DE10240603A1 - Use of malate dehydrogenase for NADH regeneration - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung enantiomerenangereicherter organischer Verbindungen gerichtet. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein enzymatisch arbeitendes Verfahren, bei dem in einem gekoppelten enzymatischen Reaktionssystem NAD(P)H zur Herstellung der organischen Verbindung von einem Enzym verbraucht und das NAD(P)H gleichzeitig durch ein zweites Enzymsystem regeneriert wird. DOLLAR A Ebenfalls vorgeschlagen wird ein derart erfindungsgemäß arbeitendes Reaktionssystem sowie ein vorteilhafter Ganzzellkatalysator.The present invention is directed to a process for the preparation of enantiomerically enriched organic compounds. In particular, the present invention relates to an enzymatically operating process in which NAD (P) H is used by an enzyme in a coupled enzymatic reaction system to produce the organic compound and the NAD (P) H is regenerated simultaneously by a second enzyme system. DOLLAR A Also proposed is a reaction system operating in accordance with the invention and an advantageous whole-cell catalyst.

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung enantiomerenangereicherter organischer Verbindungen gerichtet. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein enzymatisch arbeitendes Verfahren, bei dem in einem gekoppelten enzymatischen Reaktionssystem NAD(P)H zur Herstellung der organischen Verbindung von einem Enzym verbraucht und das NAD(P)H gleichzeitig durch ein zweites Enzymsystem regeneriert wird.The present invention is based on a process for the production of enantiomerically enriched organic Connections directed. In particular, the present invention relates an enzymatic process in which in a coupled enzymatic reaction system NAD (P) H for the production of organic Connection consumed by an enzyme and the NAD (P) H at the same time is regenerated by a second enzyme system.

Ebenfalls vorgeschlagen wird ein derart erfindungsgemäß arbeitendes Reaktionssystem sowie ein vorteilhafter Ganzzellkatalysator bzw. geeignete Plasmide.A is also proposed working according to the invention Reaction system and an advantageous whole-cell catalyst or suitable plasmids.

Die Gewinnung optisch aktiver organischer Verbindungen, z.B. Alkohole und Aminosäuren, auf biokatalytischem Wege gewinnt zunehmend an Bedeutung. Als ein Weg zur großtechnischen Synthese dieser Verbindungen, insbesondere von Alkoholen und Aminosäuren, hat sich u.a. der gekoppelte Einsatz zweier Dehydrogenasen unter Cofaktorregenerierung gezeigt ( DE19753350 , EP118750 ).The extraction of optically active organic compounds, such as alcohols and amino acids, by biocatalytic means is becoming increasingly important. Coupled use of two dehydrogenases with cofactor regeneration has been shown as one way of large-scale synthesis of these compounds, in particular of alcohols and amino acids ( DE19753350 . EP118750 ).

Schema 1:

Figure 00010001
Scheme 1:
Figure 00010001

In situ Regeneration von NADH mit der NAD-abhängigen Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii bei der reduktiven Aminierung von Trimethylpyruvat zu L-tert-Leucin (Bommarius et al. Tetrahedron Asymmetry 1995, 6, 2851–2888).In situ regeneration of NADH with the NAD-dependent Formate dehydrogenase from Candida boidinii in reductive amination from trimethyl pyruvate to L-tert-leucine (Bommarius et al. Tetrahedron Asymmetry 1995, 6, 2851-2888).

Die im wässrigen Medium effizient eingesetzten Biokatalysatoren weisen neben ihrer katalytischen Eigenschaft und Effizienz zudem den Vorteil auf, dass im Gegensatz zu einer Vielzahl an synthetischen metallhaltigen Katalysatoren auf den Einsatz metallhaltiger, insbesondere schwermetallhaltiger und somit toxischer Einsatzstoffe verzichtet werden kann. Auch kann auf den Einsatz von teuren und zudem gefährlichen Reduktionsmittel wie beispielsweise Boran bei der asymmetrischen Reduktion verzichtet werden.The efficiently used in the aqueous medium In addition to their catalytic properties, biocatalysts have and Efficiency also has the advantage of being unlike a multitude of synthetic metal-containing catalysts on the use of metal-containing, especially heavy metal and therefore toxic feedstocks can be dispensed with. Can also rely on the use of expensive and also dangerous Reducing agents such as borane in the asymmetric Reduction can be dispensed with.

Die bisher in diesen Systemen mit Erfolg eingesetzte FDH, z.B. aus Candida boidinii, hat den Nachteil, dass die spezifische Aktivität dieser Enzymklasse mit 4–8 U/mg sehr niedrig liegt. Dies bedingt den Einsatz einer großen Menge an teurem Enzym mit apparativ gesehen schwieriger Recyclierung, wenn ein so gestalteter Prozess im technischen Maßstab unter ökonomischen Gesichtspunkten vorteilhaft durchgeführt werden soll.The previously used in these systems Successful FDH, e.g. from Candida boidinii, has the disadvantage that the specific activity this enzyme class with 4-8 U / mg is very low. This requires the use of a large amount on expensive enzyme with apparatus recycling difficult, if such a process on a technical scale under economic Aspects should be carried out advantageously.

Die „malic enzyme" genannte Malatdehydrogenase (MDH) katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Malat zu Pyruvat. Zahlreiche Malatdehydrogenasen aus verschiedenen Organismen sind bekannt, so u.a. aus höheren Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen. Es wird zwischen vier Arten von Malatdehydrogenasen unterschieden, die in den Enzymklassen E.C. 1.1.1.37 bis EC 1.1.1.40 klassifiziert sind (http://www.genome.ad.jp). In Abhängigkeit vom Typ der Malatdehydrogenase wird NAD und/oder NADP als Cofaktor benötigt.The "malic enzyme" called malate dehydrogenase (MDH) catalyzes the oxidative decarboxylation of malate to pyruvate. There are numerous malate dehydrogenases from different organisms known, e.g. from higher Animals, plants and microorganisms. There are four types distinguished from malate dehydrogenases, which are found in the E.C. 1.1.1.37 to EC 1.1.1.40 are classified (http://www.genome.ad.jp). Dependent on of the type of malate dehydrogenase, NAD and / or NADP is used as a cofactor needed.

Aufgrund der Irreversibilität der oxidativen Decarboxylierungsreaktion von L-Äpfelsäure zu Pyruvat bietet sich die Nutzung der Malatdehydrogenase auch im Hinblick auf eine günstige Cofaktorregenerierung in oben geschilderten Systemen an.Because of the irreversibility of the oxidative Decarboxylation reaction of L-malic acid to pyruvate offers the use of malate dehydrogenase also with regard to a favorable Cofactor regeneration in the systems described above.

Die Nutzung der Malatdehydrogenase zur Regenerierung von NAD findet sich beispielsweise bei Suye et al. in einer Arbeit von 1992 beschrieben (S.-I. Suye, M. Kawagoe, S. Inuta, Can. J. Chem. Eng. 1992 , 70, 306–312) . Die NADH-Regenerierung mittels der Malatdehydrogenase wird dabei zur reduktiven Aminierung von Pyruvat mittels einer Alanindehydrogenase unter Verbrauch von NADH verwendet. Das Pyruvat entsteht durch die oxidative Decarboxylierung aus L-Äpfelsäure und wird im folgenden Schritt durch die Alanindehydrogenase gleich wieder verbraucht. Eine Anreicherung von Pyruvat in der Reaktionslösung wird damit vermieden, womit auch das Problem eventueller Inhibierungen der beteiligten Enzyme durch die Gegenwart von Pyruvatmengen im stöchiometrischen Bereich beseitigt wird. Allerdings ist damit das vorgestellte System auf die Produktion von Alanin ausschließlich eingeschränkt (s. auch S.-I. Suye, Recent Res. Devel. Ferment. Bioeng. 1998, 1, 55–64).The use of malate dehydrogenase to regenerate NAD can be found, for example, in Suye et al. in a work from 1992 (S.-I. Suye, M. Kawagoe, S. Inuta, Can. J. Chem. Eng. 1992, 70, 306-312). The regeneration of NADH using malate dehydrogenase is used for the reductive amination of pyruvate using an alanine dehydrogenase using NADH. The pyruvate is formed by the oxidative decarboxylation from L-malic acid and is immediately used up again in the following step by the alanine dehydrogenase. An accumulation of pyruvate in the reaction solution is thus avoided, which also eliminates the problem of possible inhibitions of the enzymes involved by the presence of Py is eliminated in the stoichiometric range. However, the system presented here is only restricted to the production of alanine (see also S.-I. Suye, Recent Res. Devel. Ferment. Bioeng. 1998, 1, 55-64).

Interessanterweise wurden – trotz des technisch hohen Potentials – außer diesen Arbeiten von der Suye-Arbeitsgruppe keine weiteren Arbeiten unter Nutzung des „Malatdehydrogenase" zur Regenerierung des oxidierten Cofaktors NAD+ bei Reduktionen von Ketpnen bzw. redukiven Aminierungen von Ketosäuren beschrieben.Interestingly, despite the technically high potential - besides this Working from the Suye working group no further work using the "malate dehydrogenase" for regeneration of the oxidized cofactor NAD + in the case of reductions of chains or reductive Aminations of keto acids described.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Angabe eines weiteren Verfahrens zur Herstellung von chiralen organischen Verbindungen wie Aminosäuren oder Alkoholen, welche durch ein wie oben beschriebenes gekoppeltes enzymatisches Reaktionssystem unter Verwendung der Malatdehydrogenase gewonnen werden können und welches nicht auf die Darstellung einer Substanz eingeschränkt ist. Insbesondere sollte dieses Verfahren im technischen Maßstab unter ökonomischen wie ökologischen Gesichtspunkten besonders vorteilhaft eingesetzt werden können.Object of the present invention was therefore the specification of a further process for the production of chiral organic compounds such as amino acids or alcohols, which by a coupled enzymatic reaction system as described above can be obtained using malate dehydrogenase and which is not limited to the representation of a substance. In particular, this process should be economical on an industrial scale like ecological Points of view can be used particularly advantageously.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des gegenständlichen Anspruchs 1 gelöst. Ansprüche 2 bis 7 beziehen sich auf bevorzugte Ausführungsformen. Ansprüche 8 und 9 schützen ein erfindungsgemäßes Reaktionssystem und einen entsprechend arbeitenden Ganzzellkatalysator. Anspruch 10 schützt bevorzugte Plasmide.The task is accomplished through a process solved with the characterizing features of the subject claim 1. Claims 2 to 7 relate to preferred embodiments. Claims 8 and 9 protect an inventive reaction system and a correspondingly working whole cell catalyst. claim 10 protects preferred plasmids.

