DE10251229A1

DE10251229A1 - Dithiolan-Derivate zur Immobilisierung von Biomolekülen auf Edelmetallen und Halbleitern

Info

Publication number: DE10251229A1
Application number: DE10251229A
Authority: DE
Inventors: Hartmut Seliger; Tobias Prokein
Original assignee: Universitaet Ulm
Current assignee: Universitaet Ulm
Priority date: 2002-03-05
Filing date: 2002-11-04
Publication date: 2003-09-25

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Dithiolan-Derivate der Formel A, DOLLAR F1 Konjugate aus den Dithiolan-Derivaten mit organisch-chemischen oder bilogisch-chemischen Molekülen, Verfahren zur Herstellung der Dithiolan-Derivate und der Konjugate, eine beschichtete Edelmetall- bzw. Halbleiter-Struktur, die ein Edelmetall-beschichtetes Substrat oder einen Halbleiterträger und ein darauf immobilisiertes Dithiolan-Derivat bzw. ein erfindungsgemäßes Konjugat umfasst, einen Biochip, der die erfindungsgemäße Edelmetall- oder Halbleiter-Struktur enthält sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivate zur Immobilisierung von organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekülen auf Edelmetalle, Edelmetalllegierungen oder Halbleitern.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Dithiolan-Derivate, Konjugate aus den Dithiolan- Derivaten mit organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekülen, Verfahren zur Herstellung der Dithiolan-Derivate und der Konjugate, eine beschichtete Edelmetall- bzw. Halbleiter-Struktur, die ein Edelmetall-beschichtetes Substrat oder einen Halbleiterträger und ein darauf immobilisiertes Dithiolan-Derivat bzw. ein erfindungsgemäßes Konjugat umfasst, einen Biochip, der die erfindungsgemäße Edelmetall- oder Halbleiter Struktur enthält sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivate zur Immobilisierung von organisch- chemischen oder biologisch-chemischen Molekülen auf Edelmetallen, Edelmetalllegierungen oder Halbleitern.

Die Chemie der Verankerung von biologisch-chemischen Molekülen, insbesondere Oligonukleotiden, an Oberflächen spielt eine entscheidende Rolle für viele analytische und biomedizinische Anwendungen. Dies gilt bspw. für die Herstellung von Oligonukleotid-Bibliotheken auf Flachmaterial-Trägern ("Oligonukleotid-Chips" bzw. "DNA-Mikroarrays" bzw. "Oligonukleotid-Mikroarrays"), die mittlerweile unentbehrliche Werkzeuge der modernen biomedizinischen Diagnostik geworden sind (Niemeyer et al. (1999) Angew. Chem. 19: 3039-3043), ebenso aber auch für Biomoleküle, die an andersartigen, bspw. partikelförmigen, insbesondere kugelförmigen Trägern immobilisiert sind. Dabei ist es nicht relevant, ob die Biomoleküle wie bspw. Oligonukleotide aus monomeren oder oligomeren Synthonen an der Oberfläche zusammengesetzt werden oder ob sie als bereits fertiggestellte Ketten der monomeren Einheiten, bspw. als Oligonukleotidketten, nach erfolgter Synthese auf die Oberfläche aufgebracht werden. Entscheidend ist jedoch, dass die Verankerung an der Oberfläche stabil und funktionsgerecht ist, d. h. dass bspw. gewährleistet ist, dass sich auch bei mehr- oder vielmaligem Gebrauch unter den Gebrauchsbedingungen die immobilisierten organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Moleküle, wie Oligonukleotide, Peptide usw., nicht ablösen. Andererseits ist es jedoch bei manchen Anwendungen erwünscht, dass das aufgepfropfte (immobilisierte) Molekül z. B. zum Zwecke der Analyse unter bestimmten Bedingungen auch abgespalten werden kann.

Im Stand der Technik sind bereits eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Herstellung von auf Glas, Kunststoffen und anderen nicht-metallischen Trägern aufgebrachten Biomolekülen, insbesondere Oligonukleotiden beschrieben worden (Wölfl (2000) BioChip-Technologien, Laborwelt, Transkript 3: 12-20). Von besonderem Interesse sind dabei u. a. Oligonukleotid-Chips auf Edelmetall-, vorzugsweise Gold- Oberflächen, aufgrund ihrer einfachen Handhabung und der Möglichkeit, sog. "Self-Assembled Monolayers" (SAM) zu erzeugen, die eine effiziente Kontrolle der Dichte der immobilisierten Moleküle ermöglichen, wodurch eine hohe Signalintensität erreicht werden kann. Diese SAM von organischen Molekülen auf Edelmetalloberflächen werden üblicherweise durch Reaktion mit Thiolen erzeugt (Bain et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 111: 321-335), die dann ihrerseits als Ankergruppen die Immobilisierung der gewünschten Moleküle wie bspw. Oligonukleotiden vermitteln (Herne et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 8916-8920).

Die Bindungsenergie der Wechselwirkung von elementarem Gold mit (Alkan-)Thiolen liegt in der Größenordnung von etwa 30 bis etwa 40 kcal/mol (Nuzzo et al. (1986) J. Am. Chem. Soc. 109: 2358-2368; Nuzzo et al. (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 558-569). Wesentlich stabiler sollte jedoch die Wechselwirkung von Gold und anderen Edelmetallen mit vicinalen Dithiol-Verbindungen sein, da sich hier die Bindungsenergie pro Molekül erhöht (Wang et al. (1998) J. Phys. Chem. B, 102: 9922-9927; Cheng et al. (1995) Anal. Chem. 67: 2767-2775).

Letsinger et al. (Bioconjugate Chem. 11: 289-291, 2000) beschreiben eine vicinale Dithiol-Verbindung und deren Wechselwirkung mit Goldoberflächen. Die Ankergruppe ist allerdings ein synthetisch nur schwer zugängliches Steroid-Derivat. Bei Verwendung derartiger, sterisch problematischer Gruppen ist es kaum möglich, auf der Edelmetalloberfläche SAM zu erzeugen, weshalb die in diesem Stand der Technik beschriebenen Verbindungen nicht zur Herstellung von Biochips verwendet wurden.

Im Stand der Technik sind einige Liponsäure-Konstrukte bekannt, die insbesondere zur Immobilisierug von Biomolekülen auf Goldoberflächen verwendet werden; vgl. z. B. Madoz et al. (1997) J. Am. Chem. Soc. 119: 1043-1051; Blonder et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120: 9335-9341; Stevenson et al. (2002) J. Nanosci. Nanotech. 2; 397-404; Kim et al. (2002) Langmuir 18: 1460-1462. Diese Liponsäure-Konjugate weisen jedoch deutliche Nachteile auf. U. a. muß das mit dem Liponsäure-Derivat zu konjugierende (Bio-)Molekül zunächst entsprechend derivatisiert werden, um es der Umsetzung mit dem Lipoylierungsreagenz zugänglich zu machen. Darüber hinaus ist es mit den bekannten Lipoylierungsreagenzien nicht möglich, Liponsäure-Reste unter Verwendung standardchemischer Verfahren in beliebige Amin- oder Hydroxyl-Gruppen einzuführen.

Holupirek (Dissertation, Universität Ulm, Sektion Polymere, 1976) beschreibt die Möglichkeit, Liponsäure als Substituent an Oligonukleotiden anzubringen und diesen Substituenten dazu zu benutzen, um aus dem Produktgemisch der Festphasensynthese das Ziel-Oligonukleotid über eine Affinitätschromatografie an Organoquecksilber-Säulen aufzureinigen. Das Verfahren erwies sich allerdings als nicht praktikabel, was insbesondere auf die nur sehr uneffiziente Einführung des Liponsäure-Rests in Oligonukleotide zurückzuführen war. Darüber hinaus war die Regeneration des lipoylierten Oligonukleotids nach der Affinitätsaufreinigung schwierig.

Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, zur Ausbildung von SAM auf Edelmetall- oder Halbleiteroberflächen besonders geeignete Verbindungen bereitzustellen, die sich in die zu immobilisierenden organisch-chemischen bzw. biologisch-chemischen Moleküle einfach und effizient einführen fassen. Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Dithiolan-Derivat der Formel A

bereitgestellt.

Im Dithiolan-Derivat der vorliegenden Erfindung ist ein Dithiolan-Ring kovalent über ein Brückenglied R¹ mit einer von einem Säurerest abgeleiteten Carbonyl- (X = O) oder Sulfonylfunktion (X = S) verbunden. Das Brückenglied R¹ muß nicht vorhanden sein, kann aber aus einer gegebenenfalls substituierten oder unsubstituierten aliphatischen oder heteroaliphatischen Kette, die gesättigt oder ungesättigt, geradkettig oder verzweigt sein kann, bestehen, aber auch ein aromatischer Rest sein oder aromatische Reste enthalten und wird typischerweise zwischen 0 und 20 C-Atome umfassen. Bevorzugte Brückenglieder sind bspw. entsprechende Ein- oder Mehrfach-Methylengruppen wie Methylen, Di-, Tri-, Tetra-, Penta- und Hexamethylen. Ein besonders bevorzugtes Brückenglied R¹ ist eine Tetramethylen-Gruppe.

Die dem Säurerest zugehörige Carbonyl- oder Sulfonylgruppe ist über eine Amid- (Y = NH) oder Esterbindung (Y = O) mit der Aminogruppe oder Hydroxyl-Gruppe eines Diol-Spacers verbunden.

Die Reste R² und R³ des Diol-Spacers können gleich oder unterschiedlich sein und sind grundsätzlich nicht besonders eingeschränkt. Sie können unabhängig voneinander aus aliphatischen und heteroaliphatischen Gruppen ausgewählt sein, die gesättigt oder ungesättigt, geradkettig oder verzweigt und/oder gegebenenfalls substituiert sein können und üblicherweise 1 bis 10 C-Atome umfassen. R² und R³ können jedoch auch entsprechende substituierte oder unsubstituierte aromatische Gruppen sein oder diese enthalten. Unter dem Gesichtspunkt der Ausbildung von SAM durch das erfindungsgemäße Dithiolan-Derivat bzw. daraus hergestellten Konjugaten auf entsprechenden Oberflächen, wie Edelmetallen, sind R¹, R² und R³ vorzugsweise derart gewählt, daß sich eine Anzahl an C- Atomen von der Dithiolan-Gruppe bis zur Gruppe -OR⁴ bzw. -OR⁵ von etwa 5 bis etwa 20 ergibt, wobei insbesondere als sterisch wenig problematische Gruppen entsprechende gesättigte aliphatische oder heteroaliphatische Gruppen bevorzugt sind. Der Rest R² des Diol-Spacers ist daher vorzugsweise aus (CH₂)n-Gruppen ausgewählt, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10, mehr bevorzugt 1 bis 5, ist. Besonders bevorzugt sind Spacer, bei denen R² Methylen (CH₂) ist. Der Rest R³ ist dementsprechend vorzugsweise aus (CH₂)_m-Gruppen ausgewählt, wobei m eine ganze Zahl von 1 bis 10, mehr bevorzugt 1 bis 5, ist. Besonders bevorzugt sind Spacer mit R³ = Methylen. Als Diol-Spacer besonders bevorzugt ist 3- Aminopropan-1,2-diol oder allgemein ein Spacer, bei dem R² und R³ Methylen sind.

Die Hydroxyl-Gruppen des Diol-Spacers im erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivat der obigen Formel A sind gleich oder unterschiedlich substituiert bzw. nicht substituiert. Daher können die Reste R⁴ und R⁵ erfindungsgemäß z. B. beide ein H-Atom oder eine säurelabile Schutzgruppe, bspw. Dimethoxytrityl oder eine verwandte Gruppe, sein. Vorzugsweise sind die Reste R⁴ und R⁵ unterschiedlich. Bei einer besonders bevorzugten Auführungsform, die sich beispielweise als Ausgangspunkt für eine weitere Derivatisierung zur Gewinnung besonders vorteilhafter Lipoylierungsreagenzien eignet, ist R⁴ H und R⁵ ist eine säurelabile Schutzgruppe ist oder umgekehrt (vgl. in diesem Zusammenhang die in Fig. 1 bis 3 gezeigten spezifischen Beispiele der Reaktionsschemata). Geeignete säurelabile Schutzgruppen, wie Dimethoxytrityl und ähnliche Gruppen, sind einem Fachmann bekannt und werden z. B. von Seliger in Beaucage et al. (Hrsg.) Current Protocols in Nucleic Acid and Chemistry, Vol. 1: 2.3.1-2.3.34, Wiley & Sons, New York, 2000, beschrieben. Der diesbezügliche Offenbarungsgehalt dieser Druckschrift ist hiermit vollumfänglich durch Bezugnahme in die vorliegende Erfindung aufgenommen. Derartige Schutzgruppen eignen sich insbesondere für Kopplungsreaktionen mit Nukleinsäuren wie Oligonukleotiden. Weitere Substituenten der Hydroxyl- Gruppen des Diol-Spacers sind Amino- und/oder Hydroxy Kopplungsgruppen. Derartige Kopplungsgruppen sind im Stand der Technik bekannt und sind entsprechend aktivierbare Reste, bspw. solche Reste, die zur Verankerung von Biomolekülen, insbesondere von Oligonukleotiden, aber auch niedermolekularen organisch-chemischen Molekülen, an Amino- oder Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Trägern wie bspw. entsprechenden Polymerträgern, z. B. Long-Chain Amino-CPG, insbesondere Aminopropyl-CPG, verwendet werden. Solche Kopplungsgruppen sind insbesondere Dicarbonylgruppen wie bspw. eine Succinyl-Gruppe. Andere Amino- und/oder Hydroxy-Kopplungsgruppen, die entsprechend der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendet werden, sind Phosporamidit-Gruppen, bspw. ein beta-Cyanoethoxy-diisopropylaminophosphan-Rest. Somit ermöglicht die Kopplungsgruppe als aktivierbarer Rest die Anknüpfung der Dithiolan-Brückenglied- Spacer Einheit an eine Hydroxyl- oder Aminogruppe.

Besonders bevorzugte Dithiolan-Derivate der vorliegenden Erfindung sind solche, bei denen R⁴ H oder eine säurelabile Schutzgruppe, bspw. eine Dimethoxytritylgruppe, ist und R⁵ eine Dicarbonyl-Gruppe, insbesondere eine Succinyl- Gruppe, ist. Es kann aber auch umgekehrt R⁵ H oder eine säurelabile Schutzgruppe sein und R⁴ eine Dicarbonyl-Gruppe sein. Besonders bevorzugte Ausführungsformen eines derartigen Dithiolan-Derivats sind derart ausgestattet, dass die Dicarbonyl-Gruppe, bspw. eine Succinyl-Gruppe, mit einem Polymerträger über eine Amid- oder Ester-Bindung verbunden ist. Ein derartiges besonders bevorzugtes Dithiolan-Derivat der vorliegenden Erfindung ist ein in der folgenden Formel I dargestellter Dithiolan-Modifier, in diesem Fall ein Liponsäure-Modifier:

Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform des Dithiolan-Derivats der vorliegenden Erfindung ist R⁴ in der obigen Formel A H oder wiederum eine säurelabile Schutzgruppe (z. B. eine Dimethoxytrityl-Gruppe) und R⁵ in der obigen Formel A eine Phosphoramidit-Gruppe, wobei die Substituenten R⁴ und R⁵ auch umgekehrt vorliegen können. Dabei ist ein N,N-Diisopropyl-betacyanoethoxyphosphoramidit als R⁵ bzw. R⁴ ganz besonders bevorzugt.

