DE10244456A1 - Methods for the detection and differentiation of bacteria - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Mikroorganismen, insbesondere den Nachweis von Bakterien. Die Erfindung betrifft insbesondere Hybridisierungsverfahren und Amplifikationsverfahren sowie gekoppelte Amplifikations-/Hybridisierungsverfahren mit sequenzspezifischen Sonden beziehungsweise Primern.The present invention relates to the field of diagnostics of microorganisms, in particular the detection of bacteria. The invention relates in particular to hybridization methods and amplification methods and coupled amplification / hybridization methods with sequence-specific probes or primers.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Mikroorganismen, insbesondere den Nachweis von Bakterien, die in klinisch relevanten Proben vorkommen. Bevorzugt können die hier beschriebenen Nukleinsäuren zur Identifizierung von Bakterien in Kulturen insbesondere in Blutkulturen benützt werden. Die Erfindung betrifft insbesondere Hybridisierungsverfahren und Amplifikationsverfahren, sowie gekoppelte Amplifikations-/ Hybridisierungsverfahren mit sequenzspezifischen Sonden beziehungsweise Primern.The present invention relates to the field of diagnostics of microorganisms, especially detection of bacteria found in clinically relevant samples. Prefers can the nucleic acids described here for the identification of bacteria in cultures, in particular in blood cultures used become. The invention particularly relates to hybridization methods and amplification methods, as well as coupled amplification / hybridization methods with sequence-specific probes or primers.

Der Nachweis von Bakterien und ihre genaue Identifizierung spielen eine sehr wichtige Rolle in der medizinischen Mikrobiologie, damit eine entsprechende adäquate Behandlung eingeleitet werden kann. Die Anzucht der Bakterien in flüssigen oder festen Medien ist eine sensitive Standardmethode zum Nachweis von Bakterien in der humanen Primärprobe. Die Differenzierung erfolgt meist durch Mikroskopie kultureller oder primärer Präparate, nach der Morphologie auf Oberflächen kultivierter Kolonien, durch Wachstumstests bei verschiedenen Bedingungen und durch katabolische Eigenschaften, wie z.B. die Verstoffwechslung von Zucker, die Bildung von Säuren u.ä. durch die dazu notwendige Anlage von Sekundärund/oder Tertiärkulturen kann bis zur Befundstellung mehrere Tage vergehen.The detection of bacteria and their accurate identification play a very important role in medical Microbiology, so that an appropriate treatment is initiated can be. The bacteria are grown in liquid or solid media a sensitive standard method for the detection of bacteria in the human primary sample. The differentiation is mostly cultural by microscopy or primary Preparations, according to the morphology on surfaces cultured colonies, through growth tests under various conditions and by catabolic properties such as the metabolism of sugar, the formation of acids etc. by the necessary installation of secondary and / or tertiary cultures it can take several days before the findings are made.

Werden Flüssigkulturen eingesetzt, ist eine erste Analyse aufgrund der Koloniemorphologie nicht möglich. Hier müssen immer Sekundärkulturen und mikroskopische Präparate angelegt werden. Besonders wichtig ist hier die Diagnostik bakterieller Infektionen des Blutes. In diesem Fall werden einige Milliliter Blut in ein Nährmedium injiziert und dieses bebrühtet. Bei positivem Wachstum erfolgt die Differenzierung des Keims und eine Prüfung die Empfindlichkeit gegenüber antibakterieller Substanzen. Ungefähr acht bakterielle Spezies finden sich in ca. 65% aller Blutkulturisolaten. Typischerweise sind dies Escherichia coli (ca.20%), Staphylococcus aureus (ca.20%), Pseudomonas aerogenosa (ca.7%), Enterococcus spp.(ca.4%), Proteus spp. und Pneumokokken (ca.3%). Zusätzlich werden Koagulase negative Staphylokokken häufig von Patienten mit intravaskulären Implantaten isoliert die aber klinisch unauffällig sind. Die verbleibenden 35% der Blutkulturisolate erstreckt sich auf über 50 verschiedene Spezies.If liquid cultures are used, is a first analysis is not possible due to the colony morphology. Here have to always secondary cultures and microscopic specimens be created. Bacterial diagnostics is particularly important here Infections of the blood. In this case, a few milliliters Blood in a nutrient medium injected and scalded. With positive growth, the differentiation of the germ and an exam the sensitivity to antibacterial substances. About eight bacterial species can be found in approx. 65% of all blood culture isolates. typically, these are Escherichia coli (approx. 20%), Staphylococcus aureus (approx. 20%), Pseudomonas aerogenosa (approx. 7%), Enterococcus spp. (Approx. 4%), Proteus spp. and pneumococci (approx. 3%). In addition, coagulase become negative Staphylococci common of patients with intravascular Implants isolate but are clinically normal. The remaining 35% of the blood culture isolates are spread over 50 different species.

In den letzten Jahren sind wichtige Erfindungen gemacht worden, um mit sehr speziesspezifischen Primern in einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion Organismen nachzuweisen. Die Detektion erfolgt dabei meist über Gelelektrophorese oder analog der ELISA-Technik über immobilisierte Sonden in Mikrotiterplatten. Allerdings eignen sich diese Methoden nicht, wenn es darum geht aus vielen möglichen pathogenen Organismen einen oder mehrere nachzuweisen.There have been important ones in recent years Inventions have been made to work with very species-specific primers in a nucleic acid amplification reaction Detect organisms. The detection is usually carried out via gel electrophoresis or analogous to the ELISA technique immobilized probes in microtiter plates. However, are suitable not these methods when it comes from many possible detect one or more pathogenic organisms.

Gerade bei der Diagnostik aus Blutkulturen ist eine schnelle Diagnostik von großer Bedeutung. Revolutionierend sind hier nukleinsäurebasierende Verfahren, die sich durch hohe Spezifität und Sensitivität auszeichnen. Bisher gibt es kommerziell Sondentests, die durch eine spezifische Hybridisierung an das bakterielle Genom die Spezies identifizieren können. Dies sind aber Einzelsondenteste, die entweder nach ersten Differenzierungshinweisen oder nach Häufigkeitswahrscheinlichkeiten ausgewählt werden müssen. Especially when diagnosing from blood cultures Fast diagnostics are of great importance. revolutionizing are nucleic acid based here Processes that are characterized by high specificity and sensitivity. So far there have been commercial probe tests by a specific Hybridize to the bacterial genome to identify the species can. However, these are individual probe tests, which either follow the first differentiation instructions or by frequency probabilities selected Need to become.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit die Bereitstellung hoch spezifischer und hoch sensitiver Verfahren zum Nachweis klinisch wichtiger Bakterien, die Entwicklung von Primern zur Durchführung eines Amplifikationsverfahren bakterieller Genomfragmente und/oder deren Transkripte und die Entwicklung eines viele Sonden tragenden Detektionssystems. Bevorzugt laufen diese Tests im Multiplexverfahren.Object of the present invention was therefore the provision of highly specific and highly sensitive processes for the detection of clinically important bacteria, the development of primers to carry out an amplification process of bacterial genome fragments and / or their transcripts and the development of a multi-probe Detection system. These tests preferably run in the multiplex method.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien, bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums ist oder komplementär zu diesem ist, an eine sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert und anschließend die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.According to the invention, this object has been achieved by a method for the detection of clinically relevant bacteria, in which a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a clinically relevant bacterium is or complementary to this is to a sequence and / or species-specific nucleic acid probe hybridized under stringent conditions and then the nucleic acid to be detected or the hybridization of the nucleic acid to be detected to the sequence specific nucleic acid probe is detected, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe selected is from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence.

Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid bezieht sich im Sinne der vorliegenden Erfindung auf Primer, Proben, Sonden und Oligomerfragmente, welche detektiert werden. Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid ist weiterhin generisch zu Polydesoxyribonukleotiden (enthaltend 2-Deoxy-D-Ribose) und zu Polyribonukleotiden (enthaltend D-Ribose) oder zu jedem weiteren Typ von Polynukleotid, das ein N-Glykosid einer Purinbase oder einer Pyrimidinbase ist, beziehungsweise einer modifizierten Purinbase oder einer modifizierten Pyrimidinbase. Eingeschlossen sind erfindungsgemäß auch PNA's, d. h. Polyamide mit Purin-/Pyrimidin-Basen. Die Begriffe Nukleinsäure und Oligonukleotid werden im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als verschieden angesehen, insbesondere soll die Verwendung der Begriffe keine Unterscheidung in Bezug auf die Länge bedeuten. Diese Begriffe schließen sowohl doppel- beziehungsweise einzelsträngige DNA, als auch doppel- beziehungsweise einzelsträngige RNA ein.In the context of the present invention, the term nucleic acid and oligonucleotide refers to primers, samples, probes and oligomer fragments which are detected. The term nucleic acid and oligonucleotide is also generic to polydeoxyribonucleotides (containing 2-deoxy-D-ribose) and polyribonucleotides (containing D-ribose) or to any other type of polynucleotide that is an N-glycoside of a purine base or a pyrimidine base, respectively a modified purine base or a modified pyrimidine base. PNAs, ie polyamides with purine / pyrimi, are also included according to the invention din bases. The terms nucleic acid and oligonucleotide are not considered to be different within the meaning of the present invention; in particular, the use of the terms is not intended to mean any differentiation in terms of length. These terms include both double and single stranded DNA and double and single stranded RNA.

Erfindungsgemäß ist insbesondere bevorzugt, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19-54 und 174 – 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.According to the invention, it is particularly preferred that the sequence specific nucleic acid probe is selected from the sequences with SEQ ID No .: 19-54 and 174 - 176 respectively complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence.

Dem Fachmann ist bewußt, daß ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Sonden entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Sonden abweichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Sonden denkbar, die gegenüber den erfindungsgemäßen Sonden mit den Sequenzen SEQ ID No. 1-176 beziehungsweise 19-54 und 174 – 176 am 5'-und/oder 3'-Ende Verlängerungen oder Verkürzungen um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen. Ebenso ist denkbar, daß einzelne oder wenige Nukleotide einer Sonde durch andere Nukleotide austauschbar sind, solange die Spezifität der Sonde nicht zu stark verändert wird und der Schmelzpunkt der Sonde nicht zu stark verändert wird. Das schließt ein, dass bei Abwandlung die Schmelztemperatur der abgewandelten Sonde nicht zu stark von der Schmelztemperatw der ursprünglichen Sonde abweicht. Die Schmelztemperatur wird dabei nach der G ( =4°C) + C ( =2°C) Regel ermittelt. Dem Fachmann ist klar, dass neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.The skilled worker is aware that starting probes can also be designed from the teachings of the present invention can, the marginally of the probes according to the invention deviate, but still work. So probes are also conceivable the opposite the probes of the invention with the sequences SEQ ID No. 1-176 or 19-54 and 174 - 176 am 5 'and / or 3' end extensions or shortening to have at least one, two or three nucleotides. Likewise conceivable that individual or a few nucleotides of a probe can be exchanged for other nucleotides are as long as the specificity the probe is not changed too much and the melting point of the probe is not changed too much. That closes that the melting temperature of the modified Probe not too much from the original melting temperature Probe deviates. The melting temperature is determined according to the G (= 4 ° C) + C ( = 2 ° C) rule determined. It is clear to the expert that, in addition to the usual Nucleotides A, G, C, T also modified nucleotides like inosine etc. can be used. The teaching of the present invention enables such modifications based on the subject of the claims.

Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit einer oder mehreren Sonden hybridisiert.According to the invention, a composition which contains the nucleic acid to be detected or a part thereof hybridized one or more probes.

Prinzipiell ist möglich, durch Hybridisierung mit einer einzelnen spezifischen Sonde die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies zu bestimmen. Es ist aber auch möglich, die Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit mehr als einer Sonde zu hybridisieren. Dadurch wird die Aussagekraft des Verfahrens erhöht. Man erhält dann ein genaues Profil und kann die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies mit hoher Sicherheit bestimmen.In principle, it is possible through hybridization with a single specific probe the nucleic acid to be detected and to determine, for example, the bacterial species. But it is also possible, the composition which the nucleic acid to be detected or contains part of it hybridize with more than one probe. This is the meaningfulness of the procedure increased. You get then an exact profile and the nucleic acid to be detected and so that, for example, the bacterial species can be determined with great certainty.

