Der vorliegenden Erfindung liegt
daher die Aufgabe zugrunde Mittel für eine Prävention, Therapie oder Diagnostik
der genannten Erkrankungen zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe
wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand
gelöst.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden
Figuren näher
erläutert:
1 zeigt
die Sequenz des humanen Stickstoffmonoxid (NO)-Synthase (eNOS)-Gens
im Bereich der T→C
Transition an Position –786.
Die unterstrichenen Basen kennzeichnen die Konsensusbindungsstellen
für zwei
bekannte Transkriptionsfaktoren.
2 zeigt
die fehlende Stimulierbarkeit der eNOS-Expression auf (A) mRNA (n=8–12) und
(B) Proteinebene (n=3) in kultivierten Endothelzellen, die aus der
Nabelschnurvene von Spendern mit –786C/C-Genotyp
isoliert worden waren, im Vergleich zu Endothelzellen van Spendern
mit –786C/T
und insbesondere –786T/T-Genotyp. Dargestellt
ist die prozentuale Steigerung der Expression in Zellen, die für 24 Stunden (mRNA)
bzw. 36 Stunden (Protein) in einem Kegel-Platte-Viskosimeter einer
Wandschubspanung (WSS) von 30 dyn/cm2 ausgesetzt
worden waren, im Vergleich zu Zellen desselben Spenders, die für diesen
Zeitraum unter statischen Bedingungen inkubiert wurden (*P < 0,05 im Vergleich
zur statischen Kontrolle).
3 zeigt
die Wiederherstellung der Schubspannungsinduktion der eNOS-Expression
in kultivierten Endothelzellen von Spendern mit –786C/C-Genotyp,
die für
4 Stunden mit einem C-Typ
(SEQ ID NO: 1) nicht aber mit einem T-Typ-Allel Decoy-Oligonukleotid
(SEQ ID NO: 3) vorbehandelt worden waren (Konzentration im Medium
von 10 μmol/l).
Dargestellt ist die prozentuale Steigerung der mRNA-Expression in
Zellen, die für 24
Stunden in einem Kegel-Platte-Viskosimeter
einer Wandschubspanung (WSS) von 30 dyn/cm2 ausgesetzt worden
waren, im Vergleich zu Zellen desselben Spenders, die für diesen
Zeitraum unter statischen Bedingungen inkubiert wurden (n = 4; *P < 0,05 im Vergleich
zur statischen Kontrolle).
4 zeigt
(A) die zeitabhängige
Induktion der eNOS-Expression auf mRNA (statistische Zusammenfassung,
n = 3–10,
*P < 0,05 vs. nicht
stimulierte Zellen) und Proteinebene (repräsentative Western Blot-Analyse)
durch IL-10 (2 ng/ml) in kultivierten Endothelzellen von Spendern
mit –786T/T-Genotyp,
die zuvor 9 Stunden mit Vitamin D3 (10 nmol/l) vorbehandelt worden
waren, um die Expression des IL-10 Rezeptors zu stimulieren. In
(B) ist die fehlende Induktion der eNOS-Expression durch IL-10 unter
ansonsten identischen experimentellen Bedingungen in kultivierten
Endothelzellen von Spendern mit –786C/C-Genotyp
gezeigt (statistische Zusammenfassung, n = 6, *P < 0,05 vs. nicht
stimulierte Zellen).
5 zeigt
die Auswirkungen der IL-10 (2 ng/ml) induzierten verstärkten eNOS-Expression
auf die CD154-stimulierte (2 × 105 Maus-Myelomzellen/ml) de novo Synthese
von IL-12 p40 auf (A) mRNA und (B) Proteinebene über 6 Stunden in IL-10 Rezeptor-exprimierenden
kultivierten Endothelzellen von Spendern mit –786T/T
bzw. –786C/T-Genotyp
sowie deren Modulation mittels Blockade der eNOS-Aktivität durch
Nitroarginin. Statistische Zusammenfassungen der RT-PCR-Analysen (mit rp132
als internem Standard; n = 6) und ELISA-Daten (n = 6–10; *P < 0,05 vs. CD154-stimulierte
Kontrollzellen).
6 zeigte
die fehlende Hemmung der CD154-stimulierten IL-12 p40-Expression
in IL-10 Rezeptor-exprimierenden kultivierten Endothelzellen von
Spendern mit –786C/C-Genotyp
sowie deren Restaurierung durch Vorbehandlung der Zellen (4 Stunden,
10 μmol/l)
mit dem C-Typ-Allel
Decoy-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 5). Statistische Zusammenfässung der
RT-PCR-Analysen
(mit rp132 als internem Standard; n = 7–15, *P < 0,05 vs. CD154-stimulierte Kontrollzellen).
Der hier verwendete Ausdruck "Decoy-Oligonukleotid" oder "Cis-Element Decoy" bezeichnet ein doppelsträngiges DNA-Molekül, das eine
Sequenz aufweist, die der naturlichen Kernbindungssequenz eines DNA-bindenen
Proteins oder Proteinkomplexes im Genom entspricht oder ähnelt und
an die das Protein oder der Proteinkomplex in der Zelle bindet.
Das Cis-Element Decoy wirkt somit als Molekül zur kompetitiven Inhibierung
(besser Neutralisierung) des Proteins oder Proteinkomplexes, das/der
die Expression der eNOS, eines Gens mit einer nachgewiesenen wichtigen
Schutzfunktion, bei Vorliegen des –786C/C-Genotyps
blockiert und somit prädisponierend
für die
Ausbildung der in den Patentansprüchen definierten Erkrankungen
und Komplikationen wirkt (siehe unten).
Der hier verwendete Begriff "C/T-Varianz" bezeichnet das Vorliegen
einer heterozygoten oder homozygoten T zu C Transition an Position –786 des
humanen eNOS-Gens. Demzufolge ist der hier verwendete Begriff "C/C-Genotyp" die homozygote 7
zu C Transition und der C/T-Genotyp die heterozygote T zu C Transition.
Die Synthese von Stickstoffinonoxid
(NO) durch die Endothelzellen der Gefäßwand spielt eine wichtige Rolle
in der Regulation der Organdurchblutung und in der Aufrechterhaltung
der Gefäßwandintegrität. Die letztgenannte
Wirkung von NO beruht insbesondere auf der Hemmung der Proliferation
glatter Gefäßmuskelzellen. Darüber hinaus
inhibiert NO die Expression von Chemokinen und Zelladhäsionsmnlekülen im Endothel.
Hierdurch wird bei entzündlichen
Prozessen die Rekrutierung, Aktivierung und Transmigration von im
Blut zirkulierenden Leukozyten unterdrückt. Insofern wird NO u. a.
eine wichtige Rolle in der Prävention
der Atherusklerose zugeschrieben, die nach heutigem Verständnis eine
chronisch rezidivierende Entzündungserkrankung
der Gefäßwand darstellt.
Die NO-Bildung in den Endothelzellen
wird von der so genannten endothelialen NO-Synthese (eNOS) katalysiert,
der physiologisch wichtigste Reiz für die Aktivität des Enzyms
ist eine Veränderung
der Wandschubspannung. Das ist die durch das strömende Blut auf die Endothelzellen,
welche die Arterien und Venen innen auskleiden, ausgeübte visköse Zugspannung.
So führt
ein Anstieg der Wandschubspannung, ausgelöst durch eine Konstriktion
des Blutgefäßes oder
einen Anstieg des Blutflusses, zu einer Steigerung der NO-Synthaseaktivität und infolgedessen
zu einer NO-vermittelten Vasodilatation, d.h. Zunahme der Organdurchblutung.
Neben dieser akuten Änderung
der Enzymaktivität
führt ein
Anstieg der Wandschubspannung mittelfristig auch zu einer verstärkten Expression
der NO-Synthase in den Endothelzellen. Bedingt durch die ständigen lokalen Änderungen
der Wandschubspannung ist die schubspannungsinduzierte Induktion
(besser Aufrechterhaltung) der NO-Synthase-Expression von entscheidender Bedeutung
für die
NO-Synthesekapazität
des Gefäßendothels
und damit für
die strukturelle und funktionelle Integrität der Gefäßwand (Gimbrone et al. (2000) Ann.