Eine spezifische Ausführungsform des Dithiolan-Derivats ist ein Liponsäuresubstituiertes Phosphoramidit-Reagenz der folgenden Formel:

Das erfindungsgemäße Dithiolan-Derivat eignet sich in hervorragender Weise zur Einführung von Dithiolan-Gruppen (mit angefügtem Brückenglied) in (niedermolekulare) organisch-chemische Verbindungen und biologisch-chemische Moleküle, welche Amino- und/oder Hydroxy-Gruppen aufweisen. Daher bildet einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Konjugat aus dem Dithiolan- Derivat gemäß vorstehender Definition und einem mindestens eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe enthaltenden organischen-chemischen oder biologisch- chemischen Molekül, das somit über die Amino- oder Hydroxyl-Gruppe die Gruppe -R⁴ oder die Gruppe -R⁵ in der obigen Formel A ersetzt.

Zu dieser erfindungsgemäßen Anwendung des Dithiolan-Derivats eignet sich das entsprechende Liponsäure-Derivat ganz besonders, da dieser Substituent, wenn er auf einer Edelmetalloberfläche, wie einer Goldoberfläche aufgebracht wird, eine hohe Bindungsenergie bereitstellt. Darüber hinaus bilden von Liponsäure abgeleitete Derivate der vorliegenden Erfindung besonders gut steuerbare SAM aus. Darüber hinaus ist Liponsäure als Ausgangsmaterial leicht und zu günstigem Preis zugänglich. Weiterhin handelt es sich bei dem Liponsäure-Substituenten um ein in der Natur vorkommendes biologisches Molekül, weshalb dieser Substituent bspw. bei medizinisch-therapeutischen oder medizinisch-diagnostischen Anwendungen von immobilisierten oder nicht-immobilisierten entsprechenden Konjugaten, bspw. Oligonukleotiden, insbesondere bei einer Antisense- oder Antigen- Therapie ein geringeres oder kein Toxizitätsrisiko darstellt. Selbstverständlich können aber auch andere Verbindungen, welche den charakteristischen Dithiolan- Rest aufweisen, als Substituent im erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivat und somit auch im erfindungsgemäßen Konjugat eingesetzt werden.

Unter dem organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekül im erfindungsgemäßen Konjugat ist generell jede derartiger Verbindungen zu verstehen, die mindestens eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe aufweist. Erfindungsgemäß ist unter dem organisch-chemischen Molekül bspw. eine niedermolekulare organisch-chemische Verbindung mit einem Molekulargewicht von bspw. < 1500 Da zu verstehen. Biologisch-chemische Moleküle im erfindungsgemäßen Konjugat sind insbesondere solche, die mindestens einen Anteil aufweisen, der aus einer natürlich vorkommenden Verbindung stammt. Bevorzugte biologisch-chemische Moleküle sind demnach Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, insbesondere Proteine, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Lipide und deren Bestandteile, insbesondere Fettsäuren, sowie Nukleinsäuren und deren Bestandteile, also Nukleoside, Nukleotide, Oligonukleotide und Polynukleotide. Selbstverständlich können ganz allgemein auch Mischformen der vorstehend genannten biologisch- chemischen Moleküle verwendet werden, bspw. Lipoproteine, Glykoproteine usw. Besonders bevorzugte biologisch-chemische Moleküle im erfindungsgemäßen Konjugat sind Nukleinsäuren und deren Bausteine, also Nukleoside, Nukleotide, Oligonukleotide und Polynukleotide. Dabei kann es sich sowohl um Desoxyribonukleotid-Spezies als auch um Ribonukleotid-Spezies sowie deren Mischformen handeln. Des weiteren können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Spezies einzelsträngig oder doppelsträngig oder sowohl einzelsträngig als auch doppelsträngig vorliegen. Darüber hinaus umfasst der Begriff Oligonukleotid bzw. Polynukleotid aber auch analoge Strukturen, wie bspw. Peptidnukleinsäuren. Somit sind im erfindungsgemäßen Konjugat auch alle möglichen Oligonukleotidanalogen Strukturen verwendbar, die gegenüber natürlich vorkommenden Molekülen mindestens eine chemische Modifikation aufweisen. Der Begriff "chemische Modifikation" bedeutet, dass die erfindungsgemäßen Konjugat enthaltende Nukleinsäure-Spezies durch Ersetzen, Anfügen oder Entfernen einzelner oder mehrerer Atome oder Atomgruppen im Vergleich zu natürlich vorkommenden Nukleinsäurespezies verändert ist.

Vorzugsweise ist die chemische Modifikation dabei derart ausgestaltet, dass die Nukleinsäure mindestens ein Analoges natürlich vorkommender Nukleotide enthält.

In einer keineswegs abschließenden Aufzählung können als Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Nukleotidanaloga Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnukleotide, Methylphosphonate, 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin und Inosin sowie 2'-Alkoxy-substituierte Ribonukleotid-Spezies genannt werden.

Im Fall des erfindungsgemäßen Konjugats aus dem Dithiolan-Derivat und den vorstehend Nukleosid/Nukleotid-Spezies (also Mononukleoside, Mononukleotide, Oligonukleotide und Polynukleotide) kann das Dithiolan-Derivat, insbesondere ein Liponsäure-Derivat, über das 5'-C-Atom des entsprechenden Nukleosids/Nukleotids bzw. über das endständige 5'-C-Atom des Oligo- oder Polynukleotids konjugiert sein (wobei das Nukleosid, Nukleotid, Oligo- oder Polynukleotid die Gruppe -OR⁵ in der obigen Formel A ersetzt) oder es kann über das 3'-C-Atom des Nukleosids/Nukleotids bzw. über das endständige 3'-C-Atom des Oligo- oder Polynukleotids konjugiert sein (wobei das Nukleosid, Nukleotid, Oligo- oder Polynukleotid die Gruppe -OR⁴ in der vorstehenden Formel A ersetzt).

Für die 3'-endständige Dithiolan-Konjugation von Nukleinsäure-Spezies eignet sich insbesondere ein Dithiolan-Derivat, wie ein entsprechendes Liponsäure- Derivat, das über eine entsprechende erfindungsgemäße Kopplungsgruppe an einen geeigneten Polymerträger gebunden ist. Ein besonders bevorzugtes Beispiel eines für die 3'-endständige Konjugation besonders geeigneten Dithiolan- Derivats ist in der obigen Formel I gezeigt.

Zur erfindungsgemäßen Konjugation eines Dithiolan-Derivats obiger Definition mit Biomolekülen, insbesondere Oligonukleotiden und Polynukleotiden, eignet sich besonders ein Dithiolan-substituiertes, vorzugsweise Liponsäuresubstituiertes, Phosphorigsäureester-Amidreagenz, das es ermöglicht, den Dithiolan-Rest, bspw. einen Liponsäure-Rest, terminal und/oder intern an jeder gewünschten Position von Oligonukleotidketten anzubringen. Somit können mit Hilfe der vorliegenden Erfindung entsprechende Moleküle, insbesondere Oligonukleotide, ein- oder mehrfach dithiolanyliert, insbesondere lipoyliert werden. Ein spezifisches Beispiel eines hierfür besonders geeigneten Dithiolan-Derivats der vorliegenden Erfindung ist in der obigen Formel II gezeigt.

