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Die Erfindung betrifft Verfahren
und Geräte für die zwei-
oder mehrdimensionale Auftrennung von Biosubstanzgemischen, besonders
von Proteingemischen, für
die massenspektrometrische Analyse.
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Die Erfindung besteht darin, die
Trenneffekte, die bei der selektiven Bindung von Biosubstanzen aus
Lösungen
an festen Oberflächen
mit geeigneten Bindungseigenschaften oder bei der fraktionsweisen Auflösung oberflächengebundener
Biosubstanzen durch besonders eingestellte Lösemittelgemische zu erzielen
sind, für
die Trennung in mehrere Fraktionen einzusetzen, und zwei oder mehrere
Generationen solcher Trennvorgänge
mit verschiedenen Trenndimensionen für die Trennung der jeweiligen
Fraktionen in jeweils mehrere Unterfraktionen hintereinanderzuschalten.
Diese Trennungen können
ohne den Einsatz von Chromatographen allein auf Pipettierrobotern
vollautomatisch vorgenommen werden und benötigen weit weniger Zeit als
eine mehrdimensionale Chromatographie oder Elektrophorese. Als reversibel
oberfächenbindende
Materialien sind praktisch alle für die Flüssigkeitschromatographie verwendeten
festen Phasen, aber darüber
hinaus auch selektiv bindende Schichten, beispielsweise Schichten
mit Breitband-Antikörpern,
und affine Belegungen allgemeinerer Art verwendbar. Die bindenden
Oberflächen
können
Beschichtungen auf suspensierbaren Kügelchen sein, vorzugsweise
magnetischen Kügelchen,
aber auch Belegungen von Gefäßwänden, beispielsweise
der Mikrogefäße in Mikrotiterplatten, oder
fleckenweise Belegungen von Probenträgerplatten, beispielsweise
von MALDI-Probenträgerplatten.
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Stand der
Technik
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In der Biochemie, der molekularen
Biologie, der Zellforschung, der pharmakologischen Medikamentenentwicklung
bis hin in die vorklinische und klinische medizinische Forschung
wird die Analyse von komplexen Biosubstanzgemischen immer wichtiger. Die
Biosubstanzgemische können
Proteingemische sein, einschließlich
aller Proteinkonjugate wie Glycoproteine oder Lipoproteine, aber
auch andere Biosubstanzen wie beispielsweise DNA, Polysaccharide,
Metabolite oder Regulationsstoffe wie etwa Cortico-Steroide. Im
Falle der Proteine kann das Gemisch ein vollständiges Proteom sein, das alle
Proteine eines Zellverbandes oder einer Körperflüssigkeit umfasst. Es aber kann
sich auch um ein Teilproteom handeln, das durch eine beliebige Art
einer Grobfraktionierung aus dem Proteom gewonnen wurde, beispielsweise
mit einer Trennung durch Zentrifugieren oder durch breitbandige
Affinitätsextraktion.
Oder es kann sich um eine künstlich
hergestellte Mischung handeln, beispielsweise um eine Mischung zweier
an sich gleicher Teilproteome, deren Zellverbände aber verschiedenen Stresszuständen (Krankheit,
Ernährung,
Temperatur, Pharmaka) unterworfen waren und deren Proteine verschieden
markiert wurden, um sie in der massenspektrometrischen Analyse wieder
ihrer Herkunft zuordnen zu können.
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Das Ziel der Analyse kann eine einfache Identifizierung
der Biosubstanzen des Gemischs sein, oder aber die Feststellung
der relativen Häufigkeiten
im Vergleich zu einem Standard, beispielsweise für diagnostische Zwecke. Im
Falle der Proteine kann es sich um die Suche nach strukturell abweichenden
Proteinen handeln, die beispielsweise durch mutative, posttranslationale
oder regulatorische Veränderungen
entstanden sind. Sehr häufig wird
die differentielle Expressionsanalyse angewandt, die die Konzentrationen
der gebildeten Proteine in Abhängigkeit
von Stresssituationen untersucht.
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Die massenspektrometrische Analyse
verlangt immer eine vorhergehende Trennung der Biosubstanzen, beispielsweise
mit chromatographischen oder elektrophoretischen Trennverfahren,
damit ein klar interpretierbares Massenspektrum entsteht. Im Falle
von Proteinen wird die Analyse manchmal nach einer Trennung an den
unveränderten
Proteinen durchgeführt,
insbesondere, wenn es sich um kleinere Proteine im Bereich bis zu
maximal etwa 50 Aminosäuren
handelt. Enthält
das Gemisch größere Proteine,
so wird vorzugsweise der massenspektrometrischen Analyse ein enzymatischer
Verdau der Proteine vorgeschaltet. Der Verdau kann im Prinzip vor
oder nach der chromatographischen oder elektrophoretischen Trennung
vorgenommen werden. Auch andere Biosubstanzen können einer enzymatischen oder
chemischen Spaltung unterworfen werden.
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Die chromatographische oder elektrophoretische
Auftrennung vor einem enzymatischen Verdau hat bei Proteinen einen
unschätzbaren
Vorteil: Es ist die Zusammengehörigkeit
der Verdaupeptide zu einem Protein bekannt. Damit liefern allein
die exakt vermessenen Massen der Verdaupeptide bereits ein Muster,
mit dem in Proteinsequenzdatenbanken eine Identifizierung anhand
eines virtuellen Verdaus der Datenbank-Proteine vorgenommen werden
kann. Nur in Fällen
der Mehrdeutigkeit dieser Suchergebnisse müssen Fragmentionenspektren
aufgenommen und zur Bestätigung
der Identifizierung herangezogen werden. Wird die Trennung nach
dem enzymatischen Verdau vorgenommen, so ist immer eine Fragmentionenmessung
notwendig, um das Verdaupeptid zu identifizieren. Die Trennung nach
dem Verdau hat aber den großen
Vorteil, dass standardisierte Analysenmethoden erarbeitet werden
können,
die praktisch unabhängig
von der Art des Proteingemischs sind, die also auf Membranproteine
genau so gut anwendbar sind wie auf Peptide der Körperflüssigkeit..