N. Y. Acad. Sci. 920, 230).
Interleukin-10 (IL-10) ist ein wichtiges
anti-inflammatorisches Zytokin bei chronisch rezidivierenden Entzündungserkrankungen
wie z.B. Psoriasis, rheumatoide Arthritis oder Morbus Crohn, die
durch eine übermäßige Aktivierung
von T-Helferzellen des Typs 1 verursacht sind (Moore et al. (2001)
Annu. Rev. Immunol. 19, 683). Auch in der Pathogenese der Atherosklerose
spielt die Infiltration und Aktivierung von Thl-Zellen in der Gefäßwand eine
wichtige Rolle (Daugherty und Rateri (2002) Circ. Res. 90, 1039).
IL-10 hemmt die Bildung von IL-12 in den mit den Th1-Zellen kommunizierenden
antigenpräsentierenden
Zellen. Hierzu zählen insbesondere
dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen; aber auch Endothelzellen
sind in der Lage die für
die Antigenpräsentation
benötigten
MHC II-Molekule auf ihrer Oberfläche
zu exprimieren und biologisch aktives IL-12 freizusetzen. IL-12
selbst ist der wichtigste Faktor für die Differenzierung von naiven
T-Helferzellen zu Thl-Zellen und stimuliert deren Proliferation
(klonale Expansion). Interessanterweise kann die Synthese von IL-12 in humanen Endotheizellen
nur nach Kostimulation über
das CD40-Rezeptor/CD40-Ligand-System
induziert werden (Lienenlüke
et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 2864). Hierbei exprimieren die
Endothelzellen in der Regel den Rezeptor (CD40) und aktivierte Th1-Zellen
den CD40-Ligand (auch als CD 154 bezeichnet).
Das humane eNOS-Gen weist eine Reihe
von Polymorphismen auf bei denen eine einzelne Base ausgetauscht
ist (SNP für
single nucleotide polymorphism), so auch eine T→C Transition im Promoter des
Gens an Position –786
(1). Linkage-Analysen
belegen, dass dieser Basenaustausch nicht isoliert vorkommt, sondern
stets mit einer A→G
Transition an Position –922
und einer T→A
Transition an Position –1486
assozuert ist. Die funktionelle Bedeutung dieser Polymorphismen
ist mit Ausnahme der T→C
Transition an Position –786 (siehe
unten) bisher nicht bekannt (Wattanapitayakul et al. (2000) Trends
Pharmacol. Sci. 22, 361). Bemerkenswert ist, dass in Westeuropa
ebenso wie in der kaukasischen Bevölkerung Nordamerikas 12–15% homozygote
Träger
der –786C-Variante
sind, d.h. sie weisen den Genotyp –786C/C
auf. Circa 48% sind heterozygot für diesen SNP, d.h. sie weisen
den Genotyp –786C/T
auf und circa 38% sind homozygote Träger der –786T-Variante, d.h.
sie weisen den Genotyp –786T/T auf. Weiterhin
interessant ist, dass diese Mutation bei anderen Säugetieren (Hund,
Maus, Ratte und Rind) offenbar nicht vorkommt, da an der entsprechenden
Position im eNOS-Promoter dieser Spezies eine Base fehlt.
Die Erfinder haben überraschenderweise
gefunden, dass Träger
des –786C/C-Genotyps – unabhängig von
den anderen primären
Risikofaktoren Bluthochdruck, Hypercholesterolämie, Rauchen und Diabetes – von einer
rascheren Progredienz der koronaren Herzkrankheit (KHK, manifeste
Atherosklerose in den Herzkranzgefäßen) betroffen sind (19,7%
der KHK-positiven Patienten (n=122) weisen den –786C/C-Genotyp
auf, aber nur 2,7% der KHK-negativen Patienten (n=111); die Häufigkeit
des –786C/C-Genotyps
in der Normalbevölkerung
beträgt
11,7% (n=540). Demzufolge haben diese Patienten ein deutlich erhöhtes Risiko,
frühzeitig
einen unter Umständen
tödlichen
Herzinfarkt zu erleiden. Nach diesen Ergebnissen ist der Grund für die raschere
Manifestierung der Atherosklerose bei den homozygoten Trägern des
Gendefekts eine verminderte NO-Synthesekapazität der Endothelzellen.
So konnten die Erfinder nachweisen,
dass in kultivierten Endothelzellen, die aus der Nabelschnurvene von
Spendern mit dem –786C/C-Genotyp isoliert
worden waren, die typische durch eine Erhöhung der Wandschubspannung
hervorgerufene Steigerung der eNOS-Expression auf mRNA- ebenso wie
auf Proteinebene ausbleibt (2).
Nach Vorbehandlung der Endothelzellen mit einem 22 by langen Decoy-Oligonukleotid,
welches dem C-Typ (SEQ ID NO: 1) nicht aber dem T-Typ-Allel (SEQ
ID NO: 3) des eNOS-Gens entspricht, konnte dagegen eine deutliche
Zunahme der eNOS-Expression durch Erhöhung der Wandschubspannung
ausgelöst werden
(3).
Die Transkription wird von Proteinen
gesteuert, die sich an die Starterregion eines Gens (Promotorregion)
binden. Die korrekte Zusammenlagerung mehrerer dieser Transkriptionsfaktoren
(Transkriptosom) bewirkt eine Aktivierung der RNA-Polymerase und
initiiert die Transkription. Andererseits kann die Bindung eines falschen
Transkriptionsfaktors die Bildung des Transkriptosoms verhindern
und damit die Expression des Gens blockieren. Decoy-Oligonukleotide imitieren
das Sequenzmotiv, an welches sich der Ziel-Transkriptionsfaktor
in der Starterregion seines (seiner) Zielgens (Zielgene) bindet,
und neutralisieren diesen. Infolgedessen wird die durch diesen Transkriptionsfaktor
vermittelte Induktion bzw. Repression der Transkription verhindert.
Ferner haben die Erfinder gefunden,
dass humane Endothelzellen nach Exposition gegenüber verschiedenen pro-inflammatorischen
Zytokinen, d.h. unter (simulierten) Entzündungsbedingungen, ebenso wie nach
Behandlung mit Vitamin D3, den Rezeptor für IL-10 exprimieren. Die Stimulation
des Rezeptors, d.h. Inkubation der IL-10 Rezeptor exprimierenden
Zellen mit IL-10, resultierte weiterhin in einer deutlichen Steigerung
der eNOS-Expression in den Endothelzellen (4); ein Effekt, der mit Hilfe von elektrophoretischen
Mobilitätsshift-Analysen und dem
Einsatz entsprechender Decoy-Oligonukleotide auf die Aktivierung
des Transkriptionsfaktors Signal transducer and activator of transcription
(STAT)-3 zuruckgeführt
werden konnte. Eine funktionelle Konsequenz dieser IL-10-vermittelten
Steigerung der eNOS-Expression
war die Hemmung der CD154-induzierten Neusynthese von IL-12 in den
Endothelzellen (5),
die NO-sensitiv ist (Modulation durch den NO-Synthese-Inhibitor
Nitroarginin). Demnach kann IL-10 seine anti-inflammatorische Wirkung
bei Th1-gewichteten chronischen Entzündungserkrankungen, insbesondere
die Hemmung der IL-12-Synthese in den Endothelzellen, durch eine
Steigerung der eNOS-Expression und der damit assoziierten verstärkten NO-Bildung
entfalten.
Die für den IL-10-Effekt wichtige
STAT-Bindungsstelle im Promoter des humanen eNOS-Gens liegt circa
60 Basenpaare oberhalb der T→C
Transition an Position –786.
Die Erfinder konnten zeigen, dass der –786C/T-Polymorphismus
einen Effekt auf die Induzierbarkeit der eNOS-Expression durch IL-10 hat. So kam es in
Endothelzellen von Spendern mit –786C/C-Genotyp – trotz
Vitamin D3-Induktion der IL-10 Rezeptor-Expression – zu keiner
Steigerung der eNOS-Expression
durch IL-I 0 (4).
Darüber
hinaus hemmte die IL-10-Exposition die CD154-induzierte Synthese von IL-12 in dieser.