Dadurch, dass man in einem Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten organischen Verbindungen in einem gekoppelten enzymatischen Reaktionssystem aufweisend eine erste enzymatische Transformation eines organischen Substrats unter Verbrauch von NAD(P)H und die Regeneration des NAD(P)H in einer zweiten enzymatischen Transformation durch eine Malatdehydrogenase unter Oxidation von L-Äpfelsäure zu Pyruvat und CO2, das entstehende Pyruvat der zweiten enzymatischen Transformation nicht als Substrat in der ersten enzymatischen Transformation einsetzt, gelangt man überaus überraschend und dafür aber nicht minder vorteilhaft zur Lösung der gestellten Aufgabe. Es kann durchaus als Überraschung angesehen werden, dass die simultane Verwendung z.B. einer Aminosäuredehydrogenase mit der decarboxylierend wirkenden Malatdehydrogenase problemlos ohne Auftreten von Kreuzreaktionen möglich ist. Auch lassen sich keine inhibierenden Einflüsse von Substraten und Produkten der Primärreaktion auf die Malatdehydrogenase und umgekehrt nachweisen. Insbesondere fällt positiv auf, dass das als Nebenprodukt gebildete Pyruvat nicht inhibierend auf die Malatdehydrogenase selbst bzw. auf die parallel eingesetzten Alkohol- bzw. Aminosäuredehydrogenasen einwirkt.The fact that in a process for the production of enantiomerically enriched organic compounds in a coupled enzymatic reaction system comprising a first enzymatic transformation of an organic substrate using NAD (P) H and the regeneration of NAD (P) H in a second enzymatic transformation by a Malate dehydrogenase with the oxidation of L-malic acid to pyruvate and CO 2 , which does not use the resulting pyruvate of the second enzymatic transformation as a substrate in the first enzymatic transformation, is achieved in an extremely surprising but no less advantageous manner in solving the problem. It can be regarded as a surprise that the simultaneous use of, for example, an amino acid dehydrogenase with the decarboxylating malate dehydrogenase is possible without the occurrence of cross-reactions. In addition, no inhibitory effects of substrates and products of the primary reaction on malate dehydrogenase and vice versa can be demonstrated. In particular, it is positive that the pyruvate formed as a by-product does not have an inhibitory effect on the malate dehydrogenase itself or on the alcohol or amino acid dehydrogenases used in parallel.

Vorteilhafterweise werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren enantiomerenangereicherte Alkohole oder Aminosäuren hergestellt. In diesem Fall kommen allseits bekannte und wohlfeile Alkoholdehydrogenase oder Aminosäuredehydrogenase als Enzyme für die erste enzymatische Transformation in Frage. Der Fachmann ist im Prinzip frei in deren Auswahl, die nach Art des Substratspektrums, Stabilität und Umsatzrate des betrachteten Enzyms erfolgt. Bekannte Enzyme dieser Provenienz sind in K. Drauz, H. Waldmann (Hrsg.), Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Volume III, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, Kapitel 15 dargestellt.Advantageously, with the method according to the invention enantiomerically enriched alcohols or amino acids. In this Well-known and cheap alcohol dehydrogenase is the case or amino acid dehydrogenase as enzymes for the first enzymatic transformation in question. The specialist is in principle free to choose, depending on the type of substrate spectrum, stability and conversion rate of the enzyme under consideration. Known enzymes this provenance are in K. Drauz, H. Waldmann (ed.), Enzymes Catalysis in Organic Synthesis, Volume III, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, Chapter 15.

Besonders vorteilhaft ist der Einsatz der Alkoholdehydrogenase aus den Organismen Rhodococcus erythropolis (S-ADH) oder Lactobacillus kefir (R-ADH) (ADH aus R. erythropolis: J. Peters, T. Zelinski, M.-R. Kula, Purification and characterization of a novel carbonyl reductase silated from Rhodococcus erythropolis, J. Biotechnol. 1994, 33, 283–292)(ADH aus Lactabacillus kefir: C. w. Bradshaw, W. Hummel, C.-H. Wong, Lactobacillus kefir Alcohol Dehydrogenase: A Useful Catalyst for Synthesis, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532–1536.). Im Hinblick auf bevorzugte Aminosäuredehydrogenasen sei der Fachmann auf beispielsweise Leucindehydrogenasen bzw. Phenylalanindehydrogenasen (A. Bommarius in: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Hrsg.: K. Drauz, H. Waldmann), Volume III, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, Kapitel 15.3) verwiesen.The use is particularly advantageous the alcohol dehydrogenase from the organisms Rhodococcus erythropolis (S-ADH) or Lactobacillus kefir (R-ADH) (ADH from R. erythropolis: J. Peters, T. Zelinski, M.-R. Kula, Purification and Characterization of a novel carbonyl reductase silated from Rhodococcus erythropolis, J. Biotechnol. 1994, 33, 283-292) (ADH from Lactabacillus kefir: C. w. Bradshaw, W. Hummel, C.-H. Wong, Lactobacillus kefir Alcohol Dehydrogenase: A Useful Catalyst for Synthesis, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532-1536.). With regard to preferred amino acid dehydrogenases be the expert on, for example, leucine dehydrogenases or phenylalanine dehydrogenases (A. Bommarius in: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Ed .: K. Drauz, H. Waldmann), Volume III, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, chapter 15.3).

Malatdehydrogenasen sind dem Fachmann ebenfalls geläufig (Lit. s. weiter vorne oder Dissertation S. Naamnieh, Universität Düsseldorf, in Vorbereitung). Auch hier wird der Fachmann sich die für seinen Zweck am effizientesten einsetzbare Dehydrogenase auswählen. Im Prinzip sind solche Malatdehydrogenasen bevorzugt, die das NAD(P)H in einem solchen Maße regenerieren, dass kein Engpass für den Reaktionsablauf des anderen eingesetzten Enzyms auftritt. Bevorzugt ist die bekannte Malatdehydrogenase aus E. coli K12 in diesem Zusammenhang. Genisolierung und Klonierung sind beschrieben in S. Naamniehs Dissertation, Universität Düsseldorf, in Vorbereitung S. 70ff.Malate dehydrogenases are known to the person skilled in the art also common (Lit. see above or dissertation S. Naamnieh, University of Düsseldorf, in preparation). Here, too, the specialist will look for his Select the most efficient dehydrogenase for the purpose. in the In principle, those malate dehydrogenases are preferred which contain the NAD (P) H to such an extent Regenerate that there is no bottleneck for the reaction process of the other enzyme used occurs. The known malate dehydrogenase is preferred from E. coli K12 in this context. Gene isolation and cloning are described in S. Naamnieh's dissertation, University of Düsseldorf, in preparation p. 70ff.

Prinzipiell kann das gegenständliche Verfahren in rein wässriger Lösung durchgeführt werden. Es ist jedoch auch möglich, der wässrigen Lösung beliebige Teile eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels zuzusetzen, um z.B. die Reaktion im Hinblick auf schlecht wasserlösliche Substrate zu optimieren. Als solche Lösungsmittel kommen insbesondere Ethylenglykol, DME oder Glycerin in Betracht. Weiterhin können aber auch Mehrphasen-, insbesondere Zweiphasensysteme aufweisend eine wässrige Phase als Lösungsmittelgemisch für das erfindungsgemäße Verfahren dienen. Hier hat sich der Einsatz bestimmter nicht wasserlöslicher Lösungsmittel schon bewährt ( DE10233107 ). Die dort diesbezüglich gemachten Aussagen gelten hier entsprechend.In principle, the process in question can be carried out in a purely aqueous solution. However, it is also possible to add any parts of a water-soluble organic solvent to the aqueous solution, for example in order to optimize the reaction with regard to poorly water-soluble substrates. Such solvents are in particular ethylene glycol, DME or glycerin. Furthermore, multi-phase, in particular two-phase systems having an aqueous phase can also serve as a solvent mixture for the process according to the invention. Here, the use of certain non-water soluble Solvent already proven ( DE10233107 ). The statements made there in this regard apply accordingly.

Prinzipiell ist der Fachmann bei der Wahl der während der Reaktion vorhandenen Temperatur frei. Er orientiert sich vorzugsweise an dem Erhalt einer möglichst hohen Ausbeute an Produkt in möglichst hoher Reinheit in möglichst kurzer Zeit. Zudem sollten die eingesetzten Enzyme unter den eingesetzten Temperaturen hinreichend stabil sein und die Reaktion sollte mit einer möglichst hohen Enantioselektivität verlaufen. Im Hinblick auf den Einsatz von Enzymen aus thermophilen Organismen können durchaus Temperaturen von 100°C die obere Grenze des Temperaturbereichs bei der Reaktion darstellen. Als untere Grenze in wässrigen Systemen sind –15°C sicher sinnvoll. Vorteilhaft ist ein Temperaturintervall zwischen 10 und 60, besonders bevorzugt zwischen 20 und 40°C einzustellen.In principle, the specialist is at the choice of during reaction temperature free. He prefers to orient himself in getting one if possible high yield of product in as much as possible high purity in as much as possible short time. In addition, the enzymes used should be among those used Temperatures should be sufficiently stable and the reaction should take place with one if possible high enantioselectivity run. With regard to the use of enzymes from thermophiles Organisms can temperatures of 100 ° C represent the upper limit of the temperature range in the reaction. As the lower limit in aqueous systems are safe at –15 ° C meaningful. A temperature interval between 10 and is advantageous 60, particularly preferably between 20 and 40 ° C.

