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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Verfahren zur Verbesserung der Messergebnisse in der Scanmikroskopie.
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Weiterhin betrifft die Erfindung
ein Scanmikroskop.
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In der Scanmikroskopie wird eine
Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte
Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines
Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung,
im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene
bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen,
so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die
Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird
in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird
ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen
abgetastet.
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Ein konfokales Rastermikroskop umfasst
im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das
Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen
Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem
Objekt idealer Weise einen Mäander
beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position,
anschließend
x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung
auf die nächste
abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position,
diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.). Die Abtastung
der Zeile erfolgt mit einer Zeilen-Abtastfrequenz. Nach dem Durchlaufen
des Mäanders
erfolgt in der Regel ein erneutes Abtasten, wobei die Abtastbahn
entweder in umgekehrter Richtung durchlaufen wird (bidirektionale
y-Abtastung) oder zunächst
wieder die ursprüngliche
Anfangsposition angefahren wird, um die Abtastbahn in derselben Richtung
erneut zu durchlaufen. Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen,
wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht
verschoben und so die nächste
abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes
wird in festen Zeitabständen
während
des Abtastvorganges gemessen und so Rasterpunkt für Rasterpunkt
abgetastet. Der Messwert muss eindeutig der dazugehörigen Abtastposition
zugeordnet werden, um aus den Messdaten ein Bild erzeugen zu können. Zweckmäßiger Weise
werden hierfür
die Zustandsdaten der Verstellelemente der Strahlablenkeinrichtung
laufend mitgemessen oder, was allerdings weniger genau ist, direkt
die Steuersolldaten der Strahlablenkeinrichtung verwendet.
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Die genaue Zuordnung der Positionssignale zu
den Detektionssignalen ist von besonderer Wichtigkeit. Bei der Zuordnung
sind Laufzeitunterschiede und die unterschiedlichen Verarbeitungszeiten
der die Signale erfassenden Detektoren, beispielsweise mit Hilfe
von Verzögerungselementen,
zu berücksichtigen.
Hierbei müssen
sehr hohe Anforderungen an die Stabilität gestellt werden.
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In der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 100 37 783.1 ist ein
Verfahren und einer Vorrichtung zur Phasenkorrektur von Positions-
und Detektionssignalen in der Scanmikroskopie offenbart. Das Verfahren
umfasst die Schritte: Erzeugen eines Positionssignals aus der Stellung
einer Strahlablenkeinrichtung und Erzeugen eines zum Positionssignal
gehörenden
Detektionssignals aus dem vom Objekt ausgehenden Licht. Anschließend wird
Positionssignals und Detektionssignals an eine Verarbeitungseinheit übergeben.
In der Verarbeitungseinheit wird ein Korrekturwert ermittelt, der
an einen Rechner zum Abgleich von Zeitdifferenzen zwischen dem Positionssignal
und dem Detektionssignal übergeben.
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Die Abtastbahn weicht bei zunehmend
höherer
Abtastgeschwindigkeit mehr und mehr von der Mäanderform ab. Dieses Phänomen ist
im Wesentlichen auf die Massenträgheit
der bewegten Elemente zurückzuführen. Bei
schnellem Abtasten ähnelt
die Abtastbahn eher einer Sinuskurve, wobei es jedoch oft vorkommt,
dass sich die Teil-Bahnkurve für
die Zeilen-Abtastung in positive x-Richtung von der Teil-Bahnkurve bei
der Abtastung in negative x-Richtung unterscheidet. Dies führt bei
bidirektionalem Zeilen-Abtasten zu erheblichen Bildstörungen,
die sich insbesondere in störenden
Streifenmustern zeigen. Analog ergibt sich das gleiche Problem bei
bidirektionaler Y-Abtastung.