Fellen nicht, sondern. verstärkte
diese sogar (6). Bedingt
durch die räumliche
Nähe kommt
es zu einer Hemmung der Bildung des Transkriptosoms im Bereich der
STAT-Bindungsstelle durch den an Position –786 bindenden inhibitorischen
Transkriptionsfaktor. Experimentelle Daten belegen, dass dieses
Defizit, d.h. die fehlende Induktion der eNOS-Expression durch IL-10
und infolgedessen die fehlende IL-10-vermittelte Hemmung der IL-12-Synthese,
durch Vorbehandlung der Endothelzellen mit dem zuvor beschriebenen
C-Typ-Allel Decoy-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5)
vollständig
kompensiert werden kann (6).
Eine weitere vergleichende Genotypisierung
zeigt beispielsweise, dass kaukasische Patienten mit rheumatoider
Arthritis eine in der Tendenz deutlich höhere Prävalenz des –786C/C-Genotyps
aufweisen als in der Normalbevölkerung
(17,2% (n=227) im Vergleich zu 11,7% (n=540)). Bei diesen Patienten
kann die intraartikuläre
Applikation eines Decoy-Oligonukleotids während des Entzündungsschubs
die endogene IL-10-vermittelte Hemmung der Th1-Zellantwort nachhaltig
verstärken
bzw. erst ermöglichen
und so den Entzündungsprozess
und die damit assozuerte Knorpeldestruktion im betroffenen Gelenk
abschwächen.
Weitere Anwendungsmöglichkeiten
ergeben sich bei den in den Patentansprüchen definierten Erkrankungen
bzw. Komplikationen.
Die vorliegende Erfindung betrifft
daher die Bereitstellung eines doppelsträngigen DNA-Oligonukleotids, das in der Lage ist,
sequenzspezifisch an ein Protein oder einen Proteinkomplex (im nachfolgenden
als "Transkriptionsfaktor" oder "inhibitorischer Transkriptionsfaktor" bezeichnet) zu binden.
Die Sequenz des doppelsträngigen
DNA-Oligonukleotids, das zur Verhinderung der Bindung des inhibitorischen
Transkriptionsfaktors verwendet wird, ist die Sequenz, an die der
Transkriptionsfaktor im Promoter des eNOS-Gens bindet. Das erfindungsgemäße Cis-Element
Decoy weist folgende 10-mer Konsensus-Kernbindungssequenz auf: 5'-CTBBCYGBCT-3' (SEQ ID NO: 33)
wobei Y=C oder T und B=C, G oder T bedeutet. Das Cis-Element Decoy kann
ferner größer als
die 10-mer Kernbindungssequenz sein und am 5'-Ende
und/oder am 3'-Ende
verlängert werden.
Entsprechende Mutationen im Bereich der Kernbindungssequenz (z.B.
5'-CTAGCTGACT-3') führen zu
einem kompletten Verlust der Bindung des Transkriptionsfaktors an
das Decoy-Oligonukleotid, sichtbar an der fehlenden biologischen
Wirkung (Tabelle 1).
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung
die Bereitstellung doppelsträngiger
DNA-Oligonukleotide,
die in der Lage sind, sequenzspezifisch an den Transkriptionsfaktor
zu binden und eine der folgenden Sequenzen haben, wobei hier nur
jeweils ein Strang der doppelsträngigen
DNA-Oligonukleotide wiedergegeben ist und der komplementäre Strang
ebenfalls umfasst ist:
5'-AGCTCTTCCCTGGCCGGCTGAC-3' (SEQ ID NO: 1),
5'-AGCTCTTCCCTGGCTGGCTGAC-3' (SEQ ID NO: 3),
5'-CTTCCCTGGCCGGCTGACCCTGC-3' (SEQ ID NO: 5),
5'-CTTCCCTGGCTGGCTGACCCTGC-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-GCTCTTCCCTGGCCGGCTG-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-CAAGCTCTTCCCTGGCCGG-3' (SEQ ID NO: 11),
5'-TCTTCCCTGGCCGGCTGAC-3' (SEQ ID NO: 13),
5'-CTGGCCGGCTGACCCTGCC-3' (SEQ ID NO: 15),
5'-TCCCTGGCCGGCTGAC-3' (SEQ ID NO: 17),
5'-CTGGCCGGCT-3' (SEQ ID NO: 19),
5'-CTGGCTGGCT-3' (SEQ ID NO: 21),
5'-TCCCTGGCYGGCTGAC-3' (SEQ ID NO: 23),
wobei Y=C oder T bedeutet,
5'-CTGGCYGGCTGAC-3' (SEQ ID NO: 25), wobei Y=C oder T bedeutet,
5'-TCCCTBBCYGBCTGAC-3' (SEQ ID NO: 27)
mit Y=C oder T und B=C, G oder T,
5'-CCCTBBCYGBCTG-3' (SEQ ID NO: 29) mit Y=C oder T und
B=C, G oder T,
5'-CTBBCYGBCTGAC-3' (SEQ ID NO: 31)
mit Y=C oder T und B=C, G oder T, und
5'-CTBBCYGBCT-3' (SEQ ID NO: 33) mit Y=C oder T und
B=C, G oder T.
Insofern stellt die Verwendung der
erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNA-0ligonukleotide,
auch Decoy-Oligonukleotid oder Cis-Element Decoy genannt, die eine
Konsensus-Kernbindungsstelle
für den
inhibitorischen Transkriptionsfaktor enthalten, das bevorzugte Verfahren
zur spezifischen Inhibierung der Aktivität dieses Faktors dar. Die exogene
Zufuhr einer großen
Zahl von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen zu einer Zelle, insbesondere
in viel höherer
Zahl als im Genom vorhanden, erzeugt eine Situation, in der die
Mehrzahl eines bestimmten Transkriptionsfaktors spezifisch an das
jeweilige Cis-Element Decoy und nicht an seine endogenen Ziel-Bindungsstellen
bindet. Dieser Ansatz zur Inhibition der Bindung von Transkriptionsfaktoren
an ihre endogene Bindungsstelle wird auch als Squenching bezeichnet.
Squelching (oder auch Neutralisation genannt) von Transkriptionsfaktoren
unter Verwendung von Cis-Element Decoys wurde u. a. erfolgreich
bei Patienten eingesetzt, um ein übermäßiges Wachstum von glatten
Gefäßmuskelzellen
in aortokoronaren Venenbypässen
zu inhibieren. Dabei wurden DNA-Fragmente verwendet, die spezifische
Bindungsstellen für
den Transkriptionsfaktor E2F enthalten (Mann et al. (1999) Lancet
354, 493).
Abgesehen von der grundsätzlichen
Voraussetzung, dass die erfindungsgemäßen Decoy-Oligonukleotide den inhibitorischen
Transkriptionsfaktor in vitro effektiv neutralisieren, ist es für die therapeutische
Wirksamkeit entscheidend, dass das DNA-Molekul schnell und in einem
ausreichenden Umfang in die Zielzelle aufgenommen wird. Darüber hinaus
sollte das erfindungsgemäße Cis-Element
Decoy eine bestimmte Länge
nicht überschreiten,
da dies für
den Transport in die Zielzelle limitierend ist. Geeignet ist jedes
Decoy-Oligonukleotid mit einer Länge
von mindestens 10 by (Konsensus-Kernbindungssequenz) bis zu einer
Länge von
etwa 30 bp, vorzugsweise bis zu einer Länge von etwa 27 Basenpaaren,
besonders bevorzugt bis zu einer Länge von etwa 23, insbesondere
bevorzugt jede Länge
von 10 bis 23 Basenpaaren.