Bevorzugtes Verfahren für die Differenzierung klinisch relevanter Bakterien ist daher ein Multiplexverfahren, bei dem die für die Differenzierung notwendigen bakteriellen Genomabschnitte in einer gemeinsamen Amplifikations- und Hybridisierungsreaktion angereichert und hybridisiert werden. Für diese Anwendung ist die Amplifikation verschiedener Genfragmente notwendig. Die Sonde und Primer zur Detektion der bakteriellen Spezies liegen auf dem 23S ribosomalen RNS-Gen und oder auf dem Elongationsfaktor TU, die Sonden und Primer zur Unterscheidung der Antibiotikaresistenzen haben als Zielsequenz die entsprechenden genomisch kodierten Resistenzgene. Da die zur Differenzierung notwendigen Polymorphismen auf dem Genom viele 1000 Basen umfassen ist zudem eine Aufsplittung in kleinere Fragmente für eine effektive Amplifikation wichtig. Die Vielzahl von Primern, die alle miteinander agieren können, erfordert ein sorgfältiges Design.Preferred method for differentiation clinically relevant bacteria is therefore a multiplex procedure, where the for the differentiation necessary in bacterial genome sections a common amplification and hybridization reaction and be hybridized. For this application is the amplification of various gene fragments necessary. The probe and primer for the detection of bacterial species lie on the 23S ribosomal RNA gene and or on the elongation factor TU, the probes and primers for differentiating antibiotic resistance have the corresponding genomically coded resistance genes as the target sequence. Since the polymorphisms necessary for differentiation on the genome many 1000 bases are also split into smaller ones Fragments for effective amplification is important. The variety of primers that everyone can interact with, requires careful Design.

Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist das Multiplexamplifikationsverfahren bestehend aus mindestens 10 und mehr Primern und das multigeplexte reverse Hybridisierungsverfahren. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist ein Multiplexverfahren mit einem selbstamplifizierenden Chip.An important aspect of the invention is the multiplex amplification process consisting of at least 10 and more primers and the multi-plexed reverse hybridization method. Another important aspect is a multiplexing method with one self-amplifying chip.

Beim Hybridisierungsverfahren müssen Sonden mit unterschiedlicher Primärstruktur unter gleichen Bedingungen hybridisieren, wobei die Spezifität ausreichend zur Erkennung von Einzelbasenaustaschen sein sollte. Deshalb sind bei der Stringenzwaschung Salze wie Betain oder Tetramethylammoniumchloid als Modulatoren der Waserstoffbrückenbindungen bevorzugt.The hybridization method requires probes with different primary structure hybridize under the same conditions, the specificity being sufficient for the detection of single base pockets. That is why when washing stringency, salts such as betaine or tetramethylammonium chloride as modulators of hydrogen bonds prefers.

Für den selbstamplifizierenden Chip sind Eigenschaften der Polymerase (z.B. „Hot Start"-Eigenschaften, das Design der Amplifikationsprimer und die Pufferzusammensetzung wichtig. Bevorzugte Polymerasen sind thermostabile "Hotstart-Polymerasen für den selbstamplifizierenden Chip: Bevorzugte Puffer sind PCR-Puffer, die modulierende Chemikalien wie Glycerin enthalten. Bevorzugte Amplifikationsprimer sind ausgewählt aus SEQ ID No. 1-176, beziehungsweise komplementär dazu, beziehungsweise davon ein Fragment oder enthalten eine dieser Sequenzen, insbesondere bevorzugt sind SEQ ID No.: 55-170. Auch hier sind zusätzlich Salze wie Betain oder Tetramethylammoniumchloid bevorzugt, aber auch stabilisierende Proteine wie BSA.For the self-amplifying chip are properties of polymerase (e.g. "Hot Start "properties that Design of the amplification primer and the buffer composition are important. Preferred polymerases are thermostable "hot start polymerases for the self-amplifying Chip: Preferred buffers are PCR buffers, the modulating chemicals like containing glycerin. Preferred amplification primers are selected from SEQ ID No. 1-176, or complementary thereto, or thereof a fragment or contain one of these sequences, in particular SEQ ID No .: 55-170 are preferred. Here too there are additional salts like betaine or tetramethylammonium chloride preferred, but also stabilizing Proteins like BSA.

Der Begriff Hybridisierung bezieht sich auf die Bildung von Duplexstrukturen durch zwei einzelsträngige Nukleinsäuren aufgrund von komplementärer Basenpaarung. Hybridisierung kann zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen oder zwischen Nukleinsäuresträngen erfolgen, welche kleinere Regionen an Fehlpaarung aufweisen. Die Stabilität des Nukleinsäuren-Duplexes wird gemessen durch die Schmelztemperatur T_m. Die Schmelztemperatur T_m ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH), bei welcher 50% der Basenpaare dissoziiert sind.The term hybridization refers to the formation of duplex structures by two single-stranded nucleic acids due to complementary base pairing. Hybridization can take place between complementary nucleic acid strands or between nucleic acid strands which have smaller regions of mismatch. The stability of the nucleic acid duplex is measured by the melting temperature T _m . The melting temperature T _m is the temperature (under defined ionic strength and pH) at which 50% of the base pairs are dissociated.

Bedingungen, bei denen lediglich vollständig komplementäre Nukleinsäuren hybridisieren, werden als stringente Hybridisierungsbedingungen bezeichnet. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt ( z.B. Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Im allgemeinen, werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Schmelztemperatur 5°C niedriger ist als die T_m für die spezifische Sequenz bei einer definierten Innenstärke und pH. Wenn die Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt wird, dann werden Sequenz-Fehlpaarungen toleriert. Das Ausmaß an Sequenz-Fehlpaarungen kann durch Veränderung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.Conditions in which only completely complementary nucleic acids hybridize are referred to as stringent hybridization conditions. Stringent hybridization conditions are the subject known (e.g. Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). In general, stringent conditions are selected so that the melting temperature is 5 ° C lower than the T _m for the specific sequence at a defined internal strength and pH. If the hybridization is performed under less stringent conditions, then sequence mismatches are tolerated. The extent of sequence mismatches can be controlled by changing the hybridization conditions.

Die Durchführung der Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist besonders wichtig für das erfindungsgemäße Verfahren. Stringent im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass das Detektionsverfahren eine eindeutige Unterscheidung zwischen einer positiven Reaktion und einer negativen Reaktion im Reaktionsfeld des Streifens zulässt. Dies kann durch folgende Maßnahmen erzielt werden:
Struktur der Sonde: Durch die Länge der zur Zielsequenz komplementären Struktur der Sonde; bevorzugt sind 15 bis 20mere.Carrying out the hybridization under stringent conditions is particularly important for the method according to the invention. Stringent in the sense of the present invention means that the detection method allows a clear distinction between a positive reaction and a negative reaction in the reaction field of the strip. This can be achieved through the following measures:
Structure of the probe: by the length of the structure of the probe complementary to the target sequence; 15 to 20 mers are preferred.

Laufpuffer: Durch den Salzgehalt wird die Stringenz beeinflusst. Die Ionenstärke liegt bevorzugt zwischen 100-500 mM, insbesondere bevorzugt bei 250 mM.Running buffer: due to the salinity stringency is affected. The ionic strength is preferably between 100-500 mM, particularly preferably at 250 mM.

Weiterhin kann durch die oben erwähnten mild denaturierenden Substanzen im Laufpuffer (DMSO, Formamid, Harnstoff) die Stringenz individuell eingestellt und optimiert werden. Die Stringenz wird auch durch den pH-Wert des Laufpuffers beeinflußt. Alle der oben genannten Maßnahmen sind letztlich Maßnahmen, die Einfluß auf Wasserstoffbrückenbindungen haben.Furthermore, mildly mentioned by the above denaturing substances in the running buffer (DMSO, formamide, urea) the stringency can be individually set and optimized. The Stringency is also affected by the pH of the running buffer. All of the above measures are ultimately measures the influence on Hydrogen bonds to have.

Die Durchführung des Hybridisierungsverfahrens ist dem Fachmann an sich bekannt. So werden üblicherweise die festen Phasen nach Inkubation mit der Lösung, die den Hybridisierungspartner enthalten kann, stringenten Bedingungen ausgesetzt, um unspezifisch gebundene Nukleinsäuremoleküle zu entfernen. Die Hybridisierung kann in herkömmlicher Weise auf einer Nylon- oder Nitrocellulosemembran durchgeführt werden wie beschrieben (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Die darin genannten Prinzipien lassen sich vom Fachmann auf weitere Ausführungsformen übertragen.Implementation of the hybridization process is known per se to the person skilled in the art. So are usually the solid phases after incubation with the solution, which may contain the hybridization partner, stringent conditions exposed to remove non-specifically bound nucleic acid molecules. The hybridization can in conventional Manner on a nylon or nitrocellulose membrane as described (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Let the principles mentioned therein transferred from the expert to other embodiments.

Auch die Länge der Zielnukleinsäure spielt eine wichtige Rolle für die Sensitivität der Hybridisierung. Bevorzugt sind Nukleinsäurenstränge mit einer Länge von 30 – 500 Basenpaaren.The length of the target nucleic acid also plays a role an important role for the sensitivity of hybridization. Preferred are nucleic acid strands with a length of 30-500 Base pairs.

Bevorzugt muss die Doppelstrang-Zielnukleinsäure vor der Hybridisierung denaturiert werden. Dies geschieht in der Regel durch basische Chemikalien oder Erwärmung, wobei die für die Doppelstrangstruktur verantwortlichen Wasserstoffbrückenbindungen aufgeschmolzen werden. Bevorzugt als basische Chemikalie ist NaOH in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 M. Besonders bevorzugt ist eine Konzentration von 0,25 M NaOH. Durch Erhitzen einer wässrigen Nukleinsäurelösung auf mindestens 95°C und anschließendem raschen Abkühlen auf 4°C können ebenfalls Einzelstrangstrukturen erreicht werden. Einzelstrangamplifikate z. B. als Produkte der NASBA-Reaktion sollten vor der Hybridisierung ebenfalls denaturiert werden, um intramolekulare Strukturen aufzulösen. Die kann wegen der Empfindlichkeit der RNS gegenüber hohen pH-Werten bevorzugt durch mild denaturierende Chemikalien wie z.B. DMSO oder Formamid erfolgen.The double-stranded target nucleic acid must be preferred hybridization can be denatured. This usually happens by basic chemicals or heating, whereby those responsible for the double strand structure Hydrogen bonds be melted. NaOH is preferred as the basic chemical in a concentration of 0.1 to 0.5 M. is particularly preferred a concentration of 0.25 M NaOH. By heating an aqueous Nucleic acid solution at least 95 ° C and then rapid cooling to 4 ° C can single strand structures can also be achieved. Einzelstrangamplifikate z. B. as products of the NASBA reaction should before hybridization can also be denatured to dissolve intramolecular structures. The may be preferred because of the sensitivity of RNA to high pH values due to mildly denaturing chemicals such as DMSO or formamide respectively.

Als Hybridisierungspuffer werden in der Regel wässrige Puffer mit einem Salzgehalt zwischen 0,1 und 0,5 M, und einem pH-Wert von 7,5 – 8,0 verwendet. Für eine gute Benetzung der sondentragenden Phase werden Detergenzien verwendet. Bevorzugt ist Natriumlaurylsultat (SDS) in einer Konzentration von 0,1 – 7%. In der besonders bevorzugten hohen Konzentration von 7% wirkt SDS zudem günstig auf Signal-/Hintergrundverhältnisse, indem unspezifische Bindungen des Enzymkomplexes unterdrückt werden. Die gewünschte Stringenz der Hybridisierung wird neben der Struktur von Zielsequenz und Sonde durch die Zusammensetzung von Hybridisierungs- und Stringenzwaschpuffer bestimmt. Bevorzugt wird nach erfolgter Hybridisierung mit einem Stringenzwaschpuffer inkubiert. Dieser destabilisiert durch eine geringere Innenstärke den Doppelstrang. So werden nicht 100% komplementäre Hybride wieder getrennt. Durch Zusätze von Chemikalien (z.B. Tetramethylammoniumchlorid), welche die Wasserstoffbrückenbindungen des Hybrids beeinflussen, lassen sich die Bindungsstärke von G/C und A/T Paarungen angleichen, was bei Multiplexsondensysteme vorteilhaft sein kann.As a hybridization buffer usually watery Buffer with a salt content between 0.1 and 0.5 M and a pH value from 7.5 - 8.0 used. For detergents become good wetting of the probe-carrying phase used. Sodium lauryl sulfate (SDS) in a concentration is preferred from 0.1 - 7%. SDS works in the particularly preferred high concentration of 7% also cheap on signal / background conditions, by suppressing unspecific binding of the enzyme complex. The desired stringency Hybridization is carried out in addition to the structure of the target sequence and probe through the composition of hybridization and stringency wash buffers certainly. After hybridization with a Stringency wash buffer incubated. This is destabilized by a lower internal strength the double strand. This does not make 100% complementary hybrids separated again. Through additives of chemicals (e.g. tetramethylammonium chloride) that cause hydrogen bonds of the hybrid, the bond strength of Match G / C and A / T pairings, which is the case with multiplex probe systems can be advantageous.