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Komplexe Gemische von Proteinen,
die man vor einem enzymatischen Verdau trennen möchte, werden heutzutage in
der Regel durch 2D-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Dabei wird für gewöhnlich SDS-PAGE
eingesetzt, das ist Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese mit Natriumdodecylsulfat
als Solubilisierungsmittel für
die Proteine. In einer Richtung werden die Proteine (noch ohne SDS)
durch ihren isoelektrischen Punkt (ihre mittlere ionische Ladung
bei der Dissoziierung der Proteine in wässriger Lösung) in einem fixierten pH-Gefälle getrennt,
in der anderen Richtung (mit SDS) durch ihre größenbestimmte, elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit
durch das Gel. Diese ist weitgehend der Masse der Proteinmoleküle proportional.
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Für
eine massenspektrometrische Analyse färbt man die Proteine im Gel
an, stanzt die angefärbten
Gelstückchen
aus, verdaut die Proteine in den Gelstückchen durch Enzyme, in der
Regel durch Trypsin, extrahiert die so entstandenen Verdaupeptide,
und misst deren exakten Massen und deren Sequenz mit Hilfe von massenspektrometrischen
Methoden. Für
die Aufgabe des Ausstechens und Verdauens gibt es kommerziell vertriebene
Roboterstationen.
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Für
die Analyse der Gemische von Verdaupeptiden haben sich massenspektrometrische
Messmethoden mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption
(MALDI = Matrix-Assisted Laser Desorption and Ionization) oder durch
Elektrosprühen (ESI
= Electro Spray Ionization) als Standardverfahren etabliert. Meist
werden dazu Flugzeitmassenspektrometer (TOF-MS = Time-Of-Flight
Mass Spectrometer) verwendet, es können hier aber auch Ionenzyklotron-Resonanzspektrometer
(FT-ICR = Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance) oder Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallenmassenspektrometer
(kurz: Ionenfallen) eingesetzt werden. Alle drei Arten von Massenspektrometern
erlauben insbesondere die Aufnahme von Fragmentionenspektren ausgewählter Primärionen,
die zur eindeutigen Identifizierung der Proteine in Sequenzdatenbanken
verwendet werden können
oder aus denen die Sequenz des Aufbaus der Peptide aus den Aminosäuren ganz oder
zumindest teilweise abgelesen werden kann.
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Es hat sich dabei erwiesen, dass
auch schlechte Auftrennungen noch zu guten Resultaten führen: Wenn
in einem ausgestanzten Gelstückchen unaufgetrennt
zwei, drei oder mehrere Proteine enthalten sind, deren Verdaupeptide
sich vermischen, so lassen sich auch diese noch gut identifizieren, selbst
wenn keine Fragmentionenspektren aufgenommen werden. Die Güte und die
Eindeutigkeit der Identifizierung hängt dabei stark von der Genauigkeit der
Massenbestimmung ab, die bei einigen der genannten Typen von Massenspektrometern
heute extrem gut ist. Die Aufnahme von Fragmentionenspektren verbessert
die Identifizierung nochmals dramatisch: so können auch Überlappungen von sechs bis acht
Proteinen noch festgestellt und identifiziert werden. Dieses Verfahren
ist im Prinzip nur durch den Substanzverbrauch bei der Aufnahme
der vielen Fragmentionenspektren und durch die zunehmende Überlappung
der Isotopengruppen einzelner Verdaupeptide begrenzt. Für die Aufnahme
der geeigneten Fragmentionenspektren wird heute in ersten Ansätzen eine
datenabhängige
Rücksteuerung
eingesetzt, um die substanzverbrauchenden Fragmentionenspektren
nur von solchen Peptiden zu gewinnen, für deren Herkunft aus Proteinen
noch keine sichere Erkenntnis besteht.
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Die 2D-Gel-Elektrophorese ist aber
schwierig zu handhaben und liefert auch in erfahrenen Laboratorien
nicht immer reproduzierbare Ergebnisse. Sie dauert lange: in der
Regel mehrere Tage. Es wird daher seit langem nach Verfahren gesucht,
die die 2D-Gel-Elektrophorese ablösen können.
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Ein viel benutztes Verfahren besteht
darin, die Proteine des Gemischs vor einer Auftrennung enzymatisch
zu verdauen, und die Verdaupeptide erst dann einer Separation zu
unterwerfen. Dabei wird für gewöhnlich eine
2D-Chromatographie angewandt, bei der das nunmehr sehr komplexe
Gemisch aus Tausenden von Verdaupeptiden zunächst einer Trennung durch Flüssigkeitschromatographie
mit einem ersten Säulenmaterial
in Hunderte von Fraktionen unterworfen wird, die einzelnen Fraktionen
werden danach mit anderen Säulenmaterialien
nochmals aufgetrennt und der Massenspektrometrie zugeführt. Die
zweiten chromatographischen Trennungsläufe werden in der Regel in
LC-MS-Kopplungen mit Ionisierung durch Elektrosprühen durchgeführt, wobei automatisch
Fragmentionenspektren der einzelnen Peptide aufgenommen werden.
