DE10227611A1 - Replication and differentiation of cells in vitro, useful e.g. for wound healing and tissue reconstruction, uses specific growth factors to initiate, end and structurally control growth - Google Patents

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Abstract

Replicating and differentiating cells in vitro in which the growth process is initiated or terminated and structurally controlled by use of the growth factors (GF) thrombopoietin (TPO); erythropoietin (EPO); growth hormone (GH, preferably human); somatostatin; leukemia inhibitory factor (LIF) and/or ciliary neurotrophic factor (CNTF), is new. Independent claims are also included for the following: (1) biological matrix or carrier structure (A) containing at least one of the specified GF; (2) preparing (A) by coating an optionally activated matrix or carrier with GF; and (3) device for performing the new methods. ACTIVITY : Osteopathic; Cardiant; Dermatological; Hepatotropic; Uropathic; Vulnerary; Antiinflammatory; Antidiabetic; Antiulcer; Vasotropic; Opthalmological. No biological data given. MECHANISM OF ACTION : Tissue Replacement Therapy.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem Wachstumsfaktor in isolierter Form zur Kultivierung von primär differenzierten Zellen, zur lokal spezifischen und/oder gerichteten Differenzierung adulter Zellen und/oder zur Regeneration von Knochen, Geweben und/oder endokriner Organe.The present invention relates to the use of at least one growth factor in isolated Form for cultivating primary differentiated cells, for locally specific and / or targeted Differentiation of adult cells and / or for the regeneration of bones, Tissues and / or endocrine organs.

In der Ontogenese, also der Keimesentwicklung des Einzelwesens, werden Wachstumsfaktoren exprimiert, die grundlegende strukturelle und hinsichtlich der Zellzahl numerische Prozesse auslösen können. Im wachsenden Organismus geht die Fähigkeit zu strukturellen Reparaturen durch Regeneration zunehmend verloren, da diese Wachstumsfaktoren nicht mehr exprimiert werden. Faktoren des Knochenmarks bzw. der blutbildenden Organe sind während spezifischen ontogenetischen Prozessen an Wachstumsprozesse anderer Organe zeitlich gekoppelt.In ontogenesis, i.e. the development of germs of the individual, growth factors are expressed, the basic ones can trigger structural and numerical processes with regard to the number of cells. in the growing organism is the ability structural repairs due to regeneration increasingly lost, because these growth factors are no longer expressed. factors of the bone marrow or the blood-forming organs are during specific ontogenetic processes in growth processes of other organs in time coupled.

Ein Nachteil bekannter Wachstumsfaktoren, wie z.B. "Epidermal Growth Factor" (EGF), "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF) oder "Hepatocyte Growth Factor" (HGF), ist dass die Vermehrungsprozesse, insbesondere beim Einsatz primärer Zellen in vitro limitiert sind und dass der Einsatz in vivo wegen möglicher Nebenwirkungen, wie z.B. der Aktivierung von Onkogenen , problematisch ist.A disadvantage of known growth factors, such as e.g. "Epidermal Growth Factor "(EGF)," Vascular Endothelial Growth Factor "(VEGF) or "Hepatocyte Growth Factor "(HGF) that the multiplication processes, especially when using primary cells are limited in vitro and that use in vivo because of possible Side effects such as the activation of oncogenes, problematic is.