Erfindungsgemäß wird nach der Hybridisierung das Ausmaß der Hybridisierung bestimmt. Das erfolgt üblicherweise dadurch, dass die Menge der Markierung bestimmt wird, die an eine feste Phase gebunden ist. Derartige Nachweisreaktionen und Detektionsverfahren sind dem Fachmann an sich bekannt.According to the invention after hybridization the extent of Hybridization determined. This is usually done by the amount of label is determined on a solid phase is bound. Such detection reactions and detection methods are known per se to the person skilled in the art.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei die Amplifikation mit sequenzspezifischen Amplifikationsprimern durchgeführt wird. Insbesondere ist bevorzugt, dass die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-170, insbesondere SEQ ID No. 1-18 und 171 – 173, beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Am meisten bevorzugt ist, dass wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18 und 55-170 und 171 – 173 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.A preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the nucleic acid to be detected is an amplification product, the amplification being carried out with sequence-specific amplification primers. It is particularly preferred that the nucleic acid to be detected is an amplification product, at least one amplification primer being selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-170, in particular SEQ ID No. 1-18 and 171-173, or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence. It is most preferred that at least one amplification primer is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-18 and 55-170 and 171-173 or is complementary to these sequences, or is a fragment thereof or is complementary to this fragment is or contains one of these sequences or the complementary sequence.

Die Amplifikationsprimer sollten so ausgewählt sein, daß das Amplifikationsprodukt gute sterische Verhältnisse in- Kombination mit der immobilisierten Sonde aufweist. Pallindromstrukturen, die zu intramolekularen Faltungen führen, können durch geeignete Primerauswahl vermieden werden. Im Falle der Markierung mit Hapten ist die räumliche Anordnung des Haptens (z.B. Biotin) im Hybrid Sonde/Zielnukleinsäure wichtig. Das Hapten sollte für den Antikörper-Enzymkomplex gut zugänglich sein.The amplification primers should so selected be that Amplification product good steric conditions in combination with of the immobilized probe. Pallindrome structures leading to lead intramolecular folds, can can be avoided by selecting suitable primers. In the case of marking with hapten is spatial Arrangement of the hapten (e.g. biotin) in the hybrid probe / target nucleic acid is important. The hapten should be for the antibody-enzyme complex easily accessible his.

Eine Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonden immobilisiert sind. In diesem Falle ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure markiert ist.One embodiment of the method is characterized in that the nucleic acid probes are immobilized. In this case it is advantageous if the nucleic acid to be detected is marked is.

In einer anderen Form des Verfahrens sind die Nukleinsäuresonden markiert. In diesem Falle ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure immobilisiert ist.In another form of the procedure are the nucleic acid probes marked. In this case it is advantageous if the one to be verified nucleic acid is immobilized.

Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein Verfahren zum Nachweis klinisch assoziierter Bakterien,

• – bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, amplifiziert wird, wobei die Amplifikation mit Primern durchgefihrt, von denen mindestens einer eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt,
• – und bei welchem anschließend die amplifizierte nachzuweisende Nukleinsäure detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz dieses Primer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 - 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Diese Ausführungsform der Erfindung wird im folgenden kurz Amplifikationsverfahren genannt. Der Begriff Amplifikationsverfahren schließt alle bevorzugten Ausführungsformen ein.

The invention further relates to a method for the detection of clinically associated bacteria,

• - In which a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a clinically relevant bacterium or is complementary to it, is amplified, the amplification being carried out with primers, at least one of which has a sequence which essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected .
• - and in which the amplified nucleic acid to be detected is subsequently detected, characterized in that the sequence of this primer is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or is complementary to these sequences, or is a fragment thereof or is complementary to is this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence. This embodiment of the invention is called amplification method in the following. The term amplification method includes all preferred embodiments.

Dem Fachmann ist bewusst, dass ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Primer entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Primern abweichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Primer denkbar, die gegenüber den erfindungsgemäßen Primern am 5'- und/oder 3'-Ende Verlängerungen oder Verkürzungen um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen. Insbesondere Verlängerungen oder Verkürzungen am 5'-Ende der Primer können immer noch funktionsfähige Primer liefern, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Ebenso ist denkbar, daß einzelne oder wenige Nukleotide eines Primers durch andere Nukleotide austauschbar sind, solange die Spezifität der Primer nicht zu stark verändert wird und der Schmelzpunkt der Primer nicht zu stark verändert wird. Dem Fachmann ist klar, dass neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.The specialist is aware that starting out primers can also be designed from the teachings of the present invention can, the marginally of the primers according to the invention deviate, but still work. So primers are also conceivable the opposite the primers according to the invention Extensions at the 5 'and / or 3' end or shortening to have at least one, two or three nucleotides. In particular Renewals or shortening at the 5 'end of the primer can still working Deliver primers that can be used according to the invention. As well it is conceivable that individual or a few nucleotides of a primer can be replaced by other nucleotides are as long as the specificity the primer is not changed too much and the melting point of the primers is not changed too much. It is clear to the person skilled in the art that in addition to the usual nucleotides A, G, C, Modified nucleotides such as inosine etc. can also be used can. The teaching of the present invention enables such modifications based on the subject of the claims.

Am meisten bevorzugt ist das letztgenannte Verfahren, wenn mindestens zwei Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 - 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Insbesondere bevorzugt ist, dass der bzw. die Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18 und 171 – 173 und SEQ ID No.: 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Erfindungsgemäß bevorzugt ist dass die Primer markiert sind.The latter is most preferred Method if at least two primers have a sequence which essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected, the sequences of these primers being selected from the sequences with SEQ ID No .: 1 - 176 or complementary to them Sequences are or represent a fragment thereof or complementary to it Fragment or one of these sequences or the complementary sequence contains. It is particularly preferred that the primer (s) have a sequence have, which is essentially a partial sequence of the to be detected nucleic acid represents, the sequences of these primers are selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-18 and 171 - 173 and SEQ ID No .: 55-170 or are complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to it Fragment or one of these sequences or the complementary sequence contains. Preferred according to the invention is that the primers are marked.

Die folgenden Ausführungen gelten sowohl für das erfindungsgemäße Hybridisierungsverfahren als auch für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren als auch für das gekoppelte Amplifikations-/ Hybridisierungsverfahren. Gerade für die Identifizierung und Differenzierung von Bakterien ist dieser sogenannte „Multiplexansatz" von großem Nutzen.The following statements apply to both the hybridization method according to the invention for as well the amplification method according to the invention for as well the coupled amplification / hybridization method. Just for the This so-called "multiplex approach" is of great benefit for identifying and differentiating bacteria.

Als Nukleinsäureamplifikationsreaktion können verschiedene Reaktionen eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Die verschiedenen Ausgestaltungen der PCR-Technik sind dem Fachmann bekannt, siehe z.B. Mullis (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris) 48(8), 579-582. Weitere Amplifikationstechniken, die zur Anwendung kommen können, sind "nucleic acid strand-based amplification" (NASBA), "transcriptase mediated amplification" (TMA), "reverse transcriptase polymerase chain reaction" (RT-PCR), "Q-β replicase amplification" (β-Q-Replicase) und die "single strand displacement amplification" (SDA). NASBA und andere Transkriptions-basierte Amplifikationsmethoden werden in Chan und Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185-196 erläutert.Various nucleic acid amplification reactions can be used Reactions are used. The polymerase chain reaction is preferred (PCR) used. The different configurations of the PCR technique are known to the person skilled in the art, see e.g. Mullis (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris) 48 (8), 579-582. Other amplification techniques used for Application can come are "nucleic acid strand-based amplification "(NASBA)," transcriptase mediated amplification "(TMA)," reverse transcriptase polymerase chain reaction "(RT-PCR)," Q-β replicase amplification "(β-Q replicase) and the "single strand displacement amplification "(SDA). NASBA and other transcription-based Amplification methods are described in Chan and Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185-196.

In der einfachsten Form der Detektion der nachzuweisenden Nukleinsäure wird das Amplifikat z.B. durch Verdau mit einem Restriktionsenzym spezifisch geschnitten und die entstandenen Ethidiumbromid-gefärbten Fragmente auf einem Agarosegel analysiert. Weit verbreitet sind auch Hybridisierungsysteme. Die Hybridisierung findet üblicherweise so statt, daß entweder die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, oder die Sonde auf einer festen Phase immobilisiert wird und mit dem jeweils anderen Hybridisierungspartner in Kontakt gebracht wird. Als feste Phasen sind verschiedenste Materialien vorstellbar, beispielsweise Nylon, Nitrocellulose, Polystyrol, silikatische Materialien usw. Es ist auch denkbar, daß als feste Phase eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird. Die Zielsequenz kann dabei auch in Lösung zuvor mit einer Fangsonde hybridisieren und danach wird die Fangsonde an eine feste Phase gebunden. In der Regel ist wenigstens eine Sonde oder wenigstens ein Primer bei der Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin. Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, Cyaninfarbstoffe usw. Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen nachgewiesen werden. Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt.In the simplest form of detection of the nucleic acid to be detected, the amplificate is, for example cut specifically by digestion with a restriction enzyme and the resulting ethidium bromide-stained fragments were analyzed on an agarose gel. Hybridization systems are also widespread. The hybridization usually takes place in such a way that either the composition which contains the amplification product or a part thereof or the probe is immobilized on a solid phase and brought into contact with the other hybridization partner in each case. A wide variety of materials are conceivable as solid phases, for example nylon, nitrocellulose, polystyrene, silicate materials, etc. It is also conceivable that a microtiter plate is used as the solid phase. The target sequence can also hybridize with a capture probe beforehand in solution and then the capture probe is bound to a solid phase. As a rule, at least one probe or at least one primer is labeled during the amplification of the nucleic acid to be detected. A wide variety of labels are conceivable, such as fluorescent dyes, biotin or digoxigenin. Known fluorescent labels are fluorescein, cyanine dyes, etc. The labels are usually covalently linked to the oligonucleotides. While fluorescent labeling can be detected directly, biotin and digoxigenin labeling can be detected after incubation with suitable binding molecules. For example, a biotin-labeled oligonucleotide can be detected by contacting it with a solution that contains streptavidin coupled to an enzyme, the enzyme, for example peroxidase or alkaline phosphatase, converting a substrate that produces a dye or leads to chemiluminescence ,

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Nukleinsäuresonden auf der festen Phase immobilisiert, und anschließend wird diese feste Phase mit der Zusammensetzung, welche die nachzuweisenden markierten Nukleinsäuren oder einen Teil davon enthält, in Kontakt gebracht. Vorzugsweise werden wenigstens zwei Sonden auf der festen Phase immobilisiert, bevorzugter wenigstens fünf Sonden, noch bevorzugter wenigstens zehn Sonden. Verschiedene Sonden können in verschiedenen Zonen immobilisiert sein. Durch Inkubation des Amplifikationsprodukts beziehungsweise der Probe enthalten die nachzuweisende Nukleinsäure oder eines Teils davon mit einer derart vorbereiteten festen Phase mit immobilisierten Sonden kann durch einen einzigen Hybridisierungsschritt eine Aussage über die Hybridisierung des Amplifikationsprodukts mit allen immobilisierten Sonden gewonnen werden. Die feste Phase ist daher bevorzugt ein Mikroarray von immobilisierten Sonden auf einer festen Phase. Derartige "DNA-Chips" erlauben es, daß auf einem kleinen Bereich eine hohe Anzahl verschiedener Oligonukleotide irrmobilisiert werden. Die festen Phasen, die für DNA-Chips geeignet sind, bestehen vorzugsweise aus silikatischen Materialien wie Glas usw. Die Markierung der Primer ist in dieser Ausführungsform vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung. Der DNA-Chip kann nach Inkubation mit dem Amplifikationsprodukt beziehungsweise der Probe enthalten die nachzuweisende Nukleinsäure oder eines Teils davon durch eine Scanvorrichtung rasch analysiert werden. Derartige Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt. Eine Übersicht über die Chip-Technologie gibt McGlennen (2001) Miniaturization technologies for molecular diagnostics. Clin Chem 47(3), 393-402.In one embodiment of the method according to the invention become the nucleic acid probes immobilized on the solid phase, and then this solid phase with the composition which the labeled nucleic acids to be detected or contains part of it brought into contact. Preferably at least two probes immobilized on the solid phase, more preferably at least five probes, more preferably at least ten probes. Different probes can be used be immobilized in different zones. By incubating the amplification product or the sample contain the nucleic acid to be detected or part of it with such a prepared solid phase immobilized probes can be done by a single hybridization step a statement about hybridization of the amplification product with all immobilized Probes can be obtained. The solid phase is therefore preferably a microarray of immobilized probes on a solid phase. Such "DNA chips" allow that on a small area immobilized a large number of different oligonucleotides become. The fixed phases for DNA chips are suitable, preferably consist of silicate Materials like glass etc. The marking of the primer is in this embodiment preferably a fluorescent label. The DNA chip can Incubation with the amplification product or the sample contain the nucleic acid to be detected or a part thereof can be quickly analyzed by a scanning device. Such devices are known to the person skilled in the art. An overview of the Chip technology gives McGlennen (2001) Miniaturization technologies for molecular diagnostics. Clin Chem 47 (3), 393-402.

