq No. 15),
Serine racemase from Pyrobaculum islandicum (Seq No. 16),
rac E1 glutamate racemase from Bacillus anthracis (Seq No. 17),
rac E2 glutamate racemase from Bacillus anthracis (Seq No. 18),
Proline racemase from Clostridium difficile (Seq No. 19),
Lysine racemase from Pseudomonas putida (Seq No. 20),
Alanine racemase from Methanococcus maripaludis (Seq No. 21),
Serine racemase from Clostridium innocuum (Seq No. 22),
Ornithine racemase from Clostridium sticklandii (Seq No. 23),
Arginine racemase from Pseudomonas taetrolens (Seq., No. 24),
BAR (lysine racemase) from Pseudomonas putida (SEQ ID NO: 25).

Zur Genamplifikation können vorzugsweise die Primer nach den Sequenzen Nr. 26–31 eingesetzt werden.For gene amplification, it is preferable to use the primers according to Sequence Nos. 26-31.

Als Substrate können Zucker und Kohlenhydrate wie z. B. Glukose, Fruktose oder Saccharose, Lactose, Maltose, Melasse, Saccharosehaltige Lösungen aus Zuckerrüben- oder Zuckerrohrherstellung, Stärke, Stärkehydrolysat und Cellulose, Öle und Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie beispielsweise Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie z. B. Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Säuren, wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure, verwendet werden.As substrates, sugars and carbohydrates such as. As glucose, fructose or sucrose, lactose, maltose, molasses, sucrose-containing solutions from sugar beet or sugar cane production, starch, starch hydrolyzate and cellulose, oils and fats, such as. As soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such. As glycerol, methanol and ethanol and organic acids, such as. As acetic acid or lactic acid can be used.

Nachdem das Racemat der gewünschten Aminosäure gebildet wurde, kann die Trennung des Racemats erfolgen.After the racemate of the desired amino acid has been formed, the racemate can be separated.

Dazu kann eines der Enantiomere bevorzugt sekretiert werden.For this purpose, one of the enantiomers can preferably be secreted.

Wird das D-Enantiomer, beispielsweise D-Arginin, bevorzugt sekretiert, so kann die D-Aminosäure von der L-Aminosäure mit bekannten Methoden, die unten beispielhaft aufgeführt sind, abgetrennt werden. If the D-enantiomer, for example D-arginine, is preferably secreted, the D-amino acid can be separated from the L-amino acid by known methods exemplified below.

Erfolgt keine bevorzugte Sekretion der Enantiomere, so kann die D-Aminosäure von der L-Aminosäure mit bekannten Methoden, die unten beispielhaft beschrieben sind, abgetrennt werden.In the absence of preferential secretion of the enantiomers, the D-amino acid may be separated from the L-amino acid by known methods exemplified below.

Eine Trennung der D-Aminosäure vom Racemat kann durch präfentielle Kristallisation, chemische Umsetzung eines Enatiomeren, z. B. durch enzymatische Modifizierung und Trennung der physikalisch unterschiedlichen Komponenten erfolgen. Entsprechende Methoden sind dem Fachmann bekannt.A separation of the D-amino acid from the racemate can be achieved by prefential crystallization, chemical reaction of an enantiomer, eg. B. by enzymatic modification and separation of the physically different components. Corresponding methods are known to the person skilled in the art.

Weiterhin kann die nicht gewünschte L-Aminosäure verstoffwechselt und die gewünschte D-Aminosäure isoliert werden.Furthermore, the unwanted L-amino acid can be metabolized and the desired D-amino acid can be isolated.

Methoden um die erreichten Aminosäureracemaseaktivitäten zu bestimmen sind beschrieben und basieren beispielsweise auf einem enzymatischen Nachweis des Produkts ( Phytochemistry 2006; 67 (9): 856; J Biol. Chem. 2002 18; 277 (42): 39070 ), oder dem Nachweis mittels Hochdruckflüssigchromatographie ( Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 ).Methods for determining the achieved amino acid racemase activities are described and are based, for example, on an enzymatic detection of the product ( Phytochemistry 2006; 67 (9): 856; J Biol. Chem. 2002 18; 277 (42): 39070 ), or detection by high pressure liquid chromatography ( Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 ).

Die Kultivierung der Bakterien die Aminosäureracemase enthalten und D-, L-Aminosäure ausscheiden erfolgt mit wachsenden oder ruhenden Zellen diskontinuierlich im batch, fed batch, repeated fed batch oder kontinuierlich wie in PCT/EP2004/008882 beschrieben. Ein genereller Überblick über Kultivierungsmethoden ist im Buch von Chmiel gegeben (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik ( Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) oder auch im Buch von Storhas ( Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994) ). Das Kulturmedium oder Fermentationsmedium muss in geeigneter Weise den Anforderungen des Bakteriums entsprechen. Beschreibungen von Kulturmedium für verschiedene Mikroorganismen sind dokumentiert im Handbuch ”Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981 ). Die Bezeichnung Kulturmedium oder Fermentationsmedium ist jeweils austauschbar.The cultivation of the bacteria containing the amino acid racemase and excretion of D, L-amino acid is carried out batchwise or in a continuous manner in batch, fed batch, repeated fed batch or continuously as in PCT / EP2004 / 008882 described. A general overview of cultivation methods is given in the book by Chmiel (Bioprocessing Technology 1. Introduction to Bioprocess Engineering ( Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) or in the book of Storhas ( Bioreactors and Peripheral Facilities (Vieweg Verlag, Brunswick / Wiesbaden, 1994) ). The culture medium or fermentation medium must suitably meet the requirements of the bacterium. Descriptions of culture medium for various microorganisms are documented in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society of Bacteriology (Washington DC, USA, 1981 ). The term culture medium or fermentation medium is in each case exchangeable.

Die Bestimmung der D- und der L-Form der gebildeten Aminosäure erfolgt auf bekannte Weise entweder enzymatisch mit geeigneten Enzymen ( Phytochemistry 2006; 67 (9): 856; J Biol. Chem. 2002 18; 277 (42): 39070 ), oder mittels Hochdruckflüssigchromatographie ( Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 ).The determination of the D and the L form of the amino acid formed takes place in a known manner either enzymatically with suitable enzymes ( Phytochemistry 2006; 67 (9): 856; J Biol. Chem. 2002 18; 277 (42): 39070 ), or by high pressure liquid chromatography ( Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 ).

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Mirkoorganismus, welcher gegenüber seiner Wildform eine erhöhte Anzahl mindestens einer für eine Aminosäureracemase kodierende DNA enthält, oder der eine natürliche Aminosäureracemase umfasst, deren Promotor gegenüber der Wildform verstärkt ist.The invention also relates to a microorganism which, compared with its wild form, contains an increased number of at least one DNA coding for an amino acid racemase, or which comprises a natural amino acid racemase whose promoter is enhanced in relation to the wild form.

In einer bevorzugten Ausführungsform produziert der Mikroorganismus gegenüber seiner Wildform mindestens eine Aminosäure verstärkt.In a preferred embodiment, the microorganism produces at least one amino acid in its wild form.

Vorzugsweise ist der Mikroorganismus ein Enterobacterium oder ein Corynebakerium.Preferably, the microorganism is an enterobacterium or a corynebacterium.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind die Mikroorganismen L-Lysin Produzenten, L-Arginin oder L-Citrullin Produzenten, L-Serin Produzenten, L-Methionin Produzenten, L-Valin Produzenten, L-Glutamate Produzenten, L-Threonin Produzenten, L-Tryptothan-Produzenten oder L-Isoleucin Produzenten.In further preferred embodiments, the microorganisms are L-lysine producers, L-arginine or L-citrulline producers, L-serine producers, L-methionine producers, L-valine producers, L-glutamate producers, L-threonine producers, L-tryptothan. Producers or L-isoleucine producers.

In dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus sind erfindungsgemäß Aminosäureracemasegene in das Genom inseriert.In the microorganism of the invention, amino acid racemase genes are inserted into the genome according to the invention.

Alternativ oder zusätzlich können die Mikroorganismen Vektoren, enthaltend für eine Aminosäureracemase kodierende DNA enthalten.Alternatively or additionally, the microorganisms may contain vectors containing DNA encoding an amino acid racemase.