Bisher wurde angenommen, dass Gewebeextrakte, wie z.B. aus der Hypophyse oder dem Hypothalamus, besonders geeignet sind, eine Zellvermehrung bei Hepatozyten zu bewirken (siehe z.B. U.S. 6,008,047 ). Derartige tierische oder gelegentlich humane Extrakte wurden bereits Zellkulturen zugegeben. Die Verwen dung tierischer oder humaner Gewebeextrakte ist vor dem Hintergrund übertragbarer viraler Erkrankungen, wie z.B. BSE, Schweine- oder Schaf-Viren, im Laborbetrieb oder in der klinischen Anwendung jedoch problematisch. Die Verwendung derartiger Extrakte dokumentiert das mangelnde Wissen der eigentlich relevanten Faktoren und deren Einsatz- und Wirkpotentiale. Ein weiterer wesentlicher Nachteil ist, dass durch derartige heterogene Extrakte, die im allgemeinen schwer definierbar sind und erheblich von der verwendeten Quelle abhängen, auch Faktoren in die Kultur eingebracht werden, die unter Umständen bei einer klinischen Anwendung unerwünschte Nebenwirkungen oder Eigenschaften bewirken. Die genaue Kenntnis der Faktoren und deren kontrollierten Gabe wäre daher sowohl ein wichtiger Faktor, um Zellen, insbesondere im Bereich des Tissue Engineering, entsprechend vermehren und differenzieren zu können als auch um strukturelle Prozesse der dreidimensionalen (3-D) Regeneration zu induzieren.So far it has been assumed that tissue extracts, such as those from the pituitary or hypothalamus, are particularly suitable for causing cell proliferation in hepatocytes (see e.g. US 6,008,047 ). Such animal or occasionally human extracts have already been added to cell cultures. The use of animal or human tissue extracts is problematic against the background of communicable viral diseases, such as BSE, swine or sheep viruses, in laboratory operations or in clinical use. The use of such extracts documents the lack of knowledge of the actually relevant factors and their application and impact potential. Another major disadvantage is that such heterogeneous extracts, which are generally difficult to define and depend to a large extent on the source used, also introduce factors into the culture which, under certain circumstances, can cause undesirable side effects or properties in clinical use. Exact knowledge of the factors and their controlled administration would therefore be an important factor in order to be able to increase and differentiate cells, particularly in the field of tissue engineering, and to induce structural processes of three-dimensional (3-D) regeneration.

Insbesondere beim Tissue Engineering stehen derartige strukturelle Vorgaben im Vordergrund, wobei das 3-D-Wachstum und dessen Initiation bisher nicht verstanden ist. Konventionelle Ansätze wie Aggregatkulturen erreichen zwar eine hohe Dichte, müssen aber mit vorexpandierten oder aus primären Geweben isolierten Zellen, z.B. Hepatozyten, aufgebaut werden. Ein induktiver Wachstumsprozess in eine bestimmte, vorgegebene Struktur war bisher nicht möglich.Especially when it comes to tissue engineering such structural requirements are in the foreground, whereby the 3-D growth and its initiation is not yet understood. Conventional approaches how aggregate cultures reach a high density, but must with pre-expanded cells or cells isolated from primary tissues, e.g. Hepatocytes. An inductive growth process in a certain, predetermined structure was previously not possible.

Im Gegenteil werden heutzutage noch Zellen, wie z.B. Hepatozyten, nach den Vermehrungsphasen in ein Gel eingebettet, um die Bildung von weiteren, auch großen Aggregaten (Superaggregaten) zu vermeiden. Diese Gele sind in der Ausdehnung zweidimensional, enthalten eine hohe Zelldichte und stoppen daher die Zellvermehrung. Derartige 2-D-Geleinschlüsse, die in Schichten resultieren, wurden bereits von Bader et al. (1995), Artif. Organs., 19, 368–374 als Sandwichmodell oder "gel entrapment" beschrieben. Durch die Einbettung von Aggregaten in Gelen kommt es zwar zu einer Verbesserung des Erhalts der Differenzierung, jedoch nicht zu einem weiteren Wachstum.On the contrary, still today Cells such as Hepatocytes, after the propagation phases in one Gel embedded to the formation of further, even large aggregates (Super aggregates) to avoid. These gels are expanding two-dimensional, contain a high cell density and therefore stop the cell proliferation. Such 2-D gel inclusions, which result in layers, were already by Bader et al. (1995), Artif. Organs., 19, 368-374 as Sandwich model or "gel entrapment ". By embedding aggregates in gels there is a Improvement in maintaining differentiation, but not in one further growth.

