DE10313291A1 - Mediumzusammensetzung für das Tissue engineering vaskularisierter Gewebe und von Blutgefäßen - Google Patents

Abstract

Es wird eine Zellkulturmediumzusammensetzung beschrieben, die geeignet ist, zur verbesserten Stabilisierung bzw. zum Erhalt eines kapillarartigen Netzwerks beim in vitro Tissue engineering vaskularisierter Gewebe beizutragen. Dazu enthält die Mediumzusammensetzung Somatotropin (Wachstumshormon).

Description

• Die Erfindung betrifft eine Zellkulturmediumzusammensetzung, die geeignet ist, zur verbesserten Stabilisierung bzw. Erhalt eines kapillarartigen Netzwerks beim in vitro Tissue engineering vaskularisierter Gewebe beizutragen.
• Standardmäßig werden Kiefer-Gesichtsdefekte heutzutage mit sogenannten mikrochirurgischen Lappenplastiken gedeckt. Das Spektrum umfaßt fasziokutane Lappen und Jejunumpatches für flache Defekte genauso wie muskuläre Lappen. Die kaufunktionelle Rehabilitation nach Ober- und Unterkieferteilresektion erfolgt mit knöchernen Transplantaten, wobei heutzutage auch hier der mikrochirurgisch revaskularisierte Transfer dominiert. Über 50 verschiedene Transplantattypen bzw. Varianten wurden bisher beschrieben (O'Brien, B. M., Morrison, W. A.: Reconstructive Microsurgery Churchill Livingstone, Edinburgh 1987; Manktelow, R. T.: Mikrovaskuläre Wiederherstellungschirurgie-Anatomie, Anwendung und chirurgische Technik. Berlin Heidelberg New York Tokyo, Springer 1988). Diese Fortschritte haben entscheidenden Einfluß auf die Verbesserung der Lebensqualität von Tumorpatienten gehabt. Es haften diesen Verfahren jedoch Nachteile an, die bislang nicht vollständig behoben sind. In erster Linie gilt dies für den Hebedefekt an der Entnahmestelle des Transplantats, der zu einer je nach Lokalisation mehr oder weniger ausgeprägten Morbidität führt.
• Die Verfahren zur artifiziellen Herstellung von Geweben oder Organen durch die Kombination spezifischer Zellkulturen mit resorbierbaren Gerüstsubstanzen für Transplantationszwecke werden unter dem Begriff "Tissue engineering" subsummiert (siehe Langer, R. et al.: Future directions in biomaterials. Biomaterials 11, 738–45, 1990, Cima, L. G. et al.: Tissue engineering by cell transplantation using degradable polymer substrates. J Biomech Eng 113, 143–51, 1991; Langer, R., Vacanti, J. P.: Artificial organs. Sci Am 273, 130–3, 1995). Wie sich aus den obigen Ausführungen ergibt, würde die Option eines mit den Methoden des Tissue engineering in vitro präformierten Transplantats auch für die plastisch-rekonstruktive Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie eine Reihe von Vorteilen erbringen, wie z.B. die Vermeidung oder Reduktion von Hebedefekten, eine Verkürzung der OP-Zeit oder die Optimierung der räumlichen Konfiguration des Transplantats. Fettgewebstransplantate zur Konturierung von Weichgewebsdefiziten oder knöcherne Transplantate könnten individualisiert "maßgeschneidert" werden, was bei den jetzigen Techniken noch ein Problem darstellt.
• Eine wesentliche Hürde beim in vitro Tissue engineering komplexer Gewebe, wie es Weichgewebs- und Knochentransplantate darstellen, besteht allerdings in einer ausreichenden Oxygenation und Ernährung auch größerer dreidimensionaler Gewebsformationen in vitro und später, nach Transplantation, in vivo. Die Versorgung per Diffusion vermag in vivo wie in vitro 150 μm Gewebedicke nicht zu überschreiten.