Da das Cis-Element Decoy eine doppelsträngige Nukleinsäure ist,
umfasst das erfindungsgemäße DNA-Oligonukleotid
jeweils nicht nur die Sense- oder Forward-Sequenz sondern auch die
komplementäre
Antisense- oder Reverse-Sequenz. Bevorzugte erfindungsgemäße DNA- Oligonukleotide weisen
eine 10-mer-Kernbindungssequenz für den inhibitorischen Transkriptionsfaktor
auf, wie sie in SEQ II) NO:33 enthalten ist. Das Cis-Element Decoy
kann jedoch auch eine zur vorstehenden Sequenz abweichende Sequenz aufweisen
und länger
als ein 10-mer sein. Besonders bevorzugt sind die Sequenzen wie
sie in SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:34 enthalten sind. Diese Aufzählung der
bevorzugten Sequenzen ist nicht abschließend. Dem Fachmann ist ersichtlich,
dass eine Vielzahl von Sequenzen als Inhibitor für den Transkriptionsfaktor
verwendet werden können,
solange sie die vorstehend aufgeführten Bedingungen der 10-mer
Konsensus-Kernbindungssequenz und eine Affinität zu dem Transkriptionsfaktor
aufweisen.
Die Affinität der Bindung einer Nukleinsäuresequenz
an diesen Transkriptionsfaktor kann durch die Verwendung des Electrophoretic
Mobility Shift Assay (EMSA) (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press; Krzesz et al. (1999) FEBS Lett.
453, 191) bestimmt werden. Dieses Testsystem ist für die Qualitätskontrolle
von Nukleinsäuren,
die für
die Verwendung in der Methode der gegenwärtigen Erfindung gedacht sind,
oder die Bestimmungen der optimalen Länge einer Bindungsstelle geeignet.
Sie ist auch für
die Identifizierung von anderen Sequenzen, die durch den Transkriptionsfaktor
gebunden werden, geeignet.
Die Methode der vorliegenden Erfindung
moduliert die Transkription eines Gens oder von Genen in einer solchen
Weise, dass das Gen oder die Gene, z.B. eNOS, vermehrt exprimiert
werden. Vermehrte Expression im Rahmen der gegenwärtigen Erfindung
bedeutet, dass die Transkriptionsrate gesteigert ist im Vergleich
zu Zellen, die nicht mit einem erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNA-Oligonukleotid
behandelt werden. Solch eine Steigerung kann beispielsweise durch
Northern Blot (Sambrook et al., 1989) oder RT-PCR (Sambrook et al.,
1989) bestimmt werden. Typischerweise ist eine solche Steigerung
zumindest eine 2-fache, besonders zumindest eine 5-fache, insbesondere
zumindest eine 10-fache Enthemmung der Genexpression.
Oligonukleotide werden in der Regel
schnell durch Endo- und Exonukleasen, im besonderen DNasen und RNasen
in der Zelle abgebaut. Deshalb können
die Nukleinsäuren
modifiziert werden, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so
dass über
einen längeren
Zeitraum eine hohe Konzentration der Oligonukleotide in der Zelle
beibehalten wird. Typischerweise kann eine solche Stabilisierung
durch die Einführung
einer oder mehrerer modifizierter Internukleotidbindungen erhalten
werden.
Ein erfolgreich stabilisiertes DNA-Oligonukleotid
enthält
nicht notwendigerweise eine Modifikation an jeder Internukleotidbindung.
Vorzugsweise sind die Internukleotidbindungen an den jeweiligen
Enden beider Oligonukleotide des Cis-Element Decoys modifiziert.
Dabei können
die letzten sechs, fünf
vier, drei, zwei oder die letzte oder eine oder mehrere Internukleotidbindungen
innerhalb der letzten sechs Internukleotidbindungen modifiziert
sein. Ferner können
verschiedene Modifikationen der Internukleotidbindungen in die Nukleinsäure eingeführt werden
und die daraus entstehenden doppelsträngigen DNA-Oligonukleotide
auf seguenzspezifische Bindung an den inhibitorischen Transkriptionsfaktor,
unter Verwendung des Routine EMSA-Testsystems, getestet werden. Dieses
Testsystem erlaubt die Bestimmung der Bindungskonstante des Cis-Element
Decoys und so die Bestimmung, ob die Affinität durch die Modifikation verändert wurde.
Modifizierte Cis-Element Decoys, die noch eine ausreichende Bindung
zeigen, können
ausgewählt
werden, wobei eine ausreichende Bindung zumindest etwa 50% oder
zumindest etwa 75%, und besonders bevorzugt etwa 100% der Bindung
der unmodifizierten Nukleinsäure
bedeutet.
Cis-Element Decoys mit modifizierter
Internukleotidbindung, die immer noch ausreichende Bindung zeigen,
können überprüft werden,
ob sie stabiler in der Zelle sind als unmodifizierte Cis-Element
Decoys. Die mit den erfindungsgemäßen Cis-Element Decoys "transfizierten" Zellen werden zu
verschiedenen Zeitpunkten auf die Menge der dann noch vorhandenen
Cis-Element Decoys
untersucht. Dabei wird vorzugsweise ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff
(z.B. Texas-Rot) markiertes Cis-Element Decoy oder ein radioaktiv
markiertes (z.B. 35S) Cis-Element Decoy
eingesetzt mit anschließender
digitaler Fluoreszenzmikroskopie bzw. Autoradiographie oder Szintigraphie.
Ein erfolgreich modifiziertes Cis-Element Decoy hat eine Halbwertzeit
in der Zelle, die höher
ist als die eines unmodifizierten Cis-Element Decoys, vorzugsweise
von zumindest etwa 48 Stunden, mehr bevorzugt von zumindest etwa
4 Tagen, am meisten bevorzugt von mindestens etwa 7 Tagen.
Geeignete modifizierte Internukleotidbindungen
sind in Uhlmann und Peyman ((1990) Chem. Rev. 90, 544) zusammengefasst.
Modifizierte Internukleotid-Phosphat-Reste und/oder Nicht-Phosphor-Brücken in
einer Nukleinsäure,
die in einer Methode der gegenwärtigen
Erfindung eingesetzt werden können,
enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphorodithioat,
Phosphoramidat, Phosphatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid-Analoge, beispielsweise
Siloxan-Brücken,
Carbonat-Brücken,
Carboxymethylester-Brücken,
Acetamidat-Brücken
und/oder Thioether-Brücken
enthalten. Bei der Verwendung Phosphorothioat-modifizierter Internukleotidbindungen
sollten diese vorzugsweise nicht zwischen den Basen Cytosin und
Guanin liegen, da dies zu einer Aktivierung der Zielzellen des Cis-Element
Decoys im Sinne einer entzündlichen
Reaktion führen
kann.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist
die Stabilisierung von Nuk1einsäuren
durch die Einführung
struktureller Merkmale in die Nukleinsäure, welche die Halbwertzeit
der Nukleinsäure
erhöhen.
Solche Strukturen, die Haarnadel- und Glocken-DNA enthalten, sind
in
US 5,683,985 offenbart.
Gleichzeitig können modifizierte
Internukleotid-Phosphat-Reste und/oder Nicht-Phosphor-Brücken, zusammen
mit den genannten Strukturen, eingeführt werden. Die sich daraus
ergebenden Nukleinsäuren
können
im oben beschriebenen Testsystem auf Bindung und Stabilität geprüft werden.
Ein Cis-Element Decoy der vorliegenden
Erfindung wird schnell in die Zelle aufgenormmen. Eine ausreichende
Aufnahme ist durch die Modulatien der Expression von einem oder
mehreren Genen, die einer Kontrolle durch den Ziel-Transkriptionsfaktor
unterliegen, charakterisiert (z.B. eNOS). Das Cis-Element Decoy
der vorliegenden Erfindung moduliert in bevorzugter Weise die Transkription
von einem Gen oder Genen nach etwa 4 Stunden der Berührung mit
der Zelle, mehr bevorzugt nach etwa 2 Stunden, nach etwa 1 Stunde,
nach etwa 30 Minuten und am meisten bevorzugt nach etwa 10 Minuten.
Eine typische Mischung, die in so einem Versuch eingesetzt wird,
enthält
10 μmol/l
Cis-Element Decoy.
Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Decoy-Oligonukleotide zur Herstellung eines
Arzneimittels, insbesondere zur Prävention oder Therapie der Atherosklerose
und ihren Folgeerkrankungen (insbesondere koronare Herzkrankheit,
Angina pectoris, Herzinfarkt, auch infolge eines Koronarspasmus,
Herzinsuffizienz, Schlaganfall und periphere Verschlusskrankheit),
chronischen Entzündungs-
bzw. Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis (chronische
Polyarthritis), Schuppenflechte einschließlich Psoariasis-Arthritis, chronisch
entzündliche
Darmerkrankungen (insbesondere Morbus Crohn), Diabetes Typ I und
II und deren Folgeerkrankungen (z.B. diabetische Nephropathie),
der multiplen Sklerose, von Sarkoidosen, Kollagenosen und Vaskulitiden
(einschließlich
Glomerulonephritiden), der akuten und chronischen Abstoßung (Vaskulopathie)
transplantierter Organe, der graft versus host disease (GVHD) sowie
dem Ischämie/Reperfusionsschaden
von Organen im Anschluss an einen chirurgischen Eingriff, dem allergischen Kontaktekzem,
der (Prä-)Eklampsie
bzw. schwangerschaftsinduzierten Hypertonie, der arteriellen Hypertonie und
ihren Folgeerkrankungen (insbesondere Linksherzhypertrophie und
Gefäßwandumbau),
der pulmonalen Hypertonie, der chronischen Niereninsuffizienz, chronisch
obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD), bakteriellen Infektionen
und ihren Folgeerkrankungen wie Helicobacter pylori-Gastritis, tuberkulöse Perikarditis,
Lyme-Borreliose mit nachfolgender Borrelien-Arthritis bzw. Neuroborreliose,
sowie Infektionen mit Hepatitis C- bzw. HI (human immunodeficiency)-Viren
und deren Folgeerkrankungen (z.B. portale Hypertonie und Fibrose bzw.
opportunistische Infektionen, insbesondere Pneumocystis-carinii-Pneumonie).
Um die Wirksamkeit der therapeutischen
Decoy-Oligonukleotide sicher zu stellen, sollten die Patienten auf
die –786C/T-Varianz,
d.h. auf die heterozygote oder homozygote Trägerschaft der –786C-Variante
des eNOS-Gens, untersucht worden sein, vorzugsweise mittels Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Analyse
(RFLP-Analyse) oder Echtzeit-PCR/Schmelzkurven-Analyse.
Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner Verfahren zur Diagnose einer –786C/T-Varianz
im humanen eNOS-Gen, umfassend die Schritte: Zugabe von DNA-Oligonukleotiden,
wobei ein DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die stromaufwärts der –786-Position
des eNOS-Gens liegt
und dem Sense-Strang entspricht und ein weiteres DNA-Oligonulcleotid
eine Sequenz aufweist, die stromabwärts der –786-Position des eNOS-Gens
liegt und dem Antisense-Strang entspricht, Durchführen einer
Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Durchführen einer DNA-Spaltung mit einem
Restriktionsenzym, das eine Erkennungssequenz aufweist, die mindestens
4 Nukleotide lang ist und die Sequenz 5'-CCGG-3' aber nicht die Seguenz 5'-CTGG-3' enthält, und Nachweisen
der durch die DNA-Spaltung erhaltenen DNA-Fragmente. Die DNA-Oligonukleotide dienen
als Primer für
die PCR.
Mit der eNOS-Sequenz ist die unter
der GenBank Accession Number L10693 (gi:348219) aufgeführte Sequenz
gemeint, die hier auch als Sense-Strang bezeichnet wird und dem
Strang entspricht, der die mRNA-Sequenz des eNOS-Genproduktes enthält. Der
Start wird mit +1 bezeichnet, entsprechend liegt die Position –786 vor
dem Startpunkt stromaufwärts.
Als Antisense-Strang wird der zum Sense-Strang komplementäre Strang
bezeichnet, der auch als Matrize bezeichnet wird.
Die DNA-Oligonukleotide (Primer)
können
jede Länge
aufweisen, die für
eine PCR erforderlich ist. Die DNA-Oligonukleotide können ferner
solche Sequenzen aus dem eNOS-Gens oder dem 5'-Bereich des eNOS-Gens aufweisen, dass
eine PCR durchgeführt
werden kann. Dazu müssen
die Primer weit genug auseinander liegen, dass ein Nachweis der
Amplifikate und der gespaltenen Amplifikate möglich ist, aber nicht soweit,
dass kein Amplifikat mehr erzeugt wird. Ferner sollten die Primer
so ausgewählt
werden, dass bei einer DNA-Spaltung DNA-Fragmente mit einer derart
unterschiedlichen Größe entstehen,
die einfach nachzuweisen sind. Vorzugsweise haben die Primer die
Sequenzen gemäß SEQ ID
NO:35 und 36. Vorzugsweise ist das Restriktionsenzym HpaII und das
Nachweisverfahren eine Agarose-Gelelektrophorese oder eine Kapillarelektrophorese.
Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner einen Kit zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
umfassend die vorstehenden DNA-Oligonukleotide (Primer), Reagenzien
zur Durchführung
einer PCR vorzugsweise einschließlich der Taq-Polymerase, ein
Restriktionsenzym und Reagenzien zur Durchführung einer DNA-Spaltung.
Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner ein Verfahren zur schnellen Bestimmung des –786C/T-Varianz des humanen
eNOS-Gens, umfassend folgende Schritte: Zugabe von DNA-Oligonukleotiden
zu einer Patienten-DNA-Probe, wobei ein DNA-Oligonukleotid eine
Seguenz aufweist, die stromaufwärts
der –786-Position des
eNOS-Gens liegt und dem Sense-Strang entspricht (Primer 1), ein
weiteres Fluoreszenzfarbstoff-modifiziertes DNA-Oligonukleotid eine
Sequenz aufweist, die die –786-Position
des eNOS-Gens umfasst und dem Antisense-Strang entspricht und zur –786C-Variante
des eNOS-Genpromotors komplementär
ist (Detektionsprobe), ein weiteres Fluoreszenzfarbstoff-modifiziertes
DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die dem Antisense-Strang
entspricht und wobei das 5'-Ende
des DNA-Oligonukleotids 1–5
Nukleotide stromaufwärts
vom 3'-Ende der
Detektionsprobe liegt (Ankerprobe), und ein weiteres DNA-Oligonukleotid
eine Sequenz aufweist, die stromabwärts der –786-Position des eNOS-Gens
liegt und dem Antisense-Strang entspricht (Primer 2), Durchfuhren
einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Nachweis der –786C-
und/oder –786T-Variante
mittels einer Fluoreszenzresonanz-Energietransfer-(FRET)-gestützten DNA-Schmelzkurven-Analyse.
Die Primer 1 und 2 können jede
Länge aufweisen,
die für
eine PCR erforderlich ist. Die Primer können ferner solche Sequenzen
aus dem eNOS-Gens oder dem 5'-Bereich
des eNOS-Gens aufweisen, dass eine PCR durchgeführt werden kann. Dazu müssen die
Primer weit genug auseinander liegen, dass ein Nachweis der Amplifikate
und der gespaltenen Amplifikate möglich ist, aber nicht soweit,
dass kein Amplifikat mehr erzeugt wird. Die Detektionsprobe ist
am 3'-Ende kovalent mit
einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Die Ankerprobe ist am 5'-Ende kovalent mit
einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt, der sich von dem der Detektionsprobe
unterscheidet. Ferner ist die Ankerprobe an 3'-Position der letzten Desoxyribose phosphoryliert
und weist eine Schmelztemperatur von 5–10°C über dem Schmelzpunkt der Detektionsprobe
auf. Die Farbstoffkombination ist so gewählt, dass der excitierte Farbstoff
der Detektionsprobe geeignet ist, den Farbstoff der Ankerprobe effizient
durch FRET anzuregen, und Licht einer definierten Wellenlänge zu emittieren
solange beide Frohen in unmittelbare Nähe zueinander sind. Vorzugsweise
werden als Fluoreszenzfarbstoff der Detektionsprobe Fluorescein
(Anregungswellenlänge
493 nm) und als Fluoreszenzfarbstoff der Ankerprobe LC Red-640 (Emission
640 nm) verwendet. Sowohl die Detektionsprobe als auch die Ankerprobe
sind nicht für
die PCR geeignet, da beide durch ihre chemischen Modifikationen
in der 3'-Position
keine enzymatische Kettenverlängerung
erlauben. Vorzugsweise hat die Detektionsprobe eine Sequenz gemäß SEQ ID
NO:37 und die Ankerprobe eine Sequenz gemäß SEQ ID NO:38. Dem Fachmann
ist ersichtlich, dass andere DNA-Oligonukleotide als Detektions-
bzw Ankerproben verwendet werden können, z.B. solche, die den
Antisense-Strang binden.