Ein formschaffendes Wachstum aus wenigen Vorläuferzellen in eine 3-D-Struktur und ein induktives Verhalten für Nachbarschaftsprozesse im Sinne einer Geweberegeneration in vitro und in vivo war bisher nicht möglich. Ein induktive Wachstumsverhalten von Zellen bedeutet jedoch gerade für therapeutische oder biotechnologische Prozesse eine erhebliche Innovation. Ein derartiges Wachstumsverhalten sollte, unterstützt durch eine 3D Trägermatrix, ein Wachstum nicht nur im Sinne einer Besiedlung oder einem strukturellen Remodelling erlauben, sondern tatsächlich eine gerichtete de novo Formierung aus einem Induktionsnukleus erlauben können. Derartige Prozesse laufen in der Ontogenese ab und bauen auf eine vorher existierende Anlage auf.Form-creating growth few progenitor cells in a 3-D structure and an inductive behavior for neighborhood processes in the sense of tissue regeneration in vitro and in vivo not possible. However, an inductive growth behavior of cells means precisely for therapeutic or biotechnological processes a significant innovation. On Such growth behavior should be supported by a 3D carrier matrix Growth not only in terms of settlement or structural Allow remodeling, but actually a directed de novo Allow formation from an induction nucleus. such Processes run in ontogeny and build on a previously existing one Plant on.

Bekannt ist lediglich, dass Wachstumsfaktoren, insbesondere bei neuronalen Progenitoren fötalen Ursprungs wie z.B. "Leukemia Inhibitory Factor" (LIF), "Ciliary Neurotropic Factor" (CNTF), "Glial Derived Neurotrophic Factor" (GDNF) oder "nerve growth factor" (NGF), eine Proliferationsphase undifferenzierter Neuronen ermöglichen. Nach Erreichen einer Differenzierung können diese Faktoren jedoch nicht mehr wirken.We only know that growth factors, especially with neuronal progenitors of fetal origin, e.g. "Leukemia Inhibitory Factor "(LIF)," Ciliary Neurotropic Factor "(CNTF)," Glial Derived Neurotrophic Factor "(GDNF) or" nerve growth factor "(NGF), a proliferation phase enable undifferentiated neurons. However, after a differentiation has been made, these factors cannot work more.

Beim Tissue Engineering haben wir zusätzlich das Problem, dass patientenspezifische, adulte Zellsysteme verwendet werden, die bereits weiter differenziert sind als fötale Zellen. Zusätzlich handelt es sich in situ als auch in vitro um Kokultwsituationen, die in der klassischen Anwendung nicht berücksichtigt werden. Im Gegenteil es wird beispielsweise sogar versucht, Kokulturen aus Endothelzellen, Makrophagen und Fibroblasten, wie sie in der Leber vorkommen, bei der Expansion der parenchymatösen Leberzellen zu vermeiden, da sie nicht erwünscht sind. Man weiß jedoch inzwischen, dass die Gegenwart dieser sogenannten nichtparenchymalen Zellen in differenzierten Kulturen wesentlich zu der Differenzierung beitragen.With tissue engineering, we also have the problem that patient-specific, adult cell systems are used that are already more differentiated than fetal cells. In addition, both in situ and in vitro are coculture situations that are not considered in traditional applications. On the contrary, attempts are even being made, for example, to avoid cocultures from endothelial cells, macrophages and fibroblasts, such as those found in the liver, during the expansion of the parenchymal liver cells, since they are not desired. However, it is now known that the presence of these so-called non-parenchymal cells contribute significantly to differentiation in differentiated cultures.