Der pH-Wert während der Reaktion wird vom Fachmann anhand der Enzymstabilitäten und Umsatzraten ermittelt und entsprechend für das erfindungsgemäße Verfahren eingestellt. Für die Malatdehydrogenase aus E. coli wurde gefunden, dass das pH-Optimum bei > 10 liegt. Im allgemeinen wird der für Enzyme bevorzugte Bereich von pH 5 bis 11 gewählt. Vorzugsweise kann ein pH-Bereich von 5,5 bis 10,0, insbesondere 6,0 bis 9,0 vorliegen.The pH during the reaction is from Expert determined based on the enzyme stabilities and conversion rates and accordingly for the inventive method set. For The malate dehydrogenase from E. coli was found to have the pH optimum is> 10. in the general will be for Enzyme preferred range chosen from pH 5 to 11. Preferably one pH range from 5.5 to 10.0, in particular 6.0 to 9.0.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein gekoppeltes enzymatisches Reaktionssystem zur Herstellung von enantiomerenangereicherten organischen Verbindungen aufweisend eine erste enzymatische Transformation eines organischen Substrats unter Verbrauch von NAD(P)H und die Regeneration des NAD(P)H in einer zweiten enzymatischen Transformation durch eine Malatdehydrogenase unter Oxidation von L-Äpfelsäure zu Pyruvat und CO2, wobei das entstehende Pyruvat der zweiten enzymatischen Transformation nicht als Substrat in der ersten enzymatischen Transformation eingesetzt wird. Prinzipiell gelten für dieses Reaktionssystem die gleichen Vorteile und bevorzugten Ausführungsformen, wie sie in Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren schon genannt wurden. Vorteilhaft eingesetzt wird das Reaktionssystem beispielsweise in einem Rührkessel, einer Rührkesselkaskaden oder in Membranreaktoren, die sowohl im batch-Betrieb als auch kontinuierlich betrieben werden können.The invention also relates to a coupled enzymatic reaction system for the production of enantiomerically enriched organic compounds comprising a first enzymatic transformation of an organic substrate using NAD (P) H and the regeneration of NAD (P) H in a second enzymatic transformation by a malate dehydrogenase under oxidation from L-malic acid to pyruvate and CO 2 , the resulting pyruvate of the second enzymatic transformation not being used as a substrate in the first enzymatic transformation. In principle, the same advantages and preferred embodiments apply to this reaction system as have already been mentioned in relation to the process according to the invention. The reaction system is advantageously used, for example, in a stirred tank, a stirred tank cascade or in membrane reactors which can be operated both in batch mode and continuously.

Im Rahmen der Erfindung wird unter Membranreaktor jedwedes Reaktionsgefäß verstanden, bei dem der Katalysator in einem Reaktor eingeschlossen wird, während niedermolekulare Stoffe dem Reaktor zugeführt werden oder ihn verlassen können. Dabei kann die Membran direkt in den Reaktionsraum integriert werden oder außerhalb in einem separaten Filtrationsmodul eingebaut sein, bei der die Reaktionslösung kontinuierlich oder intermittierend durch das Filtrationsmodul strömt und das Retentat in den Reaktor zurückgeführt wird. Geeignete Ausführungsformen sind u.a. in der WO98/22415 und in Wandrey et al. in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.; Wandreg et al. in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, 5.832 ff.; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684f. beschrieben. Die in dieser Apparatur neben der batch und semikontinuierlichen Fahrweise mögliche kontinuierliche Fahrweise kann dabei wie gewünscht im Cross-Flow-Filtrationsmodus (3) oder als Dead-End-Filtration (2) durchgeführt werden. Beide Verfahrensvarianten sind prinzipiell im Stand der Technik beschrieben (Engineering Processes for Bioseparations, Ed.: L.R. Weatherley, Heinemann, 1994, 135–165; Wandrey et al., Tetrahedron Asymmetry 1999, 10, 923–928).In the context of the invention, membrane reactor is understood to mean any reaction vessel in which the catalyst is enclosed in a reactor while low-molecular substances can be fed to the reactor or can leave it. The membrane can be integrated directly into the reaction space or installed outside in a separate filtration module, in which the reaction solution flows continuously or intermittently through the filtration module and the retentate is returned to the reactor. Suitable embodiments are inter alia in WO98 / 22415 and in Wandrey et al. in yearbook 1998, process engineering and chemical engineering, VDI p. 151ff .; Wandreg et al. in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, 5,832 ff .; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684f. described. In addition to the batch and semi-continuous mode of operation, the continuous mode of operation which is possible in this apparatus can, as desired, in the cross-flow filtration mode ( 3 ) or as dead-end filtration ( 2 ) be performed. In principle, both process variants are described in the prior art (Engineering Processes for Bioseparations, Ed .: LR Weatherley, Heinemann, 1994, 135-165; Wandrey et al., Tetrahedron Asymmetry 1999, 10, 923-928).

Ganzzellkatalysatoren aufweisend ein kloniertes Gen für ein erstes Enzym zur Transformation eines organischen Substrats und ein kloniertes Gen für eine Malatdehydrogenase, wobei diese befähigt sind, in einer ersten enzymatische Transformation eine enantiomerenangereicherte organische Verbindung unter Verbrauch von NAD(P)H herzustellen und die Regeneration des NAD(P)H in einer zweiten enzymatischen Transformation durch die Malatdehydrogenase unter Oxidation von L-Äpfelsäure zu Pyruvat und CO2 vonstatten gehen zu lassen, wobei das entstehende Pyruvat der zweiten enzymatischen Transformation nicht als Substrat in der ersten enzymatischen Transformation eingesetzt wird, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Der erfindungsgemäße Ganzzellkatalysator besitzt vorzugsweise ein Enzym (Polypeptid) mit Aminosäure- oder Alkoholdehydrogenaseaktivität und eines mit Malatdehydrogenaseaktivität, entstammend insbesondere aus den weiter oben genannten Organismen.Whole-cell catalysts comprising a cloned gene for a first enzyme for the transformation of an organic substrate and a cloned gene for a malate dehydrogenase, which are able to produce an enantiomerically enriched organic compound in a first enzymatic transformation using NAD (P) H and the regeneration of the NAD (P) H in a second enzymatic transformation by malate dehydrogenase with oxidation of L-malic acid to pyruvate and CO 2 , the resulting pyruvate of the second enzymatic transformation not being used as a substrate in the first enzymatic transformation are also the subject of the present invention. The whole-cell catalyst according to the invention preferably has an enzyme (polypeptide) with amino acid or alcohol dehydrogenase activity and one with malate dehydrogenase activity, derived in particular from the organisms mentioned above.

Als Mikroorganismen können im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommenden Organismen wie z.B. Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen herangezogen werden. Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10- oder HB101.As microorganisms in Principle all the specialist for organisms that are suitable for this purpose, e.g. Yeasts like Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, prokaryotes, such as E. coli, Bacillus subtilis or eukaryotes, such as mammalian cells, Insect cells are used. E. coli strains are preferred for this Purpose to use. The most preferred are: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10 or HB101.

Vorzugsweise wird ein Organismus wie in der DE10155928 genannt als Wirtsorganismus eingesetzt.Preferably an organism as in the DE10155928 called used as a host organism.

Der Vorteil eines derartigen Organismus ist die gleichzeitige Expression beider Polypeptidsysteme, womit nur noch ein rec-Organismus für die erfindungsgemäße Reaktion angezogen werden muss.The advantage of such an organism is the simultaneous expression of both polypeptide systems, with which just a rec organism for the reaction of the invention must be tightened.

Um die Expression der Polypeptide im Hinblick auf ihre Umsetzungsgeschwindigkeiten abzustimmen, können die entsprechenden codierenden Nukleinsäuresequenzen auf unterschiedlichen Plasmiden mit unterschiedlichen Kopienzahlen untergebracht und/oder unterschiedlich starke Promotoren für eine unterschiedlich starke Expression der Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Bei derart abgestimmten Enzymsystemen tritt vorteilhafterweise eine Akkumulation einer Zwischenverbindung nicht auf und die betrachtete Reaktion kann in einer optimalen Gesamtgeschwindigkeit ablaufen. Dies ist dem Fachmann jedoch hinlänglich bekannt (Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl.-Microbiol. Biotechnol. 46, 46–54; Farwick, M.; London, M.; Dohmen; J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE19920712).In order to coordinate the expression of the polypeptides with regard to their conversion rates, the corresponding coding nucleic acid sequences can be accommodated on different plasmids with different copy numbers and / or promoters of different strengths can be used for differently strong expression of the nucleic acid sequences. With such coordinated enzyme systems advantageously, an accumulation of an interconnect does not occur and the reaction under consideration can proceed at an optimal overall speed. However, this is well known to the person skilled in the art (Gellissen, G .; Piontek, M .; Dahlems, U .; Jenzelewski, V .; Gavagan, JW; DiCosimo, R .; Anton, DL; Janowicz, ZA (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl.-Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54; Farwick, M .; London, M .; Dohmen ; J .; Dahlems, U .; Gellissen, G .; Strasser, AW; DE19920712).

Ganz besonders vorteilhaft ist, das der erfindungsgemäße Ganzzellkatalysator ggf. das bei der erfindungsgemäßen Reaktion entstehende Pyruvat weiter verstoffwechselt, es quasi als Nahrungsquelle verwendet. Derart ausgestaltete Ganzzellkatalysatoren führen dazu, dass das Pyruvat nicht als Nebenprodukt der Reaktion anfällt und somit auch nicht in weiteren Verfahrensschritten vom eigentlich gewünschten chiralen Produkt abgetrennt werden muss.It is particularly advantageous that the whole-cell catalyst according to the invention if necessary, in the reaction according to the invention the resulting pyruvate is further metabolized, it is more or less a food source used. Whole-cell catalysts designed in this way lead to that the pyruvate is not a by-product of the reaction and therefore not in further process steps from the actual desired chiral product must be separated.