Für
die Bestimmung des Genotyps einer Patientenprobe werden in einen
PCR-Ansatz neben den für die
PCR notwendigen Reagenzien und die zu untersuchende Patienten-DNA
außerdem
die Primer 1 und 2 und die Detektions- und Ankerprobe gegeben. Nach
der durch die Primer 1 und 2 vermittelten PCR-Amplifikation eines
Fragmentes des eNOS Promoters, welches die Position -786 des Gens
enthält,
wird die Temperatur des Ansatzes so erhöht, das alle DNA-Doppelstränge denaturieren.
Hierauf wird die Temperatur wieder erniedrigt, so dass Detektions- und Ankerproben
mit den Sense-Strängen
des amplifizierten Fragmentes hybridisieren. Die Schmelzkurve wird
nun durch Anregung des Farbstoffes der Detektionsprobe und kontinuierlicher Messung
der Fluoreszenz der Ankerprobe bei gleichzeitiger Erhöhung der
Temperatur (z.B. etwa 0,2°C
pro Sekunde) aufgenommen. Hierbei wird ausgenutzt, dass die Übertragung
von Anregungsenergie des Farbstoffes der Detektionsprobe auf den
der Ankerprobe nur so lange funktioniert, wie beide Proben an den
Sense-Strang gebunden haben. Eine Unterscheidung der –786T-
von der –786C-Variante
erfolgt über
die Temperatur, bei der die Detektionsprobe vom Sense-Strang abschmilzt,
also die FRET-induzierte Fluoreszenz deutlich abnimmt. Dies ist
für die
Detektionsprobe bei Fragmenten mit der –786T-Variante
aufgrund des auftretenden G-T-Mismatches 5-10°C früher der Fall als bei Sense-Strängen mit
der –786C-Variante. Für den Nachweis
wird vorzugsweise ein Fluoreszenz-basierendes Echtzeit-PCR-Gerät (z.B.
der Light Cycler der Firma Roche) verwendet. Dem Fachmann ist ersichtlich,
dass nicht nur die Bestimmung eines Genotpyps in einer PCR, sondern
auch gleichzeitig die Bestimmung von mehr als einem Genotyp in einer
PCR, in einer sogenannten Multiplex-PCR, durchgeführt werden
kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner DNA-Oligonukleotide mit der Seguenz gemäß SEQ ID NO:3S bis 38.
Das DNA-0ligonukleotid SEQ ID NO:
37 weist folgende Sequenz auf: 5'-GGGTCAGCCGGCCAGGGAA-3', wobei an das 3'-Ende ein Fluoreszenzfarbstoff,
vorzugsweise Fluoreszein, gekoppelt ist. Das DNA-Oligonukleotid
SEQ ID NO: 38 weist folgende Sequenz auf 5'-AGCTTGATGCCCTGGTGGGAG-3', wobei an das 5'-Ende ein Fluoreszenzfarbstoff
der verschieden ist von dem Fluoreszenzfarbstoff des DNA-0ligonukleotids gemäß SEQ ID
NO:37, vorzugsweise LC Red G4U, gekoppelt ist, und an das 3'-Ende ein Phosphatrest, vorzugsweise
PO4, gekoppelt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner ein Kit zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend
die vorstehenden Primer 1 und 2, zwei weitere
DNA-Oligonukleotide (Detektionsprobe und Ankerprobe), Reagenzien
zur Durchführung
einer PCR vorzugsweise einschließlich der Taq-Polymerase, und
Reagenzien zur Durchführung
einer Schmelzkurvenanalyse.
Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner ein Verfahren zur Modulation der Transkription von mindestens
einem Gen in Zellen, insbesondere in eNOS-exprimierenden Zellen
wie Endothelzellen, Epithelzellen der Lungen, Nieren und des weiblichen
Urogenitaltraktes, Herzmuskelzellen, Thrombozyten und neuronale
Zellen (Hippocampus), wobei die Methode den Schritt der Kontaktierung
der genannten Zellen mit einer Mischung, enthaltend eine oder mehrere
erfindungsgemäße doppelsträngige Nukleinsäure(n),
die in der Lage sind, sequenzspezifisch an den inhibitorischen Transkriptionsfaktor
zu binden, umfasst. Ein bevorzugtes Verfahren ist z.B. die intraartikuläre Injektion
der Nukleinsäurehaltigen
Mischung in ein oder mehrere Gelenke bei Patienten mit rheumatoider
Arthritis.
Die Mischung enthaltend die erfindungsgemäßen Cis-Element
Decoys wird mit den Zielzellen (z.B. Endothelzellen) in Berührung gebracht.
Das Ziel dieses In-Berührung-Bringens
ist die Übertragung
der Cis-Element Decoys, die den inhibitorischen Transkritionsfaktor
binden, in die Zielzelle (d.h. zum Beispiel die eNOS-exprimierende
Endothelzelle). Deshalb können
Nukleinsäure-Modifikation
und/oder Zusatzstoffe oder Hilfsstoffe, von denen bekannt ist, dass
sie die Durchdringung von Membranen erhöhen, im Rahmen der gegenwärtigen Erfindung
benutzt werden (Uhlmann und Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 544).
Eine mit den Zielzellen in Berührung gebrachte
Mischung gemäß der Erfindung
enthält
in einer bevorzugten Ausführungsform
im Wesentlichen nur Nukleinsäure
und Puffer. Der für
Decoy-Oligonukleotide
geeignete Konzentrationsbereich liegt bei 0,1 bis 100 μmol/l, vorzugsweise
bei 0,5 bis 25 μmol/l
und besonders bevorzugt bei 10 μmo1/1.
Es können
ein oder mehrere geeignete Puffer zugesetzt werden. Ein Beispiel
eines solchen Puffers ist eine modifizierte Ringer-Lösung enthaltend
145 mmol/l Na+, 5 mmol/l K+,
11 mmol/l Cl–,
2 mmol/l Ca+, 1 mmol/l Mg2+, 10 mmol/1 Hepes,
145 mmol/l Isethionat, 10 mmol/l D-Glucose, pH 6,5.
In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung enthält
die Mischung zusätzlich
mindestens einen Zusatzstoff und/oder Hilfsstoff. Zusatzstoffe und/oder
Hilfsstoffe wie Lipide, kationische Lipide, Polymere, Liposomen,
Nanopartikel, Nukleinsäure-Aptamere,
Peptide und Proteine, die an DNA gebunden sind, oder synthetische
Peptid-DNA-Moleküle
sind beabsichtigt, um beispielsweise die Einbringung von Nukleinsäuren in
die Zelle zu erhöhen,
um die Mischung auf nur eine Untergruppe von Zellen zu richten,
um den Abbau der Nukleinsäure
in der Zelle zu verhindern, und um die Lagerung der Nukleinsäuremischung
vor der Verwendung zu erleichtern. Beispiele für Peptide und Proteine oder
synthetische Peptid-DNA-Moleküle
sind z.B. Antikörper, Antikörperfragmente,
Liganden, Adhäsionsmoleküle, die
alle modifiziert oder unmodifiziert sein können.
Zusatzstoffe, die die Cis-Element
Decoys in der Zelle stabilisieren, sind beispielsweise Nukleinsäure-kondensierende
Substanzen wie kationische Polymere, Poly-L-Lysin oder Polyethylenimin.
Die Mischung, die in dem Verfahren
der gegenwärtigen
Erfindung eingesetzt wird, wird bevorzugt lokal angewendet durch
Injektion, Infusion, Katheter, pluronische Gele, Polvmere, die anhaltend
Medikamente freisetzen, oder jede andere Vorrichtung, die lokalen
Zugang ermöglicht.
Auch die ex vivo Anwendung der Mischung (Infusion bzw. Inkubation),
verwendet im Verfahren der gegenwärtigen Erfindung, erlaubt einen
lokalen Zugang.
Die folgenden Beispiele dienen nur
der Erläuterung
und beschränken
in keiner Weise den Umfang der Erfindung.