Aus dem Wust von Peptid-Fragmentionenspektren werden datentechnisch
die originalen Proteine anhand ihrer Zusammengehörigkeit in Protein-Sequenzdatenbanken wieder
zusammengesetzt. Dieses Verfahren hat aber ebenfalls den Nachteil
einer langen Dauer, da jeder der chromatographischen Trennläufe etwa
eine halbe Stunde (oder sogar sehr viel länger) dauert. Ähnliches
gilt für
die Kopplung chromatographischer und kapillarelektrophoretischer
Trennläufe.
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Viele Arbeiten beschäftigen sich
damit, diese Vielzahl an Verdaupeptiden zu reduzieren. Sie konzentrieren
sich beispielsweise darauf, nur jeweils ein Verdaupeptid aus jedem
originären
Protein zurückzubehalten.
Auf diese Arbeiten soll aber hier nicht weiter eingegangen werden.
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Es gibt aber auch einen grundsätzlich anderen
Ansatz zur Trennung von Proteingemi-, schen, der aber bisher kaum
Eingang in die massenspektrometrische Analyse gefunden hat. Es ist
die Auftrennung über
selektive Bindungen, wie sie besonders in den vielfältigen Assays
unter Benutzung von Array-Chips verwendet wird. In den einzelnen
Feldern der Array-Chips werden dabei Schichten aufgetragen, die
wie etwa Antikörper-
oder DNA-Schichten, einzelne Proteine selektiv binden können. Bei
der Herstellung von Array-Chips bemüht man sich, möglichst
so stark selektive Schichten zu erzeugen, dass nur ein einziges
Protein gebunden wird. Das gelingt jedoch nicht immer, da alle Schichten
mehr oder weniger auch andere Proteine binden. Es ist daher festzustellen,
dass es zwischen solchen Schichten, die praktisch alle Proteine
binden, und solchen, die nur eine einzige Art von Protein binden,
eine große
Palette an mehr oder weniger breitbandig selektiven Schichten gibt,
die bisher kaum für
eine Trennung ausgenutzt wurden.
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Aufgabe der
Erfindung
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Es ist die Aufgabe der Erfindung,
eine schnelle, mehrdimensionale Auftrennung der Substanzen eines
Biosubstanzgemischs, vorzugsweise eines Proteingemischs, zu ermöglichen
und die dafür benötigten Geräte und Chemikalien
in einfach handhabbaren Zusammenstellungen bereitzustellen. Die Auftrennung
soll automatisierbar und in wenigen Stunden durchführbar sein.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die Erfindung besteht darin, die
Trenneffekte, die bei der fraktionsweisen Bindung von Proteinen aus
Lösungen
an festen Oberflächen
mit geeigneten Bindungseigenschaften oder bei der fraktionsweisen Lösung gebundener
Proteine von Oberflächen
durch besonders eingestellte Lösemittelgemische
zu erzielen sind, für
die Trennung in mehrere Fraktionen einzusetzen, und zwei oder mehrere
Generationen solcher Trennvorgänge
in mehreren Trenndimensionen für
die Trennung der jeweiligen Fraktionen in jeweils mehrere Unterfraktionen
hintereinanderzuschalten. Diese Trennungen beruhen auf jeweiligen
stationären
Gleichgewichten zwischen der Bindung der Biosubstanzen an bindefähigen Oberflächen und
ihrer Lösung
in einem Lösemittel.
Sie können
ohne den Einsatz von Chromatographen allein auf Pipettierrobotern
vorgenommen werden und benötigen
viel weniger Zeit als eine mehrdimensionale Chromatographie oder
Elektrophorese. Als reversibel oberfächenbindende Materialien sind
praktisch alle für
die Flüssigkeitschromatographie
verwendeten festen Phasen, aber darüber hinaus auch selektiv bindende Schichten,
beispielsweise Schichten mit Antikörpern, und affine Belegungen
allgemeinerer Art verwendbar. Die bindenden Oberflächen können Beschichtungen
auf suspensierbaren Kügelchen
sein, vorzugsweise magnetischen Kügelchen, aber auch Belegungen
von Gefäßwänden, beispielsweise
der Mikrogefäße in Mikrotiterplatten,
oder fleckenweise Belegungen von Probenträgerplatten sein, beispielsweise
von MALDI-Probenträgerplatten.
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Es sind somit Schritte mit lösemittelabhängig fraktionierendem
Ablösen
der oberflächengebundenen
Proteine mit Schritten selektiver Oberflächenbindung aus Lösungen mischbar,
doch ist die Mischung dieser verschiedenen Verfahren keine notwendige Voraussetzung
für die
Erfindung.
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Im Gegensatz zur dynamischen Trennung von
Substanzgemischen in Chromatographen mit mobilen flüssigen Phasen,
die Trennvermögen
von vielen Hundert oder sogar Tausend theoretischen Böden aufweisen,
handelt es sich bei dem fraktionierenden Ablösen um die Ausnutzung stationärer Lösungsgleichgewichte,
die nur einige Zig theoretische Böden Trennvermögen haben.
Durch das fraktionierende Lösen
mit stufenweise veränderten
Lösemitteln,
beispielsweise durch Lösungen
mit steigenden Konzentrationen an Salzen für Bindungen an Ionenaustauschern,
oder durch steigende Konzentrationen von organischen Lösemitteln
in wässriger
Lösung
für Bindungen
an Umkehrphasen, lassen sich jeweils mehrere Fraktionen gewinnen.