Die Herstellung des Ganzellkatalysators kann im Prinzip nach dem Fachmann bekannten Maßnahmen erfolgen (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2na ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas, P. und Bolivar, F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors in E.coli, Methods Enzymol. 185, 14–37; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205–225, Butterworth, Stoneham). Bezüglich der allgemeinen Vorgehensweise (PCR, Klonierung, Expression etc.) sei auch auf folgende Literatur und das dort zitierte verwiesen: Universal GenomeWalkerTM Kit User Manual, Clontech, 3/2000 und dort zitierte Literatur; Triglia T.; Peterson, M. G. und Kemp, D.J. (1988), A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2na ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham.The whole-cell catalyst can in principle be produced according to measures known to the person skilled in the art (Sambrook, J .; Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2 na ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas, P. and Bolivar, F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors in E. coli, Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodriguez, RL and Denhardt, D. T (eds) (1988 ), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham). With regard to the general procedure (PCR, cloning, expression, etc.), reference is also made to the following literature and the literature cited therein: Universal GenomeWalker ™ Kit User Manual, Clontech, 3/2000 and the literature cited therein; Triglia T .; Peterson, MG and Kemp, DJ (1988), A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook, J .; Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2 na ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Rodriguez, RL and Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham.

Gegenstand der Erfindung sind auch Plasmide aufweisend Genkonstrukte, in denen das Gen für eine Malatdehydrogenase und ein Gen für ein Enzym zur Transformation eines organischen Substrats unter Verbrauch von NAD(P)H vorhanden ist.The invention also provides Plasmids containing gene constructs in which the gene for a malate dehydrogenase and a gene for an enzyme for transforming an organic substrate under consumption of NAD (P) H is present.

Als Ursprungsplasmide oder -vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61–89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179–204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3–7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2na ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.In principle, all embodiments available to the person skilled in the art for this purpose come into consideration as origin plasmids or vectors. Such plasmids and vectors can e.g. B. by Studier et al. (Studier, WF; Rosenberg AH; Dunn JJ; Dubendroff JW; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61–89) or the brochures of Companies Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech or Gibco BRL. More preferred plasmids and vectors can be found in: Glover, DM (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, RL and Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, DV (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J .; Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2 na ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aufweisende Genkonstrukt in ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden kann, sind- pUC18 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) oder pET (Novagen). Vorteilhaft ist in diesem Zusammenhang das Plasmid pkk/phe/mali (5).Plasmids with which the gene construct containing the nucleic acids according to the invention can be cloned into the host organism in a very preferred manner are pUC18 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) or pET (Novagen). The plasmid pkk / phe / mali ( 5 ).

Die Darstellung dieses Plasmids und eines entsprechenden rec-Mikroorganismus ist in der Dissertation von S. Naamnieh, Universität Düsseldorf, in Vorbereitung S. 70ff beschreiben.The representation of this plasmid and a corresponding rec microorganism is in the dissertation by S. Naamnieh, University Dusseldorf, describe in preparation p. 70ff.

Für die Anwendung können die betrachteten Polypeptide des erfindungsgemäßen Verfahrens in freier Form als homogen aufgereinigte Verbindungen oder als rekombinant hergestelltes Enzym verwendet werden. Weiterhin können diese Polypeptide auch als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus.For the application can the polypeptides under consideration of the method according to the invention in free form as homogeneously purified compounds or as recombinantly produced Enzyme can be used. Furthermore, these polypeptides can also be used as part of an intact host organism or in connection with the open-minded and arbitrarily highly purified Cell mass of the host organism.

Möglich ist ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Sharma B. P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialiern – Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836–852). Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009–5010; Mori, T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipicoated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971–1974; Otamiri, M.; Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solbilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291–305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya, N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375–378).Possible is also the use of the enzymes in immobilized form (Sharma B.P .; Bailey L.F. and Messing R.A. (1982), Immobilisiert Biomaterialization - techniques and applications, Angew. Chem. 94, 836-852). This is advantageously done immobilization by lyophilization (Paradkar, V. M .; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010; Mori, T .; Okahata, Y. (1997), A variety of lipicoated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M .; Adlercreutz, P .; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solbilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291-305). Is very particularly preferred the lyophilization in the presence of surface-active substances, such as Aerosol OT or polyvinylpyrrolidone or polyethylene glycol (PEG) or Brij 52 (diethylene glycol mono-cetyl ether) (Kamiya, N .; Okazaki, S.-Y .; Goto, M. (1997) Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, biotechnol. Tech. 11 375-378).

Äußerst bevorzugt ist die Immobilisierung an Eupergit® , insbesondere Eupergit C® und Eupergit 250L® (Röhm) (Eupergit.RTM. C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential. Katchalski-Katzir, E.; Kraemer, D. M. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2000), 10(1–3), 157–176).Immobilization on Eupergit ® , in particular Eupergit C ® and Eupergit 250L ® (Röhm) (Eupergit.RTM. C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential. Katchalski-Katzir, E .; Kraemer, DM Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2000), 10 (1-3), 157-176).

Gleichfalls bevorzugt ist die Immobilisierung an Ni-NTA in Kombination mit dem His-Tag (Hexa-Histidin) ergänzten Polypeptid (Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Bornhorst, Joshua A.; Falke, Joseph J. Methods in Enzymology (2000), 326, 245–254).Immobilization is also preferred on Ni-NTA in combination with the His tag (hexa-histidine) supplemented polypeptide (Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Bornhorst, Joshua A .; Falke, Joseph J. Methods in Enzymology (2000), 326, 245-254).

Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls denkbar (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380–383).The use as CLECs is also conceivable (St. Clair, N .; Wang, Y.-F .; Margolin, A.L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383).

Durch diese Maßnahmen kann es gelingen aus Polypeptiden, welche durch organische Solventien instabil werden, solche zu generieren, die in Gemischen von wässrigen und organischen Lösungsmitteln bzw. ganz in Organik arbeiten können.With these measures it can succeed Polypeptides that become unstable due to organic solvents, to generate those in mixtures of aqueous and organic solvents or can work entirely in organic matter.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann so ausgeführt werden, dass die MDH aus E. coli mit einer NAD-abhängigen Leucindehydrogenase (LeuDH aus Bacillus cereus; Sigma) gekoppelt wird. LeuDH katalysiert unter NADH-Verbrauch die reduktive Aminierung von aliphatischen Ketosäuren wie beispielsweise Ketoisocaproat zu den entsprechenden L-Aminosäuren wie L-Leucin (Gleichung (1)). 2-Keto-isocaproat + NADH + NH4 + → L-Leucin + NAD+ (1a) NAD+ + L-Malat → Pyruvat + CO2 + NADH (1b) The method according to the invention can be carried out in such a way that the MDH from E. coli is coupled with an NAD-dependent leucine dehydrogenase (LeuDH from Bacillus cereus; Sigma). Using NADH, LeuDH catalyzes the reductive amination of aliphatic keto acids such as ketoisocaproate to the corresponding L-amino acids such as L-leucine (equation (1)). 2-keto-isocaproat + NADH + NH 4 + → L-leucine + NAD + (1a) NAD + + L-malate → pyruvate + CO 2 + NADH (1b)

Der Reaktionsverlauf wurde per HPLC verfolgt. Das Ergebnis kann folgender Tabelle 1 im Vergleich zu einem äquivalenten Umsatz mit FDH statt MDH entnommen werden.The course of the reaction was determined by HPLC tracked. The result can be compared to Table 1 below an equivalent Sales with FDH instead of MDH are taken.

Tabelle 1: Vergleich der Bildung von L-Leucin (HPLC) im gekoppelten Ansatz mit Coenzym-Regenerierung durch MDH und FDH. Eingesetzt wurden jeweils 10 mM Ketoisocaproat und für die Regenerierung durch Malatdehydrogenase (MDH) 100 mM L-Malat bzw. durch Formiatdehydrogenase (FDH) 100 mM Formiat.

Figure 00130001
Table 1: Comparison of the formation of L-leucine (HPLC) in the coupled approach with coenzyme regeneration by MDH and FDH. In each case 10 mM ketoisocaproate was used and for the regeneration by malate dehydrogenase (MDH) 100 mM L-malate or by formate dehydrogenase (FDH) 100 mM formate.
Figure 00130001

Ebenfalls untersucht wurde der Einsatz von Alkoholdehydrogenasen in Kombination mit Malatdehydrogenasen. Die MDH aus E. coli wird mit einer NAD-abhängigen S-spezifischen Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis (RE-ADH; DE10218689 ) gekoppelt. Die Verwendbarkeit der MDH wird dabei über die Reduktion eines Ketons (p-Cl-Acetophenon = pCAp) entsprechend Gleichung (4) geprüft. pCAp + NADH + H+ → p-Cl-Phenylethanol + NAD+ (4a) NAD+ + L-Malat → Pyruvat + CO2 + NADH (4b) The use of alcohol dehydrogenases in combination with malate dehydrogenases was also investigated. The MDH from E. coli is treated with an NAD-dependent S-specific alcohol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis (RE-ADH; DE10218689 ) coupled. The usability of MDH is checked by reducing a ketone (p-Cl-acetophenone = pCAp) according to equation (4). pCAp + NADH + H + → p-Cl-phenylethanol + NAD + (4a) NAD + + L-malate → pyruvate + CO 2 + NADH (4b)

Tabelle 2: Abnahme des Ketons p-Cl-Acetophenon (10 mM eingesetzt) und Zunahme des enzymatisch gebildeten Alkohols p-Cl-Phenylethanol (100 % entspr. 10 mM) in Abhängigkeit von der Zeit.

Figure 00140001
Table 2: Decrease in the ketone p-Cl-acetophenone (10 mM used) and increase in the enzymatically formed alcohol p-Cl-phenylethanol (100% corresponds to 10 mM) as a function of time.
Figure 00140001

Enantiomerenangereichert oder enantiomer angereichert bezeichnet die Tatsache, dass eine optische Antipode im Gemisch mit ihrer anderen zu > 50% vorhanden ist.Enantiomerically enriched or enantiomeric Enriched denotes the fact that an optical antipode mixed with your other at> 50% is available.