1. Patienten
Für
die Analyse der Häufigkeitsverteilung
der –786C/T-Varianz
des eNOS-Gens bei koronarer Herzkrankheit (KHK) und rheumatoider
Arthtritis wurde aus Blut von Patienten (ca. 2 ml) genomische DNA
isoliert und diese mittels einer PCR-Amplifikation mit folgender
RFLP-Analyse (s.
u.) auf die Varianz hin untersucht.
Bei der Analyse von Patienten mit
rheumatoider Arthirits konnte auf zwei bereits vorhandene Kollektive zurückgegriffen
werden. Hierbei konnten anonymisierte (Zahlencode) DNA-Proben von
Patientinnen und Patienten der Rheuma-Ambulanz der Universität Göttingen
und der Abteilung Rheumatologie des Universitätsklinikums Freiburg auf die
Varianz gestestet werden. Beide Kollektive bieten eine typische
Verteilung von Patientinnen und Patienten mit rheumatoider Arthiritis,
d.h. die betroffenen Personen sind zu etwa 80% weiblich. Das Altersprofil
reichte von 20 Jahren bis zu 80 Jahren mit Häufungen (peaks) der Patientenzahlen
bei 35–40 Jahren
(early onset) und 60–70
Jahren (late onset).
Für
die Analyse der –786C/T-Varianz des eNOS-Gens
bei koronarer Herzkrankheit wurden Blutproben während der Durchführung einer
Herzkatheteruntersuchung entnommen. Auf diese Weise konnte das Vorliegen
der Erkrankung eindeutig festgestellt bzw. ausgeschlossen werden.
Alle Patienten wurden vor der Blutabnahme mündlich und schriftlich aufgeklärt und hatten
der Verwendung ihrer Blutproben schriftlich zugestimmt. Die Genotypisierung
erfolgte in anonymisierter Form (Zahlenkodierung), Alter, Diagnose,
Geschlecht und Risikofaktorprofil der zugehörigen Personen wurden nach
erfolgter Analyse mitgeteilt. Für
die statistische Analyse der Genotypverteilung wurden Individuen
bis 64 Jahre herangezogen. Die Verteilung der bereits bekannten primären Risikofaktoren
für KHK
(Hypertonie, Diabetes mellitus, Zigarettenrauchen und Hypercholesterinämie) war
unabhängig
vom Genotyp der jeweiligen Patienten.
Als Vergleichskollektiv zur Genotypverteilung
wurde DNA aus der Nabelschnurarterie von Neugeborenen aus Göttingen
und Umgebung (im Umkreis von circa 70 km) verwendet. Auch diese
Proben waren anonymisiert und die Eltern der Kinder hatten zuvor
eine schriftliche Einverständniserklärung für die entsprechende
Verwendung der Nabelschnur abgegeben.
2. Genotypisierung
Die –786C-Variante
des humanen eNOS-Genpromotors besitzt im Vergleich zur –786T-Variante
eine zusätzliche
Restriktionsschnittstelle für
das Restriktionsenzym Hpa II und ist somit einer klassischen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Analyse
(RFLP-Analyse) zugänglich.
Für
die RFLP-Analyse wurden aus genomischer DNA (aus Blut mit Hilfe
des QIAamp DNA Mini-Kits von Qiagen, Hilden gewonnen) mit Hilfe
eNOS-Promotor-spezifischer Primer (Vorwärtsprimer 5'-GAGTCTGGCCAACACAAATCC-3' (SEQ ID NO: 35);
umgekehrter Primer 5'-GACCTCTAGGGTCATGCAGGT-3') (SEQ ID NO: 36)
durch Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) ein DNA-Fragment (657 Basenpaaren (bp); von Position –1135 bis –456 des
humanen eNOS-Gens) amplifiziert und anschließend einer spezifischen Hydrolyse
durch die Restriktionsendonuklease Hpa II unterworfen. Die resultierenden
DNA-Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Je nach Genotyp entstehen aus dem 657 bp-Fragment 2 oder 3 kleinere DNA-Fragmente.
Während
die T-Variante des Promoters im betrachteten Abschnitt nur eine
Hpa II-Schnittstelle besitzt und so nach Hydrolyse durch Hpa IT
in zwei Fragmente (284 by und 373 bp) zerfällt, bewirkt die zusätzliche
Schnittstelle der C-Variante,
dass 3 Fragmente entstehen (46 by – im verwendeten Elektrophoresesystem
nicht detektierbar –284
bp und 327 bp). Insofern ließen
sich die drei möglichen
Genotypen (–786C/C, –786T/T
und –786C/T)
nach Elektrophorese durch folgende Fragmentmuster eindeutig identifizieren: –786T/T:
284 und 373 bp; –786C/C: 284 und 327
bp; und –786C/T:
284, 327 und 373 bp.
3. Zellkultur
Humane Endothelzellen wurden durch
Behandlung mit 1,6 U/ml Dispase in Hepes-modifizierter Tyrodelösung für 30 Min.
bei 37°C
aus Nabelschnurvenen von zuvor genotypisierten Spendern isoliert
und auf Gelatine-beschichteten 6-Loch-Gewebekulturschalen (2 mg/ml
Gelatine in 0,1 M HCl für
30 Min. bei Umgebungstemperatur) in 1,5 ml M199 Medium (Gibco Life
Technologies, Karlsruhe, Deutschland), enthaltend 20% fötales Kälberserum,
50 U/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin, 10 U/ml Nystatin, 5 mmol/l
HEPES und 5 mmol/l TES, 1 μg/ml
Heparin und 40 μg/ml
endothelialer Wachstumsfaktor, kultiviert. Sie wurden durch ihre
typische Pflasterstein-Morphologie, positive Immunfärbung für von Willebrandt-Faktor
(vWF) und fluorimetrischen Nachweis (FACS) von PECAM-1 (CD31) sowie
negative Immunfärbung
für glattmuskuläres α-Actin (Krzesz
et al. (1999) FEBS Lett. 453, 191) identifiziert.
Die Maus-Myelomzelllinie P3xTBA7
(stabil mit humanem CD40-Liganden transfiziert) und P3x63Ag8.653
(nicht transfizierte Kontrollzellen) wurden in RPMI 1640 Medium
(Life Technologies), enthaltend 10% fötales Kälberserum, 50 U/ml Penicillin,
50 μg/m1
Streptomycin und 10 U/ml Nystatin kultiviert.
Die Applikation von Wandschubspannung
(in der Regel 30 dyn/cm2 für 24 bis
36 Stunden) bei den kultivierten Endothelzellen wurde mit Hilfe
eines im Brutschrank platzierbaren Kegel-Platte-Viskosimeters wie in Schubert
et al. (2000) Circ. Res. 87, 1188 beschrieben durchgeführt, mit
Ausnahme der Dimension der Kulturschalen (3,5 cm im Gegensatz zu
10,0 cm Durchmesser).
4. RT-PCR-Analyse
Die zelluläre Gesamt-RNA wurde mit dem
Qiagen RNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert, daran
anschließend
wurde eine cDNA-Synthese mit 1–5 μg RNA und
200 U SuperscriptTM II Reverser Transkriptase
(Life Technologies) in einem Gesamtvolumen von 20 μl entsprechend
der Herstelleranleitung durchgeführt.
Für den
Abgleich der cDNA-Mengen in den verschiedenen Proben wurden 5 μl der 1:10
verdünnten cDNA-Lösung (entsprechend
einem RNA-Äquivalent
von 25–125
ng) einer PCR-Reaktion (1U Taq DNA-Po1ymerase ([Life Technologies])
mit spezifischen Primern für
die konstitutiv exprimierten Genprodukte Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase
(GAPDH) und ribosomales Protein L32 (rpl32) unterworfen. GAPDH und
rp132 dienten hierbei als interne Kalibrierungs-Standards. Die PCR-Produkte wurden auf
1,5% Agarose-Gelen enthaltend 0,1% Ethidiumbromid separiert und
die Intensität
der Banden wurde densitometrisch mit einem CCD-Kamerasystem und
der One-Dscan Gelanalyse-Software von Scanalytics (Billerica, MA, USA)
bestimmt, um in nachfolgenden PCR-Analysen das Volumen der cDNA
anzupassen.
