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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein konfokales Rastermikroskop zum Abbilden eines Lumineszenzobjekts
und ein Verfahren zum Abbilden eines Lumineszenzobjekts.
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Konfokale Rastermikroskope sind seit
geraumer Zeit aus dem Stand der Technik bekannt. Insbesondere bei
biomedizinischen Anwendungen werden konfokale Rastermikroskope dann
eingesetzt, wenn – verglichen
zu konventionellen Auflicht- oder
Durchlichtmikroskopen – eine
verbesserte Auflösung
entlang der optischen Achse benötigt
wird.
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Lediglich beispielhaft wird auf die
US 5,127,730 verwiesen,
aus der ein konfokales Rastermikroskop, nämlich ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop,
bekannt ist, das eine Laserlichtquelle aufweist, die Licht mehrerer
Wellenlängen
simultan emittiert. Hierbei wird Licht einzelner Wellenlängen mit
Anregungsfiltern selektiert, wobei als Anregungsfilter Interferenz-
oder Farbfilter eingesetzt werden. Mit Selektieren von Licht einer
Wellenlänge
ist in diesem Zusammenhang zu verstehen, dass Licht lediglich dieser
Wellenlänge
zur Objektbeleuchtung von dem Licht der Laserlichtquelle durch das
Einfügen
eines entsprechenden Filters in den von der Laserlichtquelle bis
zum Objekt verlaufenden Beleuchtungsstrahlengang ausgewählt wird,
wobei der Filter nur für
diese Wellenlänge
transparent ist, das Licht der anderen Wellenlängen also nicht durch den Filter
hindurchtreten kann. Wenn zwei Wellenlängen selektiert werden, ist
ein entsprechender Interferenzfilter vorgesehen, der lediglich Licht
der zwei Wellenlängen zur
Objektbeleuchtung transmittieren und das Licht der anderen Wellenlängen nicht
transmittieren lässt. Insbesondere
umfasst die aus der
US 5,127,730 bekannte
Laserlichtquelle einen Argon-Krypton-Laser.
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Das aus der
US 5,127,730 bekannte konfokale Laser-Scanning-Mikroskop
umfasst weiterhin dichroitische oder multichroitische Strahlteiler,
die einerseits das Licht der Laserlichtquelle zum Objekt hin reflektieren
und andererseits das vom Objekt kommende Fluoreszenzlicht zum Detektor
bzw. zu den Detektoren hin transmittieren lässt. Falls nun eine Laserlichtquelle
eins konfokalen Rastermikroskops Licht mehrerer Wellenlängen emittiert,
sind zur Objektdetektion letztendlich eine enorme Anzahl von dichroitischen
oder multichroitischen Strahlteilern zusammen mit einer großen Anzahl
von Anregungsfiltern bereitzuhalten, um die Fähigkeiten des konfo kalen Rastermikroskops
zur Objektdetektion in vollem Umfang ausschöpfen zu können.
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Das aus der
US 5,127,730 bekannte konfokale Laser-Scanning-Mikroskop
weist mehrere, als Photomultiplier ausgeführte Detektoren auf, vor denen
jeweils ebenfalls ein Filter angeordnet ist, um nämlich lediglich
Licht eines bestimmten Wellenlängenbereichs,
das von einem entsprechenden Fluoreszenzfarbstoff emittiert wurde,
mit dem jeweiligen Detektor zu detektieren.
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Ausgehend von dem aus der
US 5,127,730 gebildeten
Stand der Technik wurde in einem ersten Ansatz versucht, die Vielzahl
der erforderlichen Anregungsfilter durch ein optisches Bauteil zu
ersetzen. Dies wurde mit der Einführung eines im Beleuchtungsstrahlengang
der Laserlichtquelle nachgeordneten AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter)
erzielt. Hierbei handelt es sich um ein programmierbares bzw. ansteuerbares
aktives optisches Bauteil, mit dem gezielt Licht einer oder mehrerer
Wellenlängen unter
Beaufschlagung einer Ultraschallwelle ablenkbar ist. Das AOTF wird
daher derart in dem Beleuchtungstrahlengang der Laserlichtquelle
nachgeordnet, dass bei entsprechender Beaufschlagung des Bauteils
mit Ultraschall das Licht einer bestimmten Wellenlänge von
dem AOTF abgelenkt und in den Beleuchtungsstrahlengang des konfokalen
Rastermikroskops eingekoppelt und somit zur Objektbeleuchtung selektiert
wird. Mit einem AOTF ist es für
sich gesehen weiterhin möglich,
die Leistung des Lichts einer bestimmten Wellenlänge entsprechend einzustellen,
nämlich
dadurch, dass die Leistung der Ultraschallwelle entsprechend eingestellt
ist. Insoweit wird diesbezüglich
beispielsweise auf die
US 5,410,371 verwiesen.
