DE10230516A1

DE10230516A1 - Humaner monoklonaler Antikörper

Info

Publication number: DE10230516A1
Application number: DE2002130516
Authority: DE
Inventors: Hans Konrad Mueller-Hermelink; Heinz Vollmers
Original assignee: Mueller-Hermelink Hans Konrad Prof Dr; Vollmers Heinz Prof Dr
Current assignee: Mueller-Hermelink Hans Konrad Prof Dr; Vollmers Heinz Prof Dr
Priority date: 2002-07-06
Filing date: 2002-07-06
Publication date: 2004-01-15

Abstract

Beschrieben wird ein humaner monoklonaler Antikörper mit schweren und leichten Kettenmolekülen, die jweils einen von Antikörper zu Antikörper konstant und einen von Antikörper zu Antikörper variabel aufgebauten Bereich besitzen. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß wenigstens eine variable Region der leichten und/oder der schweren Ketten substantiell jeweils die in Anlage 1 wiedergegebene Aminosäure-Sequenz aufweist. Des weiteren sieht die Erfindung Verfahren zur Herstellung des Antikörpers vor, die Verwendung des Antikörpers zur Bekämpfung von Tumoren und ein Arzneimittel und Diagnostikum, welche den Antikörper enthalten.

Description

Die Erfindung betrifft einen humanen monoklonalen Antikörper mit schweren und leichten Kettenmolekülen, die jeweils einen von Antikörper zu Antikörper konstant und einen von Antikörper zu Antikörper variabel aufgebauten Bereich aufweisen, oder ein funktionelles Fragment davon. Desweiteren sieht die Erfindung Verfahren zur Herstellung des Antikörpers vor, die Verwendung des Antikörpers zur Bekämpfung von Tumoren, und ein Arzneimittel und ein Diagnostikum, welche den Antikörper enthalten.

Die derzeitigen Verfahren zur Behandlung von Krebs umfassen eine operative Entfernung des Tumors, Strahlenbehandlungen und Chemotherapie. Ein wesentlicher Nachteil jeder dieser Methoden ist darin zu sehen, daß sie nicht spezifisch auf die Tumorzellen ausgerichtet sind. So kann es bei einer operativen Entfernung beispielsweise vorkommen, daß nicht der ganze Tumor erfaßt wird, was dazu führt, daß sich ein neuer Tumor entwickelt und gegebenenfalls Methastasen gebildet werden, die sich an weiteren Stellen im Körper festsetzen. Bei der Behandlung von Tumoren mit Strahlen oder chemotherapeutischen Mitteln führt die fehlende Selektivität häufig dazu, daß auch gesunde Zellen durch die eingesetzten Mittel geschädigt werden. Die nachteilige Folge hiervon ist, daß die Dosen an Strahlung oder chemischen Wirkstoffen nicht so hoch gewählt werden können, daß sie alle Krebszellen abtöten. Ein wesentlicher Teil der heutigen Krebsforschung zielt daher darauf ab, effektivere und insbesondere selektiv wirkende Verfahren und Mittel zur Bekämpfung von Tumoren zu finden.

Wie immunologische Studien gezeigt haben, ist auch dann, wenn das Immunsystem maligne Zellen nicht wirksam bekämpfen kann, eine zelluläre und humorale Aktivität meßbar. Diese Aktivität reicht jedoch nicht aus, um die Tumorzellen zu zerstören. Ein vielversprechender Ansatz zur Bekämpfung von Tumoren ist daher, von der Immunantwort des Patienten stammende Antikörper zu isolieren, geeignet zu vermehren und therapeutisch einzusetzen.

Ein Verfahren nach dem Stand der Technik, das diesen Weg beschreitet, ist unter dem Namen Hybridoma-Technik bekannt. Es beruht auf der In-Vitro-Gewinnung von zellulären Hybriden, die durch Zellfusion von normalen Lymphozyten mit unbegrenzt lebens- u. teilungsfähigen Myelomzellen gewonnen werden. Die hierbei erzeugten Hybridom-Zellen weisen die Eigenschaften beider Elternzellen auf. Dementsprechend besitzen sie die Fähigkeit der Lymphozyten, Antikörper zu produzieren, und die Fähigkeit der Mylomzelle zur unbegrenzten Teilung und damit zur Produktion der Antikörper in großen Mengen.