Alle PCR-Reaktionen wurden einzeln
für jedes
Primerpaar in einem lizenzierten Thermocycler (PC-Personal Cycler,
Biometra, Göttingen)
durchgeführt.
Die individuellen PCR-Bedingungen waren wie folgt:
eNOS – Produktgröße 581 bp,
30 Zyklen, Anlagerungstemperatur 58°C, Vorwärtsprimer 5'-GGAACCTGTGTGACCCTC-3'(SEQ ID NO: 39),
umgekehrter Primer 5'-CCACGTC.ATACT-CATCCA-3'(SEQ ID NO: 40)
IL-12p40
-281 bp, 30 Zyklen, 62°C,
5'-GTACTCCACATTCCTACTTCT-3'(SEQ ID NO: 41),
5'-TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3'(SEQ ID NO: 42)
IL-10
Rezeptor – 565
bp, 32 Zyklen, 59°C,
5'-GGACACCCATCCCAAATCAGTC-3'(SEQ ID NO: 43), 5'-CACGGTGAAATACTGCCTGGTG-3'(SEQ ID NO: 44)
GAPDH – 571 bp,
19 Zyklen, 58°C,
5'-TCACCATCTTCCAGGAGCG-3'(SEQ ID NO: 45),
5'-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'(SEQ ID NO: 46)
rp132 – 368 bp,
20 Zyklen, 60°C,
5'-GTTCATCCGGCACCAGTCAG-3'(SEQ ID NO: 47),
5'-ACGTGCACATGAGCTGCCTAC-3'(SEQ ID NO: 48)
Alle Amplifikate wurden durch DNA-Sequenzierung
(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Pharmacia, Freiburg, Deutschland)
mit nachfolgendem Abgleich mit den entsprechenden Genseguenzen (Referenz:
GenBank, NCBI, Bethesda, LISA) eindeutig identifiziert.
5. Decoy-Oligonukleotid-Technik
Doppelsträngige Decoy-Oligonukleotide
wurden von den komplementären
einzelsträngigen
Phosphorothioat-verbundenen Oligonukleotiden (Eurogentec, Köln, Deutschland)
wie bei Krzesz et al. (1999) FEBS Lett. 453, 191 beschrieben hergestellt.
Die kultivierten humanen Endothelzellen wurden für 4 Stunden mit dem jeweiligen
Decoy-Oligonukleotid in einer Konzentration von 10 μmol/l vorbehandelt
und nach dem Mediumwechsel dem Inkubationsmedium in derselben Konzentration
zugesetzt. Die einzelsträngigen
Sequenzen der Oligonukleotide waren wie folgt (unterstrichene Buchstaben
kennzeichnen Phosphorothioat-verbundene Basen):
STAT-3 5'-CCTGCATTCTGGGAACTGTAG-3' (SEQ ID NO: 49),
STAT-3
mutated 5'-CCTGTATGCCGTGAGCTATAG-3', (SEQ ID NO: 50)
sowie
die in Tabelle 1 abgebildeten Decoy-Oligoukleotide zur Neutralisierung
des an die Position -786 des eNOS-Gens bindenden Traskriptionsfaktors.
Die Sequenz des STAT-3 Decoy-Oligonukleotids
entspricht der Position –858
bis –838
im humanen eNOS-Gen.
Tabelle 1
Restaurierung der inhibitorischen
Wirkung von IL-10 auf die CD154-induzierte IL-12 p40 mRNA-Expression
(ausgedrückt
in % der IL-12 p40 mRNA-Expression in CD154-stimulierten Kontrollzellen;
Mittelwert ± S.E.
von n individuellen Experimenten) in humanen kultivierten Endothelzellen
von Spendern mit
–786C/C-Genotyp durch
verschiedene Cis-Element Decoys (angegeben ist jeweils nur ein Strang
der doppelsträngigen DNA-0ligonukleotide
sowie die entsprechende Position im Promoter des humanen eNOS-Gens).
Bezugsgröße ist CD154-induzierte IL-12
p40 mRNA-Expression nach IL-10-Zusatz in Endothelzellen mit
–786T/T-Genotyp (552% der
Kontrolle, n=6; vollständige
Restaurierung) bzw.
–786C/C-Genotyp (136±16% der
Kontrolle, n=21; kein Effekt).
6. Elektrophoretische
Mobilitätsshift-Analyse
(EMSA)
Die nukleären Extrakte und [32P]-markierten
doppelsträngigen
Konsensus-Oligonukleotide (Santa Cruz Biotechnologie, Heidelberg,
Deutschland), nicht-denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Autoradiographie
und Supershift-Analyse wurden wie bei Krzesz et al. (1999) FEBS
Lett. 453, 191 beschrieben durchgeführt. Dabei wurden die folgenden
DNA-Oligonukleotide
(einzelsträngige
Sequenz, Kembindungssequenz ist unterstrichen) verwendet:
STAT-3
5'-CCTGCATTCTGGGAACTGTAG-3' (SEQ ID NO: 49)
SIE
5'-GTGCATTTCCCGTAAATCTTGTCTACA-3' (SEQ ID NO: 51)
An das Oligonukleotid SIE binden
sowohl STAT-1 wie STAT-3. Insofern wurden zusätzlich Supershift-Analysen
mit einem monoklonalen Maus-Anti-Human Supershift-Antikörper (Santa
Cruz Biotechnologie) durchgeführt
(Zugabe in einer Konzentration von 10 μg/m1 zum Kernextrakt für 1 Stunde
bei Raumtemperatur).
7. Western Plot-Analyse
Die humanen Nabeischnurvenen-Endothelzellen
wurden durch fünfmaliges
aufeinanderfolgendes Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen
bei 37°C
aufgeschlossen. Protein-Extrakte wurden wie bei Hecker et al. (1994)
Biochem J. 299, 247 beschrieben hergestellt. 20–30 μg Protein wurden mit Hilfe einer 10%igen
Poiyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen
in der Gegenwart von SDS nach Standardprotokoll aufgetrennt und
auf eine BioTraceTM Polyvinylidene Fluoride
Transfermembran (Pall Corporation, Roßdorf, Deutschland) transferiert.
Zum immulologischen Nachweis der eNOS und des IL-10 Rezeptors wurden
monoklonale Maus-Anti-Human-Antikörper (BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland: 1:5000 bzw. 1:3000 Verdünnung) verwendet. Die Proteinbanden
wurden nach Hinzufügen
eines Peroxidase-gekoppelten-Anti-Maus-IgG (1:3000, Sigma, Deisenhofen,
Deutschland) mit Hilfe der Chemilumineszenz-Methode (SuperSignal
Chemiluminescent Substrate; Pierce Chemical, Rockford, IL, USA)
und nachfolgender Autoradiographie (HyperfilmTM MP,
Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England) nachgewiesen.
Der Auftrag und Transfer gleicher Proteinmengen wurde nach „Strippen" der Transfermembran
(5 Minuten 0,2N NaOH, nachfolgend 3 × 10 Minuten Waschen mit H2O) durch Nachweis gleicher Proteinbanden von β-Aktin mit
einem monoklonalen primären
Antikörper
und einem Peroxidase-gekopplelten Anti-Maus IgG (beide von Sigma-Aldrich, 1:3000
Verdünnung)
gezeigt.
8. IL-12 p40 ELISA
Der Enzym-gekoppelte Antikörper-Bindungs-Assay
(ELISA) ist eine Standardmethode zur quantitativen Analyse von Proteinen.
Er wurde wie in Lienenluke et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 2864
beschrieben zum Nachweis der IL-12 p40-Untereinheit im Überstand
der inkubierten humanen Endothelzellen eingesetzt.
9. Statistische Analyse
Wenn nicht anders angezeigt, sind
alle Daten in den Figuren als Mittelwert ± SEM von n Experimenten angegeben.
Die statistische Auswertung wurde mittels einseitiger Varianzanalyse
(ANOVA) gefolgt von einem Dunnett Post-Test durchgeführt. Ein
P-Wert < 0.05 wurde
als statistisch signifikauter Unterschied angesehen. SEQUENCE
LISTING