Der Mikroorganismus enthält bevorzugt ein Plasmid.The microorganism preferably contains a plasmid.

Der Mikroorganismus kann in seinem Genom und/oder einem Vektor, bzw. Plasmid, mindestens eine Komponente aus der Gruppe der Gene der Serin Racemase, Glutamat Racemase, Prolin Racemase, Lysin Racemase, Alanin Racemase, Ornithin Racemase, Arginin Racemase, Threonin Racemase, Tryptophan Racemase, Valin Racemase, Isoleucin Racemase, und/oder Methionin Racemase in einer größeren Zahl als derjenigen die der Wildform entspricht, enthalten. The microorganism can in its genome and / or a vector, or plasmid, at least one component from the group of genes of serine racemase, glutamate racemase, proline racemase, lysine racemase, alanine racemase, ornithine racemase, arginine racemase, threonine racemase, tryptophan Racemase, valine racemase, isoleucine racemase, and / or methionine racemase in a greater number than those corresponding to the wild form included.

Der Mikroorganismus kann in seinem Genom und/oder einem Vektor eine Racemase einer mindestens 90%igen Homologie der Gene nach den Sequenzen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 in einer größeren Anzahl als derjenigen der der Wildform entspricht enthalten.The microorganism can in its genome and / or a vector a racemase of at least 90% homology of the genes according to the sequences 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 in a larger number than those corresponding to the wild form.

Insbesondere kann der Mikroorganismus in seinem Genom und/oder einem Vektor eine Racemase nach den Sequenzen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 in einer größeren Anzahl als derjenigen der der Wildform entspricht enthalten.In particular, the microorganism may have in its genome and / or vector a racemase of sequences 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 in a greater number than that which corresponds to the wild form.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Plasmid ein Plasmid, welches in coryneformen Bakterien oder Enterobakterien repliziert, besonders bevorzugt, pZ1, pSELF.In a preferred embodiment, the plasmid is a plasmid which replicates in coryneform bacteria or enterobacteria, more preferably pZ1, pSELF.

Besonders bevorzugt enthält der erfindungsgemäße Mikroorganismus den Vektor pEKEx3-ArgR nach Seq. Nr. 32 und/oder den Vektor pEKEx2-bar-SP nach Seq. Nr. 33The microorganism according to the invention particularly preferably contains the vector pEKEx3-ArgR according to Seq. No. 32 and / or the vector pEKEx2-bar-SP according to Seq. No. 33

Der erfindungsgemäße Mikroorganismus kann für die DNA-Sequenzen, kodierend für die Aminosäureracemase, eine Signalsequenz enthalten.The microorganism according to the invention may contain a signal sequence for the DNA sequences coding for the amino acid racemase.

Besonders bevorzugt ist jedoch ein Mirkoorganismus, welcher für eine Aminosäureracemase kodierende DNA in einer gegenüber der Wildform erhöhten Anzahl aufweist, der keine Signalsequenz für das Aminosäureracemasegen besitzt, da somit die exprimierten Aminosäureracemasen nicht in ein unerwünschtes zelluläres Kompartiment transportiert werden, wie z. B. dem Periplasma, sondern das sie im Cytosol verbleiben wo die L-Aminosäure im Mikroorganismus aus dem Zucker synthetisiert wird.However, particularly preferred is a microorganism which has DNA coding for an amino acid racemase in a wild-type increased number which does not have a signal sequence for the amino acid racemase gene, since thus the expressed amino acid racemases are not transported to an undesired cellular compartment, e.g. As the periplasm, but that they remain in the cytosol where the L-amino acid is synthesized in the microorganism from the sugar.

Der erfindungsgemäße Mikroorganismus kann Aminosäureracemasegen enthalten, welche durch Hybridisierung beispielsweise nach den oben genannten Methoden verändert sind. Damit kann ein größeres Anwendungsspektrum der exprimierten Aminosäureracemasen erreicht werden. Der so veränderte Mikroorganismus kann ein coryneformes Bakterium, ein Enterobakterium, insbesondere ein Corynebakterium glutamicum oder ein Escherichia coli sein.The microorganism of the present invention may contain amino acid racemase genes which are altered by hybridization, for example, by the above-mentioned methods. Thus, a wider range of applications of the expressed amino acid racemases can be achieved. The microorganism thus modified may be a coryneform bacterium, an enterobacterium, especially a corynebacterium glutamicum or an Escherichia coli.

Gegenstand der Erfindung sind auch weiterhin Vektoren, welche Aminosäureracemasegene umfassen.The invention furthermore relates to vectors which comprise amino acid racemase genes.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Vektor ein Plasmid.In a preferred embodiment, the vector of the invention is a plasmid.

Besonders bevorzugt ist ein Plasmid aus der Gruppe pZ1 und pSELF in das ein Aminosäureracemasegen inseriert ist.Particularly preferred is a plasmid from the group pZ1 and pSELF in which an amino acid racemase gene is inserted.

Vorzugsweise sind in die erfindungsgemäßen Vektoren kodierende Gene kodierend für die der Serin Racemase, Glutamat Racemase, Prolin Racemase, Lysin Racemase, Alanin Racemase, Ornithin Racemase, Arginin Racemase, Threonin Racemase, Tryptothan Racemase, Valin Racemase, Isoleucin Racemase und/oder Methionin Racemase inseriert, insbesondere DNA-Sequenzen nach den Sequenzen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder deren 90%ige Homologe.Preferably genes coding for the genes of the invention encoding the serine racemase, glutamate racemase, proline racemase, lysine racemase, alanine racemase, ornithine racemase, arginine racemase, threonine racemase, tryptothane racemase, valine racemase, isoleucine racemase and / or methionine racemase are inserted , in particular DNA sequences according to the sequences 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or their 90% homologues.

Vorzugsweise enthält der Vektor für das Aminosäureracemasegen keine Signalsequenz.Preferably, the vector for the amino acid racemase gene does not contain a signal sequence.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind insbesondere die Plasmide pEKEx3-ArgR nach Seq. Nr. 32 und/oder den Vektor pEKEx2-bar-SP nach Seq. Nr. 33.Particularly preferred according to the invention are the plasmids pEKEx3-ArgR according to Seq. No. 32 and / or the vector pEKEx2-bar-SP according to Seq. No. 33.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen und Vektoren können D-Aminosäuren besonders einfach und preisgünstig hergestellt werden. Insbesondere entfällt die Notwendigkeit einer Kontrolle der Konzentrationen für Edukt und Produkt.With the method according to the invention and using the microorganisms and vectors according to the invention, D-amino acids can be prepared in a particularly simple and inexpensive manner. In particular, eliminates the need for a control of the educt and product concentrations.

Beispiele:Examples:

Beispiel 1example 1

Konstruktion des Vektors pEKEx3-argR.Construction of vector pEKEx3-argR.

Der kodierende Bereich der Racemase ArgR aus Pseudomonas taetrolens wurde ohne die 26 bp lange N-terminale Signalsequenz aus dem Vektor pET11b-argr ( Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 ) mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Dazu wurden die folgenden Oligonukleotide benutzt:

Figure 00120001
The coding region of the racemase ArgR from Pseudomonas taetrolens was isolated from the vector pET11b-argr (without the 26 bp N-terminal signal sequence). Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 ) amplified by polymerase chain reaction. For this purpose, the following oligonucleotides were used:
Figure 00120001

Die Oligonukleotide wurden von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und amplifizieren ein etwa 1200 bp großes Fragment. Die Nukleotide 27 bis 35 des Oligonukleotids argR-PstI(fw) binden an die Nukleotide 69 bis 77 in der in der Datenbank hinterlegten Sequenz (gi: 2513752). Zusätzlich enthalten die Oligonukleotide die Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonukleasen PstI und BamHI. Der Primer argR-PstI(fw) enthält weiterhin die Sequenz für die Ribosomenbindestelle von C. glutamicum.The oligonucleotides were synthesized by MWG Biotech (Ebersberg, Germany) and amplify an approximately 1200 bp fragment. Nucleotides 27 to 35 of the oligonucleotide argR-PstI (fw) bind to nucleotides 69 to 77 in the sequence stored in the database (gi: 2513752). In addition, the oligonucleotides contain the recognition sequences for the restriction endonucleases PstI and BamHI. The primer argR-PstI (fw) also contains the sequence for the ribosome binding site of C. glutamicum.