Durch ein mehrfaches Auswaschen einer gebundenen Fraktion von Proteinen
mit frischem Lösemittel
gleicher Konzentration lässt
sich die Trennleistung verbessern. Für diese Art der Trennung werden
die in der Chromatographie üblicherweise
eingesetzten festen Phasen verwendet. Die physikalischen Dimensionen
der Trennung können
die Molekülgröße betreffen,
wie in der „Size
Exclusion Chromatography",
oder die Ladungsdissoziation der Moleküle in Lösung, wie in der Ionenaustauscher-Chromatographie,
oder die Hydrophobie der Moleküle,
wie in der Umkehrphasen-Chromatographie.
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Hinzu kann die Verwendung von selektiv
bindenden Oberflächen
kommen, die gerade wegen ihrer mehr oder weniger starken Selektivität noch wenig
chromatographisch eingesetzt werden. Im Grenzfall kann ein oberflächengebundener
Antikörper
ein einzige Art von Proteinmolekülen
aus der betreffenden Fraktion herausfischen, doch stehen hier die breitbandselektiven
Oberflächen
im Vordergrund. Die physikalische Dimension der Trennung wird durch Oberflächeneigenschaften
der Moleküle
im Allgemeinen bestimmt, im Besonderen kann beispielsweise eine
Trennung nach Oberflächenmotiven
der Moleküle
erzielt werden, beispielsweise der Anordnung bestimmter Aminosäuren zueinander
an der Oberfläche
der gefalteten Proteine, oder auch nur eine kurze Reihenfolge von
Aminosäuren
bei einem ungefalteten Peptid. Eine in einem vorhergehenden Schritt
gewonnene Fraktion mit Proteinen ist dann mehreren selektiv bindenden
Oberflächen
nacheinander zuzuführen,
wobei jeweils ein Teil der Proteine selektiv gebunden wird. Auch
die Restlösung
der Fraktion nach Herausnahme aller an den verwendeten Schichten selektiv
gebundenen Proteine kann noch einen Teil der Proteine enthalten,
die für
die weitere Analyse bereitstehen. Die selektiv gebundenen Proteine
lassen sich wiederum entweder gemeinsam auflösen, oder aber, beispielsweise
durch steigende Anteile an organischen Lösemitteln in wässriger
Lösung,
auch wieder fraktionierend.
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Es können dann in weiteren Trenndimensionen
weitere Fraktionierungen folgen. Es entsteht so als Endprodukt eine
mehrdimensionale Matrix verschiedener Fraktionen, bei der jeweils
die Komplexität
der Mischung gegenüber
dem ursprünglichen
Gemisch soweit herabgesetzt ist, dass die Fraktionen problemlos
massenspektrometrisch analysiert werden können.
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Vor oder nach einer beliebigen Trenndimension
kann dabei ein enzymatischer Verdau der getrennten Proteine eingeschaltet
werden. Der Verdau kann in freier Lösung, aber auch affin gebunden durchgeführt werden.
Dem Verdau muss in der Regel nochmals ein Waschen der Verdaupeptide
nachgeschaltet werden, das Waschen kann aber auch mit der Probenpräparation
auf einem IVIALDI-Probenträger
gekoppelt werden.
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Die bindenden Schichten können an
Gefäßwänden oder
Oberflächenflecken
angebunden sein, sie können
aber auch Schichten auf kleinen Partikelchen bilden. Die Partikelchen
können
einerseits kleine, suspensierte Kügelchen oder Kleinpartikel
anderer Form (im Bereich von 50 Nanometer bis 100 Mikrometer Durchmesser)
mit entsprechender Oberflächenbelegung,
vorzugsweise einer porösen
Oberflächenbelegung,
sein. Die Kügelchen
können
einen magnetischen Kern besitzen, um sie durch bekannte Einrichtungen
an Gefäßwänden zu
halten oder periodisch durch Waschflüssigkeiten zu ziehen. Es kann sich
bei den Partikelchen andererseits aber auch um größere Teilchen
(mit Volumen von etwa 0,01 bis 1 Kubikmillimeter) aus offenporigem
Festschaum oder frittenförmig
zusammengebackenen Kleinpartikeln handeln. Sowohl die Festschäume wie
auch die Kügelchen
können
als frei herumschwimmende Teilchen in Flüssigkeiten (beispielsweise
als Suspensionen), wie auch oberflächengebunden verwendet werden.
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Die Schritte des Verfahrens werden
bevorzugt auf Pipettier- oder Dispensierrobotern durchgeführt. Sie
können
beispielsweise in Mikrotiterplatten ablaufen und die getrennten
Proteine können
in einem letzten Schritt auf MALDI-Probenträgerplatten aufpräpariert
werden. Die dabei verwendeten Mikrotiterplatten können vorgefertigt
alle verwendeten Partikelsuspensionen, Wandbelegungen, Waschflüssigkeiten,
Lösungen
mit eingestellten Salzgehalten, Enzyme, Pufferlösungen zur Aktivierung der
Enzyme, Proben mit Massenreferenzen und Matrixlösungen für die Präparation der Proben für die Ionisierung durch
matrixunterstützte
Laserdesorption enthalten. Die Lösungen
mit steigenden Gehalten an organischen Lösungsmitteln, beispielsweise
Methanol oder Acetonitril, können
vom Pipettierroboter selbst hergestellt werden. Die Mikrotiterplatten
können,
gegebenenfalls zusammen mit anderen Verbrauchsmaterialien wie beispielsweise
den Pipettenspitzen, in gebrauchsfertigen Verbrauchspackungen in
den Handel kommen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann selbstredend
auch mit anderen, beispielsweise chromatographischen oder elektrophoretischen,
Trennvorgängen
gekoppelt werden, die dem erfindungsgemäßen Verfahren vorhergehen oder
nachfolgen.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 zeigt
einen Querschnitt durch eine Mikrotiterplatte (1) mit acht
Mikrogefäßen (2),
die jeweils im unteren, konischen Teil eine Wandbelegung (3)
mit einem geeigneten oberflächlich
bindenden Material haben.