In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die nachzuweisende Nukleinsäure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin.In this embodiment of the method according to the invention the nucleic acid to be detected is marked. Various markings are conceivable, such as Fluorescent dyes, Biotin or digoxigenin.

Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, FITC, Cyaninfarbstoffe, Rhodamine, Rhodamin₆₀₀R-phycoerythrin, Texas Red usw.Known fluorescent labels are fluorescein, FITC, cyanine dyes, rhodamines, rhodamine ₆₀₀ R-phycoerythrin, Texas Red etc.

Vorstellbar ist auch eine radioaktive Markierung, wie z.B. ¹²⁵I, ³⁵S, ³²P, ³⁵P.A radioactive label, such as ¹²⁵ I, ³⁵ S, ³² P, ³⁵ P, is also conceivable.

Vorstellbar ist auch eine Partikelmarkierung wie z.B. mit Latex. Solche Partikel sind üblicherweise trocken, im Micron-Bereich und uniform.Particle marking is also conceivable such as. with latex. Such particles are usually dry, in the micron range and uniform.

Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukle otiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung beispielsweise direkt nachgewie sen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen oder Konjugatspartnern nachgewiesen werden. Andere Ftindungspartner als beispielsweise Biotin/Streptavidin sind Antigen/Antibody-Systeme, Hapten/Anti-Hapten-Systeme, Biotin/Avidin, Folsäure/Folat-bindende Proteine, Komplementäre Nukleinsäuren, Proteine A, G und Immunoglobulin usw. (M. N. Bobrov, et a1. J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989).The markings are common covalently linked to the oligonucleotides. During a fluorescent label for example, can be detected directly, biotin and digoxigenin labels after incubation with suitable binding molecules or Conjugate partners are detected. Founding partners other than for example biotin / streptavidin are antigen / antibody systems, Hapten / anti-hapten systems Biotin / avidin, folic acid / folate binding Proteins, complementaries Nucleic acids, proteins A, G and immunoglobulin, etc. (M.N. Bobrov, et al. J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989).

Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt. Mögliche Enzyme für diesen Verwendungszweck sind Hydrolasen, Lyasen, Oxido-Reduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Weitere Beispiele sind Peroxidasen, Glukoseoxidasen, Phosphatasen, Esterasen, und Glykosidasen. Derartige Verfahren sind dem Fachmann an sich bekannt (Wetmur JG.For example, a biotin-labeled one Oligonucleotide can be detected by mixing it with a solution in Is brought into contact, which contains streptavidin coupled to an enzyme, wherein the enzyme, e.g. Peroxidase or alkaline phosphatase, a substrate which produces a dye or leads to chemical luminescence. Possible enzymes For this Intended use are hydrolases, lyases, oxido reductases, transferases, Isomerases and ligases. Further examples are peroxidases, glucose oxidases, Phosphatases, esterases, and glycosidases. Such procedures are known to the expert (Wetmur JG.

Crit Rev Biochem Mol Biol 1991 ; (3-4) : 227-59; Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996 Jun;5(3): 223-32). Bei manchen Methoden, bei denen Enzyme als Konjugatspartner fungieren, müssen farbändernde Substanzen anwesend sein (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. R. H. Burton and P.H. van Knippenberg (1998).Crit Rev Biochem Mol Biol 1991; (3-4): 227-59; Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996 Jun; 5 (3): 223-32). In some methods where enzymes act as conjugate partners, have to color changing substances be present (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. R. H. Burton and P.H. van Knippenberg (1998).

Ein weiteres bevorzugtes Konjugat umfaßt ein Enzym, welches an einen Antikörper gekoppelt wird (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984). Weiterhin ist üblich die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit einem Gold Streptavidin Konjugat, wobei dann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden kann. Vorstellbar sind jedoch auch Bindungspartner, die kovalente Bindungen miteinander eingehen, wie z.B. Sulfhydryl-reaktive Gruppen wie Maleimide und Haloacetyl-Derivate und Amin-reaktive Gruppen wie Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalide.Another preferred conjugate comprises an enzyme which is coupled to an antibody (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984). Furthermore, it is customary to label the nucleus to be detected small acid with a gold streptavidin conjugate, whereby a biotin-labeled oligonucleotide can then be detected. However, binding partners are also conceivable that form covalent bonds with one another, such as, for example, sulfhydryl-reactive groups such as maleimides and haloacetyl derivatives and amine-reactive groups such as isothiocyanates, succinimidyl esters and sulfonyl halides.

Werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren markiert, dann sind die Sonden in der Regel nicht markiert. Die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt somit im wesentlichen nach im Stand der Technik beschriebenen Methoden (siehe auch US 6,037,127 ). Das Einbringen der Markierung in die nachzuweisende Nukleinsäure kann durch chemische oder enzymatische Methoden erfolgen, oder durch direkte Inkorporation von markierten Basen in die nachzuweisende Nukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nachzuweisende Sequenzen, die Markierungen inkorporiert haben, durch markierte Basen oder markierte Primer während der PCR hergestellt. Markierte Primer können hergestellt werden durch chemische Synthese z.B. mittels der Phosphoramidit-Methode durch die Substitution von Basen des Primers durch markierte Phosphoramiditbasen während der Primer-Synthese. Alternativ dazu können Primer hergestellt werden mit modifizierten Basen, an welche nach der Primer-Synthese Markierungen chemisch gebunden werden.If the nucleic acids to be detected are labeled, the probes are usually not labeled. The nucleic acids to be detected are thus essentially labeled using the methods described in the prior art (see also US 6,037,127 ). The labeling can be introduced into the nucleic acid to be detected by chemical or enzymatic methods or by direct incorporation of labeled bases into the nucleic acid to be detected. In a preferred embodiment, sequences to be detected which have incorporated labels are produced by labeled bases or labeled primers during the PCR. Labeled primers can be produced by chemical synthesis, for example using the phosphoramidite method by substituting bases of the primer with labeled phosphoramidite bases during the primer synthesis. Alternatively, primers can be prepared with modified bases to which labels are chemically bound after the primer synthesis.

Denkbar sind auch Verfahren ohne, dass die zu detektierende Nukleinsäure amplifiziert oder mit einer Modifikation versehen wird. Beispielsweise können ribosomale RNS Spezies mit einer DNS-Sonde spezifisch hybridisieren und mit einem RNS/DNS-spezifischen Antikörper als RNS/DNS-Hybrid nachgewiesen werden.Processes are also conceivable without that the nucleic acid to be detected is amplified or modified is provided. For example Hybridize ribosomal RNA species specifically with a DNA probe and detected with an RNA / DNA-specific antibody as an RNA / DNA hybrid become.

Eine andere Möglichkeit ist das Einbringen von Markierungen mit Hilfe der T4 Polynucleotide-Kinase oder eines terminalen Transferase-Enzyms. Vorstellbar sind so das Einbringen von radioaktiven oder fluoreszierenden Markierungen (Sambrook et. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988).Another possibility is the introduction of labels using T4 polynucleotide kinase or one terminal transferase enzyme. The introduction is conceivable radioactive or fluorescent labels (Sambrook et. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2: 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988).

Markierungen können in eines oder in beide Enden der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. Markierungen können auch innerhalb der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. In eine nachzuweisende Nukleinsäure können mehrere Markierungen eingebracht werden.Markers can be in one or both Ends of the nucleic acid sequence the nucleic acid to be detected be introduced. Labels can also be within the nucleic acid sequence the nucleic acid to be detected be introduced. Several can be present in one nucleic acid to be detected Markings are introduced.

In einer anderen Ausführungsform weist wenigstens eine der Sonden eine Markierung auf. Üblicherweise wird dann die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, auf einer festen Phasen immobilisiert und mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die wenigstens eine Sonde enthält. Auch in dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, eine Hybridisierung mit mehr als einer Sonde durchzuführen. Dazu können mehrere feste Phasen bereitgestellt werden, auf denen das Amplifikationsprodukt beziehungsweise die Probe enthaltend die nachzuweisende Nukleinsäure immobilisiert ist. Es ist aber auch möglich, auf einer festen Phase an mehreren räumlich voneinander getrennten Bereichen kleine Mengen des Amplifikationsprodukts zu immobilisieren. Diese verschiedenen Spots werden dann mit jeweils verschiedenen Sonden in Kontakt gebracht (Hybridisierung).In another embodiment at least one of the probes has a label. Usually is then the composition that the amplification product or contains part of it immobilized on a solid phase and with a composition contacted that contains at least one probe. Also in this embodiment it is preferred to hybridize with more than one probe. To can several solid phases are provided on which the amplification product or the sample containing the nucleic acid to be detected is immobilized is. But it is also possible on a fixed phase on several spatially separated Areas to immobilize small amounts of the amplification product. These different spots are then each with different probes brought into contact (hybridization).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Vorrichtung zum Nachweis Klinisch relevanter Bakterien umfassend eine feste Phase, auf der eine oder mehrere sequenzund/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Object of the present invention is also a device for the detection of clinically relevant Bacteria comprise a solid phase on which one or more sequence and / or species-specific nucleic acid probes are immobilized, characterized in that the sequence specific nucleic acid probe selected is from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence.

Besonders bevorzugt ist diese Vorrichtung, wenn die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19 -54 und 174 – 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.This device is particularly preferred when the sequence specific nucleic acid probe is selected from the sequences with SEQ ID No .: 19-54 and 174-176 respectively complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence.

Wenn mehrere Oligonukleotide immobilisiert sind, sind diese auf der festen Phase räumlich voneinander getrennt. Vorzugsweise ist die feste Phase als DNA-Chip ausgebildet.When multiple oligonucleotides are immobilized are spatially separated from each other on the solid phase. The solid phase is preferably designed as a DNA chip.

Bevorzugt ist als feste Phase ein selbstamplifizierender DNS-Chip, der in jeder Auftragseinheit („Spot") minderstens zwei oder mehr Oligonukleotide an ihren 5'-Enden immobilisiert hat. Diese fungieren hier als Amplifikationsprimer. Die Spezifität diese immobilisierten Primer ist durch ihre Struktur besonders im Bereich der 3'-Region biologisch definiert. Damit ist dieser DNS-Chip kein Hybridisierungschip, sondern ein Nukleinsäureamplifikationschip. Dies ist analog einer Multiplex-Amplifikation, die in einem Ansatz mehr als zwei Primer enthält und damit mehr als ein Amplifikationsprodukt liefert. Eine solche im Reaktionsgefäß ablaufende Amplifikationsreaktion ist stark in ihrer Multiplexfähigkeit limitiert. 30- bis 60 Amplifikationsprodukte in einer Reaktion stellen zurzeit ein technisches Maximum dar. Im Unterschied zum Hybridisierungschip ist beim Nukleinsäureamplifikationschip die Multiplexfähikeit nur durch die Chipfläche begrenzt. Je nach verwendeter Spotgröße können hier einige 10.000 Spots pro cm² aufgebracht werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit in einer Reaktion Primer komplementär zu beliebigen Positionen eines kompletten Genoms als Zielmolekül zu benützen.The preferred solid phase is a self-amplifying DNA chip which has at least two or more oligonucleotides immobilized at its 5 'ends in each application unit (“spot”). These act as amplification primers here. The specificity of these immobilized primers is special due to their structure biologically defined in the region of the 3 'region. This means that this DNA chip is not a hybridization chip, but a nucleic acid amplification chip. This is analogous to multiplex amplification, which contains more than two primers in one approach and thus provides more than one amplification product The amplification reaction taking place in the reaction vessel is severely limited in its multiplexing ability. 30 to 60 amplification products in one reaction are currently a technical maximum. In contrast to the hybridization chip, the multiplexing ability of the nucleic acid amplification chip is only limited by the chip area. Depending on the spot size used, can some 10,000 spots per cm ^{2 are} applied here. This results in the possibility of using primers in a reaction complementary to any positions of a complete genome as the target molecule.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein DNA-Chip, welcher immobilisierte Amplifikationsprimer aufweist. Bevorzugte Amplifikationsprimer sind ausgewählt aus den SEQ ID No. 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment oder enthält eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz, besonders bevorzugt für diesen Gegenstand der Erfindung sind die SEQ ID No.: 55-170.The present invention thus relates to a DNA chip which has immobilized amplification primers. Preferred amplification primers are selected from SEQ ID No. 1-176 or complementary to these sequences, or a fragment thereof or complementary tary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence, SEQ ID No .: 55-170 is particularly preferred for this object of the invention.