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Weiterhin wurde im Rahmen der deutschen Patentanmeldungen
DE 43 30 347 A1 und
DE 199 02 625 A1 eine
Möglichkeit
gefunden, die vor den Detektoren herkömmlicher konfokaler Rastermikroskope angeordneten
Filter durch den Einsatz einer entsprechenden Vorrichtung zur Selektion
und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls
zu ersetzen. Hierbei wird der Lichtstrahl zunächst mit einem Prisma, einem
optischen Gitter oder einem Hologramm spektral zerlegt. Sodann wird von
dem spektral zerlegten Licht ein erster Spektralbereich mit Hilfe
von beweglich angeordneten Spiegelblenden selektiert und mit einem
ersten Detektor detektier. Das auf die Spiegelblenden treffende,
nicht selektierte Licht wird zur Detektion mit einem zweiten Detektor
reflektiert. Insoweit ist durch die in den deutschen Patentanmeldungen
DE 43 30 347 A1 und
DE 199 02 625 A1 beschriebenen
Vorrichtungen – für sich gesehen – eine Möglichkeit
bekannt, auf die den Detektoren vorgeschalteten, im Hinblick auf
die spektrale Einstellungsmöglichkeit
unflexiblen Filter zu verzichten.
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Schließlich ist – für sich gesehen – aus der
DE 199 06 757 A1 eine
optische Anordnung bekannt, mit der die dichroitischen oder multichroitischen Strahlteiler
eines konfokalen Rastermikroskops ersetzt werden können. Hierbei
wird mit einem spektral selektiven Element Licht der Laserlichtquelle
mindestens einer Wellenlänge
zur Objektbeleuchtung selektiert und das am Objekt reflektierte
und/oder gestreute Licht der Laserlichtquelle aus dem Detektionsstrahlengang
ausgeblendet. Als spektral selektives Element wird ein ansteuerbares
aktives optisches Bauteil eingesetzt, das beispielsweise in Form
eines AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) oder eines AOD (Acousto-Optical-Deflector)
ausgeführt
ist.
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Somit ist es – jeweils für sich gesehen – bekannt,
die Anregungsfilter und die dichroitischen bzw. multichroitischen
Filter durch aktive optische Bausteine zu ersetzen. Die Detektionsfilter
eines konfokalen Rastermikroskops können ebenfalls – für sich gesehen – durch
eine spektrale Zerlegung des zu detekierenden Lichts in Verbindung
mit einer kaskadierten Blendenanordnung ersetzt werden. Eine Kombination
dieser einzelnen, die herkömmliche
Technik ersetzenden Technologien in ein und dasselbe konfokale Rastermikroskop
ist grundsätzlich
denkbar, ist jedoch mit Problemen verbunden. So sind die entsprechenden
Einzelkomponenten von dem Mikroskopbediener jeweils einzustellen,
was mit einer erheblichen Einarbeitungszeit des Mikroskopbedieners
in die neue Technologie einhergeht. Insbesondere bei Fluoreszenzobjekten
besteht bei langen Einstellzeiten die Gefahr, dass der zur Markierung
des Fluoreszenzobjekts verwendete Fluoreszenzfarbstoff ausbleicht.
Schließlich
ist es aufgrund der Vielzahl der einzustellenden Parameter nahezu
unmöglich,
stets eine optimale Objektdetektion zu erzielen.
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Der vorliegenden Erfindung liegt
daher die Aufgabe zugrunde, ein konfokales Rastermikroskop zum Abbilden
eines Lumineszenzobjekts und ein Verfahren zum Abbilden eines Lumineszenzobjekts anzugeben
und weiterzubilden, mit dem zunächst
die alternativen Technologien zu den herkömmlichen Filtern eingesetzt
werden können,
wobei darüber
hinaus der Einstellvorgang der Komponenten dieser neuen Technologien
zum Erzielen eines optimalen Detektionsergebnisses vereinfacht werden
kann.