Es ist daher wünschenswert, ein Vermehrungsverfahren in vitro und/oder ein Regenerationsverfahren in vivo zu schaffen, das den physiologischen Zustand dieser Zellsysteme im wesentlichen erhalten kann und ein im wesentlichen strukturelles Wachstum ermöglicht.It is therefore desirable to have a propagation process to create in vitro and / or a regeneration process in vivo, which essentially maintain the physiological state of these cell systems can and enables essentially structural growth.

Es wurde nun gefunden, dass die Verwendung der Wachstumsfaktoren Thrombopoietin (TPO) und/oder Erythropoietin (EPO) und/oder Wachstumshormon (GH), und/oder Somatostatin und/oder "Leukemia Inhibitory Factor" (LIF) und/oder "Ciliary Neurotropic Factor" (CNTF) die Vermehrung und Differenzierung von Zellen einleitet bzw. terminiert und strukturell lenkt.It has now been found to use the growth factors thrombopoietin (TPO) and / or erythropoietin (EPO) and / or growth hormone (GH), and / or somatostatin and / or "leukemia inhibitory Factor "(LIF) and / or" Ciliary Neurotropic Factor "(CNTF) the Propagation and differentiation of cells initiates or terminates and structurally guides.

Überraschenderweise wurde hierdurch nicht nur eine Vermehrung der Zellen, sondern auch eine Induzierung struktureller Prozesse bewirkt, insbesondere wenn über eine induktive Wirkung bei einem Implantat vor Ort (in situ) beispielsweise über einen sogenannten Homingprozess eine lokal spezifische Zellvermehrung und gerichtete Differenzierung bewirkt wird. Das bedeutet, dass die Wachstumshormone diese strukturellen Prozesse auslösen aber auch terminieren können.Surprisingly was not only an increase in cells, but also an induction of structural processes causes, especially if via a inductive effect for an implant on site (in situ), for example via a so-called homing process a locally specific cell proliferation and directed differentiation is effected. It means that however, the growth hormones trigger these structural processes can also schedule.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Vermehrung und Differenzierung von Zellen in vitro, bei dem der Wachstumsprozess der Zellen durch den Einsatz der Wachstumsfaktoren TPO und/oder EPO und/oder GH, insbesondere HGH und/oder Somatostatin und/oder LIF und/oder CNTF eingeleitet bzw. terminiert und strukturell gelenkt wird.The object of the invention is therefore a method for the multiplication and differentiation of cells in vitro, in which the growth process of the cells by using the growth factors TPO and / or EPO and / or GH, especially HGH and / or somatostatin and / or LIF and / or CNTF initiated or terminated and structurally is directed.

So ist TPO beispielsweise auch bekannt als c-Mp1-Ligand, mpl-Ligand, Megapoietin oder Megakariozyten-Wachstums- und Entwicklungsfaktor und wurde bislang nicht in der Kultur von z.B. adulten Hepatozyten oder anderen primären Zellen eingesetzt, außer von Thrombozyten oder ihren Vorläufern. TPO ist essentiell notwendig für die Entwicklung und Proliferation von Megakariozyten und Thrombozyten und somit für die Bildung von Blutplättchen. TPO wird als 332 Aminosäure-langes Protein konstitutiv in der Leber und in den Nieren produziert.For example, TPO is also known as c-Mp1 ligand, mpl ligand, megapoietin or megacariocyte growth and development factor and has so far not been in the culture of e.g. adult hepatocytes or other primary cells, except from Platelets or their precursors. TPO is essential for the development and proliferation of megacariocytes and platelets and therefore for the formation of platelets. TPO is said to be 332 amino acids long Protein constitutively produced in the liver and kidneys.