Die feste Phase der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann ein chromatographisches Material sein. Da der Analyt hauptsächlich hydrophiler Natur ist, sind hydrophile Eigenschaften des chromatographischen Materials des Teststreifens wichtig für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das chromatographische Material kann umfassen anorganische Puder wie silikatische Materialien, Magnesiumsulfat und Aluminium, kann weiterhin umfassen synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere wie Nitrocellulose, Zelluloseacetat, Zellulose, Polyvinylchlorid oder -acetat, Polyacrylamid, Nylon, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat u.s.w., kann weiterhin umfassen beschichtete Werkstoffe wie keramische Materialien und Glas. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung von Nitrocellulose als chromatographisches Material. Zusätzlich kann die Einführung von positiv geladenen Ionengruppen in z.B. Nitrocellulose oder Nylonmembranen die hydrophilen Eigenschaften des chromatographischen Materials verbessern.The solid phase of the device according to the invention can be a chromatographic material. Since the analyte is mainly hydrophilic Is nature, are hydrophilic properties of the chromatographic Material of the test strip important for the implementation of the inventive method. The chromatographic material can include inorganic powders like silicate materials, magnesium sulfate and aluminum further include synthetic or modified naturally occurring Polymers such as nitrocellulose, cellulose acetate, cellulose, polyvinyl chloride or acetate, polyacrylamide, nylon, cross-linked dextran, agarose, Polyacrylate, etc., may also include coated materials like ceramic materials and glass. Most preferred is Use of nitrocellulose as a chromatographic material. additionally can the introduction of positively charged ion groups in e.g. Nitrocellulose or nylon membranes the hydrophilic properties of the chromatographic material improve.

Das chromatographische Material kann in einem Gehäuse oder ähnlichem montiert sein. Dieses Gehäuse ist in der Regel Wasser unlöslich, rigide und kann aus einer Vielzahl von organischen und anorganischen Materialien bestehen. Wichtig ist, dass das Gehäuse nicht mit den kapillaren Eigenschaften des chromatographischen Materials interferiert, dass das Gehäuse nicht Testkomponenten unspezifisch bindet, und dass das Gehäuse nicht mit dem Detektionssystem interferiert.The chromatographic material can in one housing or similar be mounted. This housing water is usually insoluble, rigid and can be made from a variety of organic and inorganic Materials exist. It is important that the housing does not match the capillaries Properties of the chromatographic material interferes with that the housing does not bind test components non-specifically, and that the housing does not interferes with the detection system.

Bevorzugt wird als feste Phase für den selbstamplifizierenden Chip ein beschichteter Glasträger verwendet. Dem Fachmann sind solche Glasträger bekannt.Is preferred as the solid phase for the self-amplifying Chip a coated glass substrate used. Such glass supports are known to the person skilled in the art.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist bevorzugt, wenn die sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden über einen Linker an die feste Phase der Vorrichtung gebunden ist. Der Linker fungiert als Abstandshalter der Sonde zur Membran. Dies sind im vorliegenden Falle meist Polymere, die den zur Zielsequenz komplementären Teil der Sonde am 5'- oder 3'-Ende verlängern, aber selbst nicht kodierend sind. Dies können Basenabfolgen einer nichtkodierender Nukleinsäuresäurestruktur sein oder andere Polymereinheiten wie z.B. Polyether, Polyester u.ä. Der Linker muss so beschaffen sein, dass er die Hybridisierungseigenschaften der Sonde nicht oder nur schwach negativ beeinflusst wird. Dies kann dadurch vermieden werden, dass keine selbstkomplementären Strukturen vorhanden sind. Auch müssen die chemischen Voraussetzungen für die irreversible Kopplung der Sonde an das Trägermaterial gegeben sein. Eine entscheidende Voraussetzung für ein gutes Funktionieren der Sonde über ihre Eigenschaften ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz zu bilden hinaus, ist die Chemie der Kopplung an die Oberfläche. Es müssen chemische Gruppen vorhanden sein, die bei den verwendeten Immobilisierungstechniken eine irreversible Bindung ermöglichen. Dies können Amine-, Thiolgruppen, Carboimide, Succinimide u.ä. sein.The device according to the invention is preferred if the sequence and / or species-specific nucleic acid probes via a Linker is bound to the solid phase of the device. The linker acts as a spacer between the probe and the membrane. These are in the In the present case, mostly polymers containing the part complementary to the target sequence the probe at 5'- extend or 3 'end, however themselves are not coding. This can be a non-coding base sequence Nucleic acid structure or other polymer units such as e.g. Polyether, polyester etc. The Linker must be such that it has the hybridization properties the probe is not or only slightly negatively influenced. This can be avoided by the fact that no self-complementary structures available. Also have to the chemical requirements for irreversible coupling of the probe to the carrier material is given. A crucial requirement for good functioning of the probe based on its properties Chemistry is to form a stable hybrid with the target sequence coupling to the surface. To have to chemical groups may be present in the immobilization techniques used enable an irreversible bond. You can Amine, thiol groups, carboimides, succinimides and the like his.

Dem Fachmann sind jedoch auch andere Möglichkeiten bekannt, Abstandshalter beziehungsweise Linker zwischen der Sonde und der Membran zu schaffen. Sondenoligonukleotide können beispielsweise über Proteine an die Membranoberfläche gebunden werden. Die mit der Sonde beladenen Proteine können dann nach Standardverfahren an. die poröse Membran gebunden werden. Standardverfahren sind zum Beispiel die Kopplung über homobifunktionelle Kopplungsreagenzien oder heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien. Bei homobifunktionellen sind die reaktiven Gruppen gleich. Typischerweise sind dies Amine und/oder Thiole. Thiole können synthetisch direkt an Oligonukleotide gekoppelt werden und unter oxidativen Bedingungen mit z.B. Cysteinresten zu Disulfidbrücken reagieren. Für die Kopplung Amin-Amin können Amine als homobifunktionelle Kopplungsreagenzien direkt synthetisch an Oligonukleotide gekoppelt werden und über Imidoester oder Succinimidester an die Oberfläche oder das Protein gebunden werden. Bei heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien sind die reaktiven Gruppen unterschiedlich und erlauben die Kopplung von verschiedenen funktionellen Gruppen. Bevorzugt ist die Ausbildung von Amino-Thiol-Kopplungen. Mit einem heterobifunktionellen Kopplungsreagenz, welches sowohl eine Succinimidester-Maleimid oder Iodacetimid beinhaltet, können thiolierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Ein weiteres wichtiges Kopplungsagent sind die Carbodümide, die Carbonylreste an Amine koppeln. Wichtigster Vertreter ist hier das 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodümid (EDAC). Hier können an Membranen mit Carbonylresten aminomodifizierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Bei dieser Chemie wird das Kopplungsreagenz nicht in die Verbindung eingebaut.However, others are skilled in the art possibilities known, spacer or linker between the probe and to create the membrane. Probe oligonucleotides can, for example, via proteins to the membrane surface be bound. The proteins loaded with the probe can then be added Standard procedures. the porous Membrane are bound. Standard methods are, for example, coupling via homobifunctional ones Coupling reagents or heterobifunctional coupling reagents. In homobifunctional groups, the reactive groups are the same. typically, these are amines and / or thiols. Thiols can be synthesized directly Oligonucleotides are coupled and under oxidative conditions with e.g. Cysteine residues react to disulfide bridges. For the coupling Amine-amine can Amines as homobifunctional coupling reagents directly synthetic be coupled to oligonucleotides and via imido esters or succinimide esters to the surface or the protein can be bound. With heterobifunctional coupling reagents the reactive groups are different and allow coupling of different functional groups. Training is preferred of amino thiol couplings. With a heterobifunctional coupling reagent, which contains both a succinimide ester maleimide or iodoacetimide, can thiolated oligonucleotides can be coupled. Another important one Coupling agents are the carbodiids, couple the carbonyl residues to amines. The main representative is here the 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC). Here you can Membranes with carbonyl residues amino-modified oligonucleotides are coupled. With this chemistry, the coupling reagent is not in the compound built-in.

Die Hybridisierung der Sonden kann auch „in Lösung" als homogenes Verfahren durchgeführt werden. Dazu können die Sonden so modifiziert werden, dass sie nach Markierung mit Farbstoffen (z.B. Rhodaminen, Floureszinen und ihren Derivaten) in Kombination mit lichtunterdrückenden („Quencher")-Molekülen in ihren hybridisierten und freien Zuständen unterscheidbar sind. Dies kann durch intramolekulare, selbsthybridisierende Strukturen der Sonde wie bei der „molcular beacon"-Technik oder durch den Einsatz von mindestens 2 Sonden wie bei „Light cycler" (Roche) oder dem „Smart cycler" (Cepheid) geschehen. Auch „Minisequencing"-Systeme wie „Pyrosequencing" (Pyrosequencing) sind für dafür geeignet. Grundsätzlich eigen sich aber auch Ansätze, die Hybride aufgrund ihrer geänderten Therodynamik oder Kinetik von einzelsträngigen Formen unterscheiden können. Gegenstand der vorliegenden Erfindung des weiteren ist eine Nukleinsäure welche ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Zusammensetzung beziehungsweise ein Kit zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien enthaltend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.The hybridization of the probes can also be carried out “in solution” as a homogeneous process. For this purpose, the probes can be modified such that they are labeled with dyes (eg rhodamines, fluoresces and their derivatives) in combination with light-suppressing (“quencher”) molecules are distinguishable in their hybridized and free states. This can be done by intramolecular, self-hybridizing structures of the probe as in the "molecular beacon" technique or by using at least 2 probes as in "Light cycler" (Roche) or the "Smart cycler" (Cepheid). Also "mini sequencing" Systems such as "pyrosequencing" are suitable for this. In principle, however, approaches are also suitable which can distinguish hybrids from single-stranded forms on account of their changed thermodynamics or kinetics. The present invention furthermore relates to a nucleic acid which is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or is complementary to these sequences, or is a fragment thereof, or is complementary to this fragment is or contains one of these sequences or the complementary sequence. The present invention furthermore relates to a composition or a kit for the detection of clinically relevant bacteria containing one or more of the nucleic acids according to the invention.

Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein oder mehrere Fragmente aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.In particular, the subject of the present Invention a kit for the amplification of a nucleic acid to be detected, which one or more fragments from the genome of a clinically relevant Bacterium or is complementary to this containing one or more of the nucleic acids according to the invention.

Zusätzlich enthält der Kit alle für die Amplifikation der Zielsequenz notwendigen Komponenten, wie Primer, Puffersysteme und Enzyme und die irrmobilisierten Sonden für Nachweis und Spezifizierung des Amplifikats mit den dazu notwendigen Puffersystemen.The kit also includes all for amplification components necessary for the target sequence, such as primers, buffer systems and enzymes and the immobilized probes for detection and specification the amplificate with the necessary buffer systems.

Am meisten bevorzugt ist ein Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren ausgewählt aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171-173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.A kit is most preferred for the amplification of a nucleic acid to be detected, which comprises a fragment is the genome of a clinically relevant bacterium or is complementary to it, containing one or more nucleic acids selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-18, 171-173 and 55-170 or complementary to these Sequences, or a fragment thereof, or complementary to this Fragment or one of these sequences or the complementary sequence contains.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure beziehungsweise des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien.The invention also relates to the use the device according to the invention for the detection of clinically relevant bacteria. The invention relates furthermore the use of the nucleic acid according to the invention or of the kit according to the invention for the detection of clinically relevant bacteria.

Die nachzuweisende Nukleinsäure kann sich in jeder Zusammensetzung befinden, die im Verdacht steht, Bakterien zu enthalten, insbesondere klinisch relevante Bakterien. Es kann sich um Primärmaterial, z.B. Sekrete, Sulkusflüssigkeit, Abstriche und Blut usw. Oder um Kulturen von Mikroorganismen, die bereits in Flüssig- oder Festmedien angezogen wurden.The nucleic acid to be detected can Bacteria are in any composition that is suspected contain, especially clinically relevant bacteria. It can primary material, e.g. Secretions, sulcus fluid, Smears and blood etc. Or cultures of microorganisms that already in liquid or fixed media has been attracted.

Abbildungsbeschreibungen:Figure descriptions:

1 Densitometrisches Auswertungsbeispiel einer Dorblothybridisierung mit biotinilierten Sonden. 1 Densitometric evaluation example of a Dorothy hybridization with biotinylated probes.

Legende:Legend:

Haemophilus influencae (HIN) Seq ID No. 19, Proteus mirabilis (PMI) Seq ID No. 20, Serratia marcescens (SMA) Seq ID No. 21, Escherichia coli (ECO) Seq ID No. 22, Pseudomonas pudica (PPU) Seq ID No. 24, Pseudomonas fluorescens (PFL) Seq ID No. 25, Acinoetobacter baumanü (ABA) Seq ID No. 26, Klebsiella oxytoca (KOX) Seq ID No. 27, Klebsiella pneumoniae (KPN) Seq ID No. 28, Enterobacter aerogenes (EAE) Seq ID No. 29, Pseudomonas aerogenosa (PAE) Seq ID No. 30, Proteus vulgaris (PVU) Seq ID No. 31, Burgholderia cepacia (BCE) Seq ID No 32.Haemophilus influencae (HIN) Seq ID No. 19, Proteus mirabilis (PMI) Seq ID No. 20, Serratia marcescens (SMA) Seq ID No. 21, Escherichia coli (ECO) Seq ID No. 22, Pseudomonas pudica (PPU) Seq ID No. 24, Pseudomonas fluorescens (PFL) Seq ID No. 25, Acinoetobacter baumanü (ABA) Seq ID No. 26, Klebsiella oxytoca (KOX) Seq ID No. 27, Klebsiella pneumoniae (KPN) Seq ID No. 28, Enterobacter aerogenes (EAE) Seq ID No. 29, Pseudomonas aerogenosa (PAE) Seq ID No. 30, Proteus vulgaris (PVU) Seq ID No. 31, Burgholderia cepacia (BCE) Seq ID No 32.