Die erfindungsgemäßen Konjugate, z. B. lipoylierte Oligonukleotide, sind bspw. dadurch gegenüber bekannten Thiol-Konjugaten vorteilhaft, daß sie ohne weiteres längere Zeit gelagert werden können, während die üblichen Thiol-Konjugate nur unter inerten Bedingungen stabil sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend definierten Dithiolan-Derivats, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Dithiolan-Verbindung der Formel B

wobei R¹ und X wie in der vorstehenden Formel A definiert sind und Z = NH oder O ist,
b) Aktivieren der Carbonyl- oder Sulfonylgruppe der Dithiolan-Verbindung und
c) Umsetzen der aktivierten Dithiolan-Verbindung mit einer Verbindung der Formel C

wobei R², R³ und Y wie in der vorstehenden Formel A definiert sind.

Die weitere Einführung der Reste R⁴ und R⁵ in die entstehende Dithiolan-Diol- Verbindung erfolgt durch einem Fachmann bekannte Verfahren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Aktivierung der Carbonyl- oder Sulfonyl-Gruppe der Dithiolan- Verbindung gemäß obiger Formel B durch deren Umsetzung zu einem aktivierten Ester, insbesondere zu einem Dicarbonsäureimid-Ester, wie einem NHS-Ester. Durch die Aktivierung der Verbindung gemäß Formel B, bspw. von Liponsäure, mittels einem geeigneten Dicarbonsäureimid, wie Hydroxysuccinimid, zum entsprechenden Ester gelingt eine wesentliche Steigerung der Ausbeute in der Synthese der zentralen Verbindung gemäß obiger Formel C. Alternativ kann die Aktivierung der Dithiolan-Verbindung gemäß obiger Formel B bspw. auch mit einer Carbodiimid-Verbindung, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) erfolgen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens kann die Dithiolan-Verbindung gemäß obiger Formel B zu einem entsprechenden Säurehalogenid umgesetzt werden, bspw. indem die Dithiolansäure-Verbindung mit Oxalylchlorid zum entsprechenden Säurechlorid umgesetzt wird. Da das entstehende Säurechlorid häufig wenig stabil ist, erfolgen vorteilhafterweise die vorstehenden Schritte (b) und (c) gleichzeitig, indem zur Verbindung der Formel B das entsprechende Agens zur Herstellung des Säurehalogenids und die entsprechende Diol-Spacer-Verbindung zugefügt werden.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivats mittels Aktivierung der Dithiolan-Ausgangsverbindung durch ein Carbodiimid ist nachstehend am Beispiel der Herstellung des Dithiolan-Derivats der vorstehenden Formel I aus Liponsäure, Aminopropan-1,2-diol und Amino-CPG gezeigt (Schema 1 gem. Fig. 1). In einem weiteren Schema ist die entsprechende Herstellung des vorstehenden Phosphoramidit-Derivats gemäß Formel II angegeben (Schema 2 gern. Fig. 2). Das nachstehende Schema 3 (Fig. 3) zeigt beispielhaft das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Dithiolan-Derivats mit Hilfe der Umsetzung von Liponsäure zu einem NHS-Ester, wobei auch die weiteren Syntheseschritte zu einem 3'- Liponsäure-Modifier CPG bzw. eines Liponsäure-Phosporamidits gezeigt sind. Die Herstellung von Liponsäureaminopropandiol ist als Beispiel der Herstellung des erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivats aus der Dithiolansäure, in diesem Fall Liponsäure, mittels Oxalylchlorid und Umsetzung mit Aminopropan-1,2-diol im Schema 4 (Fig. 4) dargestellt.

Des weiteren umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugats, welches die Schritte:

a) Bereitstellen des erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivats und
b) Umsetzen des Dithiolan-Derivats mit einem mindestens eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe enthaltenden organisch-chemischen oder biologisch- chemischen Molekül umfasst.

Das Bereitstellen des Dithiolan-Derivats erfolgt dabei vorzugsweise durch das vorstehend definierte Herstellungsverfahren. Die mindestens eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe enthaltende organisch-chemische oder biologisch-chemische Verbindung ist vorzugsweise eine der vorstehend angegebenen Verbindungen.

Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Konjugats, wenn ein Dithiolan-Derivat verwendet wird, das eine Dicarbonyl- Gruppe enthält, welche über eine Amid- oder Ester Bindung das Dithiolan- Brückenglied-Spacer-Konstrukt mit einem Polymerträger verbindet. Ein spezifisches Beispiel für eine derartige Verbindung ist in obiger Formel I gezeigt.

Gemäß dieser besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Liponsäure-Rest über eine Amidbindung mit der Aminogruppe eines 3-Aminopropan-1,2-diol-Spacers verbunden. Eine der Hydroxyl-Gruppen des Spacers ist substituiert mit einer Schutzgruppe, hier Dimethoxytrityl, die vor dem Aufbau einer Oligonukleotidkette selektiv abgespalten wird. Die weitere Hydroxyl- Gruppe des 3-Aminopropan-1,2-diol-Spacers ist mit einer aus dem Stand der Technik bekannten Gruppe, die zur Verankerung von Oligonukleotiden an Amino- oder Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Polymerträgern verwendet wird, bspw. ein Succinylrest.

Nach Abspaltung der 4,4'-Dimethoxytritylgruppe nach einem im Stand der Technik bekannten Verfahren erfolgt von dieser freigelegten Hydroxyl-Gruppe aus der Aufbau der Oligonukleotidkette entsprechend dem Stand der Technik, wobei es unerheblich ist, ob dieser Aufbau von 3'- oder vom 5'-Ende her erfolgt. Nach dem Aufbau einer entsprechenden Nukleinsäurekette, bspw. einer Oligonukleotidkette, mit der im Stand der Technik bekannten Abspaltung vom Polymerträger, bspw. mit Ammoniak oder Aminen, verbleibt erfindungsgemäß der die Liponsäure- bzw. Dithiolangruppe enthaltende Rest über den Spacer an die Oligonukleotidkette gebunden.

Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Konjugats verwendet das Dithiolan-Derivat, bei dem R⁴ H oder eine säurelabile Schutzgruppe, bspw. eine Dimethoxytritylgruppe, ist und R⁵ eine Phosphoramidit- Gruppe, insbesondere, N,N-Diisopropyl-beta-cyanoethoxyphosphoramidit, ist. Eine spezifische Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivats, in diesem Fall eines Liponsäure-Derivats, ist in der obigen Formel II dargestellt. Auch hier ist wiederum eine Hydroxyl-Gruppe des Spacers mit einer entsprechenden Schutzgruppe, z. B. Dimethoxytrityl, geschützt. Die zweite Hydroxyl- Gruppe ist mit einem aus dem Stand der Technik bekannten aktivierbaren Rest, bspw. einem Phosphoramidit-Rest, in der Formel II einem (beta-Cyanoethoxy)- diisopropylaminophosphan-Rest, verbunden. Dieser aktivierbare Rest ermöglicht eflndungsgemäß die Anknüpfung an eine Hydroxyl- oder Aminogruppe. Im Anschluß an diesen Reaktionsschritt wird die Dimethoxytrityl-Schutzgruppe entsprechend bekannter Verfahren abgespalten. Die so erhaltene Hydroxylfunktion kann dann ggf. zur Anknüpfung einer weiteren Nukleotideinheit verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivate eignen sich daher ganz besonders zur Herstellung entsprechender Nukleinsäurekonjugate, wobei insbesondere Oligonukleotide bevorzugt sind. Das Dithiolan-Derivat der vorliegenden Erfindung, umfassend die spezifische Brückenglied-Diol-Spacer Struktur, weist gegenüber den im Stand der Technik bekannten Reagenzien den Vorteil auf, daß es in einfacher Weise in Nukleinsäure-Standardsyntheseverfahren, wie z. B. bei der Phosphoramidit-Methode und der Verankerung an Polymerträgern usw., eingesetzt werden kann. Derartige Verfahren sind bspw. von Gait (Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford, 1987) beschrieben, und der diesbezügliche Offenbarungsgehalt dieser Druckschrift ist vollständig in die vorliegende Erfindung aufgenommen. Der Ablauf eines Synthesezyklus bei der Phosphoramidit-Methode ist beispielhaft in der Fig. 6 dargestellt.