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Das erfindungsgemäße konfokale Rastermikroskop
zum Abbilden eines Lumineszenzobjekts löst die voranstehende Aufgabe
durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach umfasst ein solches konfokales
Rastermikroskop eine Licht mehrerer Wellenlängen emittierenden Laserlichtquelle,
ein nahezu stufenlos variabel einstellbares spektral selektives
Element, eine nahezu stufenlos variabel einstellbare spektral selektive
Detektionseinrichtung, einen von der Laserlichtquelle bis zum Lumineszenzobjekt verlaufenden
Beleuchtungsstrahlengang, einen vom Lumineszenzobjekt zur Detektionseinrichtung
verlaufenden Detektionsstrahlengang und eine Steuereinrichtung,
wobei mit dem spektral selektiven Element Licht der Laserlichtquelle
mindestens einer Wellenlänge
zur Objektbeleuchtung selektierbar ist, wobei mit dem spektral selektiven
Element das am Lumineszenzobjekt reflektierte und/oder gestreute
selektierte Licht der Laserlichtquelle aus dem Detektionsstrahlengang
ausblendbar ist, wobei zumindest ein Wellenlängenbereich des im Detektionsstrahlengang verlaufenden
Lichts mit der spektral selektiven Detektionseinrichtung detektierbar
ist und wobei mit der Steuereinrichtung das spektral selektive Element
und die spektral selektive Detektionseinrichtung derart aufeinander
abstimmbar sind, dass ein von der spektral selektiven Detektionseinrichtung
erzeugtes Detektionssignal maximierbar ist.
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Erfindungsgemäß ist zunächst erkannt worden, dass ein
konfokales Rastermikroskop mit einem nahezu stufenlos variabel einstellbaren
spektral selektiven Element und einer nahezu stufenlos variabel einstellbaren
spektral selektiven Detektionseinrichtung dann in ganz besonders
vorteilhafter Weise vielseitig einsetzbar ist, wenn eine Laserlichtquelle
vorgesehen ist, die simultan Licht mehrerer Wellenlängen emittiert.
Insoweit kann für
einen Detektionsvorgang des Lumineszenzobjekts Licht zweier oder
dreier Wellenlängen
simultan selektiert und zur Objektbeleuchtung verwendet werden.
Das durch die Objektbeleuchtung hierdurch induzierte Lumineszenzlicht
vom Lumineszenzobjekt kommend kann optimal detektiert werden. Mit
dem nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral selektiven
Element ist eine Einkopplung der einzelnen zu selektierenden Wellenlängen der
Laserlichtquelle in den Beleuchtungsstrahlengang möglich, wobei
das spektral selektive Element das vom Lumineszenzobjekt kommende
Licht – also
das am Lumineszenzobjekt reflektierte und oder gestreute selektierte
Beleuchtungslicht der Laserlichtquelle und das Lumineszenzlicht – wie ein
herkömmlicher
dichroitischer oder multichroitischer Strahlteiler separiert. Das
am Lumineszenzobjekt reflektierte und/oder gestreute selektierte
Beleuchtungslicht der Lichtquelle wird nämlich aus dem Detektionsstrahlengang
ausgeblendet und – aufgrund der
Umkehrbarkeit des Lichtwegs – zur
Laserlichtquelle geleitet. Das Lumineszenzlicht hingegen passiert
das spektral selektive Element zur Detektionseinrichtung hin. Der
spektrale Bereich des Lichts, der von dem spektral selektiven Element
aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet und zurück zur Laserlichtquelle
hin reflektiert wird, kann üblicherweise
sehr klein eingestellt werden, so dass in besonders vorteilhafter
Weise nahezu das gesamte Lumineszenzlicht der Detektionseinrichtung
zugeführt werden
kann. Lediglich ein minimaler spektraler Anteil, der typischerweise
der Wellenlänge
des Beleuchtungslichts plus minus 2 nm entspricht, wird nicht zur
Detektionseinrichtung geleitet.
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Nun ist eine Steuereinrichtung vorgesehen, mit
der sowohl das spektral selektive Element als auch die spektral
selektive Detektionseinrichtung eingestellt wird. Hierzu sind das
spektral selektive Element und die spektral selektive Detektionseinrichtung
dahingehend aufeinander abstimmbar, dass ein von der spektral selektiven
Detektionseinrichtung erzeugtes Detektionssignal maximierbar ist.
So könnte die
Steuereinrichtung zunächst
das spektral selektive Element derart einstellen, dass hierdurch
die Wellenlänge
bzw. die Wellenlängen
des zur Lumineszenzobjektbeleuchtung dienenden Lichts der Laserlichtquelle
festgelegt wird. Hierbei kann auch die Leistung des Lichts der jeweiligen
Wellenlänge – ebenfalls
von der Steuereinrichtung initiiert – entsprechend festgelegt werden.