• Bislang gibt es keine ideale Lösung für die Vaskularisation größerer dreidimensionaler Gewebeäquivalente in vitro noch eine andere Lösung für das Problem der Oxygenation und Ernährung beim in vitro Tissue engineering. Dies mag einer der Gründe sein, warum vaskularisierte Gewebe in klinisch applikablen Tissue engineering Ansätzen bislang eine untergeordnete Rolle spielen. Die Ergebnisse der Vaskularisation durch sekundäres Einwachsen von Blutgefäße in solche Gewebsäquivalente sind begrenzt und lösen nicht das Problem der Ernährung und Oxygenation in der in vitro Phase des Tissue engineerings vor der Transplantation. In der Konzeption eines in vitro hergestellten Weichgewebetransplantates sind eine Vaskularisation oder ein Äquivalent für eine Vaskularisation notwendig, da die Ernährung über die Diffusion sowohl in vitro wie auch in vivo auf eine Strecke von wenigen hundert Mikrometern limitiert ist. Ein möglicher Weg für das Engineering dieser Gewebe könnte die Entwicklung eines vaskulären Stromas in vitro sein, das dann als Basis für die Differenzierung eines spezifischen Transplantatgewebes dienen kann. Es ist die Frage, inwiefern die Applikation der in vitro Angiogenese in einem Ansatz für das Engineering von Weichgewebe zu einem funktionell relevanten vaskulären Netzwerk beitragen kann und in Zukunft, inwiefern die in vitro Formation von kapillarartigen Strukturen zur Ernährung dreidimensionaler artifizieller Gewebskonstrukte beitragen kann.
• Ein hypothetischer Weg für das engineering vaskularisierter Gewebe könnte die Entwicklung eines vaskulären Stromas in vitro sein, das dann als Basis für ein differenziertes Gewebe dienen kann. Ein wesentliches Proben eines solchen "mikrovaskulären Tissue engineerings" ist die fehlende Stabilisierung und Erhaltung kapillarartiger Strukturen in vitro.
• In einer Publikation (Frerich, B., et al.: In vitro vascular stroma model for the engineering of vascularized tissues. Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 30, 414–20, 2001) konnte aufgezeigt werden, daß die Erhaltung kapillarartiger Strukturen durch Zusatz von IGF-1 verbessert werden kann. Es ist allgemein bekannt, daß Wachstumshormon anabole und wachstumssteigernde Effekte hat, die über die Expression von IGF-1 vermittelt werden. Die angiogenen Effekte von Wachstumshormon werden ebenfalls der Wirkung von IGF-1 zugeschrieben. In Kindern mit Wachstumshormonmangel z. B. ist die Vaskularisation der Retina signifikant vermindert (Hellström et al Reduced retinal vascularization in children with growth hormone deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab. 84, 795–8. 1999). in vivo-Experimente von Smith et al (Essential role of growth hormone in ischemia-induced retinal neovascularization. Science 276, 1706–9, 1997) zeigen, daß das Vaskularisationsdefizit der Retina von Ratten mit Wachstumshormonmangel durch Gabe von IGF-1 verhindert werden konnte. Wachstumshormon stimuliert die Expression von IGF-1 und IGFBP's (IGF binding proteins) auch in Kulturen von stromal vaskulären Zellen (Chen et al., Hormonal regulation of insulin-like growth factor binding proteins and insulin-like growth factor I (IGF-I) secretion in porcine stromal- vascular cultures. J. Anim. Sci. 74, 2369–751996, 1996). Gould et al. (Activity of anterior pituitary tissue and growth hormone on the chick embryo chorio-allantoic membrane: a novel action of GH. Life Sci. 56, 587-94. 1995) zeigte, daß eine angiogene Wirkung von Wachstumshormon im CAM-(chick embryo chorio-allantoic membrane) assay ohne gleichzeitigen Anstieg von IGF-1 verzeichnet wurde. In physiologischen Konzentrationen bewirkt humanes Wachstumshormon die Proliferation von mikrovaskulären Epithellzellen und ist auch angingen in vitro (Rymaszewski et al., Human growth hormone stimulates proliferation of human retinal microvascular endothelial cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 617–21. 1991). Humanes Wachstumshormon zeigt darüber hinaus anders als bei anderen Säugetierwachstumshormonen einen prolaktinähnlichen Effekt und es konnte gezeigt werden, daß die Mitglieder einer humanen Prolaktin-Wachstumshormonfamilie die Gefäßformierung stimulieren während das entsprechende 16-kDA N-terminale Fragment antiangiogen sowohl in vivo als auch in vitro wirkt (Struman et al., Opposing actions of intact and N-terminal fragments of the human prolactin/growth hormone family memebers on angiogenesis: An efficient mechanism for the regulation of angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 1246–1251. 1999).