Jede aus der Fusion resultierende Hybridzelle stellt monoklonale Antikörper her, dessen Spezifität von der ursprünglichen Lymphozyten-Zelle bestimmt wird. Die Hybridom-Zellen werden vermehrt und dann diejenigen selektiert, welche Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren. Die Kultivierung dieser Auswahl und deren Isolierung führt zu hochspezifisch reagierenden Antikörpern, welche nur mit einer bestimmten antigenen Determinante reagieren. Monoklonale Antikörper, welche spezifisch an Antigene von Tumoren binden, eröffnen daher vielversprechende Möglichkeiten für Diagnose und Therapie von Tumorzellen.

Zur Verbesserung der Verfahren und Mittel im Kampf gegen Krebs besteht daher der Bedarf an derartigen monolonalen Antikörpern. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen humanen monoklonalen Antikörper, Verfahren zu dessen Herstellung und aus dem Antikörper abgeleitete Dignostika und Arzneimittel anzugeben, die eine hohe Spezifität für Antigene verschiedener Tumore aufweisen und sich daher für eine tumorspezifische Therapie und Dignose gut eignen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe hinsichtlich des monoklonalen Antikörpers dadurch gelöst, daß
wenigstens eine variable Region der leichten Ketten substanziell jeweils die in Anlage 2 und/oder der schweren Ketten substanziell je weils die in Anlage 1 wiedergegebene Aminosäure-Sequenz aufweisen.

Aus chemischer Sicht sind Antikörper Immunglobulin-Moleküle. Diese Moleküle weisen jeweils zwei identische leichte und zwei identische schwere Ketten auf, die durch Disulfid-Brücken miteinander verbunden sind. Jede der Ketten enthält eine Region von etwa 110 Aminosäuren mit variabler Sequenz, während der verbleibende Rest jeder Kette einen Bereich mit konstanter Sequenz aufweist. Die variablen Regionen von leichter und schwerer Kette ihrerseits umfassen jeweils mehrere hypervariable Regionen, welche für die Bindung der Antigene verantwortlich sind. Die spezielle Ausbildung der hypervariablen Regionen bestimmen daher die spezifischen Eigenschaften des Antikörpers.

Wie klinische Tests belegen, begründet die Ausbildung der genannten variablen Bereiche des erfindungsgemäßen Antikörpers gemäß der angegebenen Aminosäuren-Sequenz eine hohe spezifische Wirksamkeit gegenüber den Antigenen der untersuchten Tumorzellen. Da die auf Tumorzellen auftretenden Antigene auf Normalzellen nicht vorhanden sind, zeigen vorliegende Antikörper gegenüber normalen Zellen erwartungsgemäß keine oder nur geringe Bindung.

Erfindungswesentlich ist die substanzielle Gleichheit einer der variablen Regionen der leichten oder der schweren Ketten mit der erfindungsgemäßen Sequenz. Die substanzielle Gleichheit bedeutet dabei eine überwiegende Übereinstimmung der genannten Bereiche. Geringfügige Modifikationen oder Substitutionen der Ketten sind in vorliegender Erfindung mit eingeschlossen, sofern der monoklonale Antikörper oder der funktionelle Teil davon tumorspezifische Eigenschaften beibehält.

Tumorspezifische monoklonaler Antikörper nach dem Stand der Technik betreffen in der überwiegenden Zahl der Fälle von Mäusen hergeleitete Antikörper. Jene Antikörper weisen in nachteiliger Weise jedoch eine stark eingeschränkte Einsatzmöglichkeit auf, da Mausantikörper bei Anwendung auf den Menschen durch dessen Immunsystem als Fremd-protein erkannt und neutralisiert werden können noch bevor sie ihre therapeutische Wirkung entfalten.

Die Erfindung geht demgegenüber von humanen monoklonalen Antikörpern aus, welche diese Beschränkungen bei Einsatz in der Humanmedizin nicht aufweisen. Diese Antikörper weisen Sequenzen der hypervariablen Kettenbereiche auf, die substanziell denen von menschlichem Immunglobulin entsprechen. Die Antikörper können daher nach Erkennung der Determinanten oder Epitope der ihnen entsprechenden Antigene ungehindert an den betreffenden Zellen anbinden, ohne daß eine Abwehrreaktion des Immunsystems erfolgt. Bei einer Kopplung der erfindungsgemäßen Antikörper mit diagnostischen und therapeutischen Mitteln sind vorliegende Antikörper somit in vorteilhafter Weise zur Früherkennung und effektiven Behandlung von Tumoren unterschiedlicher Art geeignet.