Sodann könnte
von der Steuereinrichtung die spektral selektive Detektionseinrichtung
bezüglich
ihrer spektralen Detektionscharakteristik auf die Einstellung des
spektral selektiven Elements abgestimmt werden. Hierzu kann sich
die Steuereinrichtung beispielsweise eines Expertensystems oder selbstlernender
Algorithmen – beispielsweise
neuronaler Netzwerke – oder
Methoden der Fuzzy-Logic bedienen. So könnte bei einer Berücksichtigung
der Lumineszenzeigenschaften des Lumineszenzobjekts – beispielsweise
durch Eingabe des Mikroskopbedieners – das Expertensystem der Steuereinrichtung eine
entsprechende spektrale Einstellung der Detektionseinrichtung vornehmen.
Zusätzlich
oder alternativ könnten
mehrere Detektionen desselben Lumineszenzobjekts vorgesehen sein,
die bei unterschiedlichen Einstellungen der spektral selektiven Detektionseinrichtung
durchgeführt
werden, wobei eine Auswahl geeigneter Einstellparameter der spektral
selektiven Detektionseinrichtung anhand der Intensität der jeweils
von der spektral selektiven Detektionseinrichtung erzeugten Detektionssignale
getroffen werden kann, nämlich
beispielsweise dann, wenn das bzw. die Detektionssignale einen maximalen Wert
aufweisen.
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Die Laserlichtquelle umfasst in einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
einen Mehrlinienlaser, insbesondere einen Mischgaslaser. Als Mischgaslaser
bieten sich für
biomedizinische Applikationen insbesondere Argon-, Krypton-, Argon-Krypton- und/oder
Helium-Neon-Laser an, da hierfür
eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen zur Verfügung stehen,
die mit in diesen Lasern anregbar sind. Je nach Ausführung der
Mischgaslaser emittieren diese Licht mehrerer Wellenlängen, beispielsweise
emittiert der Argon-Krypton-Laser Licht bei den Wellenlängen 488
nm, 568 nm und 647 nm. Die Laserlichtquelle könnte allerdings auch einen
Laser bzw. ein Lasersystem umfassen, mit dem die Wellenlänge variabel
durchstimmbar ist. So könnte
die Laserlichtquelle einen Farbstofflaser oder einen OPO (optisch
parametrisierter Oszillator) umfassen.
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Wie bereits erwähnt, umfasst das spektral selektive
Element eine ansteuerbares aktives optisches Bauteil. Hierdurch
ist es, eine entsprechende Ansteuerung vorausgesetzt, nahezu stufenlos
variabel einstellbar. Grundsätzlich
können
alle aus der
DE 199
06 757 A1 bekannten Ausführungsformen eines dort offenbarten
spektral selektiven Elements zum Einsatz bei dem hier vorliegenden
erfindungsgemäßen konfokalen
Rastermikroskop kommen, so dass der Offenbarungsgehalt der
DE 199 06 757 A1 hier ausdrücklich hinzugezogen
und insoweit als bekannt vorausgesetzt wird. Besonders bevorzugt
sind als spektral selektives Element zwei AOTF-Kristalle vorgesehen, wobei eines davon
das aktive optische Bauteil bildet, das mit einer entsprechenden
Ultraschallwelle beaufschlagt wird. Das andere AOTF-Kristall ist
als optisch inaktives Bauteil dem ersten AOTF-Kristall im Detektionsstrahlengang nachgeordnet,
und zwar ist es derart angeordnet, dass es eine spektrale Zerlegung
des vom Lumineszenzobjekt kommenden Lumineszenzlichts sowie eine
eventuelle Drehung der Polarisationsrichtung durch das erste AOTF-Kristall
rückgängig macht. Hierzu
ist das zweite AOTF-Kristall bezüglich
der Längsachse
des ersten AOTF-Kristalls
um 180 Grad verdreht angeordnet.