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2 zeigt
eines dieser Mikrogefäße (2)
mit einer eingeführten
Pipettenspitze (4, 5, 6, 7)
eines Pipettierroboters. Die auswechselbare Pipettenspitze hat einen
Schaft (4) mit Kanüle
(7) und eine besonders geformte Konusspitze (5),
die in den Konus des Mikrogefäßes so eingepasst
ist, dass nur ein schmaler Spalt zwischen Wandbelegung (3)
und Konusspitze (5) bleibt. Durch mehrere Ansaug- und Ausstoßvorgänge kann
die Flüssigkeit
in der Pipettenspitze in guten Kontakt mit der Wandbelegung (3)
gebracht werden, damit Wasch-, selektive Bindungs- und selektive
Lösungsvorgänge besonders
effektiv ablaufen können.
Die Konusspitze hat kleine Noppen (6) die sich an die Wand
anlegen und die Konusspitze so justieren, dass selbst kleinste Flüssigkeitsmengen aus
den Mikrogefäßen wieder
abgesaugt werden können.
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Besonders
günstige
Ausführungsformen
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Die Erfindung besteht darin, eine
erste diskrete n-fache Fraktionierung der Substanzgemischprobe vorzunehmen
und jede (oder auch nur einige) der n Fraktionen mindestens einer
zweiten diskreten m-fachen Fraktionierung einer anderen Trenndimension
zu unterwerfen. Die n×m-fach
(oder auch weniger) fraktionierten Proben werden, wahlweise unter Vor- oder Nachschalten
weiterer Fraktionierungen durch andere Trennverfahren oder eines
enzymatischen Verdaus, massenspektrometrisch untersucht, wobei vorzugsweise
Massenspektrometer mit Einrichtungen zur Messung von Fragmentionenspektren verwendet
werden.
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Ein bevorzugtes Verfahren verwendet
einen Pipettierroboter und vorgefertigte, mit aufgeklebten Folien
versiegelte Mikrotiterplatten, die die benötigten Wandbelegungen oder
Partikelsuspensionen, Waschflüssigkeiten,
Extraktionsflüssigkeiten
mit eingestellten Salzgehalten, Enzyme, Pufferlösungen zur Aktivierung der
Enzyme und Matrixlösungen
für die Präparation
der Proben für
die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption enthalten.
Die Verschlussfolien können
von Pipettenspitzen durchstochen oder vor Gebrauch abgezogen werden.
Die wässrigen
Lösungen
mit steigenden Gehalten an organischen Lösungsmitteln, beispielsweise
Acetonitril, können
vom Pipettierroboter selbst hergestellt werden. Der Pipettierroboter
kann ebenfalls die für MALDI-Präparationen
der getrennten Proteine auf entsprechenden Probenträgerplatten
notwendigen Schritte vornehmen, wobei die Probenträgerplatten bevorzugt
ebenfalls die Größe von Mikrotiterplatten haben.
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Unter Verwendung von Mikrotiterplatten kann
ein erfindungsgemäßes Verfahren
für ein
als Beispiel gewähltes
Proteingemisch aus folgenden Schritten bestehen, wobei dem erfindungsgemäßen Verfahren
mit zwei Trenndimensionen hier als Beispiel eine erste Trenndimension
durch Size-Exclusion vorgeschaltet ist. Die Size-Exclusion-Chromatographie
ist hier nicht Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens, weil sie keine
Bindung an Oberflächen beinhaltet.
Das kombinierte Verfahren hat somit drei Trenndimensionen, die beiden
letzten gehören
zum erfindungsgemäßen Verfahren:
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Das kombinierte Verfahren nimmt
in Schritt (1) eine Trennung des Proteingemischs nach Größe der Moleküle auf einer
Size-Exclusion-Mikrosäule
in acht Fraktionen vor. Diese Trennung auf einer Mikrosäule kann
leicht auf einem Pipettierroboter implementiert werden. (2) Die
so gewonnenen acht Fraktionen der ersten Dimension des kombinierten
Verfahrens werden in acht Mikrogefäße gegeben, deren Wandoberflächen mit
Ionenaustauschermaterial belegt sind, und die Proteine werden dort
ionisch gebunden. (3) Die in den Ionenaustauschern gebundenen Proteingemische
werden mehrfach mit einer Waschflüssigkeit gewaschen, die die
Proteine nicht löst.
(4) Die Proteine werden in der ersten Trenndimension des erfindungsgemäßen Verfahrens
(also in der zweiten Dimension des kombinierten Verfahrens) in sechs
Stufen in wässerigen
Salzlösungen
steigender Konzentrationen (beispielsweise Ammoniumchlorid) ausgelöst und die
jeweils sechs, also insgesamt 48 Fraktionen werden jetzt in Mikrogefäße gegeben,
die mit affinitätssorbierenden
Umkehrphasen belegt sind, wobei die Proteine dort affin gebunden werden.
Es sind jetzt die Proteine in den 48 Fraktionen grob nach Molekülgröße und Molekülladung
sortiert, eine Sortierung, wie sie grundsätzlich auch der 2D-Gelelektrophorese
zugrunde liegt. (5) Die Proteine aller 48 Fraktionen werden jeweils
mit Waschflüssigkeiten
gewaschen, um sie vom Salz zu befreien, wobei die Flüssigkeiten
so gewählt
sind, dass sie keine Proteine lösen.