• Die Aufgabenstellung der Erfindung besteht darin, eine Mediumzusammensetzung für das Tissue engineering vaskularisierter Gewebe und Blutgefäße aufzuzeigen, die zur Stabilisierung (im Sinne der Rekrutierung von Perizyten und glatten Muskelzellen sowie im Sinne des Erhalts der Netzwerkstruktur) beiträgt und die Erhaltung kapillarartiger Strukturen verbessert.
• Erfindungsgemäß wird im Anspruch 1 und in weiteren ausgestaltenden Ansprüchen 2 bis 4 eine Zellkuiturenmediumzusammensetzung beschrieben, mit der ein verbesserter Erhalt kapillarartiger Strukturen im Rahmen des Tissue engineerings möglich ist. Das Medium ist dadurch gekennzeichnet, daß es einen Zusatz von Somatotropin (Wachstumshormon) enthält. Besonders günstig ist eine Konzentration von 50 ng/ml. Es sind damit sowohl serumhaltige wie auch serumfreie Mediumformulierungen möglich, die sich beide dadurch auszeichnen, daß kapillarartige Strukturen in einem Tissue engineering Ansatz stabilisiert werden.
• Im Folgenden wird die Erfindung in Ausführungsbeispielen erläutert.
• Beispiel 1 – Formulierungsbeispiel für das Medium
• Iscove's mod. Dulbecco's Medium + Nutritient mixture Ham's F-12 werden im Verhältnis 1:1 angesetzt und mit Transferrin (2 bis 10 μg/ml), Insulin (5 bis 15 μg/ml), ggf. auch Hydrocortison 1 μg/ml. Serumzusatz ist bis 10% möglich, z.B. mit FKS (fetalem Kälberserum) oder NKS (Neugeborenen Kälberserum), aber auch serumfreie Formulierung mit Albuminzusatz von mind. 0,5% oder für dynamische Kultivierung z.B. unter Perfusionsbedingungen mit Dextranzusatz. Alternativ können auch vergleichbare Mediumformulierungen eingesetzt werden, die sich für die Endothelzellkultur eignen. Dazu wird humanes Somatotropin (Wachstumshormon = human growth hormone, hGH) gegeben, z.B. von Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland in einer Konzentration zwischen 5 und 500 ng pro ml.
• Beispiel 2 – Beispiele für Somatotropin-Wirkung im Zusammenhang mit Stabilisierung kapillarartiger Strukturen
• Für den experimentellen Nachweis der Somatotropin-Wirkung im Rahmen des Tissue engineerings wurden dreidimensionale Kulturen in Transwelleinsätzen zusammengesetzt (Corning Costar, Cambridge, Ma, USA). Der Boden dieser Einsätze wird von einer porösen Polycarbonatmembran gebildet, wobei die Poren einen Durchmesser von 12 μm besitzen. Die Untersuchungen wurden an einem vereinfachten Gewebemodell durchgeführt, das im Wesentlichen aus Fettgewebsstromazellen und humanen umbilikalen venösen Endothelzellen bestand. Dextranmicrocarrier dienten in diesem vereinfachten Modell als ein Ersatz für z. B. ein resorbierbares Gerüstmaterial. Dicht bewachsene Mikrocarrier (bei dichter Packung 4 ml) wurden von den Rührkulturflaschen entnommen und zentrifugiert, um überschüssiges Medium zu entfernen. Humane umbilikale Endothelzellen wurden trypsiniert und zentrifugiert. Das Pellet wurde in Thrombinlösung resuspendiert und mit den Mikrocarriern vermischt. Diese Fibrinlösung war vorher mit einem konstanten Gemisch angiogener Wachstumsfaktoren (VEGF, bFGF, EGF) supplementiert worden. Sechs Stunden nach der Polymerisation wurden die Fibringele zusätzlich mit einer Schicht aus Endothelzellen sowohl auf der Ober- wie auf der Unterfläche besiedelt. Danach wurden die Einsätze in die Multiwellplatten zurückgesetzt und mit serumfreiem Kulturmedium bedeckt. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Vier experimentelle Serien wurden kultiviert mit unterschiedlichen hGH-Konzentrationen im Medium von 0,5 ng/ml, 5 ng/ml, 50 ng/ml und 500 ng/ml.