Als zusätzliche Wachstumsfaktoren können gemäß der vorliegenden Erfindung "Transforming Growth Factor Beta" (TGF beta), Prostaglandine, Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor (GM-CSF), "Growth Hormone Releasing Honnone" (GHRH), "Thyrotropin-releasing Homone" (TRH), "Gonadotropinreleasing Hormone" (GnRH), "Corticotropin-releasing Hormone" (CRH), Dopamin, "Antidiuretic Hormon" (ADH), Oxytocin, Prolactin, Adrenocorticotropin, beta-Celltropin, Lutrotropin und/oder Vasopressin eingesetzt werden.As additional growth factors according to the present Invention "Transforming Growth Factor Beta "(TGF beta), prostaglandins, granulocyte macrophage stimulating factor (GM-CSF), "Growth Hormone Releasing Honnone "(GHRH)," Thyrotropin-releasing Homones "(TRH)," Gonadotropinreleasing Hormones "(GnRH)," Corticotropin-releasing Hormones "(CRH), Dopamine, "Antidiuretic Hormone "(ADH), oxytocin, Prolactin, adrenocorticotropin, beta-celltropin, lutrotropin and / or vasopressin be used.

Neben einer Beendigung bzw. Reduzierung der Zufuhr der beschriebenen Wachstumsfaktoren zu der Kultur eignen sich zur Terminierung des erfindungsgemäßen Wachstumsprozesses auch Somatostatin und/oder TGF Beta und/oder Prostaglandine.In addition to ending or reducing the The growth factors described are suitable for the culture also to terminate the growth process according to the invention Somatostatin and / or TGF beta and / or prostaglandins.

Die einzelnen Konzentrationen der Wachstumsfaktoren liegen in Lösung üblicherweise bei ca. 1 bis ca. 100 ng/ml, vorzugsweise bei ca. 10 bis ca. 50 ng/ml, insbesondere bei ca. 10 bis ca. 20 ng/ml. Bei lokalen Beschichtungen können die Konzentrationen der Wachstumsfaktoren jedoch auch ein Vielfaches davon betragen.The individual concentrations of Growth factors are usually in solution at about 1 to about 100 ng / ml, preferably at about 10 to about 50 ng / ml, especially at about 10 to about 20 ng / ml. For local coatings can however, the concentrations of the growth factors are also a multiple of which amount.

Beispielsweise können bei der Regeneration endokriner Organe die Interaktion der Wachstumsfaktoren, insbesondere von "Growth Hormone Releasing Hormone" (GHRH), "Thyrotropin-releasing Homone" (TRH), "Gonadotropin-releasing Hormone" (GnRH), "Corticotropin-releasing Hormone" (CRH), Somatostatin, Dopamine, "Antidiuretic Hormone" (ADH) und/oder Oxytocin, mit der Trägermatrix in situ eine endokrine Differenzierung und/oder Wachstum auslösen.For example, endocrine in regeneration Organs the interaction of growth factors, especially "Growth Hormone Releasing Hormones "(GHRH)," Thyrotropin-releasing Homones "(TRH)," Gonadotropin-releasing Hormones "(GnRH)," Corticotropin-releasing Hormones "(CRH), somatostatin, Dopamine, "Antidiuretic Hormones "(ADH) and / or Oxytocin, with the carrier matrix trigger endocrine differentiation and / or growth in situ.

Des weiteren können Prolactin, Adrenocorticotropin, beta-Celltropin, Lutrotropin und/oder Vasopressin für die strukturellen Prozesse eingesetzt werden.Prolactin, adrenocorticotropin, beta-celltropin, lutrotropin and / or vasopressin for the structural Processes are used.

In einer weiteren Ausführungsform können zusätzlich ein oder mehrere Nervenregenerationsfaktoren, vorzugsweise "nerve growth factor" (NGF) und/oder ein oder mehrere Gefäßregenerationsfaktoren, vorzugsweise "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF) und/oder "Plateled Derived Growth Factor" (PDGF), eingesetzt werden.In another embodiment can additionally one or several nerve regeneration factors, preferably "nerve growth factor" (NGF) and / or one or several vascular regeneration factors, preferably "Vascular Endothelial Growth Factor "(VEGF) and / or "Plateled Derived Growth Factor "(PDGF), be used.