Bei der Lösung der Aufgabe hinsichtlich des Herstellungsverfahrens wird vorgeschlagenen, die humanen monoklonalen Antikörpers vorzugsweise mittels der Hybridoma-Technik zu erzeugen. Gemäß einem Merkmal der Erfindung werden hierzu B-Lymphozyten aus einem lymphatischen Organ, vorzugsweise der Milz oder des Lymphknotens, eines Karzinom-Patienten entnommen. Diese Lymphozyten sind infolge des vorhandenen Karzinoms zur Bildung derjenigen Antikörpern stimuliert, welche speziell auf die Antigene der vorliegenden Tumorzellen reagieren.

Die Lymphozyten werden in vitro jeweils mit einer Myelom-Zelle fusioniert. Gemäß vorliegender Erfindung werden hierbei die Heteromyelomzellen HAB-1 sowie deren Subklone verwendet. Die Heteromyelomzelle HAB-1 ist spezifiziert in der Literatur: Faller, G et al., HAB-1, BrJCancer 62, 595-8 (1990). Gleichermaßen können Subklone der HAB-1-Zelle Verwendung finden, die als HAB-1.X bezeichenbar sind. Die entstandenen Zellklone besitzen wie die originären B-Lymohozyten die Eigenschaft, Antikörper zu produzieren. Die Spezifität dieser Antikörper wird dabei durch die ursprüngliche Lymphozyten-Zelle bestimmt. In vorliegendem Fall bedeutet dies, daß auch die von den Zellklonen produzierten Antikörper mit den Antigenen des speziell vorliegenden Tumors korrespondieren. Nach Se lektion derjenigen Zellen, die jeweils Antikörper der gewünschten Spezifität synthetisieren, werden diese Zellen kultiviert und dabei von jeder der Hybridzellen jeweils monoklonale Antikörper in unbegrenzter Menge produziert.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung werden bei dem vorgeschlagenen Verfahren insbesondere Lymphozyten von Patienten entnommen, die ein Karzinom des

– Magen
– Dickdarm
– Lunge
– Bauchspeicheldrüse
– Speiseröhre
– Prostata
– Brust

aufweisen.

Neben einer Herstellung der vorliegenden humanen monoklonalen Antikörper durch die Hybridoma-Technik schließt die Erfindung auch andere Herstellungsmethoden ein. Vorgeschlagen wird, insbesondere bei der Herstellung kleinerer funktioneller Fragmente, die direkte Synthese mittels der dem Fachmann bekannten Rekombinanten-Methode oder der Herstellung mittels der bekannten Phagenbankmethode (phage display).

Die Vermehrung erfolgt unter Anwendung der bekannten Polymerase Ketten Reaktion (Polymerase chain reaction = PCR).

Das PCR-Verfahren ist dem Fachmann bekannt, beispielsweise aus dem US-Patent 4,683,195. Es dient der gezielten Vervielfältigung eines spezifischen DNA-Fragments und wird mit Vorteil dann angewandt, wenn DNA-Abschnitte nur in geringen Spuren vorliegen. Das Verfahren ermöglicht, eine bekannte DNA-Sequenz unter einer Vielzahl ähnlicher Sequenzen zu erkennen und in vitro in kurzer Zeit stark zu vermehren. Hierbei kann eine spezielle DNA-Sequenz innerhalb einer Zeitspanne von ca. 3 h etwa 100.000fach vervielfältigt werden.

Bei Anwendung des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung der erfindnungsgemäßen monoklonalen Antikörper, oder von funktionellen Fragmentes davon, wird RNA der Hybridomzellen, die tumorspezifische monoklonale Antikörper produzieren, in vitro mittels reverser Transcriptase in komplementäre doppelsträngige cDNA umkopiert. Anschließend wird die cDNA, welche funktionelle Fragmente der variablen Bereiche der leichten und schweren Ketten enthält, mittels PCR vervielfältigt. Die PCR-Produkte werden gereinigt, extrahiert und anschließend kloniert.