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Die beschriebenen Abweichungen von
der Idealbahn und die bei höheren
Abtastfrequenzen, insbesondere bei bidirektionaler y-Abtastung,
auftretenden Abgleichsfehler führen
zu Rasterfehlern im Bild. Ganz besonders störend zeigen sich diese Abgleichfehler
bei mäanderförmiger Abtastung;
denn der Abgleichfehler bei Abtastung in positiver y-Richtung und
bei Abtastung in negativer y-Richtung wirken in entgegengesetzten
Richtungen, was zu verzerrten, gestauchten oder gedehnten als auch
zu entlang der y-Achse alternativ verschobenen Bildern führt.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe
zugrunde, ein Verfahren zur Scanmikroskopie anzugeben, das auch
bei höheren
Abtastfrequenzen und insbesondere bei bidirektionaler Abtastung
zu von diesen Fehlern bereinigten Messergebnissen führt.
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Die Aufgabe wird durch ein Verfahren
gelöst, dass
durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
- – Führen eines
Beleuchtungslichtstrahls über
eine Probe mit einer Strahlablenkeinrichtung, die den Beleuchtungslichtstrahl
periodisch mit mindestens einer Ablenkfrequenz in mindestens einer Richtung
ablenkt,
- – Detektieren
des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes in Abhängigkeit
von der Zeit mit einem Detektor und Erzeugen von Detektionssignalen,
- – Ermitteln
der zeitlichen Funktion der Amplitude der Detektionssignale,
- – Errechnen
der Funktion der Amplitude der Detektionssignale im Frequenzraum
durch Bilden der Fouriertransformierten der zeitlichen Funktion,
- – Korrigieren
der Amplitude derjenigen Detektionssignale, die zur Ablenkfrequenz
korrespondieren und
- – Errechnen
einer korrigierten zeitlichen Funktion der Amplitude der Detektionssignale
durch Bilden der inversen Fouriertransformierten.
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Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung ein
Scanmikroskop anzugeben, mit dem bei höheren Abtastfrequenzen und
insbesondere bei bidirektionaler Abtastung eine Verbesserung der
Messergebnisse erzielbar ist.
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Diese Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop
mit
- – einer
Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl zur Beleuchtung einer
Probe emittiert,
- – einer
Strahlablenkeinrichtung zum Führen
des Beleuchtungslichtstrahls über
die Probe, wobei die Strahlablenkeinrichtung den Beleuchtungslichtstrahl
periodisch mit mindestens einer Ablenkfrequenz in mindestens einer
Richtung ablenkt,
- – einem
Detektor, der Detektionssignale des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes
in Abhängigkeit
von der Zeit erzeugt und
- – einer
Verarbeitungseinheit zum Ermitteln der zeitlichen Funktion der Amplitude
der Detektionssignale, zum Errechnen der Funktion der Amplitude
der Detektionssignale im Frequenzraum, zum Korrigieren der Amplitude
derjenigen Detektionssignale, die zur Ablenkfrequenz korrespondieren, und
zum Errechnen einer korrigierten zeitlichen Funktion der Amplitude
der Detektionssignale durch Bilden der inversen Fourierfransformierfen,
gelöst.
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Die Erfindung hat den Vorteil, dass
eine Verbesserung der Messergebnisse ohne Abänderung der eigentlichen Strahlablenkeinrichtung
insbesondere bei höheren
Abtastfrequenzen und bei bidirektionaler Abtastung ermöglicht ist.
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In einer bevorzugen Ausgestaltung
ertolgt das Führen
des Beleuchtungslichtstrahls über
einen oder mehrere auswählbare
Teilbereiche der Probe. Vorzugsweise erfolgt das Abtasten sowohl
in x-Richtung, als auch in y-Richtung bidirektional entlang einer
möglichst
mäanderförmigen Abtastbahn.