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde mit der KOD Hot Start Polymerase (Novagen, San Diego, USA) durchgeführt. Der Reaktionsansatz enthielt 1,5 mM MgSO4, 200 μM dNTP, 0,3 μM der jeweiligen Primer, 0,02 Units KOD Hot Start Polymerase und 1 × KOD Hot Start Puffer. Zur Amplifikation wurde der Mix für 2 min. auf 95°C erhitzt. Anschließend wurde 35 × ein Zyklus aus 20 sec. 95°C, 30 sec. 59°C, 1 min. 70°C, durchlaufen. Abschließend wurde für 4 min. auf 70°c erhitzt und die Probe auf 8°C abgekühlt.The polymerase chain reaction (PCR) was performed with KOD Hot Start Polymerase (Novagen, San Diego, USA). The reaction contained 1.5 mM MgSO4, 200 μM dNTP, 0.3 μM of the respective primers, 0.02 units of KOD Hot Start Polymerase and 1 × KOD Hot Start Buffer. For amplification, the mix for 2 min. heated to 95 ° C. Subsequently, 35 times a cycle of 20 sec. 95 ° C, 30 sec. 59 ° C, 1 min. 70 ° C, go through. Finally, for 4 min. heated to 70 ° C and the sample cooled to 8 ° C.

Das etwa 1200 bp große Produkt wurde mit den Restriktionsendonukleasen PstI und BamHI inkubiert und in einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Mittels des MN NucleoSpin Extract II Kits (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) wurde das Fragment aus dem Gel aufgereinigt. Der Vektor pEKEx3 ( Gande et al., Journal of Bacteriology, 2007, p. 5257–5264, Vol. 189 ) wurde ebenfalls mit PstI und BamHI inkubiert, aus dem Agarosegel aufgereinigt und die Enden mittels alkalischer Phosphatase (ROCHE Diagnostics, Mannheim, Deutschland) dephosphoryliert. Der so präparierte Vektor wurde mit dem Insert gemischt und mit T4-DNA-Ligase (ROCHE Diagnostics, Mannheim, Deutschland) behandelt.The approximately 1200 bp product was incubated with the restriction endonucleases PstI and BamHI and separated in a 1% agarose gel. The fragment was gel purified using the MN NucleoSpin Extract II kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany). The vector pEKEx3 ( Gande et al., Journal of Bacteriology, 2007, p. 5257-5264, Vol. 189 ) was also incubated with PstI and BamHI, purified from the agarose gel and the ends dephosphorylated by alkaline phosphatase (ROCHE Diagnostics, Mannheim, Germany). The thus prepared vector was mixed with the insert and treated with T4 DNA ligase (ROCHE Diagnostics, Mannheim, Germany).

Der E. coli Stamm DH5α wurde mit dem Ligationsansatz transformiert und zur Selektion auf positive Transformanden auf LB-Platten mit 100 μg/ml Spectinomycin plattiert.The E. coli strain DH5α was transformed with the ligation mixture and plated for selection on positive transformants on LB plates with 100 μg / ml spectinomycin.

Einzelne Kolonien wurden in LB-Medium mit 100 μg/ml Spectinomycin gepickt und die Kulturen angezogen. Nach Isolation der Plasmid-DNA mit dem QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) wurden die Klone mittels Restriktionsverdau mit EcoRI, EcoRV oder PvuII charakterisiert.Single colonies were picked in LB medium with 100 μg / ml spectinomycin and the cultures grown. After isolation of the plasmid DNA with the QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), the clones were characterized by restriction digestion with EcoRI, EcoRV or PvuII.

Im Restriktionsverdau positive Klone wurden abschließend mittels Sequenzierung getestet. Dazu wurden 800 ng des Plasmids mit 20 pmol Oligonukleotid gemischt und bei AGOWA (Berlin, Deutschland) sequenziert. Folgende Oligonukleotide wurden benutzt:

Figure 00130001
In the restriction digest positive clones were finally tested by sequencing. 800 ng of the plasmid were mixed with 20 pmol oligonucleotide and sequenced at AGOWA (Berlin, Germany). The following oligonucleotides were used:
Figure 00130001

Das Plasmid wurde als pEKEx3-argR bezeichnet und ist in 1 gezeigt.The plasmid was named pEKEx3-argR and is in 1 shown.

1: Das Plasmid pEKEx3-ArgR. Es sind ausgewählte Restriktionsschnittstellen gezeigt, sowie die Spectinomycin-Resistenz (Spc-ca.), der Repressor (laIq), die Ribosomenbindestelle (RBS), das Racemasegen (ArgRC), ein Terminator (Term), und der Replikationsursprung (rep). 1 : The plasmid pEKEx3-ArgR. Selected restriction sites are shown, as well as spectinomycin resistance (Spc-ca.), The repressor (laIq), the ribosome binding site (RBS), the racemase gene (ArgRC), a terminator (term), and the replication origin (rep).

Beispiel 2Example 2

Konstruktion des Vektors pEKEx2-bar-SP.Construction of vector pEKEx2-bar-SP.

Der kodierende Bereich der Racemase BAR aus Pseudomonas putida KT2440 DSM6125 wurde aus dem Vektor pEP22b-aaRaz ( Journal of Molecular Catalysis B, 58 (2009) 10–16 ) mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Dazu wurden die folgenden Oligonukleotide benutzt:

Figure 00130002
The coding region of the racemase BAR from Pseudomonas putida KT2440 DSM6125 was isolated from the vector pEP22b-aaRaz (FIG. Journal of Molecular Catalysis B, 58 (2009) 10-16 ) amplified by polymerase chain reaction. For this purpose, the following oligonucleotides were used:
Figure 00130002

Die Oligonukleotide wurden von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und amplifizieren ein etwa 1240 bp großes Fragment. Die Nukleotide 10 bis 27 des Oligonukleotids bar-SP-BamHI(fw) binden an die Nukleotide 1 bis 18 in der in der Datenbank hinterlegten Sequenz (gi: 92272047). Zusätzlich enthalten die Oligonukleotide die Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonukleasen BamHI und SacI. The oligonucleotides were synthesized by MWG Biotech (Ebersberg, Germany) and amplify an approximately 1240 bp fragment. Nucleotides 10 to 27 of the oligonucleotide bar-SP-BamHI (fw) bind to nucleotides 1 to 18 in the sequence stored in the database (gi: 92272047). In addition, the oligonucleotides contain the recognition sequences for the restriction endonucleases BamHI and SacI.

Die PCR wurde mit der KOD Hot Start Polymerase (Novagen, San Diego, USA) wie zuvor im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.The PCR was performed with the KOD Hot Start Polymerase (Novagen, San Diego, USA) as previously described in Example 1.

Das etwa 1240 bp große Produkt wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und SacI inkubiert und in einem 1% Agarosegel identifiziert. Mittels des MN NucleoSpin Extract II Kits (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) wurde das Fragment aus dem Gel aufgereinigt. Der Vektor pEKEx2 ( Eikmanns et al., 1991, Gene 102: 93–98 ) wurde ebenfalls mit BamHI und SacI inkubiert, aus dem Agarosegel aufgereinigt und die Enden mittels alkalischer Phosphatase (ROCHE Diagnostics, Mannheim, Deutschland) dephosphoryliert. Der so präparierte Vektor wurde mit dem Insert gemischt und mit T4-DNA-Ligase (ROCHE Diagnostics, Mannheim, Deutschland) behandelt.The approximately 1240 bp product was incubated with the restriction endonucleases BamHI and SacI and identified in a 1% agarose gel. The fragment was gel purified using the MN NucleoSpin Extract II kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany). The vector pEKEx2 ( Eikmanns et al., 1991, Gene 102: 93-98 ) was also incubated with BamHI and SacI, purified from the agarose gel and the ends dephosphorylated by alkaline phosphatase (ROCHE Diagnostics, Mannheim, Germany). The thus prepared vector was mixed with the insert and treated with T4 DNA ligase (ROCHE Diagnostics, Mannheim, Germany).