2 Densitometrisches Auswertungsbeispiel einer Dorblothybridisierung mit biotinilierten Sonden. 2 Densitometric evaluation example of a Dorothy hybridization with biotinylated probes.

LegendeLegend

Staphylococcusaureus (SAU) Seq ID No. 33, Enterococcus gallinarum (EGA) Seq ID No. 34, Staphylococcus capitis (SCA) Seq ID No. 35, Enterococcus faecalis (EFA) Seq ID No. 36, Enterococcus durans (EDU) Seq ID No. 37, Staphylokokken Gruppe F (SGF) Seq ID No. 38, Enterococcus faecium (EFC) Seq ID No. 39, Enterococcus durans (EDU) Seq ID No. 40, Streptococcus pyogenes (SPY) Seq ID No. 41, Streptococcus sciuni (SCI) Seq ID No. 42, Streptococcus oralis (SOR) Seq ID No. 43, Staphylococcus saprophyticus (PVU) Seq ID No. 44, Staphylococcus cohaii (SCO) Seq ID No. 45, Staphylococcus lugdunensis/haemolyticus/hominis (SLHH) Seq ID No. 46, Staphylococcus warneri (SWA) Seq ID No. 47, Staphylococcus epidermidis (SEP) Seq ID No. 48, Staphylococcus lyticans (SLY) Seq ID No. 49, Staphylococcus schleiferi (SOR) Seq ID No. 50;Staphylococcusaureus (SAU) Seq ID No. 33, Enterococcus gallinarum (EGA) Seq ID No. 34, Staphylococcus capitis (SCA) Seq ID No. 35, Enterococcus faecalis (EFA) Seq ID No. 36, Enterococcus durans (EDU) Seq ID No. 37, staphylococci Group F (SGF) Seq ID No. 38, Enterococcus faecium (EFC) Seq ID No. 39, Enterococcus durans (EDU) Seq ID No. 40, Streptococcus pyogenes (SPY) Seq ID No. 41, Streptococcus sciuni (SCI) Seq ID No. 42, Streptococcus oralis (SOR) Seq ID No. 43, Staphylococcus saprophyticus (PVU) Seq ID No. 44, Staphylococcus cohaii (SCO) Seq ID No. 45, Staphylococcus lugdunensis / haemolyticus / hominis (SLHH) Seq ID No. 46, Staphylococcus warneri (SWA) Seq ID No. 47, Staphylococcus epidermidis (SEP) Seq ID No. 48, Staphylococcus lyticans (SLY) Seq ID No. 49, Staphylococcus Schleiferi (SOR) Seq ID No. 50;

3 Hybridisierungsbeispiel: Bakterielle DNS wurde mit den Primern SEQ ID No.: 5, 6, 9 – 16 und 19 – 21 amplifiziert 3 Hybridization example: Bacterial DNA was amplified with the primers SEQ ID No .: 5, 6, 9 - 16 and 19 - 21

Positive Banden Streifen 1 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus aureus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 33Positive bands strip 1 hybridized with amplified DNA from Staphylococcus aureus: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 33

Positive Banden Streifen 2 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus epidermidis: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 48Positive bands strip 2 hybridized with amplified DNA from Staphylococcus epidermidis: biotinylated DNS, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 48

Positive Banden Streifen 3 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecium: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 39 Positive bands strip 3 hybridized with amplified DNA from Enterococcus faecium: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 39

Positive Banden Streifen 4 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Streptococcus oxalis: biotinilierte DNS, SÉQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 43Positive bands strip 4 hybridized with amplified DNA from Streptococcus oxalis: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 43

Positive Banden Streifen 5 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecalis: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 36Positive bands strips 5 hybridized with amplified DNA from Enterococcus faecalis: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 36

Positive Banden Streifen 6 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Streptococcus pyogenes: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 41Positive bands strip 6 hybridized with amplified DNA from Streptococcus pyogenes: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 41

Positive Banden Streifen 7 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus gallinarum: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 34Positive bands strip 7 hybridized with amplified DNA from Enterococcus gallinarum: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 34

Positive Banden Streifen 8 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus casseliflavus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 56Positive bands strip 8 hybridized with amplified Enterococcus casseliflavus DNA: biotinylated DNS, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 56

Positive Banden Streifen 9 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus durans: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 40Positive bands strip 9 hybridized with amplified DNA from Enterococcus durans: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 40

Positive Banden Streifen 10 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus saprophyticus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 44Positive bands strips 10 hybridized with amplified DNA from Staphylococcus saprophyticus: biotinylated DNS, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 44

Positive Banden Streifen 11 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus cohnii: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 45Positive bands strip 11 hybridized with amplified DNA from Staphylococcus cohnii: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 45

Positive Banden Streifen 12 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus warneri: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 47Positive bands strip 12 hybridized with amplified DNA from Staphylococcus warneri: biotinylated DNS, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 47

Positive Banden Streifen 13 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus lyticans: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 49Positive bands strip 13 hybridized with amplified DNA from Staphylococcus lyticans: biotinylated DNS, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 49

Positive Banden Streifen 14 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Staphylococcus schleiferi: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 50Positive bands strip 14 hybridized with amplified DNA from Staphylococcus schleiferi: biotinylated DNS, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 50

Positive Banden Streifen 15 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus casseliflavus: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 56, SEQ ID No.: 54Positive bands strips 15 hybridized with amplified Enterococcus casseliflavus DNA: biotinylated DNS, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 56, SEQ ID No .: 54

Positive Banden Streifen 16 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecalis: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 36, SEQ ID No.: 51Positive bands strips 16 hybridized with amplified DNA from Enterococcus faecalis: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 36, SEQ ID No .: 51

Positive Banden Streifen 17 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus gallinarum: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 34, SEQ ID No.: 53Positive bands strip 17 hybridized with amplified Enterococcus gallinarum DNA: biotinylated DNS, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 34, SEQ ID No .: 53

Positive Banden Streifen 18 hybridisiert mit amplifizierter DNS von Enterococcus faecium: biotinilierte DNS, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 39, SEQ ID No.: 52Positive bands strips 18 hybridized with amplified DNA from Enterococcus faecium: biotinylated DNA, SEQ ID No .: 55, SEQ ID No .: 39, SEQ ID No .: 52

4 Analysebeispiel eins selbstamplifizierender Chip 4 Analysis example of a self-amplifying chip

Der Glasträger wurde mit folgenden Primerpaaren beschichtet:
Staphylococcus lyticans Seq ID No. 126/127, Staphylococcus aureus Seq ID No. 122/123, Enterococcus gallinarum Seq ID No. 120/121, Moraxella catarrhalis Seq ID No. 69/70, Escherichia coli Seq ID No.67/68, Salmonella typhimurium Seq ID No. 55/56, Enterobacter aerogenes Seq ID No. 63/64, Burgholderia cepacia Seq ID No. 100/101, Alcaligines faecalis Seq ID No. 102/103, Proteus vulgaris Seq ID No. 57/58, Stenotrophomonas maltophilia Seq ID No. 55/56. Pufferkontrolle: Primerauftragepuffer ohne Oligonukleotid; The glass support was coated with the following primer pairs:
Staphylococcus lyticans Seq ID No. 126/127, Staphylococcus aureus Seq ID No. 122/123, Enterococcus gallinarum Seq ID No. 120/121, Moraxella catarrhalis Seq ID No. 69/70, Escherichia coli Seq ID No.67 / 68, Salmonella typhimurium Seq ID No. 55/56, Enterobacter aerogenes Seq ID No. 63/64, Burgholderia cepacia Seq ID No. 100/101, Alcaligines faecalis Seq ID No. 102/103, Proteus vulgaris Seq ID No. 57/58, Stenotrophomonas maltophilia Seq ID No. 55/56. Buffer control: primer application buffer without oligonucleotide;

BeispieleExamples

Mit den hier beschriebenen Methoden können die entsprechenden Bakterien entweder aus Primärmaterial (z.B. Abstrichen, Blut u.ä.) oder aus bakteriellen Flüssig- oder Festmedien identifiziert und differenziert werden.With the methods described here can the corresponding bacteria either from primary material (e.g. smears, Blood, etc.) or from bacterial liquid or fixed media can be identified and differentiated.

DNA/RNA-Isolierung:DNA / RNA isolation:

Bakterielle Nukleinsäure wurde entweder von Festnährmedien, Flüssigmedien oder aus Primärmaterial nach entsprechender Vorbehandlung gewonnen.Bacterial nucleic acid was used either from solid culture media, liquid media or from primary material obtained after appropriate pretreatment.

Dazu wurde von Festmedien mit einer sterilen Impföse bakterielles Material entnommen und in 300μl 10mM Tris/HCl pH 7,5 suspendiert. Aus Flüssigkulturen wurde 1ml entnommen, 5min bei 13.000rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand verworfen und in 300μl 10mM Tris/HCl pH 7,5 resuspendiert. Die bakterielle Suspension wurde 15min bei 95°C in einem Thermomixer (Eppendorf Hamburg, Deutschland) inkubiert, 15min in einem Ultraschallbad (Bandelin, Berlin,) beschallt und 10min bei 13.000rpm in einer Tischzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zentrifugiert. Vom Überstand wurden jeweils 5μl in die Amplifikationsreaktion eingesetzt.For this purpose, fixed media with a sterile inoculation loop bacterial material removed and suspended in 300μl 10mM Tris / HCl pH 7.5. From liquid cultures 1 ml was removed, 5 min at 13,000 rpm in a table centrifuge centrifuged, the supernatant discarded and in 300μl 10mM Tris / HCl pH 7.5 resuspended. The bacterial suspension was 15min at 95 ° C incubated in a thermomixer (Eppendorf Hamburg, Germany), Sonicated for 15 minutes in an ultrasonic bath (Bandelin, Berlin,) and 10min at 13,000rpm in a table centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Germany) centrifuged. From the supernatant were 5μl each used in the amplification reaction.

Beispiel 1 DotblothybridisierungExample 1 Dotblot Hybridization

Amplifikation:amplification:

Alle Primer und Sonden wurden kommerziell synthetisiert. (Interactiva, Ulm, Deutschland).All primers and probes became commercial synthesized. (Interactiva, Ulm, Germany).

Als Primer zur Amplifikation von Zielsequenzen der oben angegebenen Organismen wurden die Seq ID No. 1 – 6 verwendet.As a primer for the amplification of Target sequences of the organisms specified above became the Seq ID No. 1 - 6 used.

Der PCR-Ansatz enthielt 1 × Taq-Puffer (Qiagen, Hilden, Deutschland), je 1 μM Primer, 200μM dNTP (Roche, Mannheim, Deutschland) und 1U Hotstar Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland). Die PCR-Amplifikation wurde auf einem Thermocycler PE 9600 (ABI, Weiterstadt, Deutschland) mit 15min 95°C, 30 Zyklen mit 20sek 95°C und 30sek 60°C durchgeführt.The PCR mixture contained 1 × Taq buffer (Qiagen, Hilden, Germany), 1 μM primer each, 200 μM dNTP (Roche, Mannheim, Germany) and 1U Hotstar Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Germany). The PCR amplification was carried out on a PE 9600 thermocycler (ABI, Weiterstadt, Germany) at 15 minutes at 95 ° C., 30 cycles at 20 seconds at 95 ° C. and 30 seconds at 60 ° C.

Detektion der Amplifikate durch Sondenhybridisierung:Detection of the amplificates by probe hybridization:

Alle Sonden wurden am 5'-Ende biotiniliert, um Zielsequenz/Sonden-Hybride über an Streptavidin gekoppelte Reporterenzyme nachweisen zu können. Als Sonden werden Oligonukleotide mit den Sequenzen Tabelle 1 SEQ ID NO 19 – 22, 24 – 50 eingesetzt.All probes were biotinylated at the 5 'end to target sequence / probe hybrid to be able to detect reporter enzymes coupled to streptavidin. As Probes become oligonucleotides with the sequences Table 1 SEQ ID NO 19 - 22, 24-50 used.