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Die spektral selektive Detektionseinrichtung umfasst
Mittel zur spektralen Zerlegung des im Detektionsstrahlengang verlaufenden
Lichts. Vorzugsweise ist dieses Mittel in Form eines Prismas ausgeführt. Alternativ
könnte
ein Gitter oder ein Hologramm vorgesehen sein. Weiterhin umfasst
die spektral selektive Detektionseinrichtung Mittel, die einerseits zum
Selektieren eines ersten Spektralbereichs zur Detektion mit einem
ersten Detektor und andererseits Mittel zur Reflektion zumindest
eines Teils des nicht selektierten Spektralbereichs zur Detektion
mit einem zweiten Detektor aufweist. Somit durchläuft das
im Detektionsstrahlengang verlaufende Licht zunächst das beispielsweise in
Form eines Prismas ausgeführte
Mittel zur spektralen Zerlegung und trifft dann – spektral zerlegt bzw. räumlich aufgefechert – auf das
Mittel zum Selektieren eines ersten Spektralbereichs. Der Teil des
spektral zerlegten Lichts, der auf das Mittel zur Reflexion zumindest
eines Teils des nicht selektierten Spektralbereichs auftrifft, wird
zu einem zweiten Detektor reflektiert. Die spektral selektive Detektionseinrichtung
könnte
somit gemäß den Ausführungsformen,
die aus den
DE 43 30
347 A1 und
DE
199 02 625 A1 bekannt sind, ausgeführt sein. Insoweit wird der
Offenbarungsgehalt dieser deutschen Patentanmeldungen hier ausdrücklich hinzugezogen
und ebenfalls insoweit als bekannt vorausgesetzt.
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Falls die Mittel zum Selektieren
des ersten Spektralbereichs bzw. die Mittel zur Reflexion zumindest
eines Teils des nicht selektierten Spektralbereichs durch verschiebbar
angeordnete Blenden, Spaltblenden und/oder Spiegelblenden realisiert sind,
wobei eine Verschiebung bzw. mechanische Verstellung zumindest nahezu
stufenlos erfolgen kann, liegt eine nahezu stufenlos variabel einstellbare
spektral selektive Detektionseinrichtung vor.
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Zur optimalen Einstellung der verschiedenen Parameter
des konfokalen Rastermikroskops ist in einer konkreten Ausführungsform
vorgesehen, dass dasselbe Lumineszenzobjekt mehrmals detektiert wird.
Bei jeder Detektion wird hierbei die Einstellung der Detektionseinrichtung – d.h. also
von einem der einzustellenden Parameter – von einem vorgebbaren größeren zu
einem kleineren spektralen Bereich des ersten, des nicht selektierten
und jedes weiteren Spektralbereichs hin variiert. Diese mehrmaligen
Detektionen desselben Lumineszenzobjekts erfolgen hierbei bei einer
konstanten Beleuchtungssituation, beispielsweise bei einer simultanen
Beleuchtung mit Licht zweier unterschiedlicher Wellenlängen.
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Nun könnten beispielsweise 10 Detektionen des
Lumineszenzobjekts vorgesehen sein, wobei die Detektionseinrichtung
zunächst
so eingestellt wird, dass die Mittel zum Selektieren des ersten
Spektralbereichs einen vorgebbaren größten spektralen Bereich zum
ersten Detektor passieren lassen. Bei der zweiten Detektion könnte dann
eines der Mittel – beispielsweise
eine verschiebbar angeordnete Spiegelblende – zum Selektieren des ersten
Spektralbereichs derart eingestellt werden, dass dann ein kleinerer
spektraler Bereich mit dem ersten Detektor detektierbar ist. In
einer darauffolgenden erneuten Detektion könnte die Einstellung der Detektionseinrichtung
derart verändert
werden, dass dann das andere Mittel – beispielsweise eine verschiebbar
angeordnete Blende – zum
Selektieren des ersten Spektralbereichs einen weiter verkleinerten
spektralen Bereich zum ersten Detektor passieren lässt.
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Die Ergebnisse dieser mehrmaligen
Detektionen könnten
mit der Steuereinrichtung erfasst und ausgewertet werden. Diese
Auswertung könnte
eine Einstellung der Mittel zum Selektieren des ersten Spektralbereichs
der Detektionseinrichtung ergeben, auf der aufbauend die Mittel
zur Reflexion zumindest eines Teils des dann nicht selektierten
Spektralbereichs zur Detektion mit einem zweiten Detektor bei erneuter
mehrmaliger Detektion von einem vorgebbaren größeren zu einem kleineren spektralen
Bereich hin variierbar sind. Weitere kaskadierte Mittel zur Reflexion
eines weiteren Spektralbereichs zu einem weiteren Detektor könnten ebenfalls – sozusagen
iterativ – erfolgen.