Der E. coli Stamm DH5α wurde mit dem Ligationsansatz transformiert und zur Selektion auf positive Transformanden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin plattiert.The E. coli strain DH5α was transformed with the ligation batch and plated for selection on positive transformants on LB plates with 50 μg / ml kanamycin.

Einzelne Kolonien wurden in LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin gepickt und die Kulturen angezogen. Nach Isolation der Plasmid-DNA mit dem QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) wurden die Klone mittels Restriktionsverdau mit SalI oder XbaI charakterisiert.Single colonies were picked in LB medium with 50 μg / ml kanamycin and the cultures grown. After isolation of the plasmid DNA with the QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), the clones were characterized by restriction digestion with SalI or XbaI.

Im Restriktionsverdau positive Klone wurden abschließend mittels Sequenzierung getestet. Dazu wurden 800 ng des Plasmids mit 20 pmol Oligonukleotid gemischt und bei AGOWA (Berlin, Deutschland) sequenziert. Als Oligonukleotide wurden die, die im Beispiel 1 angegeben sind, benutzt. Das Plasmid wurde als pEKEx2-bar-SP bezeichnet und ist in 2 gezeigt.In the restriction digest positive clones were finally tested by sequencing. 800 ng of the plasmid were mixed with 20 pmol oligonucleotide and sequenced at AGOWA (Berlin, Germany). As oligonucleotides, those given in Example 1 were used. The plasmid was named pEKEx2-bar-SP and is in 2 shown.

2: Das Plasmid pEKEx2--bar-SP. Es sind ausgewählte Restriktionsschnittstellen gezeigt, sowie die Kanamycin-Resistenz (KanR), der Repressor (laIq), der Promotor (Ptac) das Racemasegen (BAR-SP), und der Terminator (TrrnB). 2 : The plasmid pEKEx2 - bar-SP. Selected restriction sites are shown, as well as kanamycin resistance (KanR), the repressor (laIq), the promoter (Ptac) the racemase gene (BAR-SP), and the terminator (TrrnB).

Beispiel 3Example 3

Transformation des L-Lysin Produzenten Corynebacterium glutamicum DM1800.Transformation of the L-lysine producer Corynebacterium glutamicum DM1800.

Als Ausgangsstamm wurde der L-Lysin Produzent Corynebacterium glutamicum DM1800 benutzt, der bei Georgi et al. beschrieben ist ( Metab Eng. 2005; 7 (4): 291–301 .). Dieser Stamm leitet sich vom Wildtyp ab, und enthält die zwei chromosomalen Punktmutationen pyc-P458S und lysC-T311I, die bewirken, dass der Stamm L-Lysin ausscheidet. Zellen von C. glutamicum DM1800 wurden kompetent gemacht, wie bei Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) . Das Plasmid pEKEx3-argR enthaltend die Seq. Nr. 10 aus Beispiel 1 wurde, wie ebenfalls bei Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) , durch Elekroporation mit dem Gene Pulser System von Bio-Rad in C. glutamicum DM1800 eingeführt und auf BHIS ( FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299–303 ) welches 100 micro g pro ml Spectinomycin enthielt ausplattiert. Nach Isolation der Plasmid-DNA mit dem QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) wurden die Klone mittels Restriktionsverdau mit EcoRI, EcoRV und PvuII charakterisiert. Ein positiver Klon wurde als Stamm DM1800 pEKEx3-argR bezeichnet.The starting strain used was the L-lysine producer Corynebacterium glutamicum DM1800, which was described by Georgi et al. is described ( Metab Eng. 2005; 7 (4): 291-301 .). This strain derives from the wild type and contains the two chromosomal point mutations pyc-P458S and lysC-T311I which cause the strain to excrete L-lysine. Cells of C. glutamicum DM1800 were made competent as in Tauch et al. (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362). , The plasmid pEKEx3-argR containing the Seq. No. 10 of Example 1 was, as also at Tauch et al. (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362). , introduced by electroporation with the Bio-Rad Gene Pulser System into C. glutamicum DM1800 and extended to BHIS ( FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299-303 ) containing 100 micro g per ml of spectinomycin plated. After isolation of the plasmid DNA with the QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), the clones were characterized by restriction digestion with EcoRI, EcoRV and PvuII. One positive clone was designated strain DM1800 pEKEx3-argR.

Beispiel 4Example 4

Transformation des L-Arginin Produzenten Corynebacterium glutamicum ΔargR argB26argB31.Transformation of L-arginine producer Corynebacterium glutamicum ΔargR argB26argB31.

Als Ausgangsstamm wurde der L-Arginin Produzent Corynebacterium glutamicum ΔargR argB26argB31 benutzt der bei Ikeda et al. beschrieben ist (Appl. Environ Microbiol. 2009; 75 (6): 1635) . Dieser Stamm leitet sich vom Wildtyp ab, hat den Regulator argR deletiert, und trägt die zwei chromosomalen Punktmutationen argB26argB31. Zellen von C. glutamicum ΔargR argB26argB31 wurden kompetent gemacht, wie bei Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) . Das Plasmid pEKEx3-argR enthaltend die Seq. Nr. 10 aus Beispiel 1 wurde, wie ebenfalls bei Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) , durch Elekroporation mit dem Gene Pulser System von Bio-Rad in C. glutamicum ΔargR argB26argB31 eingeführt und auf BHIS ( FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299–303 ) welches 100 micro g pro ml Spectinomycin enthielt ausplattiert. Nach Isolation der Plasmid-DNA mit dem QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) wurden die Klone mittels Restriktionsverdau mit EcoRI, EcoRV und PvuII charakterisiert. Ein positiver Klon wurde als Stamm C. glutamicum ΔargR argB26argB31 pEKEx3-argR bezeichnet.The starting strain used was the L-arginine producer Corynebacterium glutamicum ΔargR argB26argB31 Ikeda et al. Environ Microbiol., 2009; 75 (6): 1635). , This strain is derived from the wild type, has deleted the regulator argR, and carries the two chromosomal point mutations argB26argB31. Cells of C. glutamicum ΔargR argB26argB31 were made competent as in Tauch et al. (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362). , The plasmid pEKEx3-argR containing the Seq. No. 10 of Example 1 was, as also at Tauch et al. (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362). , introduced by electroporation with the Gene Pulser system of Bio-Rad into C. glutamicum ΔargR argB26argB31 and extended to BHIS ( FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299-303 ) containing 100 micro g per ml of spectinomycin. After isolation of the plasmid DNA with the QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), the clones were characterized by restriction digestion with EcoRI, EcoRV and PvuII. A positive clone was designated strain C. glutamicum ΔargR argB26argB31 pEKEx3-argR.

Beispiel 5Example 5

Transformation des L-Serin Produzenten Corynebacterium glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB.Transformation of the L-serine producer Corynebacterium glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB.

Als Ausgangsstamm wurde der L-Serin Produzent Corynebacterium glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB benutzt der bei Stolz et al. beschrieben ist (Appl. Environ Microbiol. 2007; 73 (3): 750) . Dieser Stamm leitet sich vom Wildtyp ab, und enthält die zwei chromosomalen Deletionen ΔpabABC und ΔsdaA sowie auf einem Plasmid die Serinsynthesegene serACB, die bewirken, dass der Stamm L-Serin ausscheidet. Zellen von C. glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB wurden kompetent gemacht, wie bei Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) . Das Plasmid pEKEx2-bar-SP enthaltend die Seq. Nr. 11 aus Beispiel 2, wurde wie ebenfalls bei Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) , durch Elekroporation mit dem Gene Pulser System von Bio-Rad in C. glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB eingeführt und auf BHIS ( FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299–303 ) welches 50 micro g pro ml Kanamycin enthielt ausplattiert. Nach Isolation der Plasmid-DNA mit dem QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) wurden die Klone mittels Restriktionsverdau mit SalI oder XbaI charakterisiert. Ein positiver Klon wurde als Stamm C. glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2-bar-SP bezeichnet.The starting strain used was the L-serine producer Corynebacterium glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB Stolz et al. Environ Microbiol., 2007; 73 (3): 750). , This strain is derived from the wild type and contains the two chromosomal deletions ΔpabABC and ΔdaA as well as on one plasmid the serine synthase serACB, which cause the strain to excrete L-serine. Cells of C. glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB were made competent as in Tauch et al. (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362). , The plasmid pEKEx2-bar-SP containing the Seq. No. 11 from Example 2, as well as at Tauch et al. (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362). , introduced by electroporation with the Gene Pulser system of Bio-Rad into C. glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB and extended to BHIS ( FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299-303 ) containing 50 micro g per ml of kanamycin. After isolation of the plasmid DNA with the QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), the clones were characterized by restriction digestion with SalI or XbaI. One positive clone was designated strain C. glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2-bar-SP.