(6) Die Proteine werden in der zweiten Trenndimension des erfindungsgemäßen Verfahrens
(der dritten Trenndimension des kombinierten Verfahrens) in jeweils
acht Stufen in Lösungsgemischen
gelöst,
die steigende Anteile an organischen Lösungsmitteln (beispielsweise
mit Acetonitril) in wässeriger
Lösung
enthalten. Dabei werden die Proteine nach ihrer Hydrophobie getrennt,
wie dieses in der Umkehrphasen-Chromatographie
geschieht. (7) Die nunmehr 384 Fraktionen werden auf eine MALDI-Probenträgerplatte
aufgetragen, die bereits mit einer Matnx-Dünnschicht belegt ist. Diese
Dünnschicht
bindet die Proteine affin. (8) Die Probenträgerplatte wird in üblicher
Weise der massenspektrometrischen Untersuchung in einem-Fugzeitmassenspektrometer
zugeführt,
wobei wahlweise auf der Probenträgerplatte
auch ein Waschschritt zwischengeschaltet sein kann.
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Dieses Verfahren kann sehr leicht
auf einem Pipettierroboter implementiert und automatisiert werden.
Günstig
ist dabei ein Pipettierroboter mit acht Pipettennadeln, da dann
jeweils acht Trenn- und Waschvorgänge parallel ablaufen können. Die
Automatisierung ist hier viel leichter durchzuführen als mit anderen Arten
von Trennverfahren.
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Natürlich ist es auch möglich, das
Verfahren so einzuengen, dass nur die Fraktion der leichten Peptide
aus der Size-Exclusion-Chromatographie den nachfolgenden Schritten
des erfindungsgemäßen Verfahrens
unterworfen wird. Diese bedürfen dann
zu ihrer Analyse keines enzymatischen Verdaus. Es kann aber auch
dem Schritt (6) ein enzymatischer Verdau, beispielsweise
durch Trypsin, folgen. Dabei können
alle Proteine dem Verdau unterworfen werden, oder auch nur die größeren Moleküle, die
ja bereits in Schritt (1) von den kleineren Peptiden getrennt
wurden.
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Es wird für die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens
zweckmäßigerweise
eine Mikrotiterplatte mit 96 Mikrogefäßen verwendet, von denen acht
an den Innenwänden
mit Ionenaustauschern belegt sind, und 48 mit Umkehrphasen. Die
Mikrogefäße können mit
einer durchstechbaren Folie verschlossen sein. Sowohl Ionenaustauschermaterialien
wie auch Umkehrphasen können
in den jeweiligen Mikrogefäßen gleich
sein, können
aber auch auf die vorhergehende Trennung nach Molekülgrößen abgestimmt
sein. Die restlichen Mikrogefäße dieser
wie auch weiterer Mikrotiterplatten können Waschflüssigkeiten,
Auslöseflüssigkeiten,
Enzyme, Aktivierungspuffer für
die Enzyme und dergleichen mehr enthalten. Es kann bevorzugt ein
Pipettierroboter mit acht Pipettiernadeln verwendet werden. Das
Verfahren kann dann (außer
dem tryptischen Verdau) in etwa zwei Stunden durchgeführt werden.
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Die wandbelegten Mikrogefäße können dabei
eine besondere, unten konische Form haben, die auf Formen von austauschbaren
Pipettierspitzen abgestimmt sind, wie in 2 gezeigt. Die aufeinander abgestimmten
Formen dienen dazu, die Wasch- oder Eluierungsflüssigkeiten gut in Strömungskontakt
mit den Wandbelegungen zu bringen, wobei ein mehrfaches Ansaugen
und Ausstoßen
der Flüssigkeit
einen besonders guten Wasch- oder Löseeffekt ergibt. Noppen an
der Pipettierspitze verhindern ein vollständiges Anliegen an der Wand.
Die Pipettierspitze dieser Form kann die Flüssigkeit auch praktisch vollständig wieder
entfernen.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung bedient
sich nicht der Wandbelegungen in den Mikrogefäßen, sondern verwendet Suspensionen
mit winzigen Partikelchen mit Oberflächenbelegungen, wie sie ebenfalls
bereits im Handel sind, vorzugsweise Magnetkügelchen. Die Magnetkügelchen
können Durchmesser
von 50 Nanometer bis etwa 10 Mikrometer haben. Dazu werden besondere
Einrichtungen auf den Pipettierrobotern aufgebracht, die über versetzbare
Magnete erlauben, die Kügelchen
durch die Flüssigkeit
mehrfach langsam hin- und
herzuziehen oder zum Entfernen der Flüssigkeit an der Wand festzuhalten.
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Die Partikelchen können aber
auch – statt
als Suspension verwendet zu werden – auf einer flachen Oberfläche in stark
hydrophober Umgebung flächig aufgebracht
sein. Dabei können
auch Partikelchen mit größeren Durchmessern
und Partikelchen ohne Magnetisierbarkeit verwendet werden. Sie können beispielsweise
aufgeklebt sein. Die Wasch- und Löseflüssigkeiten werden dabei einfach
als Tröpfchen aufpipettiert
oder mit Piezo-Dispensern aufdispensiert.