Die dargestellten Strukturen beziehen sich bei Vorliegen eines Stereozentrums auf beide möglichen Enantiomere und bei Vorliegen von mehr als einem Stereozentrum im Molekül auf alle möglichen Diastereomere und bezüglich eines Diastereomers auf die darunter fallenden möglichen zwei Enantiomere der in Frage stehenden Verbindung.Obtain the structures shown in the presence of a stereo center on both possible enantiomers and if there is more than one stereo center in the molecule on all of them potential Diastereomers and regarding of a diastereomer to the possible two enantiomers of connection in question.

Der Organismus Candida boidinii ist unter der Nummer ATCC 32195 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und öffentlich zugänglich.The organism Candida boidinii is under the number ATCC 32195 deposited with the American Type Culture Collection and open to the public.

Die in dieser Schrift genannten Dokumente des Standes der Technik gelten als von der Offenbarung mitumfasst.The documents mentioned in this document of the prior art are considered to be included in the disclosure.

Beschreibungen der Zeichnungen:Descriptions of the drawings:

1 zeigt einen Membranreaktor mit Dead-End-Filtration. Das Substrat 1 wird über eine Pumpe 2 in den Reaktorraum 3 überführt, der eine Membran 5 aufweist. Im rührerbetriebenen Reaktorraum befinden sich neben dem Lösungsmittel der Katalysator 4, das Produkt 6 und nicht umgesetztes Substrat 1. Über die Membran 5 wird hauptsächlich niedermolekulares 6 abfiltriert. 1 shows a membrane reactor with dead-end filtration. The substrate 1 is via a pump 2 in the reactor room 3 transferred to a membrane 5 having. In addition to the solvent, the catalyst is located in the stirrer-operated reactor room 4 , the product 6 and unreacted substrate 1 , Over the membrane 5 becomes mainly low molecular weight 6 filtered off.

2 zeigt einen Membranreaktor mit Cross-Flow-Filtration. Das Substrat 7 wird hier über die Pumpe 8 in den gerührten Reaktorraum überführt, in dem sich auch Lösungsmittel, Katalysator 9 und Produkt 14 befindet. Über die Pumpe 16 wird ein Lösungsmittelfluß eingestellt, der über einen ggf. vorhandenen Wärmetauscher 12 in die Cross-Flow-Filtrationszelle 15 führt. Hier wird das niedermolekulare Produkt 14 über die Membran 13 abgetrennt. Hochmolekularer Katalysator 9 wird anschließend mit dem Lösungsmittelfluß ggf. wieder über einen Wärmetauscher 12 ggf. über das Ventil 11 zurück in den Reaktor 10 geleitet. 2 shows a membrane reactor with cross-flow filtration. The substrate 7 is here about the pump 8th transferred into the stirred reactor space, in which there is also solvent, catalyst 9 and product 14 located. About the pump 16 a solvent flow is set, via an existing heat exchanger 12 into the cross-flow filtration cell 15 leads. Here is the low molecular weight product 14 across the membrane 13 separated. High molecular weight catalyst 9 is then again with the solvent flow, if necessary via a heat exchanger 12 if necessary via the valve 11 back to the reactor 10 directed.

Beispiel 1:Example 1:

Zur Gewinnung der hier benutzten MDH aus E. coli K12 s. Dissertation S. Naamnieh, Universität Düsseldorf, in Vorbereitung S. 70ff.To obtain the used here MDH from E. coli K12 s. Dissertation S. Naamnieh, University of Düsseldorf, in preparation p. 70ff.

Reinigung und biochemische Eigenschaften der MDH aus E. coli:Cleaning and biochemical Properties of MDH from E. coli:

a) Reinigunga) Cleaning

Die Reinigung der recMDH aus E. coli-Rohextrakten (Expressionsstamm: E. coli-Derivat JM105) erfolgte in Anlehnung an das Reinigungsprotokoll (Stols L., and Donnelly M. I. (1997). Production of succinic acid through overexpression of NAD(+)-dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant. Appl Environ Microbiol 63: 2695-701.). Zunächst wurden die rec-Bakterienzellen durch Desintegration mit Glasperlen aufgeschlossen (Aufschlusspuffer Tris/HCl 100mM pH 7.5). Im Anschluss daran erfolgte ein Reinigungsschritt durch eine Q-Sepharose. Nach der Reinigung mittels Q-Sepharose konnte eine spezifische Aktivität der MDH von etwa 7,3 U/mg bestimmt werden. Durch die Aufreinigung dieses Enzymes mittels weiterer chromatographischer Schritte, Hydroxyapatit und Phenylsepharose konnte die MDH bis zur Homogenität mit einer spezifischen Aktivität von 133 U/mg gereinigt werden.Purification of recMDH from E. coli crude extracts (Expression strain: E. coli derivative JM105) was based on to the cleaning protocol (Stols L., and Donnelly M. I. (1997). Production of succinic acid through overexpression of NAD (+) - dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant. Appl Environ Microbiol 63: 2695-701.). First the rec bacterial cells were disintegrated with glass beads digested (digestion buffer Tris / HCl 100mM pH 7.5). In connection followed by a cleaning step using a Q-Sepharose. After Purification using Q-Sepharose could have a specific activity of MDH of about 7.3 U / mg can be determined. By cleaning this up Enzymes using further chromatographic steps, hydroxyapatite and phenylsepharose was able to achieve homogeneity with a specific activity of 133 U / mg can be cleaned.

Tab. 3: Zusammenfassung der Reinigung der rec-MDH aus E. coli.

Figure 00170001
Tab. 3: Summary of the purification of the rec-MDH from E. coli.
Figure 00170001

b) Biochemische Charakterisierungb) Biochemical characterization

– Km-Werte - Km values

Für L-Malat wurde ein Km-Wert von 0,29 mM gemessen und für das Coenzym NAD+ ein Km-Wert von 0,14 mM.For A km value of 0.29 mM was measured for L-malate and for the coenzyme NAD + a Km of 0.14 mM.

Beide Km-Werte liegen in einem niedrigen Bereich von < 1 mM, sie zeigen, dass beide Substrate mit guter Affinität vom Enzym erkannt werden. Beide Werte sprechen dafür, dass die MDH für die Regenerierung von NADH verwendet werden kann.Both km values are low Range from <1 mM, they show that both substrates have good affinity for the enzyme be recognized. Both values suggest that the MDH for the regeneration of NADH can be used.

– pH-Optimum (1)- pH optimum ( 1 )

MDH zeigt maximale Aktivität bei höheren pH-Werten von 11 und höher. Allerdings ist der Aktivitätsabfall zu niedrigeren pH-Werten relativ gering, so liegen bei pH 8,0 noch 72% und bei pH 7,0 noch 67% Aktivität vor.MDH shows maximum activity at higher pH values from 11 and higher. However, the drop in activity relatively low at lower pH values, the pH is still at 8.0 72% and at pH 7.0 still 67% activity.

– Temperaturoptimum- optimum temperature

Das Temperaturoptimum der MDH liegt bei ca. 55°C (4).The temperature optimum of the MDH is approx. 55 ° C ( 4 ).

Beispiel 2:Example 2:

a) Kopplung von Leucin-Dehydrogenase mit Malat-a) Coupling of leucine dehydrogenase with malate

Dehydrogenasedehydrogenase

Die MDH aus E. coli wird mit einer NAD-abhängigen Leucin-Dehydrogenase (LeuDH aus Bacillus cereus; Sigma) gekoppelt. LeuDH katalysiert unter NADH-Verbrauch die reduktive Aminierung von aliphatischen Ketosäuren wie beispielsweise Ketoisocaproat zu den entsprechenden L-Aminosäuren wie L-Leucin.The MDH from E. coli is with a NAD-dependent Leucine dehydrogenase (LeuDH from Bacillus cereus; Sigma) coupled. LeuDH catalyzed under NADH consumption the reductive amination of aliphatic keto acids such as for example ketoisocaproate to the corresponding L-amino acids such as L-leucine.

Testansatz (1 ml gesamt; wenn nicht anders angegeben ist in Klammern die Konzentration der Stammlösung angegeben):Test batch (1 ml total; unless stated otherwise, the concentration of the Stock solution specified):

526 μl Hepes-Puffer (200 mM Hepes, pH 8,5 mit 10 mM MgCl2); 143 μl Ammoniumsulfat-Lösung (500 mM im Test); 100 μl Ketoisocaproat (100 mM); 20 μl NAD+ (50 mM); 200 μl L-Malat (500 mM, Na-salz, in Hepes-Puffer gelöst, pH 8,5); 1 μl LeuDH (0,5U im Test); 10 μ1 MDH (1,5U im Test; partiell gereinigt).526 ul Hepes buffer (200mM Hepes, pH 8.5 with 10mM MgCl 2 ); 143 µl ammonium sulfate solution (500 mM in the test); 100 ul Ketoisocaproat (100mM); 20 ul NAD + (50mM); 200 ul L-malate (500mM, sodium salt, dissolved in Hepes buffer, pH 8.5); 1 ul LeuDH (0.5U in the test); 10 μ1 MDH (1.5U in the test; partially cleaned).

Der Testansatz wird bei 30°C inkubiert, nach 0, 10, 30, 60 und 120 min werden Proben (50 μl; Eppendorf-Reaktionsgefässe) entnommen und zum Abstoppen der Reaktion für 3 min bei 95°C erhitzt. Denaturiertes Protein wird durch Zentrifugation für 10 min bei 13.000 rpm (Eppendorf-Tischzentrifuge) abgetrennt und der Überstand nach Derivatisierung mit ortho-Phthalaldehyd (OPA) mittels HPLC analysiert.The test mixture is incubated at 30 ° C, samples (50 μl; Eppendorf reaction vessels) are taken after 0, 10, 30, 60 and 120 min and to stop the reaction for 3 min at 95 ° C heated. Denatured protein is centrifuged for 10 min at 13,000 rpm (Eppendorf benchtop centrifuge) separated and the supernatant after derivatization with ortho-phthalaldehyde (OPA) using HPLC analyzed.