Der Aufbau des konstanten Bereichs der schweren Kette eines Antikörpers bestimmt dessen Isotyp und legt die Effektor-Funktion des Antikörpers fest. Bei Immunglobulin besteht die konstante Region der schweren Ketten aus einer der fünf in der Literatur mit μ, γ, δ, α oder ε bezeichneten Sequenzen, die konstante Region der leichten Ketten aus einer der Sequenzen κ oder λ. Der unterschiedliche Aufbau der schweren Ketten führt zu den fünf Immunglobilin-Klassen IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Die Antikörper gemäß vorliegender Erfindung gehören in der Regel der Klasse IgM an, wobei sowohl leichte Ketten der Klasse λ als auch κ auftreten können. Ebenso ist eine Ausbildung des Antikörpers gemäß Klasse IgG vorgesehen.

Die Erfindung umfaßt monoklonale Antikörper als auch funktionelle Fragmente davon. Dabei ist die Funktionalität der genannten Fragmente dadurch gekennzeichnet, daß sie Eigenschaften des Antikörpers aufweisen. Diese können beispielsweise darin bestehen, daß sie eine Bindungsfähigkeit gegenüber Antigenen oder eine Spezifität für Tumorzellen besitzen, oder aufgrund des Aufbaus ihres konstanten Bereichs eine Effektor-Funktion aufweisen. Gemäß einem Merkmal der Erfindung sind insbesondere Fragmente einbezogen, welche gemäß bekannter Nomenklatur (z. B. Cell Biophysics, 22 (1993), S. 189 – 224) einer der Gruppen
V_L, V_H, Fv, Fc, Fab, Fab', F(ab')₂
angehören. Dabei umfaßt die Gruppe
V_L Fragmente, welche den variablen oder den variablen und konstanten Bereich der leichten Ketten einschließen
V_H Fragmente, welche den variablen Bereich oder den variablen und den konstanten Bereich der schweren Ketten einschließen
Fv Fragmente, welche die variablen Regionen der schweren und der leichten Ketten oder Teile davon einschließen
Fc Fragmente, welche die konstanten Regionen der schweren Ketten oder Teile davon einschließen
Fab Fragmente, welche größer als die Fragmente der Gruppe Fv sind
Fab' Fragmente, welch größer als die Fragmente der Gruppe Fab sind
F(ab')₂ Fragmente, welche die variablen Bereiche beider schwerer und beider leichter Ketten oder Teile davon enthalten und optional die ersten konstanten Bereiche beider schweren Ketten oder Teile davon.

Durch Verwendung der genannten Fragmente ist es möglich, spezielle Anforderungen für bestimmte Anwendungen zu realisieren. Eine Anpassung der Eigenschaften des Antikörpers oder dessen funktioneller Fragmente läßt sich gemäß einem Merkmal der Erfindung auch dadurch erreichen, daß einzelne Aminosäure-Gruppen substituiert und/oder hinzugefügt und/oder entfernt sind. Eingriffe dieser Art führen dazu, daß beispielsweise die Stabilität oder die Selektivität des Antikörpers bzw. dessen funktioneller Fragmente modifiziert werden, dessen globalen Eigenschaften, wie beispielsweise die Bindungsfähigkeit gegenüber Tumor-Antigenen, jedoch erhalten bleiben.

Die Antikörper bzw. deren funktionelle Fragmente gemäß vorliegender Erfindung können mit weiteren Wirkstoffen verbunden werden. Durch eine Ankopplung derartiger Substanzen werden die Anwendungsbereiche des vorliegenden Antikörpers wesentlich erweitert. Insbesondere lassen sich die humanen monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung hierdurch für diagnostische Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen und für therapeutische Verfahren zur Bekämpfung von Tumorzellen einsetzen.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung sind insbesondere folgende Substanzen vorgesehen:

– eine radiaktive Substanz,
– und/oder ein Farbstoff,
– und/oder ein Enzym,
– und/oder ein Immunotoxin,
– und/oder ein Wachstumshemmer,

wobei diese Wirkstoffe

– zum qualitativen oder quantitativen Nachweis,
– zur Verringerung der Proliferation,
– zur Erzeugung der Apoptose
– zur Vermeidung von Metastasenbildung

von Tumorzellen dienen können.

Der Nachweis von Tumorzellen wird häufig mit dem Fachleuten unter dem Namen Immunoassay bekannten Verfahren geführt, dessen Grundlage die Antigen-Antikörper-Reaktion ist. Um aus dieser Reaktion quantitative Aussage gewinnen zu können, wird der Antikörper gemäß vorliegender Erfindung mit einer gut nachweisbaren Markierungssubstanz gekoppelt. Substanz und Kopplung sind dabei so gewählt, daß die immunologischen Eigenschaften der Komponenten weitgehend erhalten bleiben. Die bekanntesten Immunoassays sind Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay und Fluoreszenzimmunoassay. Im Ergebnis ermöglichen die an die Antikörper angekoppelten diagnostischen Substanzen empfindliche und zuverlässige Verfahren zur Früherkennung von Krebs.