Das erfindungsgemäße Dithiolan-Derivat eignet sich insbesondere zur Immobilisierung von organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekülen auf Edelmetallen oder Edelmetall-Legierungen sowie auf Halbleitern.

Somit wird erfindungsgemäß auch eine beschichtete Edelmetall-Struktur bereitgestellt, die

a) ein Substrat aus einem Trägermaterial,
b) mindestens eine mindestens bereichsweise auf dem Substrat ausgebildete Schicht eines oder mehrerer Edelmetalle und/oder Edelmetall-Legierungen und
c) mindestens ein mindestens bereichsweise auf der Edelmetallschicht immobilisiertes erfindungsgemäßes Dithiolan-Derivat und/oder mindestens ein mindestens bereichsweise auf der Edelmetallschicht immobilisiertes erfindungsgemäßes Konjugat gemäß obiger Definition, umfasst.

Des weiteren wird erfindungsgemäß eine beschichtete Halbleiter Struktur bereitgestellt, umfassend einen Thiol-bindenden Halbleiterträger und mindestens ein mindestens bereichsweise auf dem Halbleiter immobilisiertes erfindungsgemäßes Dithiolan-Derivat und/oder mindestens ein mindestens bereichsweise auf dem Halbleiter immobilisiertes erfindungsgemäßes Konjugat gemäß obiger Definition. Bevorzugte erfindungsgemäße Halbleiter Strukturen sind solche, bei denen Galliumarsenid oder Indiumphosphid mit erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivaten bzw. -Konjugaten beschichtet ist; hinsichtlich der Bindung von Thiolen auf Halbleitern vgl. z. B. Lunt et al. (1991) J. Appl. Phys. 70: 7449; Gu et al. (1995) Langmuir 11: 1849-1851; Zerulla et al. (1999) Langmuir 15, 5285-5294.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind dabei solche Schicht-Strukturen, bei denen das immobilisierte Dithiolan-Derivat und/oder das immobilisierte Konjugat einen Self- Assembled-Monolayer (SAM) ausbilden/ausbildet. Diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen beschichteten Edelmetall- bzw. Halbleiter-Struktur stellt eine kontrollierte Schicht der immobilisierten Moleküle, bspw. Biomoleküle wie Oligonukleotide, bereit. Durch die Ausbildung eines SAM ist es möglich, die Dichte der immobilisierten Moleküle so zu steuern, daß ein möglichst ausgewogenes Verhältnis zwischen einer hohen Dichte von bspw. in einem Array verwendeten Sondenmolekülen (d. h. eine möglichst große Anzahl von Bindungsstellen für potentielle Bindungspartner (Zielmoleküle) pro Flächeneinheit) und deren Zugänglichkeit für die zu untersuchenden Zielmoleküle resultiert, was beim Einsatz in einem Biochip (z. B. einem entsprechenden Mikroarray) eine hohe Signalintensität ergibt.

Insbesondere zur Steigerung der Hybridisierungseffizienz bei immobilisierten Sonden-Oligonukleotiden kann erfindungsgemäß die Schichtstruktur derart ausgebildet werden, dass neben dem erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivat bzw. dem Konjugat bspw. ein Spacer (vgl. Southem et al. (1999) The Chiping Forecast 21: 5-9; Southern et al. (1997) Nucl. Acid Res. 25: 1155-1161) zugefügt wird. Des weiteren kann die Hybridisierungseffizienz bspw. durch die Verwendung von an der Oberfläche locker gepackter Sondenoligos gesteigert werden (Southem et al. (1997), supra).

Im Vergleich zu anderen Immobilisierungsstrategien kann bei den erfindungsgemäß konjugierten Oligonukleotiden ein sogenanntes gemischtes Oligo-SAM ausgebildet werden, indem neben dem erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivat bzw. dem Konjugat aus diesem mit einem Oligonukleotid ein übliches Alkanthiol zur Steuerung der Dichte des erwünschten Oligo-SAM zugegeben wird. Hierdurch läßt sich ebenfalls erreichen, dass das verwendete Oligonukleotid für eine effiziente Hybridisierung gut zugänglich ist. Durch diese Maßnahmen läßt sich die Hybridisierungseffizienz auf bis zu 100% steigern (Levicky (1998) JACS. 120: 9787-9792).

Ein weiterer großer Vorteil der auf einem Edelmetall immobilisierten Dithiolanmodifizierten Moleküle, insbesondere von Liponsäure-modifizierten Oligonukleotiden, ist die hohe Bindungskapazität auf dem Edelmetall. Bspw. weist Gold eine Bindungskapazität von Liponsäure von 7,1 × 10^-10 mol/cm² auf (Pirrung (2002) Angew. Chem. 114: 1326-1341). Des weiteren sind die erfindungsgemäßen Schichtstrukturen solchen aus dem Stand der Technik, insbesondere üblichen thiolmodifizierten Oligonukleotid-Schichten, dadurch überlegen, dass aufgrund des Vorhandenseins der vicinalen Dithiolgruppe das Dithiolan-Derivat der vorliegenden Erfindung eine höhere Bindungsenergie auf dem Trägermaterial aufweist, weshalb sich durch die Zweifachverankerung eine stabilere Anbindung zu erwarten ist (vgl. Wang et al. (1998), supra; Cheng et al. (1995), supra).

Die erfindungsgemäßen beschichteten Edelmetall- bzw. Halbleiter Strukturen zeichnen sich des weiteren dadurch aus, dass die Bestandteile sowie die Struktur selbst durch Standard-Synthese-Verfahren hergestellt werden können. Demgegenüber erfordern übliche thiolmodifizierte Oligonukleotide aus dem Stand der Technik eine aufwendige Behandlung bzw. Aufarbeitung, damit die zur Chemisorption des entsprechenden Konjugats gewünschte -SH-Gruppe frei wird.