Vorzugsweise läuft
die mehrmalige Detektion bei Variation der Einstellung der Detektionseinrichtung
automatisch ab. Bezüglich
dieser Vorgehensweise ist es zweckmäßig, wenn die Steuereinrichtung
in Abhängigkeit
unterschiedlicher Einstellungen der spektral selektiven Detektionseinrichtung
jeweils Detektionssignale aufnimmt und zwischenspeichert. Insbesondere
könnte
vorgesehen sein, dass die Steuereinrichtung die jeweiligen Detektionssignale
miteinander vergleicht und einer entsprechenden Auswertung unterzieht.
Die Steuereinrichtung könnte
einen Steuerrechner aufweisen, wobei der Steuerrechner entsprechende
Schnittstellen zur Ansteuerung bzw. Einstellung des spektral selektiven
Elements, der spektral selektiven Detektionseinrichtung und zum
Auslesen der einzelnen Detektoren aufweist.
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In einer ganz besonders bevorzugten
Ausführungsform
gibt die Steuereinrichtung die Einstellungen des spektral selektiven
Elements, der spektral selektiven Detektionseinrichtung und/oder
des Detektionssignals auf einer Ausgabeeinheit aus. Diese Ausgabeeinheit
könnte
beispielsweise einen oder mehrere Monitore eines Steuerrechners
umfassen. Vorzugsweise erfolgt die Ausgabe in grafischer Form. So
könnte
der spektrale Bereich eines jeden Detektors der spektral selektiven
Detektionseinrichtung durch seine untere und seine obere Grenze,
die jeweils einer Wellenlänge
entspricht, vor einem Hintergrund dargestellt werden, der dem kontinuierlichen
Spektrum des sichtbaren Lichts entspricht. Eine Veränderung
eines Detektionsbereichs eines Detektors der spektral selektiven
Detektionseinrichtung durch den Mikroskopbediener könnte durch
ein interaktives Verschieben einer oder beider Grenzen mit Hilfe
der Computermaus des Steuerrechners erfolgen. In gleicher Weise
könnte
die momentane Einstellung des spektral selektiven Elements ebenfalls grafisch
auf dem Hintergrund ausgegeben bzw. dargestellt werden. Eine Veränderung
des spektral selektiven Elements könnte ebenfalls interaktiv mit
der Computermaus des Steuerrechners erfolgen, so dass in besonders
vorteilhafter Weise insgesamt eine ergonomische und intuitiv einfache
Bedienung des konfokalen Rastermikroskops möglich ist. Somit sind die Einstellungen
des spektral selektiven Elements und der spektral selektiven Detektionseinrichtung
mit Hilfe der Steuereinrichtung vom Rastermikroskopbediener durchführbar, und
zwar insbesondere mit Hilfe der Ausgabeeinheit.
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Zur Selektion des zur Objektbeleuchtung dienenden
Lichts einer oder mehrerer Wellenlängen der Laserlichtquelle ist
im Beleuchtungstrahlengang der Laserlichtquelle eine Selektionseinrichtung
nachgeordnet, wobei die Selektionseinrichtung unmittelbar bei der
Laserlichtquelle angeordnet sein kann. Mit der Selektionseinrichtung
ist neben der Selektion des Lichts einer oder mehrerer Wellenlängen auch noch
die Lichtleistung des Lichts der jeweils selektierten Wellenlänge einstellbar.
Insbesondere könnte eine
Leistungsmodulation mit der Selektionseinrichtung vorgesehen sein,
so dass beispielsweise Fluoreszenzlebensdauerexperimente durchgeführt werden
können.
Im Konkreten könnte
die Selektionseinrichtung ein AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) umfassen,
wobei ein AOTF üblicherweise
im Zusammenhang mit Lasern eingesetzt wird, die Licht im sichtbaren
oder im ultravioletten Wellenlängenbereich
emittieren. Falls ein Laser als Lichtquelle dient, der Licht im
infraroten Wellenlängenbereich
emittiert, könnte
als Selektionseinrichtung ein EOM (Electro-Optical-Modulator) eingesetzt
werden.
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Das mit dem konfokalen Rastermikroskop abgebildete
Lumineszenzobjekt könnte
mit Lumineszenzmarker spezifisch markiert sein. Insbesondere biologische
Objekte könnten
gemäß den aus
dem Stand der Technik bekannten Markierungs- bzw. Färbungsverfahren
mit Fluoreszenzfarbstoffen spezifisch markiert sein.