• Die Ausmessung der Formation kapillarartiger Strukturen wurde über UEA-TRITC-Markierung und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie durchgeführt. Die Länge positiver kapillarartiger Strukturen wurde interaktiv an einem Bildauswertungssystem ausgemessen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe führte der Zusatz von hGH zu einem Anwachsen der Länge kapillarartiger Strukturen. Dieser Effekt schien auch dosisabhängig zu sein. Mit steigender Dosierung von 0,5 ng/ml über 5 ng/ml bis zu 50 ng/ml wurden höhere Werte für die Gesamtlänge kapillarartiger Strukturen pro Volumeneinheit erreicht (1). Die besten Resultate wurden erreicht mit einer Dosierung von 50 ng/ml. Der Abfall vom achten bis zum 32-ten Tag war deutlich flacher im Vergleich zu dem bei der 0,5 ng-Gruppe und der 5 ng-Gruppe. Dieser Umstand eines flacheren Abfalls der Kurven wurde als verbesserte Stabilisierung bzw. Erhaltung kapillarartiger Strukturen über den zeitlichen Verlauf interpretiert. Eine weitere Steigerung der Dosierung von 500 ng/ml zeigte keine weitere Verbesserung.
• Beispiel 4 – Verbesserung der Vernetzung kapillarartiger Strukturen in Somatotropin-supplementierten Kulturen
• Die Vernetzung kapillarartiger Strukturen und Remodellierungsprozeß werden durch HGH Zusatz verbessert. Die Kulturen, die mit 50 und 500 ng/ml HGH supplementiert worden waren, zeigten kapillarartige Strukturen in breiten irregulären Bändern mit dünnen Fortsetzungen in den ersten Tagen. Nach 16 Tagen war das Netzwerk weniger dicht aber homogener mit einem höheren Grad an Vernetzungen. Dieser Trend setzte sich bis zum 32-ten Tag fort mit homogen konfigurierten Strukturen ähnlich dem natürlichen Remodellierungsprozeß. In der Kontrollgruppe und in der 0,5 ng/ml-Gruppe wurde dieser Remodellierungsprozeß nicht in dem selben Ausmaß beobachtet. Um ein Ausmaß für den Grad der Vernetzung des kapillarartigen Netzwerks zu erhalten, wurde die relative Verteilung der Einzellängen miteinander verbunden nach Strukturen ausgewertet (2). Nach acht Tagen war selbst bei den Gruppen mit niedriger hGH Dosierung (0,5 und 5 ng/ml) die Länge der Einzelstrukturen höher als in der Kontrollgruppe. In der Interpretation bedeutet dies, daß ein höherer Vernetzungsgrad mit längeren miteinander verbundenen Strukturen bestand. Maximal war dieser Effekt in der 50 und 500 ng/ml-Gruppe. Aber nur bei einer Dosierung von 50 ng/ml zeigte die Längenverteilung nach 16 und 32 Tagen ansteigende Werte der Einzelstrukturen, was bedeutet, daß sich kleinere Strukturen zu größeren gefäßartigen Vernetzungen vereinigten.

Claims (4)

1. Mediumzusammensetzung für das Tissue engineering vaskularisierter Gewebe und von Blutgefäßen, die sich dadurch auszeichnet, daß die Zusammensetzung Somatotropin (Wachstumshormon) enthält.
2. Mediumzusammensetzung nach Anspruch 1, die sich dadurch auszeichnet, daß ein Grundmedium, das für die Endothelzellkultur geeignet ist und mit Insulin und Transferrin, eventuell auch Corticoiden supplementiert ist, und gegebenenfalls einen Albuminzusatz von mehr als 0,5% und einen Dextranzusatz aufweist, Somatotropin (Wachstumshormon) enthält.
3. Mediumzusammensetzung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Somatotropin in einer Konzentration von 5 bis 500 ng/ml enthalten ist.
4. Mediumzusammensetzung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Somatotropin in einer Konzentration von 50 ng/ml enthalten ist.