Für die erfindungsgemäße beschichtete Edelmetall-Struktur kommen zahlreiche Edelmetalle, wie Gold, Silber, Kupfer, Platin, Palladium, Ruthenium und Iridium sowie Legierungen von Edelmetallen in Frage. Ein erfindungsgemäß besonders bevorzugtes Edelmetall ist bspw. Gold. Die erfindungsgemäße beschichtete Edelmetall-Struktur kann derart ausgestaltet sein, dass das Substrat mindestens bereichsweise flächig ausgebildet ist. Als Trägermaterialien kommen dabei insbesondere Glas, Kunststoffe, Halbleiter (insbesondere Silizium) und Metalle, vorzugsweise solche, die vom Edelmetall der Beschichtung verschieden sind, zum Einsatz. Dabei kann erforderlichenfalls die Oberfläche des Trägermaterials gemäß einem Fachmann bekannter Verfahren behandelt bzw. beschichtet sein, um das aufzubringende Edelmetall oder die aufzubringende Edelmetall-Legierung zu binden. Standardmäßig werden derzeit für Biochips, insbesondere Mikroarrays, Glasträger verwendet. Andererseits kommen auch Partikel aus Edelmetallen oder Edelmetall-Legierungen bzw. hiermit beschichtete partikuläre Trägermaterialien in Frage, so dass das Substrat erfindungsgemäß auch partikelförmig ausgebildet sein kann. Bei einer partikelförmigen Ausgestaltung der erfindungsgemäßen beschichteten Edelmetall-Struktur sind bspw. Materialien wie Polymere, z. B. Polystyrol, Glas, Kieselsäure usw. besonders geeignet.

Im Fall flächig ausgebildeter Strukturen eignet sich die Edelmetall- bzw. die Halbleiter-Struktur besonders zur Verwendung als Nukleinsäure-Array, insbesondere als DNA-Mikroarray, auf Biochips.

Daher wird erfindungsgemäß ebenfalls ein Biochip bereitgestellt, welcher die erfindungsgemäße beschichtete Edelmetall-/Halbleiter-Struktur umfasst.

Weitere Vorteile der erfindungsgemäßen Beschichtung von Edelmetallen, insbesondere Gold, mit Dithiolan-Derivaten und davon abgeleiteten Konjugaten, insbesondere von Oligonukleotiden, sind eine besonders gute Bindungskapazität (Wölfl (2000) Transkript Laborwert 3), die Möglichkeit der Ausbildung von SAM (Bamdad (1998) Biophys. J. 75: 1997-2003), d. h. die kontrollierte Anbindung von Analysemolekülen, insbesondere DNA, zum Einsatz in der Diagnostik, sowie die Möglichkeit der schnellen Produktion eines Biochips, da die Immobilisierung der erwünschten Analysemoleküle, wie bspw. DNA-Oligonukleotide, und die Blockierung der Chipoberfläche innerhalb von etwa 3 Stunden möglich ist.

Die Figuren zeigen:
Fig. 1 zeigt in einem Syntheseschema die Herstellung eines erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivats, vorliegend eines CPG-Modifier- Reagenz gemäß Formel I (Schema 1). Liponsäure wird unter Aktivierung durch DCC mit Aminopropan-1,2-diol umgesetzt, wobei sich das entsprechende Propan-2,3-diol-1,2-dithiolan-3-pentansäureamid ergibt. In einer weiteren Reaktion wird eine der Hydroxyl-Gruppen mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid geschützt. Durch Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid wird an die freigebliebene Hydroxyl-Gruppe ein Succinyl-Rest angefügt und sodann durch Aktivierung mit DCC ein p-Nitrophenylester hergestellt. Schließlich wird der so aktivierte Ester mit Amino-CPG umgesetzt, um das am Polymerträger gekoppelte Dithiolan-Derivat der Formel I zu ergeben.
Fig. 2 zeigt in einem Syntheseschema 2 die Herstellung eines ertindungsgemäßen Dithiolan-Derivats, das eine Phosphoramidit-Gruppe an einem Hydroxyl-Sauerstoff des Diol-Spacers aufweist, wobei von dem DMT-geschützten Propan-2,3-diol-1,2-dithiolan-3- pentansäureamid ausgegangen wird, das gemäß Schema 1 der Fig. 1 dargestellt werden kann. Das Liponsäureamid-Spacer Konjugat wird mit Chlor-N,N-diisopropyl-beta-cyanophosphin und N,N- Diisopropylamin in trockenem Dichlormethan umgesetzt, um die Verbindung der Formel II zu ergeben.
Fig. 3 zeigt in einem weiteren Syntheseschema die Kopplung von Liponsäure mit Aminopropan-1,2-diol in einer alternativen Herstellungsweise von 3'-Liponsäure-Modifier-CPG bzw. Liponsäure- Phosphoramidit (Schema 3). Zunächst wird Liponsäure mittels Hydroxysuccinimid zum Liponsäure-NHS-Ester aktiviert. Der NHS- Ester wird dann mit Aminopropan-1,2-diol in Dichlormethan/Triethylamin umgesetzt, um wieder das Liponsäureamid- Spacer-Derivat zu ergeben. Sodann erfolgt die Anbringung einer 4,4'-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe am endständigen Hydroxylrest. Ausgehend von diesem geschützten Derivat kann dann bspw. das entsprechende 3'-Liponsäure-Modifier CPG oder ein Liponsäure- Phosphoramidit, wie in Fig. 1 (Schema 1) bzw. Fig. 2 (Schema 2) gezeigt, hergestellt werden.
Fig. 4 zeigt in einem weiteren Syntheseschema eine andere Ausführungsform der Herstellung von Liponsäureaminopropanthiol (Schema 4). In diesem Fall wird Liponsäure mit Oxalylchlorid zum entsprechenden Säurechlorid umgesetzt, um somit eine aktivierte Verbindung zu erhalten, die mit Aminopropan-1,2-diol reagiert, um das gewünschte Produkt zu ergeben.
Fig. 5A zeigt in einer schematischen Darstellung die Immobilisierung von erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Liponsäure-Konjugaten, wobei das Liponsäure-Derivat mit dem 3'-C-Atom des endständigen Nukleotids verbunden ist.
Fig. 5B zeigt in einer der Fig. 5A entsprechenden Darstellung die Konjugation des Liponsäure-Derivats an das endständige 5'-C-Atom des konjugierten Oligonukletids.
Fig. 6 zeigt in einem Syntheseschema den Oligonukleotid-Synthese- Zyklus, der bei der Phosphoramidit-Methode durchlaufen wird (vgl. Gait (1987), supra).
Die nachstehenden Ausführungsbeispiele erläutern die vorliegende Erfindung weiter, ohne sie einzuschränken.

1. Ausführungsbeispiel

Herstellung von 3-Liponsäure-Modifier CPG

Literatur

Nelson et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 7179-7186; Nelson et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 7187-7194.

Verwendete Chemikalien

D,L-alpha-Liponsäure, 4-Pyrrolidinopyridin, 3-Aminopropan-1,2-diol, Dicyclohexylcarbodiimid, Dichlormethan, 4,4'-Dimethoxytriphenylmethylchlorid, Pyridin (trocken), Methanol, Dimethylaminopyridin, Bernsteinsäureanhydrid, Ethylacetat, Dioxan, p-Nitrophenol, Triethylamin, Aminopropyl-CPG (Herstellung siehe unter Amino-CPG, http:/ / www.interactiva.de), Dimethylformamid, Acetanhydrid, Diethylether.

Herstellung von Propan-2.3-diol-1.2-dithiolan-3-pentansäureamid

Zu einem Gemisch, bestehend aus 3-Aminopropan-1,2-diol (5 mmol, 0,5 g), 4- Pyrrolydinopyridin (5 mmol, 0,7 g) und Dicyclohexylcarbodiimid (10 mmol, 1,9 g) in 20 ml Dichlormethan, wurde D,L-alpha-Liponsäure (5 mmol, 1 g) gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylhamstoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer verdampft.