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Das von der Probe ausgehende Detektionslicht
wird in Abhängigkeit
von der Zeit mit einem Detektor detektiert. Vorzugsweise erfolgt
das Detektieren taktweise, wobei auf die Detektion des von einem Rasterpunkt
ausgehenden Detektionslichtes jeweils eine vorgebbare Anzahl von
Zeittakten erfolgt. Aus den gemessenen Amplituden der Detektionssignale, die
zu den Rasterpunkten innerhalb eines vom Benutzer vorgegebenen Bereichs
gehören,
werden in einer bevorzugen Ausführungsform
die Mittelwerte gebildet, so dass man eine Information über die
zeitliche Funktion der mittleren Amplitude der Detektionssignale
innerhalb des vom Benutzer vorgegebenen Bereichs erhält. Durch
Errechnen der Funktion der mittleren Amplitude der Detektionssignale
im Frequenzraum, durch Bilden der Fouriertransformierten der zeitlichen
Funktion der mittleren Amplitude, durch Korrigieren der mittleren
Amplitude derjenigen Detektionssignale, die zur Ablenkfrequenz korrespondieren,
und durch Errechnen einer korrigierten zeitlichen Funktion der mittleren
Amplitude der Detektionssignale durch Bilden der inversen Fouriertransformierten,
erhält
man insbesondere für
den vorgegebenen Bereich eine besonders gesteigerte Qualität der Messergebnisse.
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Das Verfahren ist u.a. bei der Auswertung der
Messergebnisse nach Abtastung eines einzelnen Rasterpunkts, nach
der Abtastung einer Zeile (x-Abtastung),
eines vorgebbaren Bereichs oder nach der Abtastung des gesamten
Bildfeldes einsetzbar.
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In einer bevorzugten Variante ist
vorgesehen, dass die Detektionssignale, die zu anderen störenden Frequenzen
korrespondieren, die beispielsweise durch Vibrationen von elektrisch
betriebenen Komponenten des Scanmikroskops verursacht werden, korrigiert
werden. Auf diese Weise können
u.a. die negativen Auswirkungen des von Transformatoren verursachte
50 Hz-Brummen auf
die Messergebnisse weitgehend vermieden werden.
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Bei der Abtastung einer einzelnen
Zeile wird insbesondere die Amplitude derjenigen Detektionssignale,
die zur Zeilen-Ablenkfrequenz korrespondieren, korrigiert. Bei der
Abtastung einer Ebene wird insbesondere die Amplitude derjenigen
Detektionssignale, die zur Zeilen-Ablenkfrequenz korrespondieren
und derjenigen Detektionssignale, die zur Bild-Ablenkfrequenz korrespondieren,
korrigiert.
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In einer besonderen Ausführungsform
beinhaltet das Korrigieren eine Glättung der Funktion der Amplitude
der Detektionssignale im Frequenzraum, was beispielsweise durch
Angleichung an die Amplitude benachbarter Frequenzen realisiert
werden kann. In einer anderen Variante beinhaltet das Korrigieren
ein Verwerfen der Detektionssignale, die zur Ablenkfrequenz korrespondieren.
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In einer ganz besonders bevorzugen
Ausgestaltung ist das Scanmikroskop ein konfokales Scanmikroskop.
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In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand
schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend
beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen
versehen sind. Dabei zeigen:
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1 Ein
erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
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2 die
zeitliche Funktion der mittleren Amplitude von Detektionssignalen,
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3 die
Funktion der mittleren Amplitude der Detektionssignale im Frequenzraum
und
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4 eine
korrigierte zeitliche Funktion der mittleren Amplitude der Detektionssignale.
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1 zeigt
schematisch ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
das als konfokales Scanmikroskop ausgeführt ist. Der von einer Lichtquelle 1,
die als Laser 3 ausgeführt
ist, kommende Beleuchtungslichtstrahl 5 wird mit Hilfe
der Optik 9 auf die Beleuchtungslochblende 11 fokussiert.
Nach Passieren der Beleuchtungslochblende 11 wird der Beleuchtungslichtstrahl 5 von
einem Strahlteiler 13 zu einer Scanspiegeleinheit 15,
die den Beleuchtungslichtstrahl 5 durch die Scanoptik 17,
die Tubusoptik 19 und das Objektiv 21 hindurch über bzw.
durch die Probe 23 führt.
Die Probe ist mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Der
Beleuchtungslichtstrahl 5 wird bei nicht transparenten
Proben 23 über
die Probenoberfläche
geführt.