Derivatisierung mit OPA (= ortho-Phthaldialdehyd):Derivatization with OPA (= orthophthalaldehyde):

140 μl Na-Borat-Puffer (100 mM; pH 10,4); 40 μl Probe bzw. Standard; 20 μl OPA/IBLC-Reagenz (= ortho-Phthaldialdehyd/N-Isobutyryl-L-cystein). Von dieser Reaktionslösung werden 20 μl für die HPLC-Analyse injiziert.140 μl Na borate buffer (100 mM; pH 10.4); 40 ul Sample or standard; 20 ul OPA / IBLC reagent (= orthophthalaldehyde / N-isobutyryl-L-cysteine). From this reaction solution become 20 μl for the HPLC analysis injected.

HPLC-Analyse:HPLC analysis:

Ergebnisse s. Tabelle 1:Results see Table 1:

b) Vergleichsversuch: Kopplung von Leucin-Dehydrogenase mit Formiat-Dehydrogenaseb) Comparative experiment: coupling of leucine dehydrogenase with formate dehydrogenase

In einem parallel durchgeführten Vergleichsansatz wurden dieselben Komponenten wie oben beschrieben verwendet, aber an Stelle der Malat-Dehydrogenase wurden 0,5 U Formiat-Dehydrogenase (FDH aus Candida boidinii; Sigma) eingesetzt und als Regenerierungssubstrat an Stelle von 100 mM L-Malat 100 mM Formiat.
Ergebnisse s. Tabelle 1.In a comparison run carried out in parallel, the same components as described above were used, but 0.5 U formate dehydrogenase (FDH from Candida boidinii; Sigma) was used instead of malate dehydrogenase and 100 mM as regeneration substrate instead of 100 mM L-malate formate.
Results see Table 1.

Beispiel 3: Kopplung der MDH mit Alkohol-Dehydrogenase:Example 3: Coupling the MDH with alcohol dehydrogenase:

Die MDH aus E. coli (Expressionsstamm: E. coli-Derivat JM 105) wird mit einer NAD-abhängigen S-spezifischen Alkohol-Dehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis (RE-ADH) gekoppelt. Die Verwendbarkeit der MDH wird dabei über die Reduktion eines Ketons (p-Cl-Acetophenon) geprüft.The MDH from E. coli (expression strain: E. coli derivative JM 105) is characterized by an NAD-dependent S-specific alcohol dehydrogenase Rhodococcus erythropolis (RE-ADH) coupled. The usability the MDH is about tested the reduction of a ketone (p-Cl-acetophenone).

Testansatz (1 ml gesamt; wenn nicht anders angegeben ist in Klammern die Konzentration der Stammlösung angegeben):Test batch (1 ml total; unless stated otherwise, the concentration of the Stock solution specified):

678,7 μl Hepes-Puffer (100 mM Hepes, pH 8,5 mit 10 mM MgCl2); 1,3 μl p-Cl-Acetophenon (10 mM im Test); 20 μl NAD+ (50 mM); 200 μl L-Malat (500 mM, Na-salz, in Hepes-Puffer gelöst, pH 8,5); 15 μl RE-ADH (1U im Test); 85 μl MDH (1U im Test; partiell gereinigt).678.7 µl Hepes buffer (100 mM Hepes, pH 8.5 with 10 mM MgCl 2 ); 1.3 µl p-Cl-acetophenone (10 mM in the test); 20 ul NAD + (50mM); 200 ul L-malate (500mM, sodium salt, dissolved in Hepes buffer, pH 8.5); 15 ul RE-ADH (1U tested); 85 μl MDH (1U in the test; partially cleaned).

Der Testansatz wird bei 30°C inkubiert, nach 0, 10, 20, 30 und 60 min werden Proben (50 μl) entnommen, mit 100 μl Ethylacetat versetzt und die Oberphase mittels Gaschromatographie auf Bildung des Alkohols p-Cl-Phenylethanol hin analysiert.
Ergebnisse s. Tabelle 2.The test mixture is incubated at 30 ° C., samples (50 μl) are taken after 0, 10, 20, 30 and 60 min, 100 μl of ethyl acetate are added and the upper phase is analyzed by gas chromatography for the formation of the alcohol p-Cl-phenylethanol.
Results see Table 2.

Beispiel 4: Konstruktion eines Expressionsvektors mit heterologer ExpressionExample 4: Construction an expression vector with heterologous expression

Aus der Sequenz des amplifizierten Fragmentes wurden Primer mit integrierten Restriktionsschnittstellen und ein Codon für die ribosomale Bindungsstelle konstruiert. Nach der Amplifikation des Malatdehydrogenases aus dem rekombinanten pUC18 wurde das PCR-Fragment in den rekombinanten recPhe-pKK-223-3-Expressionsvektor hinter der PheDH-Sequenz an der PstI und HindIII-Restriktionsschnittstellen kloniert ( 8 – Konstruktion des Plasmids für eine heterologe Expression zur L-Phe Synthese mittels Ganzzellumsetzung). PCR:

Figure 00200001
Primers with integrated restriction sites and a codon for the ribosomal binding site were constructed from the sequence of the amplified fragment. After amplification of the malate dehydrogen nases from the recombinant pUC18, the PCR fragment was cloned into the recombinant recPhe-pKK-223-3 expression vector behind the PheDH sequence at the PstI and HindIII restriction sites ( 8th - Construction of the plasmid for heterologous expression for L-Phe synthesis using whole cell conversion). PCR:
Figure 00200001

Tabelle 4: PCR Protokoll zur Amplifizierung des Malatdehydrogenases aus dem rekombinanten pUC18-Plasmid. Variiert wurden die Konzentrationen der Template-DNA.

Figure 00200002
Table 4: PCR protocol for the amplification of malate dehydrogenase from the recombinant pUC18 plasmid. The concentrations of the template DNA were varied.
Figure 00200002

Figure 00210001
Figure 00210001

Ein Zyklus besteht aus:A cycle consists of:

Denaturierungsschritt :denaturation : 94°C94 ° C Annealingschritt:annealing: 59°C59 ° C Amplifizierungsschritt:amplification: 72°C72 ° C

Klonierung:cloning:

Das neue Konstrukt des rekombinanten Plasmids (5) wurde in kompetente E. coli-Zellen JM 105 bzw. HB 101 transformiert.The new construct of the recombinant plasmid ( 5 ) was transformed into competent E. coli cells JM 105 or HB 101.

Die Standardtransformation wurde nach dem Protokoll von Hanahan (Hanahan D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol 166: 557–80.) durchgeführt. Hierzu wurden 100–200 μl kompetenter E. coli -Zellen auf Eis aufgetaut und 40 ng DNA aus dem Ligationsansatz zugegeben. Die Plasmidzellsuspension wurde 30 min auf Eis gekühlt und anschließend für 90 sec auf 42°C erwärmt und sofort wieder auf Eis gekühlt. Nach Zugabe von 300 μl LB – Medium wurden die Zellen zur Regeneration etwa 45 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 200 μl dieser Kultur auf einer Antibiotikahaltigen LB-Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.The standard transformation was following the Hanahan protocol (Hanahan D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol 166: 557-80.). For this became 100-200 μl more competent E. coli cells thawed on ice and 40 ng DNA from the ligation batch added. The plasmid cell suspension was cooled on ice for 30 min and subsequently for 90 sec to 42 ° C heated and immediately chilled on ice again. After adding 300 μl LB - medium the cells were incubated at 37 ° C. for about 45 minutes for regeneration. Subsequently were 200 ul spread this culture on an antibiotic-containing LB plate and over Night at 37 ° C incubated.

Mit der Klonierung der Malatdehydrogenase 3' zur PheDH an der Pst1- und HindIII-Schnittstelle mit eigener ribosomalen Bindungsstelle konnte eine Expression beider Enzyme gleichzeitig erfolgen.With the cloning of malate dehydrogenase 3 'to PheDH at the Pst1 and HindIII interfaces with their own ribosomal binding site could express both enzymes done simultaneously.

Anmerkung: Weitere Detailinformationen zur experimentellen Herstellung dieser Zellen werden beschrieben sein in: S.Note: More detailed information for the experimental production of these cells are described be in: S.

Naamnieh, Dissertation, Universität Düsseldorf, in Vorbereitung.Naamnieh, dissertation, University of Düsseldorf, in preparation.

Beispiel 5: Coexpression der PheDH und der MalatdehydrogenaseExample 5: Coexpression PheDH and malate dehydrogenase

Von den positiven Klonen wurden einige zur Expression ausgewählt. Eine Einzelkolonie der jeweiligen Klone wurde in 5 ml LBamp -Medium überimpft, und nach Erreichen von OD580 = 0,6 mit 1 mM IPTG induziert. Die Induktion erfolgte über Nacht und die geernteten Zellen wurden mit Ultraschall aufgeschlossen.Some of the positive clones were selected for expression. A single colony of the respective clones was inoculated into 5 ml LB amp medium and, after reaching OD 580 = 0.6, induced with 1 mM IPTG. Induction took place overnight and the harvested cells were disrupted using ultrasound.

Der rekombinante Stamm HB101 zeigt eine Malatdehydrogenase-Aktivität von 100 U/ml und ebenso eine PheDH -Aktivität von 130 U/ml. Die Aktivität beider Enzyme im rekombinanten Stamm JM 105 ist eindeutig höher und liegt bei ~ 600 U/ml für Malatdehydrogenase und 1200 U/ml für die PheDH.The recombinant strain HB101 shows a malate dehydrogenase activity of 100 U / ml and also a PheDH activity of 130 U / ml. The activity of both Enzymes in the recombinant strain JM 105 is clearly higher and is ~ 600 U / ml for Malate dehydrogenase and 1200 U / ml for PheDH.

Die beiden rekombinanten Stämme wurden im 10 L Fermenter kultiviert und die Aktivität beider Enzyme bestimmt.The two recombinant strains were cultivated in a 10 L fermenter and the activity of both enzymes determined.