Saugfähiges Papier (Blotting Papier GB002, Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland), und eine Nylonmembran (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) wurden auf die Größe der Blotapparatur (Minifold Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) geschnitten und mit 10 x SSC getränkt. In die Öffnungen der zusammengebauten Apparatur wurden 250μl Denaturierungslösung (50 mM NaOH; 1,5 M NaCl) vorgelegt und 20 μl Amplifikat zupipettiert. Nach Anlegen eines Vakuums wurde gewartet, bis alle Flüssigkeit vollständig durchgesaugt war. Anschließend wurde mit 10 x SSC-Puffer nachgespült. Die Membran wurde, nachdem sie vollständig getrocknet war in einem UV-Crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) bei 1200 Joule/cm² fixiert und mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.Absorbent paper (blotting paper GB002, Schleicher & Schüll, Dassel, Germany) and a nylon membrane (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) were cut to the size of the blot apparatus (Minifold Schleicher & Schüll, Dassel, Germany) and cut with 10 x SSC soaked. 250 μl of denaturing solution (50 mM NaOH; 1.5 M NaCl) were placed in the openings of the assembled apparatus and 20 μl of amplificate were pipetted in. After applying a vacuum, it was waited until all the liquid had been sucked through completely. It was then rinsed with 10 × SSC buffer. After it had dried completely, the membrane was fixed in a UV crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) at 1200 joules / cm ² and washed with distilled water and dried.

Alle Hybridisierungen wurden bei 45°C in einem Hybridisierungsofen (Hybaid Mini Oven MkII, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) in Glasröhren durchgeführt. Die mit DNA/RNA-Amplifikat beschichtete Membran wurde in trockenem Zustand eingerollt und in eine Glasröhre gegeben. Anschließend wurde die Membran unter ständiger Rotation Smin mit vorgewärmten Hybridisierungspuffer inkubiert. Nach Zugabe von 2 pmol biotinilierter Sonde erfolgte für eine Stunde die Hybridisierungsreaktion. Nichtgebundene oder nur partial gebundene Sonde wurde durch 30min Inkubation mit Stringent-Puffer bei 45°C mit einmaligem Tausch des vorgewärmten Stringent-Puffers entfernt. Anschließend wurde Blocking-Reagens zugegeben und 15min bei 37°C weiterinkubiert. Die Hybride wurden durch ein Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat durch Zugabe von NBT/BCIP kolorimetrisch oder durch Aufsprühen von Chemielumineszenzsubstrat (Lumi-Phos 530, Cellmark Diagnostics, Abindon, England) autoradiographisch detektiert. Dazu wurde Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat zugegeben und 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal 15min mit Substratpuffer gewaschen. Die Membran wurde dann entnommen, Lumi-Phos-Reagens wurde aufgesprüht, gefolgt von 2h Exposition eines Röntgenfilms. Alternativ dazu wurde Substratpuffer mit NBT/BCIP zugegeben und die Farbentwicklung abgewartet.All hybridizations were made at 45 ° C in a hybridization oven (Hybaid Mini Oven MkII, MWG-Biotech, Ebersberg, Germany) in glass tubes carried out. The membrane coated with DNA / RNA amplificate was dried Condition rolled up and placed in a glass tube. Then was the membrane under constant Rotation smin with preheated Hybridization buffer incubated. After adding 2 pmol biotinylated Probe was made for the hybridization reaction for one hour. Unbound or just partially bound probe was incubated with Stringent buffer for 30 min at 45 ° C with a single exchange of the preheated Stringent buffers removed. Then blocking reagent added and 15min at 37 ° C. continuing incubation. The hybrids were made by a streptavidin-alkaline Phosphatase conjugate by adding NBT / BCIP colorimetric or by spraying chemical luminescent substrate (Lumi-Phos 530, Cellmark Diagnostics, Abindon, England) detected by autoradiography. Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate was used added and 30min at 37 ° C. incubated. Subsequently the membrane was washed twice with substrate buffer for 15 min. The Membrane was then removed, Lumi-Phos reagent was sprayed on, followed from 2h exposure of an X-ray film. Alternatively, substrate buffer with NBT / BCIP was added and the color development waited.

Verwendete Lösungen:Solutions used:

• 10 × SSC-Lösung (Standard-Saline-Citrat):10 × SSC solution (standard saline citrate):
• 1,5M NaCl, 0,15M Trinatriumcitrat;1.5M NaCl, 0.15M trisodium citrate;
• Hybridisierungspuffer:Hybridization buffer:
• 7% SDS (Na-dodecylsulfat), 0,25M Phosphatpuffer pH 7,5;7% SDS (Na-dodecyl sulfate), 0.25M phosphate buffer pH 7.5;
• Stringentwaschlösung (Stringent-Puffer):Stringentwaschlösung (Stringent buffer):
• 3M TMCL (Tetramethylammoniumchlorid), 50mM Tris/Cl, 2mM EDTA, 0,1% SDS;3M TMCL (tetramethylammonium chloride), 50mM Tris / Cl, 2mM EDTA, 0.1% SDS;
• Lösung zur Absättigung der Membranbindungsstellen:solution for saturation of the membrane connection points:
• 5g/l Blockingreagenz (Roche) in Maleinsäurepuffer pH 7,5 (4,13g NaCl und 5,53g5g / l blocking reagent (Roche) in maleic acid buffer pH 7.5 (4.13g NaCl and 5.53g
• Maleinsäure in 500ml Wasser, pH mit 5M NaOH auf 7,5 eingestellt); Substratpuffer:maleic in 500 ml of water, pH adjusted to 7.5 with 5M NaOH); Substrate buffer:
• 274mM Tris/Cl pH 7,5, 68,6 mM Na₃Citrat, 200mM NaCI, 27,4 mM MgCl₂ * 6 H₂O;274mM Tris / Cl pH 7.5, 68.6mM Na ₃ citrate, 200mM NaCl, 27.4mM MgCl ₂ * 6H ₂ O;
• BCIP:BCIP:
• 50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indonylphosphat-toluidiniumsalz in 100% Dimethylformamid;50 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indonyl phosphate toluidinium salt in 100% dimethylformamide;
• NBT:NBT:
• 75 mg/ml Nitroblautetrazoliumsalz in 70% Dimethylformamid;75 mg / ml nitro blue tetrazolium salt in 70% dimethylformamide;

Die Autoradiogramme wurden densitometrisch ausgewertet. Als 100%-Wert wurde der Amplifikatdot der Spezies, aus der die Sondensequenz abgeleitet wurde, zugrundegelegt. Als Kontrollen wurden immer eine Probe, der statt Nukleinsäurelösung Wasser zugegeben wurde und eine Probe mit 100ng isolierter humaner DNS als Dots auf der Membran mitgeführt.The autoradiograms became densitometric evaluated. The amplificate dot of the species, from which the probe sequence was derived. As Controls were always a sample of water instead of nucleic acid solution was added and a sample with 100ng of isolated human DNA carried as dots on the membrane.

In 1 und 2 sind die Ergebnisse von Beispiel 1 dargestellt. Angegeben sind die %-Werte der densitometrischen Auswertung. Der Wert der für die Spezies homologen Sonde wurde 100% gesetzt.In 1 and 2 the results of Example 1 are shown. The% values of the densitometric evaluation are given. The value of the probe homologous to the species was set to 100%.

Beispiel 2 Reverse HybridisierungsstreifenExample 2 Reverse Hybridization Strips

Herstellung des Hybridisierungsstreifens mit immobolisierten Sonden:Production of the hybridization strip with immobolized probes:

Eine Nylonmembran (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) wurden auf die Größe der Blotapparatur geschnitten und mit 10 × SSC getränkt. In die Öffnungen der zusammengebauten Apparatur wurden 250 μ1 einer 1 μM Sondenlösung wie in 3 beschrieben in 10 × SSC in schlitzförmigen Öffnungen der Blotapparatur vorgelegt. Nach Anlegen eines Vakuums wurde gewartet, bis alle Flüssigkeit vollständig durchgesaugt war. Anschließend wurde mit 10 × SSC-Puffer nachgespült. Die Membran wurde, nachdem sie vollständig getrocknet war in einem UV-Grosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) bei 1200 Joule/cm² fixiert und mit destilliertem Wasser gewaschen, getrocknet und in ca. 4mm breite Streifen geschnitten.A nylon membrane (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) was cut to the size of the blot apparatus and soaked with 10 × SSC. 250 μ1 of a 1 μM probe solution were inserted into the openings of the assembled apparatus as in 3 described in 10 × SSC presented in slot-like openings of the blot apparatus. After applying a vacuum, it was waited until all the liquid had been sucked through completely. It was then rinsed with 10 × SSC buffer. After it had dried completely, the membrane was fixed in a UV large linker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) at 1200 joules / cm ² and washed with distilled water, dried and cut into strips approximately 4 mm wide.

Alle Hybridisierungen wurden bei 50°C in einem Wasserbad (Thermolab, GFL, Burgwedel, Deutschland) durchgeführt. Die mit Sonden beschichtete Membran wurde in Streifen geschnitten und in einer Inkubationswanne (Corning costar, Bodenheim, Deutschland) mit vorgewärmtem Hybridisierungspuffer inkubiert. Nach Zugabe von 20μl in 0,4M NaOH denaturiertem Amplifikat erfolgte für eine Stunde die Hybridisierungsreaktion. Nichtgebundene oder nur partial gebundenes Amplifikat wurde durch 30min Inkubation mit Stringent-Puffer bei 50°C mit einmaligem Tausch des vorgewärmten Stringent-Puffers entfernt. Anschließend wurde Blocking-Reagens zugegeben und 15min bei 37°C inkubiert. Die Hybride wurden kolorimetrisch durch ein Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat mit Zugabe von NBT/BCIP detektiert. Dazu wurde Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat zugegeben und 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal 15min mit Substratpuffer gewaschen. Die Membran wurde in Substratpuffer mit NBT/BCIP 10min inkubiert und die Farbentwicklung durch Waschen mit H₂O_bidest gestoppt (s. 3).All hybridizations were carried out at 50 ° C in a water bath (Thermolab, GFL, Burgwedel, Germany). The probe coated membrane was cut into strips and incubated in a incubation tray (Corning costar, Bodenheim, Germany) with preheated hybridization buffer. After the addition of 20μl in 0.4M NaOH denatured amplificate, the hybridization reaction was carried out for one hour. Unbound or only partially bound amplicon was removed by incubation for 30 minutes with Stringent buffer at 50 ° C. with a single exchange of the preheated Stringent buffer. Blocking reagent was then added and incubated for 15 minutes at 37 ° C. The hybrids were colorimetrically detected by a streptavidin-alkaline phosphatase conjugate with the addition of NBT / BCIP. Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate was added and incubated at 37 ° C for 30 min. The membrane was then washed twice with substrate buffer for 15 min. The membrane was incubated in substrate buffer with NBT / BCIP for 10 min and the color development was stopped by washing with H ₂ O _bidest (see 3 ).

Beispiel 3: Selbstamplifizierender ChipExample 3: Self-amplifying chip

Isolierung bakterieller genomischer DNS:Isolation bacterial genomic DNA:

1,5 ml einer positiven Bakterienulture wurden in ein 2ml Reaktionsgefäß gefüllt und bei 8000g 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde dekantiert und das Sediment wird zweimal in 500 μ1 deionisiertem Wasser gewaschen. Daraufhin erfolgte eine 30minütige Inkubation bei 95° C in einem Heizblock (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) und eine 15minütige Ultraschallbehandlung (Bandelin, Berlin, Deutschland) . Nach 10minütiger Zentrifugation bei 14.000g werden 400 μl des Überstandes abgenommen und in eine neues Reaktionsgefäß transferiert.1.5 ml of a positive bacterial culture were placed in a 2 ml reaction vessel and Centrifuged at 8000g for 10 minutes, the supernatant was decanted and the sediment is twice in 500 μ1 deionized water. This was followed by a 30 minute incubation at 95 ° C in a heating block (Eppendorf, Hamburg, Germany) and a 15 minute one Ultrasound treatment (Bandelin, Berlin, Germany). After centrifugation for 10 minutes at 14,000 g 400 ul of the supernatant removed and transferred to a new reaction vessel.

Immobilisierung der spezies-spezifischen OligonukleotideImmobilization of the species-specific oligonucleotides

Die spezies-spezifischen aminomodifizierten Oligonukleotidpaare (Interactiva, Ulm, Deutschland) werden in Na-Phosphatpuffer 20μM verdünnt und in eine Platte mit 384 Vertiefungen pipettiert. Die Oligonukleotidpaare werden mit einem Volumen von 1nl in runden Feldern (="spots") mit einem Durchmesser von je 200 μm einzeln nebeneinander auf dem Glasträger (75 × 25 mm) aufgetragen. Die Oligonukleotidpaare werden immer in doppelter Ausführung nebeneinander immobilisiert (Duplikatspots).The species-specific amino modified Oligonucleotide pairs (Interactiva, Ulm, Germany) are in Na phosphate buffer Diluted 20μM and pipetted into a 384 well plate. The oligonucleotide pairs are with a volume of 1nl in round fields (= "spots") with a diameter of 200 μm each applied individually side by side on the glass support (75 × 25 mm). The oligonucleotide pairs are always in duplicate immobilized next to each other (duplicate spots).