Bei biologischen Proben 23 (Präparaten) oder transparenten
Proben kann der Beleuchtungslichtstrahl 5 auch durch die
Probe 23 geführt
werden. Der von der Probe 23 ausgehende Detektionslichtstrahl 25 gelangt
durch das Objektiv 21, die Tubusoptik 19 und die
Scanoptik 17 hindurch und über die Scanspiegeleinheit 15 zum
Strahlteiler 13, passiert diesen und trifft nach Passieren
der Detektionsblende 27 auf einen Detektor 29,
der hier als Photomultiplier ausgeführt ist. Im Detektor 29 werden elektrische,
zur Leistung des vom Objekt ausgehenden Detektionslichtes 25 proportionale
Detektionssignale erzeugt und an die Verarbeitungseinheit 31 weitergegeben.
An der Scanspiegeleinheit 15 ist ein induktiv arbeitender
Positionssensor 7 (kapazitiv ist auch möglich) zur Ermittlung der Positionssignale
angebracht.
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Die ermittelten Positionssignale
werden an die Verarbeitungseinheit 31 weitergegeben. Dort
erfolgt eine Zuordnung zu den Detektionssignalen. Es ist für einen
Fachmann selbstverständlich,
dass die Positionssignale auch über
die Verstellsignale ermittelt werden können. In der Verarbeitungseinheit
wird die zeitliche Funktion der Amplitude der Detektionssignale
ermittelt und die Funktion der Amplitude der Detektionssignale im
Frequenzraum durch bilden der Fouriertransformierten errechnet.
Anschließend
wird in der Verarbeitungseinheit die Amplitude derjenigen Detektionssignale,
die zur Zeilen-Ablenkfrequenz und zur Bild-Ablenkfrequenz korrespondieren
durch Glätten
oder Verwerfen korrigiert und eine korrigierte zeitliche Funktion
der Amplitude der Detektionssignale durch Bilden der inversen Fouriertransformierten
errechnet.
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Die korrigierten Detektionssignale
werden von der Verarbeitungseinheit an einen PC 33 weitergegeben
und als Graf, z.B. in der Form I(t), zeitlicher Funktion
der mittleren Amplitude von Detektionssignalen, oder als korrigierter
Datensatz, z.B. als Bild, auf dessen Monitor 35 dargestellt.
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2 zeigt
die zeitliche Funktion der mittleren Amplitude von Detektionssignalen
einer Abtastzeile dargestellt in einem Koordinatensystem, bei dem
auf der Abszisse die Zeit t und auf der Ordinate die Amplitude I(t)
in beliebigen Einheiten aufgetragen ist.
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3 zeigt
die Funktion der mittleren Amplitude der Detektionssignale im Frequenzraum,
dargestellt in einem Koordinatensystem, bei dem auf der Abszisse
die Frequenz υ und
auf der Ordinate die Amplitude I(υ)
in beliebigen Einheiten aufgetragen ist. Es ist deutlich eine Erhöhung im
Bereich der Zeilen-Abtastfrequenz υA zu
erkennen. Diese Überhöhung wird
durch Glätten
korrigiert und an die Amplituden der Nachbarfrequenzen angepasst.
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4 zeigt
die korrigierte zeitlichen Funktion der mittleren Amplitude der
Detektionssignale, dargestellt in einem Koordinatensystem, bei dem
auf der Abszisse die Zeit t und auf der Ordinate die Amplitude I(t)
in beliebigen Einheiten aufgetragen ist. Die durch Abweichungen
von der Idealabtastbahn und durch Abgleichfehler hervorgerufenen
Störungen sind
weitgehend unterdrückt.
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Die Erfindung wurde in Bezug auf
eine besondere Ausführungsform
beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Lichtquelle
- 3
- Laser
- 5
- Beleuchtungslichtstrahl
- 7
- Positionssensor
- 9
- Optik
- 11
- Beleuchtungslochblende
- 13
- Strahlteiler
- 15
- Scanspiegeleinheit
- 17
- Scanoptik
- 19
- Tubusoptik
- 21
- Objektiv
- 23
- Probe
- 25
- Detektionslichtstrahl
- 27
- Detektionsblende
- 29
- Detektor
- 31
- Verarbeitungseinheit
- 33
- PC
- 35
- Monitor