Tabelle 5: Aktivitätsbestimmung der exprimierten Enzyme in einem 10 L Fermenter mit LB-Medium als batch-Fermentation.

Figure 00220001
Table 5: Activity determination of the expressed enzymes in a 10 L fermenter with LB medium as batch fermentation.
Figure 00220001

Aus den Daten der Expression ist zu entnehmen, dass der E. coli Stamm JM 105 deutlich bessere Aktivität für beide Enzyme zeigt, daher wurden alle weiteren Versuche mit diesem Stamm durchgeführt.From the data of the expression is it can be seen that the E. coli strain JM 105 has significantly better activity for both Enzymes shows, therefore all further attempts with this strain carried out.

Beispiel 6: Optimierung der AktivitätExample 6: Optimization of activity

Um die maximale Aktivität der erhaltenen Rohextrakte ausschöpfen zu können, wurden mehrere Parameter untersucht und variiert.To get the maximum activity of the received Use raw extracts to be able several parameters were examined and varied.

Beide heterolog exprimierten Enzyme zeigen bei unterschiedlichen Bedingungen beste Stabilitätseigenschaften. Von Interesse war es, die optimalen Eigenschaften für beide Enzyme im gleichen System zu ermitteln. Die nachfolgenden Versuche wurden mit Blick auf diese Tatsache durchgeführt.Both heterologously expressed enzymes show the best stability properties under different conditions. Of interest was the optimal properties for both Identify enzymes in the same system. The subsequent attempts were carried out with this in mind.

a) Optimierung des Aufschlusspuffera) Optimization of the digestion buffer

1 g Zellen JM105 wurde in 0,1 M Tris- bzw. 0,1 M Kpi-Puffer mit/ohne BSA (1,5 g/l) 30 %ig aufgeschlossen. Der Aufschluss erfolgte mit Ultraschall bei 70 cont. Cycles. Zusätzlich zu den Puffern wurden 1,5 g/l BSA zur Stabilisierung der Enzyme zugegeben.1 g of cells JM 105 was digested in 0.1 M Tris or 0.1 M Kpi buffer with / without BSA (1.5 g / l) 30%. The digestion was carried out with ultrasound at 70 cont. Cycles. In addition to the buffers, 1.5 g / l BSA was added to stabilize the enzymes.

Tabelle 6: Aktivitätsvergleich in Abhängigkeit des Aufschlusspuffers

Figure 00230001
Table 6: Activity comparison depending on the digestion buffer
Figure 00230001

Der Zusatz an BSA führte in beiden Fällen zu einer Steigerung der Aktivität. Ebenso beeinflusste der Aufschluß-Puffer die Aktivitäten. Hierbei war zu beobachten, dass der geeignete Aufschluß-Puffer für die einzelnen Enzyme verschieden war. Der Kpi-Puffer war für die PheDH besser geeignet als für das Malatdehydrogenase, da aber die Aktivitätsabnahme des Malatdehydrogenases im Kpi-Puffer relativ gering war, wurden die rekombinanten Zellen nach der heterologen Expression weiterhin in diesem Puffer aufgeschlossen.The addition to BSA resulted in both cases to an increase in activity. The digestion buffer also influenced the activities. in this connection it was observed that the appropriate digestion buffer was different for the individual enzymes was. The Kpi buffer was for the PheDH is more suitable than for the malate dehydrogenase, but since the activity decrease of the malate dehydrogenase in the Kpi buffer was relatively low, the recombinant cells after the heterologous expression continued to be digested in this buffer.

b) Aufschlussdauer zur Untersuchung der Stabilitätb) Duration of information for the investigation of stability

Ebenso wurde die Aufschlussdauer überprüft und der kritische Punkt zur Stabilität der Enzyme während dieses Vorganges bestimmt. Aus den Daten ist die optimale Aufschlussdauer zu entnehmen (9 – Stabilitätsbestimmung der PheDH bzw. des Malatdehydrogenases nach verschiedenen Aufschlusszeiten mittels Ultraschalls. Die Zellen wurden nach einer 60-, 30-sekundigen Behandlung zwischenzeitlich 30 Sekunden abgekühlt).The digestion time was also checked and the critical point regarding the stability of the enzymes during this process was determined. The optimal digestion time can be found in the data ( 9 - Determination of the stability of PheDH or malate dehydrogenase after various digestion times using ultrasound. The cells were temporarily cooled for 30 seconds after a 60-, 30-second treatment).

Für diesen Versuch wurde folgende Suspension verwendet:
1 g rekombinante Zellen (JM105)
3 ml Kpi-Puffer 0,1 MThe following suspension was used for this experiment:
1 g recombinant cells (JM105)
3 ml Kpi buffer 0.1 M

Bei längerer Behandlung der Zellen mit Ultraschall nimmt die Aktivität der PheDH drastisch ab, wogegen die Aktivität der Malatdehydrogenase erhalten bleibt. Die idealen Aufschlussbedingungen für einen 25 %igen Aufschluß von 1 g rekombinantem E. coli JM105 sind daher 4 × 30 s Ultraschallbehandlung mit zwischenzeitlich 3 × 30s Abkühlung im Eisbad.With prolonged treatment of the cells with ultrasound, the activity of PheDH decreases dramatically, whereas the activity the malate dehydrogenase is retained. The ideal digestion conditions for one 25% digestion of 1 g of recombinant E. coli JM105 is therefore 4 × 30 s ultrasound treatment with meanwhile 3 × 30s cooling down in the ice bath.

Bei längeren Behandlungen mit Ultraschall wird die Probe erhitzt, was zu einer Denaturierung der Enzyme führen kann. Die Proteinmenge wurde bei diesem Versuch bestimmt und ist aus nachfolgender zu entnehmen.For longer treatments with ultrasound the sample is heated, which can lead to denaturation of the enzymes. The amount of protein was determined in this experiment and is from the following refer to.

Tabelle 7: Proteinbestimmung beider exprimierter Enzyme, PheDH und Malatdehydrogenase, nach Variation der Aufschlusszeit. Die Zellen wurden nach einer 60-, 30-sekundigen Behandlung zwischenzeitlich 30Sekunden abgekühlt.

Figure 00250001
Table 7: Protein determination of both expressed enzymes, PheDH and malate dehydrogenase, after variation of the digestion time. The cells were temporarily cooled for 30 seconds after a 60-, 30-second treatment.
Figure 00250001

Bei einer Reinigung des Malatdehydrogenases bis zur Homogenität konnte eine spezifische Aktivität von 466 U/mg erreicht werden. Die Reinigungsschritte sind in Tabelle 8 zusammengefasst.When cleaning the malate dehydrogenase to homogeneity could have a specific activity of 466 U / mg can be achieved. The cleaning steps are in table 8 summarized.

Tabelle 8: Aufreinigung der rekombinanten Malatdehydrogenase

Figure 00250002
Table 8: Purification of the recombinant malate dehydrogenase
Figure 00250002

Figure 00260001
Figure 00260001

c) Km-Wertbestimmungc) Km value determination

Für das Substrat und das Coenzym der Malatdehydrogenase wurden die KM-Werte bestimmt. Die KM-Werte wurden an homogenen oder partiell gereinigten rec-Malatdehydrogenase Proben bestimmt.The K M values were determined for the substrate and the coenzyme of malate dehydrogenase. The K M values were determined on homogeneous or partially purified rec-malate dehydrogenase samples.

L-Malat:L-malate: 0,29 mM0.29 mM NAD+NAD + 0,14 mM0.14 mM

Beispiel 7: Gekoppelte L-Phenylalanin Synthese unter Regeneration des Coenzyms NADHExample 7: Coupled L-phenylalanine Synthesis with regeneration of the coenzyme NADH

Wichtige Faktoren für eine gekoppelte Reaktion sind das pH-Optimum sowie die Temperaturstabilität der beiden Enzyme. Zusätzlich zu der Stabilität der Enzyme spielen weitere Faktoren wie z.B. der Einfluss der verschiedenen Substrate auf die Enzyme eine Rolle.Important factors for a coupled Reaction are the pH optimum as well as the temperature stability of the two enzymes. additionally to stability the enzymes play other factors such as the influence of different Substrates on the enzymes matter.

In Bezug auf das pH-Optimum wurde eine Kinetik durchgeführt und die pH-Abhängigkeit der Synthese bestimmt. In 10 ist die Zunahme der Aktivität bei steigendem pH-Wert zu entnehmen, wobei für die Synthese aus Gründen der Coenzymsstabilität ein pH-Wert von 8.0 ausgewählt wurde, in dem beide Enzyme zwar nicht die höchste Aktivität zeigen, aber bei dem das Coenzym stabil bleibt (10 – pH-Optimum von Malatdehydrogenase und der PheDH. Die Aktivität beider Enzyme nimmt bei Zunahme des pH-Wertes zu. Die Messungen wurden mit partiell gereinigtem Enzym durchgeführt. Für die Phenylalanin Dehydrogenase wurde die reduktive Aminierung gemessen).Kinetics were carried out with regard to the pH optimum and the pH dependence of the synthesis was determined. In 10 the increase in activity with increasing pH can be seen, whereby a pH of 8.0 was selected for the synthesis for reasons of coenzyme stability, in which both enzymes do not show the highest activity, but at which the coenzyme remains stable ( 10 - Optimal pH of malate dehydrogenase and PheDH. The activity of both enzymes increases with an increase in pH. The measurements were carried out with partially purified enzyme. Reductive amination was measured for phenylalanine dehydrogenase).

Ein zweiter Faktor für die gekoppelte Enzymreaktion ist die geeignete Temperatur, bei der beide Enzyme für längere Zeit stabil erhalten bleiben. Daher wurde ein weiterer Versuch zur Bestimmung des Temperaturoptimums durchgeführt (11 – Temperaturoptimum. Die Messungen wurden bei pH 8,5 und in 0,1M HEPES-Puffer durchgeführt).A second factor for the coupled enzyme reaction is the suitable temperature at which both enzymes remain stable for a long time. Therefore, another experiment was carried out to determine the optimum temperature ( 11 - optimum temperature. The measurements were carried out at pH 8.5 and in 0.1M HEPES buffer).