Die genannten cytotoxischen Substanzen zielen auf eine Verminderung der Lebens- oder Teilungsfähigkeit der Tumorzellen. Sie bewirken alternativ eine Unterdrückung der DNA-Synthese, Unterdrückung der Zellteilung, Apoptose der Zellen oder einen nicht apoptotischen Zelltod. Sie bringen damit das Wachstum von Tumorzellen zum Stillstand oder bringen Tumorzellen zum Absterben.

Durch Kopplung der genannten Substanzen mit den selektiv gegen Krebszellen wirksamen Antikörpern gemäß vorliegender Erfindung lassen sich somit gezielt Tumore unterschiedlicher Art wirkungsvoll bekämpfen. Die Erfindung sieht hierbei insbesondere

– die Diagnose
– und/oder Prophylaxe
– und/oder Therapie

folgender Tumore vor:

– Karzinom des Dickdarm, der Bauchspeicheldrüse, der Prostata, der Gebärmutter, der Eileiter, der Nebenniere und/oder der Lunge,
– Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre oder der Lunge
– Magen-Karzinom
– duktales Karzinom der Brust.

Schließlich umfaßt vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel und ein Diagnostikum, die jeweils dadurch gekennzeichnet sind, daß deren Wirkstoffe den genannten monoklonalen Antikörper oder funktionelle Fragmente davon enthalten. Die genannten Mittel enthalten in der Regel weitere Zusatzstoffe, wie physiologische Lösungen, Lösungsmittel, Glycole, Öle oder dergl. im Stand der Technik bekannte Substanzen.

METHODEN, BEISPIELE UND EINZELHEITEN Antikörper PM-2

Schwere Kette (VH)

Aminosäure-Sequenz

siehe Anlage 1

DNA-Sequenz

siehe Anlage 1
Leichte Kette (VL)

Aminosäure-Sequenz

siehe Anlage 2

DNA-Sequenz

siehe Anlage 2

Methode 1 Immortalisierung von Lymphozyten und Primärtestung der Antikörper

Zur Immortalisierung werden die Lymphozyten mit einer Variante des Heteromyeloms HAB-1 nach Standardprotokoll fusioniert und kultiviert. Kurz zusammengefaßt, Lymphozyten werden mit HAB-1 Zellen mittels PEG verschmolzen. Die Triome werden auf vier 24-Lochplatten ausgesät. Die durchschnittliche Wachstumsfrequenz beträgt 80–90%, 50% der wachsenden Klone sezernieren Immunglobuline.

Die erste Austestung der sezernierten humanen monoklonalen Antikörper erfolgt im ELISA, um den Isotyp zu ermitteln. Der nächste Test ist eine immunhistochemische Färbung auf Cryoschnitten des autologen Tumors.

Benötigte Medien

– RPMI 1640 (Firma PAA) ohne Zusätze
– RPMI 1640 mit HAT-Zusatz (HAT-Suppilement, Firma PAA) sowie 10% FCS, 1% Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin

Immortialisierung

– HAB-1 (Fusionspartner) zweimal mit RPMI ohne Zusätze waschen
– zentrifugieren 5 min bei 1500 U/min
– eingefrorene Lymphozyten (aus Milz oder Lymphknoten) auftauen und zweimal mit RPMI ohne Zusätze waschen, ebenfalls zentrifugieren
– beide Pellets jeweils in 10 ml RPMI ohne Zusatz aufnehmen und in der Neubauer-Zählkammer zählen
– im Verhältnis von 1:2 – 1:3 HAB-1 zu Lymphozyten, fusionieren
– die Zellpellets nach dem zweiten Waschvorgang zusammen geben, mischen und 8 min bei 1500 U/min zentrifugieren
– das zuvor bei 37 °C aufgewärmte PEG (Polyethylene Glycol 1500, Firma Roche) vorsichtig tröpfelweise auf das Pellet unter leicht rotierenden Bewegungen des 50 ml Röhrchens laufen lassen
– leicht resuspendieren und dann genau 90 sek. im Wasserbad bei 37 °C rotieren lassen
– danach wir das PEG mit RPMI ohne Zusätze heraus gewaschen (zwei volle 10er Pipetten)
– zentrifugieren 5 min bei 1500 U/min
– 24-Well-Platten ausplattieren mit 1 ml pro Well RPMI mit HAT-Zusatz
– das Pellet lösen in RPMI mit HAT-Zusatz
– jeweils einen halben ml der Zellen in ein 24-Well pipettieren
– Fusionsplatten in den Brutschrank stellen
– wöchentlich Mediumwechsel mit RPMI mit HAT-Zusatz