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Das Lumineszenzobjekt könnte grundsätzlich mit
Methoden der Phosphoreszenzanregung oder der Fluoreszenzanregung
detektierbar bzw. abbildbar sein. Weiterhin ist auch eine Objektdetektion nach
den Methoden der Raman-Mikroskopie denkbar. Die Fluoreszenzanregung
erfolgt bevorzugt mit Mehr-Photonen-Anregungsprozessen, stellvertretend
hierfür
sei eine Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen mit Femtosekunden-
oder Pikosekunden-Lasern genannt, beispielsweise einen gepulstes
Licht emittierenden Titan:Saphir-Laser.
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In verfahrensmäßiger Hinsicht wird die eingangs
genannte Aufgabe durch die Merkmale des nebengeordneten Patentanspruchs
13 gelöst.
Hiernach selektiert zur Objektbeleuchtung ein nahezu stufenlos variabel
einstellbares spektral selektives Element Licht mindestens einer
Wellenlänge
einer mehrere Wellenlängen
emittierenden Laserlichtquelle. Das spektral selektive Element blendet
das am Lumineszenzobjekt reflektierte und/oder gestreute selektierte
Licht der Laserlichtquelle aus dem Detektionsstrahlengang aus, der
vom Lumineszenzobjekt zu einer nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral
selektiven Detektionseinrichtung verläuft. Die spektral selektive
Detektionseinrichtung detektiert zumindest einen Wellenlängenbereich
des im Detektionsstrahlengang verlaufenden Lichts. Eine Steuereinrichtung
stimmt das spektral selektive Element und die spektral selektive
Detektionseinrichtung derart aufeinander ab, dass ein von der spektral selektiven
Detektionseinrichtung erzeugtes Detektionssignal maximiert wird.
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Vorzugsweise dient das erfindungsgemäße Verfahren
zum Betrieb eines konfokalen Rastermikroskops nach einem der Ansprüche 1 bis
12. Insoweit wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den vorangegangenen
Teil der Beschreibung verwiesen.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch
1 nachgeordneten Patentansprüche
und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit
der Erläuterung
des bevorzugten Ausführungsbeispiels
der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte
Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In
der Zeichnung zeigt die einzige
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Fig. eine schematische Darstellung
eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels
eines konfokalen Rastermikroskops zum Abbilden eines Lumineszenzobjekts.
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Mit dem in der einzigen Fig. gezeigten
konfokalen Rastermikroskop wird ein Fluoreszenzobjekt 1 abgebildet.
Ein Argon-Krypton-Laser dient als Laserlichtquelle 2, der
Licht mehrerer Wellenlängen
emittiert. Das von der Laserlichtquelle 2 emittierte Licht passiert
eine Anregungslochblende 3 und trifft auf ein nahezu stufenlos
variabel einstellbares spektral selektives Element 4. Das
spektral selektive Element 4 ist in Form eines AOTF ausgeführt und
selektiert Licht der Laserlichtquelle 2 mindestens einer
Wellenlänge.
Dieses Licht wird, wenn es selektiert ist, in Richtung der Scanneinrichtung 5 abgelenkt.
Das vom spektral selektiven Element 4 nicht selektierte
Licht der Laserlichtquelle 2 passiert das spektral selektive Element 4 ohne
Ablenkung und wird von der Strahlfalle 6 absorbiert.
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Der von der Scanneinrichtung 5 in
zwei senkrecht zueinander stehende Richtungen gescannte Lichtstrahl
des selektierten Lichts durchläuft
ein Mikroskopobjektiv 7, das das zur Anregung dienende Licht
auf das Fluoreszenzobjekt 1 fokusiert. Der Beleuchtungsstrahlengang 23 erstreckt
sich von der Laserlichtquelle 2 bis zum Fluoreszenzobjekt 1.
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Sowohl das am Fluoreszenzobjekt 1 reflektierte
und/oder gestreute selektierte Licht der Laserlichtquelle 2 als
auch das vom Fluoreszenzobjekt 1 emittierte Fluoreszenzlicht
durchläuft
in umgekehrter Richtung das Mikroskopobjektiv 7 und trifft
auf die Scanneinrichtung 5, die den zwischen der Scanneinrichtung 5 und
dem Fluoreszenzobjekt 1 bewegten Lichtstrahl in einen ortsfesten
Lichtstrahl umwandelt und zum spektral selektiven Element 4 reflektiert. Das
spektral selektive Element 4 wiederum blendet das am Fluoreszenzobjekt 1 reflektierte
und/oder gestreute selektierte Licht der Laserlichtquelle 2 aus dem
Detektionsstrahlengang 19 aus, indem das spektral selektive
Element 4 diese Licht in Richtung der Laserlichtquelle 2 ablenkt.