Wie aus 11 zu entnehmen ist, liegt das Temperaturoptimum beider Enzyme bei 50°C. Bei 30°C beträgt die gemessene Aktivität nur 60 %.How out 11 it can be seen that the temperature optimum of both enzymes is 50 ° C. At 30 ° C the measured activity is only 60%.

Das Malatdehydrogenase ist für längere Zeit bei 45°C stabil. Da die PheDH aber bei diesem Temperaturwert instabil wird, wurden die Synthesen bei 30°C durchgeführt, damit die Stabilität beider Enzyme sowie des Coenzyms über längere Zeit gewährleistet werden konnte.The malate dehydrogenase is for a long time at 45 ° C stable. However, since the PheDH becomes unstable at this temperature, the syntheses were at 30 ° C carried out, thus stability both enzymes and the coenzyme guaranteed for a long time could be.

Enzyme erreichen ihre optimale Aktivität im jeweils geeigneten Puffer. Beide Enzyme wurden mit zwei verschiedenen Puffern in je einem Reaktionsansatz getestet (Tabelle 9).Enzymes achieve their optimal activity in each case suitable buffer. Both enzymes were made with two different buffers tested in one reaction batch each (Table 9).

Tabelle 9: Vergleich der PheDH- bzw. der Malatdehydrogenase-Aktivität in verschiedenen Reaktionspuffern. Die Aktivitäten sind in Prozent vom Optimalen zu sehen.

Figure 00270001
Table 9: Comparison of PheDH and malate dehydrogenase activity in different reaction buffers. The activities can be seen in percent of the optimal.
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Da die Aktivität der PheDH in HEPES-Puffer nicht erheblich abnimmt, wurde die gekoppelte Enzymreaktion in diesem Puffer durchgeführt.Because the activity of PheDH in HEPES buffer did not decrease significantly, the coupled enzyme reaction was in this Buffer performed.

Mit der Bestimmung der Puffer-, pH- und Temperatur-Werte konnten geeignete Bedingungen und Medien für die Synthese von Phenylalanin durch eine gekoppelte Enzymreaktion mit Regeneration des Cofaktors (NADH) ausgewählt werden.By determining the buffer, pH and temperature values could create suitable conditions and media for the synthesis of phenylalanine through a coupled enzyme reaction with regeneration of the cofactor (NADH) is selected become.

Eingesetzt wurden 30 mM Phenylpyruvat, 100 mM Ammoniumsulfat, 100 mM HEPES-Puffer, 70 mM L-Malat, 2 mM NAD+, 2 mM Mg2+, 25U PheDH (partiell gereinigt) und 30U Malatdehydrogenase. Die Proben werden mittels HPLC analysiert.30 mM phenyl pyruvate, 100 mM ammonium sulfate, 100 mM HEPES buffer, 70 mM L-malate, 2 mM NAD +, 2 mM Mg 2+ , 25U PheDH (partially purified) and 30U malate dehydrogenase were used. The samples are analyzed by HPLC.

Die Synthese wurde über mehrere Stunden verfolgt. Nach 4 h waren ca. 50 % des eingesetzten Substrates Phenylpyruvat zu L-Phenylalanin umgesetzt (12 – Bildungskinetik für L-Phe. Die Bildung von L-Phe wurde in situ durchgeführt).The synthesis was followed over several hours. After 4 hours, approximately 50% of the phenylpyruvate substrate used had been converted to L-phenylalanine ( 12 - Educational kinetics for L-Phe. The formation of L-Phe was carried out in situ).

Beispiel 8: GanzzellumsetzungExample 8: Whole cell conversion

Als Standard- Ansatz für die Ganzzellumsetzung wurde folgendes Medium verwendet:As a standard approach for whole cell implementation the following medium was used:

0.1 M0.1 M HEPES-Puffer (pH 8.0)HEPES buffer (pH 8.0) 40 mM40 mM Phenylpyruvatphenylpyruvate 0.1 M0.1 M L-MalatL-malate 0.1 M0.1 M Ammoniumsulfatammonium sulfate 2 mM2 mM MgCl2 MgCl 2

Die Umsetzung erfolgte bei 30°C und mit 1g rekombinanten E.coli-Zellen. Das gebildete Phenylalanin wurde mittels HPLC nachgewiesen (6).The reaction was carried out at 30 ° C. and with 1 g of recombinant E. coli cells. The phenylalanine formed was detected by HPLC ( 6 ).

Die Bildung von L-Phe durch rekombinante E.coli -Zellen wurde über 20 h verfolgt und die Ausbeute bestimmt ( 7).The formation of L-Phe by recombinant E. coli cells was monitored over 20 h and the yield was determined ( 7 ).

Eine Metabolisierung des entstandenen Produktes L-Phe konnte nach 20h Inkubation nicht nachgewiesen werden.A metabolism of the resulting Product L-Phe could not be detected after 20 hours of incubation.

Claims (10)

Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten organischen Verbindungen in einem gekoppelten enzymatischen Reaktionssystem aufweisend eine erste enzymatische Transformation eines organischen Substrats unter Verbrauch von NAD(P)H und die Regeneration des NAD(P)H in einer zweiten enzymatischen Transformation durch eine Malatdehydrogenase unter Oxidation von L-Äpfelsäure zu Pyruvat und CO2, dadurch gekennzeichnet, dass das entstehende Pyruvat der zweiten enzymatischen Transformation nicht als Substrat in der ersten enzymatischen Transformation eingesetzt wird.A process for the preparation of enantiomerically enriched organic compounds in a coupled enzymatic reaction system comprising a first enzymatic transformation of an organic substrate using NAD (P) H and the regeneration of NAD (P) H in a second enzymatic transformation by a malate dehydrogenase with oxidation of L- Malic acid to pyruvate and CO 2 , characterized in that the resulting pyruvate of the second enzymatic transformation is not used as a substrate in the first enzymatic transformation. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste enzymatische Transformation unter Verwendung einer Alkoholdehydrogenase oder Aminosäuredehydrogenase abläuft.A method according to claim 1, characterized in that the first enzymatic transformation using an alcohol dehydrogenase or amino acid dehydrogenase expires. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Alkoholdehydrogenase eine ADH aus Lactobacillus kefir oder Rhodococcus erythropolis und als Aminosäuredehydrogenase eine Leucindehydrogenasen bzw. Phenylalanindehydrogenasen verwendet wird.A method according to claim 2, characterized in that as Alcohol dehydrogenase is an ADH from Lactobacillus kefir or Rhodococcus erythropolis and as amino acid dehydrogenase a leucine dehydrogenase or phenylalanine dehydrogenase used becomes. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Malatdehydrogenase aus E. coli, insbesondere E. coli K12 verwendet wird.Method according to one or more of the preceding claims, characterized characterized that a malate dehydrogenase from E. coli, in particular E. coli K12 is used. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einem wässrigen ein- oder mehrphasigen Lösungsmittelgemisch durchgeführt wird.Method according to one or more of the preceding claims, characterized characterized in that the reaction in an aqueous single or multi-phase Solvent mixture carried out becomes. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur während der Reaktion zwischen 20 und 40°C liegt.Method according to one or more of the preceding claims, characterized characterized that the temperature during the reaction between 20 and 40 ° C lies. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert während der Reaktion zwischen 6 und 9 liegt.Method according to one or more of the preceding claims, characterized characterized that the pH during the reaction between 6 and 9 lies. Gekoppeltes enzymatisches Reaktionssystem zur Herstellung von enantiomerenangereicherten organischen Verbindungen aufweisend eine erste enzymatische Transformation eines organischen Substrats unter Verbrauch von NAD(P)H und die Regeneration des NAD(P)H in einer zweiten enzymatischen Transformation durch eine Malatdehydrogenase unter Oxidation von L-Äpfelsäure zu Pyruvat und CO2, dadurch gekennzeichnet, dass das entstehende Pyruvat der zweiten enzymatischen Transformation nicht als Substrat in der ersten enzymatischen Transformation eingesetzt wird.Coupled enzymatic reaction system for the production of enantiomerically enriched organic compounds comprising a first enzymatic transformation of an organic substrate using NAD (P) H and the regeneration of NAD (P) H in a second enzymatic transformation by a malate dehydrogenase with oxidation of L-malic acid to pyruvate and CO 2 , characterized in that the pyruvate formed in the second enzymatic transformation is not used as a substrate in the first enzymatic transformation. Ganzzellkatalysator aufweisend ein kloniertes Gen für ein erstes Enzym zur Transformation eines organischen Substrats und ein kloniertes Gen für eine Malatdehydrogenase, wobei dieser befähigt ist, in einer ersten enzymatische Transformation eine enantiomerenangereicherte organische Verbindung unter Verbrauch von NAD(P)H herzustellen und die Regeneration des NAD(P)H in einer zweiten enzymatischen Transformation durch die Malatdehydrogenase unter Oxidation von L-Äpfelsäure zu Pyruvat und CO2 vonstatten geht, wobei das entstehende Pyruvat der zweiten enzymatischen Transformation nicht als Substrat in der ersten enzymatischen Transformation eingesetzt wird.Whole cell catalyst comprising a cloned gene for a first enzyme for the transformation of an organic substrate and a cloned gene for a malate dehydrogenase, which is able to produce an enantiomerically enriched organic compound in a first enzymatic transformation using NAD (P) H and the regeneration of the NAD (P) H takes place in a second enzymatic transformation by the malate dehydrogenase with oxidation of L-malic acid to pyruvate and CO 2 , the pyruvate formed in the second enzymatic transformation not being used as a substrate in the first enzymatic transformation. Plasmide aufweisend Genkonstrukte, in denen das Gen für eine Malatdehydrogenase und ein Gen für ein Enzym zur Transformation eines organischen Substrats unter Verbrauch von NAD(P)H vorhanden ist.Plasmids containing gene constructs in which the gene for a malate dehydrogenase and a gene for one Enzyme to transform an organic substrate under consumption of NAD (P) H is present.
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