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Unter „Partikelchen" werden hier ganz
allgemein Materialien mit großer
aktiver, äußerer oder
innerer Oberfläche
verstanden. Das können
einerseits kleine, suspensierte Kügelchen oder Kleinpartikel
anderer Form (im Bereich von 5 bis 100 Mikrometer Durchmesser) mit
entsprechend aktivierter Oberflächenbelegung,
vorzugsweise einer porösen
Oberflächenbelegung
sein. Die Kügelchen
können
einen magnetischen Kern besitzen, um sie durch bekannte Einrichtungen
an Gefäßwänden zu
halten oder durch Waschflüssigkeiten
zu ziehen. Es kann sich bei den Partikelchen andererseits aber auch
um größere Teilchen
(mit Volumen von etwa 0,01 bis 1 Kubikmillimeter) aus offenporigem
Festschaum oder frittenförmig zusammengebackenen
Kleinpartikeln handeln. Sowohl die Festschäume wie auch die Kügelchen
können
als frei herumschwimmende Teilchen in Flüssigkeiten (beispielsweise
als Suspensionen), wie auch oberflächengebunden, wie auch eingeschlossen
in Mikrosäulen
oder Pipettenspitzen verwendet werden.
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Für
die Aufreinigung von Peptid-, Protein- oder DNA-Mischungen haben
sich bisher besonders schwammartige Mikrokügelchen aus Umkehrphasen-Material
(Poros©,
ABI Bio-Systems),
mit schwammartigen Umkehrphasenmaterial gefüllte Pipettenspitzen (ZipTips©,
Millipore) oder magnetisierbare Kügelchen mit C18-Belegung bewährt. Diese Materialien
binden Peptide oder Oligonukleotide über hydrophobe Bindungen. Die
Biomoleküle
lassen sich in der Regel durch wässrige
Methanol- oder Acetonitril-Lösungen
eluieren; die Eluierung stufenweise mit jeweils veränderten
Anteilen an organischen Lösemitteln
oder auch stufenweise durch jeweilige Änderung des pH-Wertes vorgenommen
werden. Alle diese Materialien lassen sich auch im Rahmen der erfindungsgemäße Trennung
von Substanzen verwenden.
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Das Trennvermögen von Lösungsgleichgewichten ist nur
moderat, kann aber durch mehrere Lösungsvorgänge mit frischem Lösungsmittel
gleicher (oder sogar etwas schwächerer)
Konzentration verstärkt
werden. Aus Ionenaustauschern werden also die Proteine mehrfach
mit der gleichen Salzkonzentration (oder mit Salzlösungen ganz
leicht abnehmender Konzentration) ausgelöst, um alle bei dieser Konzentration
austauschbaren Proteine auszuwaschen. Aus Umkehrphasen werden die
Proteine mehrfach mit der gleichen wässrigen Lösung von Acetonitril ausgewaschen.
Es ergibt sich so eine schärfere
Trennung der Proteine.
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Unter Verwendung der in 2 gezeigten Pipettenspitzen
kann ein Auswaschen von Proteinen mit einer Lösung eingestellter Konzentration
auch dynamisch vorgenommen werden. Dabei wird die Lösung zunächst einfach
in das Mikrogefäß gegeben, das
in der Wandbelegung die Proteine trägt, wobei die Pipettenspitze
nicht in die Flüssigkeit
ragt. Dabei wird nur ein sehr geringer Teil der Proteine in Lösung gehen.
Dann wird die Pipettenspitze abgesenkt, die praktisch noch saubere
Lösung
befindet sich jetzt größtenteils
oberhalb der Wandbelegung. Nunmehr wird die Lösung sehr langsam angesaugt,
wobei ein guter Wandkontakt zur Belegung hergestellt wird. Es wird
so dynamisch mit stets sauberer Lösung ausgewaschen, wobei eine
sehr gute Trennauflösung
der einzelnen Fraktionen erzielt wird.
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Hat ein Trennverfahren eine Auflösung von etwa
40 theoretischen Böden,
was mit diesen Trennverfahren durchaus erzielt werden kann, so werden bei
einer Fraktionierung in acht Fraktionen 80% der Proteine sauber
in nur einer Fraktion zu finden sein. Nur 20 % der Proteine entfallen
auf zwei benachbarte Fraktionen, mit durchaus sehr unterschiedlichen
Verhältnissen
der Aufteilung. Bei zwei Generationen der Trennung gleicher Trennschärfe hintereinandergeschaltet
und jeweils acht Fraktionen fallen 64 % der Proteine sauber in nur
eine Fraktion, 32 % sind auf jeweils zwei Fraktionen verteilt, und
4 % erstrecken sich über
vier Fraktionen. Bei drei Generationen der Trennung sind rund 50
% der Proteine in jeweils nur einer der nunmehr 512 Fraktionen zu
finden, etwa 37 % überdecken
zwei Fraktionen, etwa 12 % verteilen sich auf jeweils vier Fraktionen,
und weniger als ein Prozent der Proteine verteilt sich auf acht
Fraktionen, im ungünstigsten
Fall gleichmäßig verteilt;
in günstigeren
Fällen
wird eine dieser Fraktionen den Hauptteil des Proteins enthalten.
Diese Zahlen spiegeln das große
Trennpotential der Erfindung wieder.
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Häufig
sind nicht alle Proteine zu untersuchen, sondern es richtet sich
das Ziel nur auf die Analyse einer Untermenge von Proteinen. Ein
Beispiel ist das Studium der relativen Expressionsstärke bestimmter
Eiweiße
in gestresstem und ungestresstem Gewebe. Ist diese Untermenge klein,
so braucht die Trennung nicht unbedingt in allen Verästelungen durchgeführt zu werden.
Außerdem
ist es dann möglich,
durch Verschiebung der Trenngrenzen zu erreichen, dass die gesuchten
Proteine jeweils nur in einer Fraktion zu finden sind.