Beispiel 6Example 6

Bildung von D-Lysin.Formation of D-lysine.

C. glutamicum DM1800 pEKEx3-argR und der Ausgangsstamm C. glutamicum DM1800 mit dem Leervektor pEKEx3 wurde in einem für die D-, L-Lysinbildung geeigneten Nährmedium angezogen und die D-Lysinakkumulation im Medium bestimmt.C. glutamicum DM1800 pEKEx3-argR and the starting strain C. glutamicum DM1800 with the empty vector pEKEx3 was grown in a nutrient medium suitable for D, L-lysine formation and the D-lysine accumulation in the medium was determined.

Zu diesem Zweck wurde DM1800 pEKEx3-argR und DM1800 pEKEx3 auf BHI (Brain Heart Infusion, Difco laboratories, Detroit, Michigan, USA) Agarplatten die 100 micro g pro ml Spectinomycin enthielten über Nacht bei 30°C inkubiert. Ausgehend von dieser Platte wurde eine CGIII Vorkultur ( Menkel et al., Appl. Environ Microbiol. 1989; 55 (3): 684 ) beimpft (50 ml Medium in einer 500 ml Erlenmeyer Flasche). Diese Vorkultur wurde 17 Stunden bei 30°C auf einem Schüttler bei 120 UpM inkubiert. Hiervon ausgehend wurde die Hauptkultur beimpft. Dazu wurden Zellen der Vorkultur entnommen, durch Zentrifugation pelletiert und in 0.9% (w/v) NaCl aufgenommen. Mit dieser Suspension wurde die Hauptkultur in CGXII beimpft, sodass die Anfangs OD (600 nm) 1 betrug. Das Medium CGXII ist bei Eggeling and Reyes pp535–566 in Handbook of Corynebacterium glutamicum beschrieben ( Eggeling and Bott, eds, Taylor & Francis, Boca Rota, London, Singapore, 2005 ).For this purpose, DM1800 pEKEx3-argR and DM1800 pEKEx3 on BHI (Brain Heart Infusion, Difco laboratories, Detroit, Michigan, USA) agar plates containing 100 micro g per ml of spectinomycin were incubated overnight at 30 ° C. Starting from this plate, a CGIII preculture ( Menkel et al., Appl. Environ Microbiol. 1989; 55 (3): 684 ) (50 ml of medium in a 500 ml Erlenmeyer flask). This preculture was incubated for 17 hours at 30 ° C on a shaker at 120 rpm. From this, the main culture was inoculated. For this purpose, cells of the preculture were removed, pelleted by centrifugation and taken up in 0.9% (w / v) NaCl. With this suspension, the main culture was inoculated into CGXII so that the initial OD (600 nm) was 1. The medium CGXII is described in Eggeling and Reyes pp535-566 in Handbook of Corynebacterium glutamicum ( Eggeling and Bott, Eds, Taylor & Francis, Boca Rota, London, Singapore, 2005 ).

Nach 48 Stunden wurden Proben zur D-, L-Lysinbestimmung entnommen. Die quantitative Bestimmung erfolgte durch Vorsäulenderivatisierung mittels Boc-L-Cystein (BocC) und o-Phthdialaldehyd zu fluoreszierenden Isoindolderivaten, wie bei Buck und Krummen beschrieben ( J Chromatogr 1987; 387: 255–265 ). Die Trennung und Quantifizierung der D- und L-Enantiomere erfolgte mittels Hochdruckflüssigchromatographie und einem Gradienten, bestehend aus 0,1 M NaAcetat pH 7,2 und Methanol auf einem Agilent LC1100 HPLC System (Agilent, Waldbronn, Germany). Als Trennsäule wurde LiChrospher 100 RP18 Ec-5μ benutzt (CS-Chromatographie, Langerwehe, Deutschland). Die erhaltene D-Lysinkonzentration ist in Tabelle 1 wieder gegeben. Tabelle 1: Stamm D-Lysin (mM) DM1800 pEKEx3 0,00 DM1800 pEKEx3-argR 36,61 After 48 hours, samples were taken for D, L-lysine determination. The quantitative determination was carried out by pre-column derivatization using Boc-L-cysteine (BocC) and o-phthaldehyde to fluorescent isoindole derivatives, as described in Buck and Krummen ( J Chromatogr 1987; 387: 255-265 ). The separation and quantification of the D and L enantiomers was carried out by high pressure liquid chromatography and a gradient consisting of 0.1 M NaAcetat pH 7.2 and methanol on an Agilent LC1100 HPLC system (Agilent, Waldbronn, Germany). The separation column used was LiChrospher 100 RP18 Ec-5μ (CS chromatography, Langerwehe, Germany). The D-lysine concentration obtained is given in Table 1 again. Table 1: tribe D-lysine (mM) DM1800 pEKEx3 0.00 DM1800 pEKEx3-argR 36.61

Beispiel 7 Example 7

Bildung von D-Arginin.Formation of D-arginine.

Corynebacterium glutamicum ΔargR argB26argB31 pEKEx3-argR aus Beipiel 4 und der Ausgangsstamm C. glutamicum ΔargR argB26argB31, transformiert mit dem Leervektor pEKEx3, wurde in einem für die D-, L-Argininbildung geeigneten Nährmedium angezogen und die D-Argininakkumulation im Medium bestimmt.Corynebacterium glutamicum ΔargR argB26argB31 pEKEx3-argR from Example 4 and the starting strain C. glutamicum ΔargR argB26argB31, transformed with the empty vector pEKEx3, was grown in a nutrient medium suitable for D, L-arginine formation and the D-arginine accumulation in the medium was determined.

Zu diesem Zweck wurde C. glutamicum ΔargR argB26argB31 pEKEx3-argR und C. glutamicum ΔargR argB26argB31, wie in Beispiel 6 beschrieben, inkubiert und kultiviert. Nach 48 Stunden wurden Proben zur D-, L-Argininbestimmung entnommen. Die Probenahme und Bestimmung erfolgte, wie in Beispiel 6 beschrieben. Die erhaltene D-Argininkonzentration ist in Tabelle 2 wieder gegeben. Tabelle 2: Stamm D-Arginin (mM) ΔargR argB26argB31 pEKEx3 0,00 ΔargR argB26argB31 pEKEx3-argR 24,05 For this purpose, C. glutamicum ΔargR argB26argB31 pEKEx3-argR and C. glutamicum ΔargR argB26argB31 were incubated and cultured as described in Example 6. After 48 hours, samples were taken for determination of D, L-arginine. The sampling and determination was carried out as described in Example 6. The D-arginine concentration obtained is given in Table 2 again. Table 2: tribe D-arginine (mM) ΔargR argB26argB31 pEKEx3 0.00 ΔargR argB26argB31 pEKEx3-argR 24.05

Beispiel 8Example 8

Bildung von D-, L-Serin-Formation of D, L-serine

Corynebacterium glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2-bar-SP aus Beipiel 5 und der Ausgangsstamm C. glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2 transformiert mit dem Leervektor pEKEx2 wurden in einem für die D-, L-Serinbildung geeigneten Nährmedium angezogen und die D-Serinakkumulation im Medium bestimmt.Corynebacterium glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2-bar-SP from example 5 and the starting strain C. glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2 transformed with the empty vector pEKEx2 were grown in a nutrient medium suitable for D, L-serine formation and the D-serin accumulation in the medium was determined.