Methode 2 Molekulare Charakterisierung der Antikörper

Zur Sequenzierung der monoklonalen Antikörper wird cDNA aus gesamt RNA (RNAse Kit, Quiagen) von Triomen hergestellt (M-MLV reverse transcriptase, Gibco). Anschließend werden die entsprechenden VH-Gene durch PCR-Amplifikation vervielfältigt (Tag Polymerase, MBI-Fermentas). Die PCR-Produkte werden über Gel-Elektrophorese gereinigt und extrahiert. Nach dem Klonieren der PCR-Produkte (pCR-Script Amp SK+cloning kit, Stratagene) werden die positiven Klone sequenziert (DyeDeoxy Termination cycle sequencing kit, Applied BioSystems). Die Sequenzen werden mit Hilfe von Dnasis für Windows, Genebank und V-Base Databases analysiert (Vollmers et al., 1998).

Immunhistochemische Charakterisierung

Antikörper, die mit dem autologen Tumor reagieren, werden auf einem Panel von Normalgeweben und Tumorgeweben im Immunperoxidase Test (Protokoll siehe unten) untersucht, um einen Überblick über die Reaktion des Antikörpers und die Verteilung des Antigens zu erhalten.

Antikörper, die spezifisch mit den Tumorzellen reagieren und nicht mit gesundem Gewebe, werden weiter untersucht. Zunächst auf Tumoren des gleichen Typs verschiedener Patienten, dann auf Tumoren anderer Organe und schließlich auf Normalgeweben. Eine nähere Charakterisierung des Antikörpers und des Antigens erfolgt nur. wenn das Reaktionsmuster des Antikörpers auf eine zumindest eingeschränkte Spezifität mit malignem Gewebe schließen läßt.

Immunperoxidasefärbung auf Kryoschnitten und Cytospins

– Objektträger (OT)
– OT's nach dem Schneiden mindestens 2 h trocknen lassen
– OT's 10 min in Aceton stellen
– 30 min trocknen lassen
– 3 × mit Tris-NaCI waschen und anschließend 5 min in Tris-NaCI stehen lassen
– mit 100 μl Milchpulver (3 % in PBS) absättigen für 15 – 30 min
– 3 × mit Tris-NaCI waschen
– 100 μl des jeweiligen 1. Antikörpers:
→ für negative Kontrolle RPMI
→ für positive Kontrolle CK8 1:50 mit BSA/PBS oder CAM 5.2 1:10 mit BSA/PBS (BSA 0,5%ig in PBS)
– 30 min inkubieren lassen
– 3 × mit Tris-NaCI waschen
– 100 μl des jeweiligen 2. Antikörpers:
→ Rabbit Anti Maus Peroxidase konjugiert 70 % PBS + 30% Humanserum + 1:50 AK
→ Rabbit Anti Human IgM Peroxidase konjugiert 70 % PBS + 30 % Kaninchenserum + 1:50 AK
– 30 min inkubieren lassen
– 3 × mit Tris-NaCI waschen
– OT's 10 min in PBS stellen
– 1 DAB-Tablette und 1 H₂O₂-Tablette in 1 ml Leitungswasser lösen
– 100 μl Substrat auf die OT's pipettieren und für 10 min inkubieren lassen
– mit Aqua dest. spülen
– OT's für 5 min in Hämalaun stellen
– 15 min fließend wässern
– OT's in Aqua dest. stellen und mit Glyceringelatine eindecken

IMMUNPEROXIDASEFÄRBUNG AUF PARAFFINSCHNITTEN Entparaffinierung

– Xylol 1 5 min
– Xylol 2 5 min
– 100% Ethanol 1 5 min
– 100% Ethanol 2 5 min
– Methanol (70 ml) + H₂O₂ (500 μl) 5 min
– 90% Ethanol 1 3 min
– 90% Ethanol 2 3 min
– 80% Ethanol 1 3 min
– 80% Ethanol 2 3 min
– 70% Ethanol 1 3 min
– 70% Ethanol 2 3 min