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Die beiden günstigsten und bisher am weitesten
untersuchten Trenndimensionen für
dieses Verfahren sind die Molekularladung, gemessen durch Ionenaustauscher,
und molekulare Hydrophobie, gemessen durch Umkehrphasen. Die Trennung durch
Affinitäten
anderer Art sind bisher weniger untersucht, bieten aber ein großes Potential.
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Eine Trennung durch Ionenaustauscher
wird durch die Extraktion der gebundenen Proteine mit Salzlösungen in
stufenweise steigender Konzentration durchgeführt, wobei für eine spätere MALDI-Analyse
ein alkalifreies Salz genommen werden sollte. Es hat sich dafür Ammoniumchlorid
(NH4Cl) sehr gut bewährt. Die Konzentrationsstufen
werden vorzugsweise so gewählt,
dass für
das vorliegende analytische Problem eine Trennung in möglichst
gleich viele Proteine in den einzelnen Trennstufen erzielt wird. Die
Salzkonzentrationen können
in Kalibrationsexperimenten ermittelt werden. Mehrfaches Auswaschen mit
gleicher Konzentration erhöht
die Tennschärfe. Die
getrennten Proteine in den Salzlösungen
werden dann Mikrogefäßen mit
Umkehrphasen zugegeben und dort an den Umkehrphasen affin gebunden.
Dadurch können
auch größere Mengen
an Salzlösungen
aufeinanderfolgend von ihren Proteinen befreit werden.
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Die Proteine an den Umkehrphasen
werden wiederum gewaschen, dieses Mal mit einer Flüssigkeit,
die die Proteine nicht von den Umkehrphasen eluiert. Das kann beispielsweise
mit angesäuertem Wasser
geschehen. Auch hier können
Belegungen der Wände
der Mikrogefäße mit Umkehrphasen
oder Umkehrphasenkügelchen
mit magnetischem Kern verwendet werden, das Waschen kann mit Hilfe
von Magneten oder mit Hilfe besonderer Pipettenspitzen abgekürzt werden.
Die Magnete helfen auch dabei, die Partikel an der Wand der Wells
festzuhalten, um die Waschflüssigkeit
aus den Wells der Mikrotiterplatten restlos zu entfernen, ohne die
Partikel mit den gebundenen Proteinen mitzunehmen.
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Der Trennvorgang mit Umkehrphasen
besteht aus einem partiellen Auslösen der Proteine mit einer
wässrigen
Lösung
eines organischen Lösemittels,
wobei für
die verschiedenen Fraktionen der Anteil an organischem Lösemittel
stufenweise steigt. Auch hier kann ein mehr faches Auswaschen mit
gleicher Konzentration vorgenommen werden, um die Trennschärfe zu erhöhen. Die
Lösungen
der Proteine können
beispielsweise direkt auf MALDI-Probenträgerplatten aufgebracht werden,
die bereits mit einer Dünnschicht
von α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure als Matrixsubstanz
belegt sind. Diese Schicht bindet die Proteine affin, die Lösung kann
nach kurzer Einwirkungszeit wieder abgesaugt werden.
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Die Trennung mit teilselektiven Affinitätsphasen
erfolgt etwas anders als bei den vorgehend beschrieben Phasen. Hier
wird jede Fraktion der vorausgehenden Trennungen jeweils nacheinander
den verschiedenen Affinitätsphasen
zugeführt,
wobei diese sich beispielsweise ebenfalls als Wandbelegungen in
Mikrogefäßen befinden
können.
Jede dieser Affinitätsphasen
entzieht der Fraktion bestimmte Proteine und bindet diese. Nachdem
die Lösung
einer Reihe von beispielsweise sieben verschiedenen Affinitätsphasen
nacheinander zugeführt
wurde, kann die restliche Lösung
immer noch Proteine enthalten, die bisher von keiner Affinitätsphase
gebunden wurden. Dieser Rest bildet dann eine achte Fraktion, die beispielsweise
einer breitbandigen Umkehrphase zugeführt wird, um die Proteine ebenfalls
oberflächengebunden
vorliegen zu haben.
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Aus diesen teilselektiven Affinitätsphasen können die
Proteine durch entsprechende Lösemittel entweder
komplett ausgelöst
werden, oder aber wiederum fraktionierend durch steigende Anteile
an organischen Lösemitteln.
Im letzteren Fall erwirken die teilselektiven Affinitätsphasen
eine Trennung nach zwei Dimensionen.
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Die Mikrotiterplatten können vorgefertigt
und versiegelt alle verwendeten Partikelsuspensionen, Wandbelegungen,
Waschflüssigkeiten,
Lösungen
mit eingestellten Salzgehalten, Enzyme und Pufferlösungen zur
Aktivierung der Enzyme enthalten. Die Mikrotiterplatten können, gegebenenfalls
zusammen mit anderen Verbrauchsmaterialien wie beispielsweise den
besonders geformten Pipettenspitzen, in gebrauchsfertigen Verbrauchspackungen
in den Handel kommen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann vom Fachmann
unter Kenntnis der Grundsätze
der Erfindung in vielfältiger
Weise variiert werden. Die Erfindung ist daher nicht auf die oben
angeführten
Beispiele begrenzt. So können
insbesondere andere Arten der Trennung (nach anderen Dimensionen)
verwendet, es können
andere Arten des Verdaus oder der Spaltung angewandt, oder die Trennungen
können
auf kleinen Durchlaufsäulen,
die mit schwammartigen Phasen gefüllt sind, durchgeführt werden.