Zu diesem Zweck wurden C. glutamicumΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2-bar-SP und C. glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2, wie in Beispiel 6 beschrieben, inkubiert und kultiviert. Nach 48 Stunden wurden Proben zur D-, L-Serinbestimmung entnommen. Die Probenahme und Bestimmung erfolgte, wie in Beispiel 6 beschrieben. Die erhaltene D-Serinkonzentration ist in Tabelle 3 wieder gegeben. Tabelle 3: Stamm D-Serin (mM) ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2 0,00 ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2-bar-SP 6,29 For this purpose, C. glutamicumΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2-bar-SP and C. glutamicum ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2 were incubated and cultured as described in Example 6. After 48 hours, samples were taken for D, L-serine determination. The sampling and determination was carried out as described in Example 6. The obtained D-serine concentration is given in Table 3 again. Table 3: tribe D-serine (mM) ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2 0.00 ΔpabABCΔsdaA pserACB pEKEx2-bar-SP 6.29

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.This is followed by a sequence protocol according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can be downloaded from the official publication platform of the DPMA.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list of the documents listed by the applicant has been generated automatically and is included solely for the better information of the reader. The list is not part of the German patent or utility model application. The DPMA assumes no liability for any errors or omissions.

Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • JP 2000253893 [0004] JP 2000253893 [0004]
  • JP 05091895 [0004] JP 05091895 [0004]
  • JP 64002594 [0004] JP 64002594 [0004]
  • JP 2008061642 (A) [0004] JP 2008061642 (A) [0004]
  • US 7186532 [0004] US 7186532 [0004]
  • WO 03/040373 [0035] WO 03/040373 [0035]
  • EP 2004/008882 [0048] EP 2004/008882 [0048]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007; 73 (6): 1299 [0024] Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007; 73 (6): 1299 [0024]
  • Appl. Environ Microbiol. 2009; 75 (15): 5161 [0024] Appl. Environ Microbiol. 2009; 75 (15): 5161 [0024]
  • ”The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) [0030] "The DIG System Users Guide to Filter Hybridization" by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) [0030]
  • Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255–260 (1991)) [0030] Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)) [0030]
  • Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996 [0030] Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996. [0030]
  • Journal of Biotechnology 104 (1–3), 311–323 (2003) [0035] Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003) [0035]
  • Amann et al. (Gene 69 (2), 301–315 (1988)) [0035] Amann et al. (Gene 69 (2), 301-315 (1988)) [0035]
  • Amann und Brosius (Gene 40 (2–3), 183–190 (1985) [0035] Amann and Brosius (Gene 40 (2-3), 183-190 (1985) [0035]
  • Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549–554 [0036] Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554 [0036]
  • Journal of Biotechnology 99, 79–91 (2002) [0036] Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002) [0036]
  • Journal of Biotechnology 104, 27–40 (2003) [0036] Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003) [0036]
  • Phytochemistry 2006; 67 (9): 856; J Biol. Chem. 2002 18; 277 (42): 39070 [0047] Phytochemistry 2006; 67 (9): 856; J Biol. Chem. 2002 18; 277 (42): 39070 [0047]
  • Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 [0047] Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 [0047]
  • Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) [0048] Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) [0048]
  • Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994) [0048] Bioreactors and Peripheral Devices (Vieweg Verlag, Brunswick / Wiesbaden, 1994) [0048]
  • ”Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981 [0048] "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society of Bacteriology (Washington, DC, USA, 1981. [0048]
  • Phytochemistry 2006; 67 (9): 856; J Biol. Chem. 2002 18; 277 (42): 39070 [0049] Phytochemistry 2006; 67 (9): 856; J Biol. Chem. 2002 18; 277 (42): 39070 [0049]
  • Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 [0049] Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 [0049]
  • Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 [0072] Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045 [0072]
  • Gande et al., Journal of Bacteriology, 2007, p. 5257–5264, Vol. 189 [0075] Gande et al., Journal of Bacteriology, 2007, p. 5257-5264, Vol. 189 [0075]
  • Journal of Molecular Catalysis B, 58 (2009) 10–16 [0081] Journal of Molecular Catalysis B, 58 (2009) 10-16 [0081]
  • Eikmanns et al., 1991, Gene 102: 93–98 [0084] Eikmanns et al., 1991, Gene 102: 93-98 [0084]
  • Metab Eng. 2005; 7 (4): 291–301 [0089] Metab Eng. 2005; 7 (4): 291-301 [0089]
  • Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) [0089] Tauch et al. (Curr Microbiol 2002; 45 (5): 362) [0089]
  • Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) [0089] Tauch et al. (Curr Microbiol 2002; 45 (5): 362) [0089]
  • FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299–303 [0089] FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299-303 [0089]
  • Ikeda et al. beschrieben ist (Appl. Environ Microbiol. 2009; 75 (6): 1635) [0090] Ikeda et al. Environ Microbiol., 2009; 75 (6): 1635). [0090]
  • Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) [0090] Tauch et al. (Curr Microbiol 2002; 45 (5): 362) [0090]
  • Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) [0090] Tauch et al. (Curr Microbiol 2002; 45 (5): 362) [0090]
  • FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299–303 [0090] FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299-303 [0090]
  • Stolz et al. beschrieben ist (Appl. Environ Microbiol. 2007; 73 (3): 750) [0091] Stolz et al. Environ Microbiol., 2007; 73 (3): 750). [0091]
  • Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) [0091] Tauch et al. (Curr Microbiol 2002; 45 (5): 362) [0091]
  • Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362) [0091] Tauch et al. (Curr Microbiol 2002; 45 (5): 362) [0091]
  • FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299–303 [0091] FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299-303 [0091]
  • Menkel et al., Appl. Environ Microbiol. 1989; 55 (3): 684 [0093] Menkel et al., Appl. Environ Microbiol. 1989; 55 (3): 684 [0093]
  • Eggeling and Bott, eds, Taylor & Francis, Boca Rota, London, Singapore, 2005 [0093] Eggeling and Bott, Eds, Taylor & Francis, Boca Rota, London, Singapore, 2005 [0093]
  • J Chromatogr 1987; 387: 255–265 [0094] J Chromatogr 1987; 387: 255-265 [0094]

Claims (32)

Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, bei dem in einem eine L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismus eine L-Aminosäure produziert wird, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Mikroorganismus ein Aminosäureracemasegen gegenüber der Wildform des Mikroorganismus verstärkt exprimiert wird und eine durch den Mikroorganismus gebildete L-Aminosäure durch die durch die Expression des Aminosäureracemasegens gebildete Aminosäureracemase in die D-Aminosäure in vivo racemisiert wird, wonach die D-Aminosäure von der L-Aminosäure getrennt wird.A process for the preparation of D-amino acids in which an L-amino acid is produced in a microorganism producing an L-amino acid, characterized in that an amino acid racemase gene is more intensely expressed in the microorganism than the wild type of the microorganism and an L-amino acid formed by the microorganism Amino acid is racemized by the amino acid racemase formed by the expression of the Aminosäureacemasegens in the D-amino acid in vivo, after which the D-amino acid is separated from the L-amino acid. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Serinracemasegen, Glutamatracemasegen, Prolinracemasegen, Lysinracemasegen, Alaninracemasegen, Ornithinracemasegen, Argininracemasegen, Threoninracemasegen, Tryptophanracemasegen, Valinracemasegen, Isoleucinracemasegen und/oder Methioninracemasegen gegenüber der Wildform verstärkt exprimiert wird.A method according to claim 1, characterized in that a Serinracemasegen, Glutamatracemasegen, Prolinracemasegen, Lysinracemasegen, Alaninracemasegen, Ornithinracemasegen, Argininracemasegen, Threoninracemasegen, Tryptophanracemasegen, Valinracemasegen, Isoleucinracemasegen and / or Methioninracemasegen is increasingly expressed to the wild type. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Aminosäureracemasegen einer 90%igen Homologie der Aminosäureracemasegene nach den Sequenzen Nr. 1 bis 14 gegenüber der Wildform verstärkt exprimiert wird.Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that at least one amino acid racemase gene of a 90% homology of the Aminosäureacemasegene after the sequences Nos. 1 to 14 is expressed against the wild type amplified. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Aminosäureracemasegen nach den Sequenzen Nr. 1 bis 14 gegenüber der Wildform verstärkt exprimiert wird.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that at least one amino acid racemase gene is amplified according to the sequences Nos. 1 to 14 compared to the wild form. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Aminosäureracemasegen in das Genom des Mikroorganismus inseriert wird.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the amino acid racemase gene is inserted into the genome of the microorganism. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in den Mikroorganismus ein Vektor, der mindestens ein Aminosäureracemasegen beinhaltet, eingebracht wird.Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that in the microorganism, a vector which contains at least one amino acid racemase gene is introduced. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor nach Seq. 32 und/oder Seq. 33 in den Mikroorganismus eingebracht wird.A method according to claim 6, characterized in that a vector according to Seq. 32 and / or Seq. 33 is introduced into the microorganism. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine für eine Aminosäureracemase kodierende DNA ohne Signalsequenz eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that a coding for an amino acid acidase DNA without signal sequence is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der gegenüber seiner Wildform verstärkt eine L-Aminosäure produziert.Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that a microorganism is used which increasingly produces an L-amino acid compared to its wild form. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus ein Enterobakterium oder ein coryneformes Bakterium eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that an enterobacterium or a coryneform bacterium is used as the microorganism. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus ein Escherichia coli oder ein Corynebakterium glutamicum eingesetzt wird.A method according to claim 10, characterized in that the microorganism used is an Escherichia coli or a Corynebacterium glutamicum. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet dass ein Mikroorganismus aus der Gruppe bestehend aus L-Lysin Produzenten, L-Arginin oder L-Citrullin Produzenten, L-Serin Produzenten, L-Methionin Produzenten, L-Valin Produzenten, L-Glutamate Produzenten, L-Threonin Produzenten, L-Isoleucin Produzenten und L-Tryptophan Produzenten eingesetzt wird.Method according to one of claims 10 or 11, characterized in that a microorganism from the group consisting of L-lysine producers, L-arginine or L-citrulline producers, L-serine producers, L-methionine producers, L-valine producers, L- Glutamate producers, L-threonine producers, L-isoleucine producers and L-tryptophan producers is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der bereits in seiner Wildform ein Aminosäureracemasegen beinhaltet, das gegenüber der Wildform überexprimiert wird oder das gegenüber der Wildform in einer erhöhten Kopienzahl vorliegt.Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that a microorganism is used, which already contains in its wild form an amino acid racemase gene, which is overexpressed in relation to the wild type or which is present in an increased copy number compared to the wild form. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des Aminosäureracemasegens durch die Verwendung von gegenüber der Wildform verstärkten Promotoren erhöht wird.Process according to any one of Claims 1 to 13, characterized in that the activity of the amino acid racemase gene is increased by the use of wild-type promoters. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das durch die Aktivität der aus der Expression resultierenden Aminosäureracemase gebildete Racemat dadurch getrennt wird, dass eine Verstoffwechselung der L-Aminosäure erfolgt und die D-Aminosäure isoliert wird. Process according to any one of Claims 1 to 14, characterized in that the racemate formed by the activity of the amino acid racemate resulting from the expression is separated by metabolizing the L-amino acid and isolating the D-amino acid. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung des durch die Aktivität der aus der Expression resultierenden Aminosäureracemase gebildete Racemats, durch bevorzugte Sekretion der D-Aminosäure erfolgt.Method according to one of claims 1 to 15, characterized in that the separation of the racemate formed by the activity of resulting from the expression of the resulting amino acid racemate, takes place by preferential secretion of the D-amino acid. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er eine gegenüber seiner Wildform erhöhte Zahl an für eine Aminosäureracemase kodierende Gene umfasst oder dass er in seiner Wildform ein Aminosäureracemasegen umfasst, dessen Promotor gegenüber der Wildform verstärkt ist.Microorganism, characterized in that it comprises a number of genes coding for an amino acid racemase compared to its wild-type or that it comprises in its wild form an amino acid racemase gene whose promoter is enhanced in relation to the wild form. Mikroorganismus nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass in sein Genom ein für eine Aminosäureracemase kodierendes Gen inseriert ist.Microorganism according to Claim 17, characterized in that a gene coding for an amino acid racemase is inserted into its genome. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Vektor umfassend ein für eine Aminosäureracemase kodierendes Gen enthält.Microorganism according to one of claims 17 or 18, characterized in that it contains a vector comprising a gene coding for an amino acid racemase. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens ein Serinracemasegen, Glutamatracemasegen, Prolinracemasegen, Lysinracemasegen, Alaninracemasegen, Ornithinracemasegen, Argininracemasegen, Threoninracemasegen, Tryptophanracemasegen, Valinracemasegen, Isoleucinracemasegen und/oder Methioninracemasegen in einer größeren Menge gegenüber der Wildform enthält.Microorganism according to one of claims 17 to 19, characterized in that it contains at least one Serinracemasegen, Glutamatracemasegen, Prolinracemasegen, Lysinracemasegen, Alaninracemasegen, Ornithinracemasegen, Argininracemasegen, Threoninracemasegen, Tryptophanracemasegen, Valinracemasegen, Isoleucinracemasegen and / or Methioninracemasegen in a greater amount compared to the wild type. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens ein Aminosäureracemasegen einer 90%igen Homologie der Racemasegene nach den Sequenzen Nr. 1 bis 14 in einer größeren Menge gegenüber der Wildform verstärkt enthält.Microorganism according to one of claims 17 to 20, characterized in that it contains at least one Aminosäureureracemasegen a 90% homology of the racemase genes according to the sequences Nos. 1 to 14 in an increased amount compared to the wild-type amplified. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens ein Aminosäureracemasegen nach den Sequenzen Nr. 1 bis 14 in einer gegenüber der Wildform erhöhten Menge enthält.Microorganism according to one of claims 17 to 21, characterized in that it contains at least one amino acid racemase gene according to sequences Nos. 1 to 14 in a wild-type increased amount. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Vektor nach Sequenz 32 und/oder 33 ist.Microorganism according to one of claims 17 to 22, characterized in that the vector is a vector according to sequence 32 and / or 33. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass er keine Signalsequenz für das Aminosäureracemasegen umfasst.Microorganism according to one of claims 17 to 23, characterized in that it does not comprise a signal sequence for the amino acid racemase gene. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Enterobakterium oder ein coryneformes Bakterium ist.Microorganism according to one of claims 17 to 24, characterized in that it is an enterobacterium or a coryneform bacterium. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 17 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Mikroorganismus aus der Gruppe bestehend aus L-Lysin Produzenten, L-Arginin oder L-Citrullin Produzenten, L-Serin Produzenten, L-Methionin Produzenten, L-Valin Produzenten, L-Glutamate Produzenten, L-Threonin Produzenten, L-Isoleucin Produzenten und L-Tryptophan Produzenten ist.Microorganism according to one of claims 17 to 25, characterized in that it contains a microorganism from the group consisting of L-lysine producers, L-arginine or L-citrulline producers, L-serine producers, L-methionine producers, L-valine producers, L-glutamate producers, L-threonine producers, L-isoleucine producers and L-tryptophan producers is. Vektor enthaltend ein für eine Aminosäureracemase kodierendes Gen.Vector containing a gene coding for an amino acid racemase. Vektor nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Aminosäureracemasegen ein Gen aus der Gruppe Serinracemasegen, Glutamatracemasegen, Prolinracemasegen, Lysinracemasegen, Alaninracemasegen, Ornithinracemasegen, Argininracemasegen, Threoninracemasegen, Tryptophanracemasegen, Valinracemasegen, Isoleucinracemasegen und/oder Methioninracemasegen ist.Vector according to claim 27, characterized in that the amino acid racemase gene is a gene from the group serinracemase gene, glutamate racemase gene, proline racemase gene, lysine racemase gene, alanine racemase gene, ornithine racemase gene, arginine racemase gene, threonine racemase gene, tryptophan racemase gene, valine racemase gene, isoleucine racemase gene and / or methionine racemase gene. Vektor nach einem der Ansprüche 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Aminosäureracemasegen einer 90%igen Homologie der Racemasegene nach den Sequenzen Nr. 1 bis 14 enthält.Vector according to one of claims 27 or 28, characterized in that it contains an amino acid racemase gene with a 90% homology of the racemase genes according to sequences Nos. 1 to 14. Vektor nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Aminosäureracemasegen nach den Sequenzen Nr. 1 bis 14 enthält.Vector according to one of claims 27 to 29, characterized in that it contains an amino acid racemase gene according to sequences Nos. 1 to 14. Vektor nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass das Aminosäureracemasegen keine Signalsequenz enthält. Vector according to one of claims 27 to 30, characterized in that the amino acid racemase gene contains no signal sequence. Vektor nach einem der Ansprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Vektor nach Sequenz Nr. 32 oder 33 ist.Vector according to one of claims 27 to 31, characterized in that it is a vector according to sequence no. 32 or 33.
DE102010025124A 2010-06-25 2010-06-25 Process for the preparation of D-amino acids, microorganism, and vector Withdrawn DE102010025124A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102010025124A DE102010025124A1 (en) 2010-06-25 2010-06-25 Process for the preparation of D-amino acids, microorganism, and vector