Die Immobilisierung der aminomodifizierten Oligonukleotidpaare (Interactiva, Ulm, Deutschland) auf die oberflächenmodifizierten Glasträger erfolgt in allen Fällen durch „Kontakt printing" mit Hilfe des OMNI-GRID (GeneMachines, San Carlos, USA) spotters. Von den Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden von einem mit einer Reihe von Präzisionsspitzen versehenen Roboterarm die spezies-spezifischen Oligonukleotide und setzt sie an genau definierten Stellen auf den Glas-Objekträgern ab.Immobilization of the amino-modified Oligonucleotide pairs (Interactiva, Ulm, Germany) on the surface modified glass slides takes place in all cases through "contact printing "with the help of the OMNI-GRID (GeneMachines, San Carlos, USA) spotters. Of the Wells of the microtiter plate are made by one with a row of precision tips provided robot arm the species-specific oligonucleotides and sets them down at precisely defined points on the glass slides.

Die verwendeten Chiprohlinge „Motorola Activated slides" (Motorola, Schaumburg, Illinois USA) besitzen reaktive Gruppen auf ihrer Oberfläche, die aminomodifizierte Oligonukleotide an der Oberfläche kovalent binden können (keine weiteren Angaben des Herstellers).The chip blanks used “Motorola Activated slides "(Motorola, Schaumburg, Illinois USA) have reactive groups on their surface that can covalently bind amino-modified oligonucleotides to the surface (none further information from the manufacturer).

Prozessierung der gespotteten Arrays:Processing the spotted arrays:

Die gespotteten Glasträger werden über Nacht in einer Feuchtkammer mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung bei Raumtemperatur inkubiert. Darauf werden die Glasträger 15 Minuten bei 50°C in Blockierungs-Reagenz inkubiert und 2 × 5 Minuten bei Raumtemperatur in deionisiertem Wasser gewaschen. Darauf erfolgt eine 15 minütige Inkubation bei 50°C im Waschpuffer Motorola und wiederum werden die Glasträger 2 × 5 Minuten bei Raumtemperatur in deionisiertem Wasser gewaschen. Die Glasträger werden durch 5minütiges Zentrifugieren bei 1000rpm getrocknet.The spotted glass slides become overnight in a wet room with saturated Sodium chloride solution incubated at room temperature. The glass slides on it for 15 minutes at 50 ° C incubated in blocking reagent and 2 × 5 minutes at room temperature washed in deionized water. This is followed by a 15 minute incubation at 50 ° C in the Motorola washing buffer and again the glass slides are 2 × 5 minutes washed in deionized water at room temperature. The glass slides will by 5 minutes Centrifuge dried at 1000rpm.

Festphasen-PCRSolid phase PCR

Verwendete Materialien/GeräteMaterials / devices used

Materialstoffe

material substances

Geräte

equipment

Alle Komponenten werden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vermischt und zunächst 15 Minuten bei 95°C inkubiert. Der komplette PCR-Reaktionsansatz wird direkt auf das Reaktionsfeld der Glasträger pipettiert, auf dem die Oligonukleotide immobilisiert sind. Die PCR-Reaktion wird mit einem Deckglas bedeckt und der Glasträger in den in-situ-Aufsatz (Twin Towers block) des Thermocyclers gelegt. Während der ersten Inkubationsphasen bei 95°C verschließt das „self-seal"-Reagenz den Raum zwischen den Rändern des Deckglases und dem darunter befindlichen Glasträger; dies verhindert zum einen eine Evaporation des PCR-Reaktionsansatzes während der Hitzeschritte der PCR und zum anderen wird dadurch eine luftdichte Reaktionskammer für die PCR-Reaktion ausgebildet.All components are in one 1.5 ml reaction vessel mixed and first 15 minutes at 95 ° C incubated. The complete PCR reaction approach is applied directly to the Reaction field of the glass carrier pipetted on which the oligonucleotides are immobilized. The PCR reaction is covered with a cover slip and the glass slide in the in-situ attachment (twin towers block) of the thermal cycler. During the first incubation phases at 95 ° C closes the "self-seal" reagent the room between the edges the cover slip and the glass slide underneath; this prevents evaporation of the PCR reaction while the heat steps of the PCR and on the other hand this makes it airtight Reaction chamber for the PCR reaction trained.

PCR-Programm:

PCR program:

Waschprotokoll nach erfolgter Festphasen-PCR

Wash protocol after solid phase PCR

Nach der Festphasen-PCR werden die Glasträger aus dem Thermocycler entnommen und das Deckglas wird vorsichtig entfernt. Die Glasträger werden 15 Minuten bei 68°C in Waschpuffer 1, 5 Minuten bei Raumtemperatur in Waschpuffer 2 und 5 Minuten bei Raumtemperatur in Waschpuffer 3 gewaschen. Darauf werden sie mit Hilfe von Druckluft getrocknet.After the solid phase PCR, the glass slides are removed from the thermal cycler and the cover slip is carefully removed. The glass slides are placed in washing buffer at 68 ° C for 15 minutes 1 , 5 minutes at room temperature in washing buffer 2 and 5 minutes at room temperature in wash buffer 3 washed. Thereon they are dried using compressed air.

Darauf werden die Glasträger mit Hilfe eines konfokalen Laserscanners (Scan Array 4000, DSS Imagetech, New Dehli, Indien) gescannt und es resultiert die bildliche Darstellung des Fluoreszenz-Signals auf dem Glasträger. Je intensiver das Fluoreszenzsignal auf dem Glasträger ist, desto weißer erscheint der jeweilige Spot und umgekehrt desto schwächer das Signal ist, desto schwärzer erscheint der jeweilige Spot. Zwischen weißem und schwarzem Spot erscheinen in der Intensitätsskala die Farben rot-grün-blau.The glass slides are attached to it Using a confocal laser scanner (Scan Array 4000, DSS Imagetech, New Delhi, India) is scanned and the resulting image is shown of the fluorescence signal on the glass substrate. The more intense the fluorescence signal on the glass support is, the whiter the respective spot appears and vice versa the weaker that Signal is the blacker the respective spot appears. Appear between white and black spot in the intensity scale the colors red-green-blue.

Die Integration der Fluoreszenzsignale in Zahlenwerte erfolgte durch die ImaGene software (ImaGene Standard edition; Biodiscovery, Marina del Ray, USA) (s. 4).The fluorescence signals were integrated into numerical values using the ImaGene software (ImaGene Standard edition; Biodiscovery, Marina del Ray, USA) (see 4 ).

Tabelle 1

Table 1

Tabelle 2:

Table 2:

Tabelle 3Table 3

Die Primer SEQ ID No. 55-170 sind als speziespezifische Amplifikationsprimer für den selbstamplifizierenden Chip konstruiert.

Tabelle 4

Tabelle 5

SEQUENCE LISTING

The primers SEQ ID No. 55-170 are designed as species-specific amplification primers for the self-amplifying chip.

Table 4

Table 5

SEQUENCE LISTING

Claims (24)

Verfahren zum Nachweis Klinisch relevanter Bakterien, bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Klinisch relevanter Bakteriums ist oder komplementär zu diesem ist an eine sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert und anschließend die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Methods for the detection of clinically relevant bacteria, in which a nucleic acid to be detected, which is a fragment is the genome of a clinically relevant bacterium or is complementary to it is on a sequence and / or species-specific nucleic acid probe hybridized under stringent conditions and then the nucleic acid to be detected or the hybridization of the nucleic acid to be detected to the sequence specific nucleic acid probe is detected, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe selected is from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19-54 und 174-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Method according to claim 1, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe selected is from the sequences with SEQ ID No .: 19-54 and 174-176 respectively complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences or the complementary Contains sequence. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei die Amplifikation mit sequenzspezifischen Amplifikationsprimern durchgeführt wurde.Method according to claim 1 or 2, characterized in that the nucleic acid to be detected Amplification product is, the amplification with sequence-specific Amplification primers performed has been. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Procedure according to a of claims 1 to 3, characterized in that the nucleic acid to be detected Is amplification product, at least one amplification primer selected is from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171-173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Method according to claim 4, characterized in that at least one amplification primer selected is from the sequences with SEQ ID No .: 1-18, 171-173 and 55-170 respectively complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences or the complementary Contains sequence. Verfahren gemäß einem Anspruch -, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonden immobilisiert sind.Procedure according to a Claim -, characterized in that the nucleic acid probes are immobilized. Verfahren Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Nukleinsäure markiert ist.A method according to claim 6, characterized in that the nucleic acid to be detected is marked. Verfahren gemäß einem Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonden markiert sind.Procedure according to a Claims 1-5, characterized in that the nucleic acid probes are marked. Verfahren zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien, – bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, amplifiziert wird, wobei die Amplifikation mit Primern durchgeführt, von denen mindestens einer eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, – und bei welchem anschließend die amplifizierte nachzuweisende Nukleinsäure detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz dieses Primer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Methods for the detection of clinically relevant bacteria, - in which a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a clinically relevant bacterium or complementary to this is amplified using amplification with primers carried out, at least one of which has a sequence that is essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected, - and at which afterwards the amplified nucleic acid to be detected is thereby detected characterized in that the sequence of this primer is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or complementary to these Is sequences or represents a fragment thereof complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.:1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Method according to claim 9, characterized in that at least two primers have a sequence, which essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected, the sequences of these primers being selected from the sequences with SEQ ID No.:1-176 or complementary to these Sequences are, or represents a fragment thereof, respectively complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der bzw. die Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171 – 173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Method according to claim 9 or 10, characterized in that the primer or primers a Have sequence, which is essentially a partial sequence of the to be detected nucleic acid represents, the sequences of these primers are selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-18, 171-173 and 55-170 respectively complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mit der Polymerase-Ketten-Reaktion erfolgt.Procedure according to a of claims 9 to 11, characterized in that the amplification with the Polymerase chain reaction takes place. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 9 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Primer markiert sind.Procedure according to a of claims 9 to 12 characterized in that the primers are marked. Vorrichtung zum Nachweis Klinisch relevanter Bakterien umfassend eine feste Phase, auf der eine oder mehrere sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Device for the detection of clinically relevant bacteria comprising a solid phase on which one or more sequence and / or species-specific nucleic acid probes are immobilized, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe selected is from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 19 -54 und 174 – 176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Device according to claim 14, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe selected is from the sequences with SEQ ID No .: 19-54 and 174-176 respectively complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence. Vorrichtung gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzund/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden über einen Linker an die feste Phase der Vorrichtung gebunden ist.Device according to claim 14 or 15, characterized in that the sequence and / or species-specific Nucleic acid probes over a Linker is bound to the solid phase of the device. Nukleinsäure welche ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.nucleic acid which selected is from the sequences with SEQ ID No .: 1-176 or complementary to these Sequences, or represents a fragment thereof, or complementary to this Fragment or one of these sequences or the complementary sequence contains. Kit zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren gemäß Anspruch 17.Containing kit for the detection of clinically relevant bacteria one or more nucleic acids according to claim 17th Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren gemäß Anspruch 17.Kit for the amplification of a nucleic acid to be detected, which a fragment from the genome of a clinically relevant bacterium or complementary to this, containing one or more nucleic acids according to claim 17th Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Klinisch relevanten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren. ausgewählt aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1-18, 171 – 173 und 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Kit for the amplification of a nucleic acid to be detected, which a fragment from the genome of a clinically relevant bacterium or complementary to this is containing one or more nucleic acids. selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-18, 171 - 173 and 55-170 respectively complementary to these sequences, or a fragment thereof, or complementary to this Fragment or one of these sequences or the complementary sequence contains. Verwendung der Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 zum Nachweis Klinisch relevanter Bakterien.Use of the device according to one of claims 14 to 16 for the detection of clinically relevant bacteria. Verwendung der Nukleinsäure gemäß Anspruch 17 beziehungsweise des Kits gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 zum Nachweis klinisch relevanter Bakterien.Use of the nucleic acid according to claim 17 or of the kit according to one of claims 18 to 20 for the detection of clinically relevant bacteria. DNA-Array umfassend eine feste Phase auf dem Nukleinsäuren immobilisiert sind, wobei die Nukleinsäuren ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -176 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.DNA array comprising a solid phase immobilized on the nucleic acids are, the nucleic acids selected are from the sequences with SEQ ID No .: 1 -176 or complementary to these sequences, or represents a fragment thereof, or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence. DNA-Array gemäß Anspruch 23, wobei die Nukleinsäuren ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 55-170 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequen zen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.DNA array according to claim 23, the nucleic acids selected are from the sequences with SEQ ID No .: 55-170 respectively complementary to these sequences, or represents a fragment thereof, or complementary to this fragment or one of these sequences respectively the complementary Contains sequence.