Herstellung von Propan-2.3-diol-3-O-4,4'-dimethoxydiphenylmethyl-1,2-dithiolan- 3-pentansäureamid

Das zähflüssige, unreine Produkt wurde in 10 ml trockenem Pyridin gelöst und mit 4,4'-Dimethoxytriphenylmethylchlorid (5 mmol, 1,69 g) umgesetzt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt.
Anschließend wurden 10 ml Methanol zugefügt, für weitere 10 min gerührt und unter Vakuum getrocknet.
Das Produkt wurde mittels einer Kieselgel-Säule (5 × 20 cm) gereinigt (Ausbeute 61%, Elutionsgemisch: Dichlormethan/Hexan/Triethylamin (50/50/1%)) und mittels Dünnschichtchromatographie (DC) überprüft (Laufmittel: Dichlormethan/Hexan/Triethylamin, 50/50/1%), Detektion: UV-Licht (die Tritylgruppe kann unter HCl-Dampf sichtbar gemacht werden).

Herstellung von 3'-Liponsäure-Modifier-CPG

Zu einer Lösung von Propan-2,3-diol-3-O-4,4'-dimethoxytriphenylmethyl-1,2- dithiolan-3-pentansäureamid (1 mmol, 0,61 g) und Dimethylaminopyridin (0,9 mmol, 200 mg) in trockenem Pyridin (12 ml) wurde Bernsteinsäureanhydrid (3 mmol, 300 mg) gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde in Ethylacetat (100 ml) gelöst, mit einer 0,5 M Natriumchlorid-Lösung (3 × 100 ml) und einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung (1 × 100 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abgezogen und das Produkt unter Vakuum getrocknet.
Das trockene Bernsteinsäurederivat, p-Nitrophenol (2,5 mmol, 350 mg) und 0,5 ml trockenes Pyridin wurden in 10 ml trockenem Dioxan gelöst. Zum Gemisch wurde anschließend Dicyclohexylcarbodiimid (4,8 mmol, 1,0 g) gegeben und unter milden Bedingungen 3 h gerührt. Der dabei entstandene Dicyclohexylhamstoff wurde abfiltriert.
1 g Aminopropan-CPG wurde im Filtrat suspendiert, 1 ml Triethylamin wurden hinzugefügt und über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt.
Der derivatisierte Träger wurde mit Dimethylformamid, Methanol und Diethylether sorgfältig gewaschen und getrocknet.
Schließlich wurde der Liponsäure-Träger mit einer Lösung von Acetanhydrid/Pyridin/Dimethylaminopyridin (10 : 90 : 1) gecappt. Daraufhin wurde mit Methanol und Diethylether gründlich gewaschen und unter Hochvakuum eingehend getrocknet.
Die Synthese ist im Schema 1 (Fig. 1) gezeigt.

2. Ausführungsbeispiel

Herstellung von Liponsäure-Phosphoramidit

Literatur

Nelson et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 7179-7186.

Verwendete Chemikalien

N,N-Diisopropylethylamin, Dichlormethan (trocken), Chlor-N,N-diisopropyl-betacyanoethoxyphosphoramidit, Methanol, Ethylacetat, Hexan, Triethylamin

Auszugehen ist von Propan-2,3-diol-O-4-4'-dimethoxytriphenylmethyl-1,2- dithiolan-3-pentansäureamid, das bspw. gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel hergestellt wird.

Herstellung von Propan-2,3-diol-2-O-[N,N-diisopropyl-beta-cyanoethoxyphosphoramidit]-3-O-[4,4'-dimethoxydiphenylmethyl]-1,2-dithiolan-3-pentansäureamid

Unter Vakuum getrocknetes Propan-2,3-diol-3-O-4-4'-dimethoxytriphenylmethyl- 1,2-dithiolan-3-pentansäureamid (1,25 mmol, 2,2 µg) und trockenes N,Ndiisopropylethylamin (6 mmol, 0,78 g) wurden in 45 ml trockenem Dichlormethan unter Argon gelöst. Zu dieser Lösung wurde langsam innerhalb von 5 min Chlor- N,N-diisopropyl-beta-cyanoethoxyphosphoramidit (2,5 mmol, 0,6 g) beigefügt und für 1 h unter Argon gerührt. Danach wurde Methanol (1 ml) zugeführt und für weitere 10 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen eiskaltem Ethylacetat (170 ml) und 10% eiskaltem Natriumhydrogencarbonat (275 ml) partitioniert. Die organische Phase wurde mit 10% kalter Natriumhydrogencarbonat-Lösung (275 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt wurde, wurde der gummiartige Rest mittels einer Kieselgel- Säule (5 × 10 cm) aufgereinigt. Das gewünschte Produkt konnte mit Dichlor methan/Hexan/Triethylamin (50 : 50 : 1%) isokratisch eluiert werden (Überprüfung mittels DC, Laufmittel: Dichlormethan/Hexan/Triethylamin (50 : 50 : 1%), Detektion: UV-Licht, wobei unter HCl-Dampf die Tritylgruppe sichtbar gemacht werden kann). Das Lösungsmittel wurde einrotiert und das gereinigte Liponsäure- Phosphoramidit im Vakuum getrocknet. Die Synthese ist im Schema 2 (Fig. 2) dargestellt.

3. Ausführungsbeispiel

Synthese von 3'-, 5'-lipoylierten Oligonukleotiden

Die Oligonukleotidsynthesen erfolgten gemäß einem Standardprotokoll auf einem Expedite TM Syntheziser (PerSeptive Biosystems). Alle synthetisierten Oligonukleotide wurden anschließend mittels HPLC standardgemäß aufgereinigt. Die Synthesen von 3'-, 5'-lipoylierten Oligonukleotiden konnten per MALDI bestätigt werden.

4. Ausführungsbeispiel

Immobilisierung lipoylie der Oligonukleotide auf goldbeschichteten Trägern

Goldträger

Als Substrat wurden handelsübliche Objektträger verwendet, die mit 10 nm Wolfram/Titan (Adhäsions-Schicht) und 100 nm Gold besputtert wurden. Die Goldträger wurden mit Piranha-Lösung (70% H₂SO₄: 30% H₂O₂) gereinigt.

Immobilisierung

Es wurden 1, 2, 5, 10, 15 bzw. 30 µmol in 3 µl 1 M NaH₂P04 (ph 4,1) mit Liponsäure an 3'-C und 5'-C modifizierte Oligonukleotide (Lip-Oligonukleotide) auf gereinigte Goldträger aufgebracht. Die Goldträger wurden in einer wasserdampfgesättigten Kammer 2 h belassen. Nach Immobilisierung wurden die Flüssigkeitstropfen abpipettiert und gründlich mit bidestilliertem Wasser gespült.

Passivierung der Träger Peripherie

Der Goldträger wurde nach der Immobilisierung mit Lip-Oligonukleotiden zur Verhinderung unspezifischer Bindung in einer 1 mM Lösung von Thio- Polyethylenglycol MW 5000 (Rapp Polymers) für 45 min inkubiert. Anschließend wurde sorgfältig mit bidestilliertem Wasser gespült. Verbliebene Wassertropfen wurden mit Stickstoff abgeblasen.

Nachweis der Immobilisierung

Zum Nachweis der Immobilisierung wurde der beschichtete Objektträger mit radioaktiv markierten Oligonukleotiden, welche die komplementäre Sequenz zu den immobilisierten Nukleotiden aufwies, hybridisiert (Hybridisierung mit ³²P, 1 M NaCl-TE-Puffer, über Nacht bei Raumtemperatur). Zusätzlich konnte eine Immobilisierung von lipoylierten Oligonukleotiden mit Hilfe von Röntgen- Photoelektronen-Spektroskopie-(XPS) Untersuchungen bestätigt werden.