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102010025124A DE102010025124A1 (en) 2010-06-25 2010-06-25 Process for the preparation of D-amino acids, microorganism, and vector

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102010025124A1 true DE102010025124A1 (en) 2011-12-29

Family

ID=44583895

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102010025124A Withdrawn DE102010025124A1 (en) 2010-06-25 2010-06-25 Process for the preparation of D-amino acids, microorganism, and vector

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE102010025124A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108384818A (en) * 2018-05-18 2018-08-10 南京大学 A kind of method that enzymatic conversion method prepares D-His

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS642594A (en) 1987-06-22 1989-01-06 Toray Ind Inc Production of d-serine
JPH0591895A (en) 1991-08-12 1993-04-16 Mitsubishi Petrochem Co Ltd Production of d-serine
JP2000253893A (en) 1999-03-09 2000-09-19 Mitsui Chemicals Inc Production of d-serine
WO2003040373A2 (en) 2001-08-06 2003-05-15 Degussa Ag Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
WO2005021772A1 (en) 2003-08-29 2005-03-10 Degussa Ag Process for the preparation of l-lysine
US7186532B2 (en) 2000-11-01 2007-03-06 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing D-serine
JP2008061642A (en) 2006-08-10 2008-03-21 Toyobo Co Ltd Method for producing d-amino acid

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS642594A (en) 1987-06-22 1989-01-06 Toray Ind Inc Production of d-serine
JPH0591895A (en) 1991-08-12 1993-04-16 Mitsubishi Petrochem Co Ltd Production of d-serine
JP2000253893A (en) 1999-03-09 2000-09-19 Mitsui Chemicals Inc Production of d-serine
US7186532B2 (en) 2000-11-01 2007-03-06 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing D-serine
WO2003040373A2 (en) 2001-08-06 2003-05-15 Degussa Ag Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
WO2005021772A1 (en) 2003-08-29 2005-03-10 Degussa Ag Process for the preparation of l-lysine
JP2008061642A (en) 2006-08-10 2008-03-21 Toyobo Co Ltd Method for producing d-amino acid

Non-Patent Citations (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981
"The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993)
Amann et al. (Gene 69 (2), 301-315 (1988))
Amann und Brosius (Gene 40 (2-3), 183-190 (1985)
Appl. Environ Microbiol. 2009; 75 (15): 5161
Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007; 73 (6): 1299
Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 83 (6): 1045
BECHTHOLD, M.: Integrated operation of enzymatic racemisation and chiral simulated moving bed technology. 2007. Dissertaion eingereicht bei der ETH Zürich Diss. ETH NO. 17111 *
Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)
CACERES, N. E.: HARRIS, N. B.: [u.a.]: Overexpression of the D-alanin racemace gene confers resistance to D-cycloserine in Mycobacterium smegmatis. 1997. In: Journal of Bacteriology, Vol. 179, S. 5046-5055 *
Eggeling and Bott, eds, Taylor & Francis, Boca Rota, London, Singapore, 2005
Eikmanns et al., 1991, Gene 102: 93-98
FEMS Microbiol. Lett. 1989; 53 (3): 299-303
Gande et al., Journal of Bacteriology, 2007, p. 5257-5264, Vol. 189
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)
Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996
Ikeda et al. beschrieben ist (Appl. Environ Microbiol. 2009; 75 (6): 1635)
J Chromatogr 1987; 387: 255-265
Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003)
Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)
Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)
Journal of Molecular Catalysis B, 58 (2009) 10-16
Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991))
Menkel et al., Appl. Environ Microbiol. 1989; 55 (3): 684
Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554
Metab Eng. 2005; 7 (4): 291-301
Phytochemistry 2006; 67 (9): 856; J Biol. Chem. 2002 18; 277 (42): 39070
Stolz et al. beschrieben ist (Appl. Environ Microbiol. 2007; 73 (3): 750)
Tauch et al. beschrieben (Curr Microbiol. 2002; 45 (5): 362)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108384818A (en) * 2018-05-18 2018-08-10 南京大学 A kind of method that enzymatic conversion method prepares D-His

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7156594B2 (en) Preparation of (R)-3-hydroxybutyric acid or its salts by one-step fermentation
EP2726615B1 (en) Variants of the promoter of the gap gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
EP2811028B1 (en) Process for producing L-valine employing recombinant Corynebacteria comprising the propionate-inducible ilvBN operon
EP2041276B1 (en) Method for producing l-amino acids by means of mutants of the glta gene coding for citrate synthase
EP2354235B1 (en) Method for the fermentative production of L-amino acids involving the use of coryneform bacteria
DE102010003419A1 (en) Process for the fermentative production of L-ornithine
EP2121899A1 (en) Process for production of cadaverine by fermentation
WO2014029592A1 (en) Method for the fermentative production of l-amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
DE102004013503A1 (en) Process for producing L-amino acids using coryneform bacteria
EP1767616A2 (en) Method for producing L-amino acids or ketoacids employing coryneform bacteria with attenuated aceE (pdhA) expression
EP2089525B1 (en) Allels of the oxyr gene of coryneform bacteria
EP1756279A1 (en) Method for producing l-amino acids by means of recombinant coryneform bacteria with reduced activity asur regulators
EP1924694B1 (en) Method for producing amino acids using micro-organisms
DE102004009454A1 (en) Fermentative production of L-amino acids, especially methionine, useful e.g. in animal nutrition, by culturing bacteria in which components of the methionine uptake system are suppressed
DE10162729A1 (en) Alleles of the sigA gene from coryneform bacteria
DE102016007810B4 (en) Process for producing D-xylonate
DE102006050489A1 (en) Coryneform bacterium mutant useful for amino acid production comprises a gene coding for a 2-methylcitrate dehydratase polypeptide with an amino acid other than proline at position 272
EP1659174A2 (en) Alleles of the mtK gene from coryneform bacteria
EP1841859B1 (en) Alleles of the mqo-gene from coryneform bacteria
DE10144493A1 (en) Process for the fermentative production of L-amino acids using coyneform bacteria
EP1601773A2 (en) Nucleotide sequences of coryneform bacteria coding for proteins involved in l-serine metabolism and method for producing l-serine
DE102010025124A1 (en) Process for the preparation of D-amino acids, microorganism, and vector
DE10210527A1 (en) Alleles of the aceA gene from coryneform bacteria
DE10044831A1 (en) Improved process for the microbial production of L-serine and a suitable genetically modified microorganism
KR20120098235A (en) Microorganism producing unnatural amino acids and the method of producing unnatural amino acids using the microorganism

Legal Events

Date Code Title Description
R120 Application withdrawn or ip right abandoned

Effective date: 20111201