1 × mit Tris/NaCI waschen kochen: 300 ml dest. H₂O in den Schnellkochtopf, Citronensäure (pH 5,5) in den Einsatz füllen, Objektträger (OT) 5 min kochen 15 min blocken mit BSA/PBS, 150 μl pro OT 1 × mit Tris/NaCI waschen 1. Antikörper, 150 μl pro OT, 2,5 h in feuchter Kammer im Brutschrank inkubieren, 3 × mit Tris/NaCI waschen 2. Antikörper, 150 μl pro OT, 45 min in feuchter Kammer bei RT inkubieren 3 × mit Tris/NaCI waschen 10 min in PBS stehen lassen 10 min DAB, 150 μl pro OT 3 × mit H₂O waschen, dann 1 x mit dest. H₂O waschen 5 min mit Hämalaun färben 10–15 min fließend wässern mit dest. H₂O waschen mit Glyceringelatine eindeckeln

Färbungen auf Tumor-Geweben

Tumorgewebe wurden gefärbt, um beurteilen zu können, auf wie vielen Karzinomen die zu untersuchenden Antikörper eine Reaktion zeigen. PM-2 Färbungen auf Normalgewebe

Färbungen auf Tumorgewebe

Cell-Death-ELISA^PLUS (Firma Roche, Mannheim) Das Ausmaß der Apoptoseinduktion durch den Antikörper CM-1 wurde mit Hilfe des Cell Death Detection ELISA^PLUS analysiert. Dieser Test basiert auf dem Prinzip eines quantitativen Sandwich-Enzym-Immunoassays, bei dem Peroxidase-konjugierte murine monoklonale Antikörper eingesetzt werden, die gegen Histon- bzw. DNA-Komponenten gerichtet sind. Nach enzymatischer Umsetzung eines farblosen Substrates kann dann anhand der Farbintensität des Reaktionsproduktes die Menge der vorhandenen Nukleosomen und damit die relative Anzahl apoptotischer Zellen photometrisch bestimmt werden.

Hierzu werden 100 μl einer Zellsuspension (1.0 × 10⁵/ml) der verschiedenen Zell-Linien mit 100 μl der unverdünnten bzw. 1:1 verdünnten Antikörperüberstände in einer 96-Well-Platte für 24 h im Brutschrank bei 37 °C und 7% CO₂ inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Zellen 10 min lang bei 200 g zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und 200 μl Lysispuffer hinzugegeben, wodurch in den folgenden 30 min bei Raumtemperatur die Lyse der Zellen erfolgt. Nach erneutem Zentrifugieren werden jeweils 20 μl des Überstandes in Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten übertragen und dann 80 μl des Immunoreagentes (1/20 Anti-DNA- POD, 1/20 Anti-Histon Biotin, 18/20 Inmkubationspuffer) hinzupipettiert. Zusätzlich wird eine im Testkit enthaltene Positivkontrolle und ein Blank-Ansatz mitgeführt. Nachdem die Platten 2 Stunden lang bei ca. 250 rpm durchmischt worden sind, wird nach dreimaligem Waschen mit Inkubationspuffer (250 μl) 100 μl der ABTS-Lösung (1 ABTS-Tablette in 5 ml Substratpuffer) in jedes Well pipettiert. Nach erneutem Durchmischen spiegelt sich dann die Intensität der antikörperinduzierten Apoptose in einem intensiven grünen Farbniederschlag wider. Die Farbintensität wurde mit Hilfe eines ELISA-Readers bei λ = 415 nm gegen die Referenzwellenlänge von 490 nm vermessen und daraus die Intensität der antikörperinduzierten Apoptose errechnet.

CellDeathELISA Antikörper

PM-2

Zell-Linie

BXPC-3

Inkubationszeit

24 h

Nach 24stündiger Inkubation zeigte der untersuchte Antikörper PM-2 im Vergleich zu den Negativkontrollen eine ausgeprägte Apoptose-Indikation, wobei der Effekt bei PM-2 den der Negativkontrolle um das 1,46 überstieg.