Claims

1. Dithiolan-Derivat der Formel A

wobei
R¹ nichts oder ein geradkettiger oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter, substituierter oder unsubstituierter aliphatischer, heteroaliphatischer Rest mit 1 bis 20 C-Atomen oder ein entsprechender substituierter oder unsubstituierter aromatischer Rest ist,
R², R³ jeweils unabhängig voneinander ein geradkettiger oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter, substituierter oder unsubstituierter aliphatischer oder heteroaliphatischer Rest mit 1 bis 10 C-Atomen oder ein entsprechender substituierter oder unsubstituierter aromatischer Rest ist,
R⁴, R⁵ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus, H, säurelabilen Schutzgruppen, und Amino- und/oder Hydroxy-Kopplungsgruppen, ausgewählt sind,
X O oder S ist und
Y NH oder O ist.

2. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 1, wobei R¹ Tetramethylen ist.

3. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei X = O und Y = N ist.

4. Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R² (CH₂) ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10, insbesondere von 1 bis 5 ist.

5. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 4, wobei R² Methylen ist.

6. Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R³ (CH₂)_m ist, wobei m eine ganze Zahl von 1 bis 10, insbesondere von 1 bis 5 ist.

7. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 6, wobei R³ Methylen ist.

8. Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R⁴ H ist und R⁵ eine säurelabile Schutzgruppe ist oder umgekehrt.

9. Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R⁴ H oder eine säurelabile Schutzgruppe ist und R⁵ eine Dicarbonyl-Gruppe ist oder umgekehrt.

10. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 9, wobei die Dicarbonyl-Gruppe mit einem Polymerträger über eine Amid- oder Ester-Bindung verbunden ist.

11. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 10, das die folgende Formel aufweist:

wobei DMT eine Dimethoxytrityl-Gruppe ist.

12. Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R⁴ H oder eine säurelabile Schutzgruppe ist und R⁵ eine Phosphoramidit-Gruppe ist oder umgekehrt.

13. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 12, wobei die Phosphoramidit-Gruppe N,N-Diisopropyl-β-cyanoethoxyphosphoramidit ist.

14. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 13, das die folgende Formel aufweist:

wobei DMT eine Dimethoxytrityl-Gruppe ist.

15. Konjugat aus mindestens einem Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und einem mindestens eine Amino- oder Hydroxyl- Gruppe enthaltenden organisch-chemischen oder biologisch- chemischen Molekül, das über die Amino- oder Hydroxyl-Gruppe die Gruppe -OR⁴ oder die Gruppe -OR⁵ in der Formel A gemäß Anspruch 1 ersetzt.

16. Konjugat nach Anspruch 15, wobei das biologisch-chemische Molekül aus der Gruppe, bestehend aus Nukleosiden, Nukleotiden, Oligonukleotiden und Polynukleotiden, ausgewählt ist.

17. Konjugat nach Anspruch 16, wobei das Dithiolan-Derivat über das 5'-C- Atom des Nukleosid/Nukleotids bzw. über das endständige 5'-C-Atom des Oligo- oder Polynukleotids konjugiert ist und die Gruppe -OR⁵ in der Formel A gemäß Anspruch 1 ersetzt.

18. Konjugat nach Anspruch 16, wobei das Dithiolan-Derivat über das 3'-C- Atom des Nukleosid/Nukleotids bzw. über das endständige 3'-C-Atom des Oligo- oder Polynukleotids konjugiert ist und die Gruppe -OR⁴ in der Formel A gemäß Anspruch 1 ersetzt.

19. Verfahren zur Herstellung eines Dithiolan-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Dithiolan-Verbindung der Formel B

wobei R¹ und X wie in Formel A gemäß Anspruch 1 definiert sind und Z=NH oder O ist,

b) Aktivieren der Carbonyl- oder Sulfonyl-Gruppe der Dithiolan- Verbindung und

c) Umsetzen der aktivierten Dithiolan-Verbindung mit einer Verbindung der Formel C

wobei R², R³ und Y wie in Formel A gemäß Anspruch 1 definiert sind.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei im Schritt (b) die Verbindung der Formel B zu einem aktivierten Ester umgesetzt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der aktivierte Ester ein Dicarbonsäureimid-Ester ist.

22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei im Schritt (b) die Verbindung der Formel B zum Säurehalogenid umgesetzt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Schritte (b) und (c) gleichzeitig erfolgen.

24. Verfahren zur Herstellung des Konjugats nach einem der Ansprüche 15 bis 18, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen des Dithiolan-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und

b) Umsetzen des Dithiolan-Derivats mit einem mindestens eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe enthaltenden organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekül.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Bereitstellen des Dithiolan- Derivats durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23 erfolgt.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Dithiolan-Derivat gemäß Anspruch 10 oder 11 definiert ist.

27. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Dithiolan-Derivat gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 definiert ist.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei das biologisch- chemische Molekül aus der Gruppe, bestehend aus Nukleosiden, Nukleotiden, Oligonukleotiden und Polynukleotiden, ausgewählt ist.

29. Beschichtete Edelmetall-Struktur, umfassend

A) ein Substrat aus einem Trägermaterial,

B) mindestens eine mindestens bereichsweise auf dem Substrat ausgebildete Schicht eines oder mehrerer Edelmetalle und/oder Edelmetalllegierungen und

C) mindestens ein mindestens bereichsweise auf der Edelmetallschicht immobilisiertes Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder mindestens ein mindestens bereichsweise auf der Edelmetallschicht immobilisiertes Konjugat nach einem der Ansprüche 15 bis 18.

30. Edelmetall-Struktur nach Anspruch 29, wobei das immobilisierte Dithiolan-Derivat und/oder das immobilisierte Konjugat einen Self-Assembled- Monolayer ausbilden/ausbildet.

31. Edelmetall-Struktur nach Anspruch 29 oder 30, wobei das Edelmetall aus der Gruppe, bestehend aus Gold, Silber, Kupfer, Platin, Palladium, Ruthenium und Iridium, sowie Legierungen dieser Edelmetalle, ausgewählt ist.

32. Edelmetall-Struktur nach Anspruch 31, wobei das Edelmetall Gold ist.

33. Edelmetall-Struktur nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei das Substrat mindestens bereichsweise flächig ausgebildet ist.

34. Edelmetall-Struktur nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei das Substrat partikelförmig ausgebildet ist.

35. Edelmetall-Struktur nach einem der Ansprüche 29 bis 34, wobei das Trägermaterial Glas, Kunststoff, ein Halbleiter oder ein Metall ist.

36. Beschichtete Halbleiter Struktur, umfassend einen Thiol-bindenden Halbleiterträger und mindestens ein mindestens bereichsweise auf dem Halbleiterträger immobilisiertes Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder mindestens ein mindestens bereichsweise auf dem Halbleiterträger immobilisiertes Konjugat nach einem der Ansprüche 15 bis 18.

37. Halbleiter Struktur nach Anspruch 36, wobei der Halbleiter Galliumarsenid oder Indiumphosphid ist.

38. Halbleiter-Struktur nach Anspruch 36 oder 37, wobei das immobilisierte Dithiolan-Derivat und/oder das immobilisierte Konjugat einen Self- Assembled-Monolayer ausbilden/ausbildet.

39. Biochip, umfassend die Edelmetall-Struktur nach einem der Ansprüche 29 bis 35 und/oder die Halbleiter-Struktur nach einem der Ansprüche 36 bis 38.

40. Verwendung des Dithiolan-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Immobilisierung von organisch-chemischen oder biologisch- chemischen Molekülen auf Edelmetallen, Edelmetalllegierungen und Halbleitern.