Das Fluoreszenzlicht vom Fluoreszenzobjekt 1 passiert das
spektral selektive Element 4 und – nach dem konfokalen Prinzip – die Detektionslochblende 8 und
tritt somit in die Detektionseinrichtung 9 ein. Die Detektionseinrichtung 9 umfasst
ein Mittel 10 zur spektralen Zerlegung des Fluoreszenzlichts,
das in Form eines Prismas ausgeführt
ist. Weiterhin umfasst die Detektionseinrichtung Mittel 11 und 12,
die zum Selektieren eines ersten Spektralbereichs 13 dienen.
Das Fluoreszenzlicht dieses ersten Spektralbereichs 13 wird
von dem ersten Detektor 14 detektiert. Das Mittel 11 ist
als verschiebbar angeordnete Blende ausgeführt, die von dem Motor 15 entlang
der Richtung des beim Mittel 11 eingezeichneten Doppelpfeils
bewegbar ist. Das Mittel 12 zum Selektieren des ersten
Spektralbereichs 13 ist in Form einer verspiegelten Blende
ausgeführt,
die durch den Motor 16 entlang der Richtung des beim Mittel 12 eingezeichneten
Doppelpfeils bewegbar ist.
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Das am Mittel 12 reflektierte
Fluoreszenzlicht ist der spektrale Anteil des vom Mittel 10 spektral
zerlegten Fluoreszenzlichts, der nicht für den ersten Detektor 14 selektiert
ist. Dieses Licht passiert zumindest größtenteils das Mittel 17 zum
Selektieren des reflektierten Spektralbereichs, das mit dem Detektor 18 detektiert
wird. Der Detektionsstrahlengang 19 erstreckt sich vom
Fluoreszenzobjekt 1 bis zu den Detektoren 14, 18.
Die Linse 20 kollimiert bzw. fokussiert das vom Mittel 10 spektral
zerlegte Fluoreszenzlicht auf die Ebene, in der die Mittel 11 und 12 zum Selektieren
des ersten Spektralbereichs 13 angeordnet sind.
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Weiterhin umfasst das konfokale Rastermikroskop
eine Steuereinrichtung 21, die sowohl das spektral selektive
Element 4 als auch die spektral selektive Detektionseinrichtung 9 derart
aufeinander abstimmt, dass ein von der spektral selektiven Detektionseinrichtung 9 erzeugtes
Detektionssignal maximierbar ist.
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Das spektral selektive Element 4 ist
in Form eines ansteuerbaren aktiven optischen Bauteils ausgeführt, nämlich in
Form eines AOTF.
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Die Detektionseinrichtung
9 ist
im Sinn der im
3 gezeigten Ausführungsform
der
DE 43 30 347 A1 ausgebildet.
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Der Steuereinrichtung 21 ist
eine Ausgabeeinheit 22 zugeordnet, die in Form eines Computerbildschirms
ausgeführt
ist. Die Ausgabeeinheit 22 zeigt einem in der Fig. nicht
gezeigten Mikroskopbediener die momentanen Einstellungen des spektral selektiven
Elements 4, der spektral selektiven Detektionseinrichtung 9 sowie
das Detektionssignals grafisch an.
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Zwischen der Laserlichtquelle 2 und
der Anregungslochblende 3, also im Beleuchtungsstrahlengang 23,
ist eine Selektionseinrichtung 24 der Laserlichtquelle 2 nachgeordnet.
Die Selektionseinrichtung 24 selektiert Licht mindestens
eine Wellenlänge
der Laserlichtquelle 2. Weiterhin kann mit der Selektionseinrichtung 24 die
Leistung des Lichts einer selektierten Wellenlänge eingestellt und moduliert
werden. Die Selektionseinrichtung 24 ist als AOTF ausgeführt.
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Die Steuereinrichtung ist mit dem
spektral selektiven Element 4, mit den Detektoren 14, 18 sowie
den Motoren 15, 16 der Detektionseinrichtung 9 und
mit der Selektionseinrichtung 24 über die Steuer- bzw. Ausleseleitungen 25 verbunden.
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Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen,
dass das voranstehend erörterte
Ausführungsbeispiel
lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dient, diese
jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel
einschränkt.