MTT-Test

– Zellen trypsinisieren und in 10 ml RPMI-Vollmedium (RPMI-1640, 10% FCS, 1% Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin) resuspendieren
– Zellen zählen und auf 1 × 10⁶ Zellen pro ml verdünnen
– in eine 96-Well-Platte 50 μl Zellsuspension pro Well pipettieren, (erste Reihe freilassen!), d. h. pro Well liegt eine Zellzahl von 5 × 10⁴ Zellen vor
– pro Well 50 μl Antikörper (verschiedene Verdünnungen in Vollmedium) hinzufügen
– 96-Well-Platte 24 h bzw. 48 h im Brutschrank inkubieren
– 50 μl MTT-Lösung in jedes Well pipettieren
– Platte 20 min im Brutschrank inkubieren
– Platte anschließend 10 min bei 2800 rpm zentrifugieren und den Überstand absaugen
– 150 μl DMSO pro Well hinzufügen und das Zellpellet resuspendieren
– Absorption bei einer Wellenlänge von 540 nm und 690 nm im ELISA-Reader bestimmen.

MTT

3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (SIGMA), 5 mg/ml in PBS lösen.

MTT-Test Antikörper

PM-2

Zell-Linie

BXPC-3 (Pankreas-Karzinom)

Inkubationszeit

24 h

Antikörper

PM-2

Zell-Linie

BXPC-3 (Pankreas-Karzinom)

Inkubationszeit

48 h

Claims

Humaner monoklonaler Antikörper mit schweren und leichten Kettenmolekülen, die jeweils einen von Antikörper zu Antikörper konstant und einen von Antikörper zu Antikörper variabel aufgebauten Bereich aufweisen, oder funktionelles Fragment davon, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine variable Region der leichten Ketten substanziell jeweils die in Anlage 2 und/oder der schweren Ketten substanziell jeweils die in Anlage 1 wiedergegebene Aminosäure-Sequenz aufweist.
Verfahren zur Herstellung des humanen monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes davon nach Anspruch 1 mittels der Hybridoma-Technik, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridom-Zellen durch Fusion der Heteromyelomzellen HAB-1 sowie deren Subklone mit B-Lymphozyten gewonnen werden, welche aus einem lymphatischen Organ, vorzugsweise der Milz oder Lymphknoten, eines Karzinom-Patienten entnommen sind.
Verfahren zur Herstellung des humanen monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes davon nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Lymphozyten einem Patient mit einem Karzinom des Magen, Dickdarm, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Prostata, Brust entnommen sind.
Verfahren zur Herstellung des humanen monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er/es mittels der Rekombinanten-Methode hergestellt wird.
Verfahren zur Herstellung des humanen monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er/es mittels der Gentechnologie hergestellt wird, unter Anwendung von Phagenbanken (phage display-Methode).
Humaner monoklonaler Antikörper oder funktionelles Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 – 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufbau der konstanten Region der schweren Ketten dem von Immunglobulin M oder G (IgM oder IgG) entspricht.
Humaner monoklonaler Antikörper oder funktionelles Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 – 6, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte funktionelle Fragment einer der Gruppen V_L V_H Fv Fc Fab Fab' F(ab')₂ angehört.
Humaner monoklonaler Antikörper oder funktionelles Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 – 7, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Aminosäure-Gruppen substituiert, und/oder hinzugefügt, und/oder entfernt sind.
Humaner monoklonaler Antikörper oder funktionelles Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 – 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Substanz angekoppelt ist, insbesondere eine radioaktive Substanz, und/oder ein Farbstoff, und/oder ein Enzym, und/oder ein Immunotoxin, und/oder ein Wachstumshemmer.
Humaner monoklonaler Antikörper oder funktionelles Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 – 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite Substanz angekoppelt ist, insbesondere zum qualitativen oder quantitativen Nachweis, zur Verringerung der Proliferation, zur Erzeugung der Apoptose zur Vermeidung von Metastasenbildung von Tumorzellen.
Verwendung des monoklonalen Antikörpers oder eines funktionellen Fragmentes davon nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Bekämpfung von Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß es/er zur Diagnose und/oder zur Prophylaxe und/oder zur Therapie insbesondere folgender Tumore eingesetzt wird: Karzinom des Dickdarm, der Bauchspeicheldrüse, der Prostata, der Gebärmutter, der Eileiter, der Nebenniere und/oder der Lunge, Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre oder der Lunge Magen-Karzinom duktales Karzinom der Brust.
Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß dessen Wirkstoff den genannten monoklonalen Antikörper oder funktionelle Fragmente davon enthält.
Diagnostikum, dadurch gekennzeichnet, daß dessen Wirkstoff den genannten monoklonalen Antikörper oder funktionelle Fragmente davon enthält.