In Anwesenheit von Endothelzellen kann auch eine Endothelialisierung der Zellen und somit eine optimale Hämokompatibilität erreicht werden.In the presence of endothelial cells can also be an endothelialization of the cells and thus an optimal Haemocompatibility achieved become.

Die genannten Wachstumsfaktoren sind im allgemeinen käuflich zu erwerben, können aber auch gentechnisch nach dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden. Sie umfassen nicht nur die natürlich vorkommenden Wachstumsfaktoren, sondern auch Derivate oder Varianten mit im wesentlichen derselben biologischen Aktivität.The growth factors mentioned are generally available for purchase can acquire but also produced genetically using methods known to those skilled in the art become. They include not only the naturally occurring growth factors, but also also derivatives or variants with essentially the same biological Activity.

So ist beispielsweise TPO von der Fa. CellSystems GmbH, St. Katharinen käuflich zu erwerben. Für die Kultivierung von humanen adulten Hepatozyten wird die Verwendung von humanem TPO bevorzugt. Des weiteren ist die Herstellung und Charakterisierung von TPO und dessen Varianten beispielsweise in EP 1 201 246 , WO95/21919 , WO95/21920 und WO95/26746 beschrieben.For example, TPO can be purchased from CellSystems GmbH, St. Katharinen. For the cultivation of human adult hepatocytes, the use of human TPO is preferred. Furthermore, the production and characterization of TPO and its variants is shown, for example, in EP 1 201 246 . WO95 / 21919 . WO95 / 21920 and WO95 / 26746 described.

Als Varianten von TPO eignen sich beispielsweise die in der WO95/21919 beschriebenen TPI-Derivate oder die in WO95/21920 beschriebenen allelischen Varianten oder Spezieshomologe oder das in WO95/26746 und EP 1 201 246 beschriebene pegylierte TPO, ohne sie darauf zu beschränken. Als pegyliertes TPO wird im Sinne der vorliegenden Erfindung TPO-Derivate verstanden, die an ein organisches Polymer, wie z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylen, gebunden sind. Als weitere Varianten von TPO werden auch Derivate von TPO verstanden, die eine Sequenzidentität von weniger als 100% besitzen und dennoch die Aktivität von TPO, wie vorzugsweise in EP 1 201 246 beschrieben, besitzen. Üblicherweise besitzen TPO-Derivate eine Sequenzidentität von mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, insbesondere mindestens 80% und vor allem mindestens 85% im Vergleich zu humanem TPO einschließ lich derer Fragmente mit TPO-Aktivität. Eine besonders bevorzugte TPO-Aktivität im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Beschleunigung der Proliferation, Differenzierung und/oder Reifung von Megakaryozyten oder Megakaryozyten-Vorläufer in Plättchen-produzierende Formen dieser Zellen durch TPO oder dessen Varianten.Examples of variants of TPO are those in the WO95 / 21919 described TPI derivatives or those in WO95 / 21920 described allelic variants or species homologue or that in WO95 / 26746 and EP 1 201 246 described pegylated TPO without being limited to them. For the purposes of the present invention, pegylated TPO is understood to mean TPO derivatives which are bound to an organic polymer, such as, for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol or polyoxyalkylene. Derivatives of TPO which have a sequence identity of less than 100% and still have the activity are also understood as further variants of TPO of TPO, as preferably in EP 1 201 246 described. Typically, TPO derivatives have a sequence identity of at least 70%, preferably at least 75%, in particular at least 80% and above all at least 85% compared to human TPO including those fragments with TPO activity. A particularly preferred TPO activity in the sense of the present invention is the acceleration of the proliferation, differentiation and / or maturation of megakaryocytes or megakaryocyte precursors in platelet-producing forms of these cells by TPO or its variants.

EPO wird auch als embryonale Form des TPO bezeichnet und ist mit seinen Varianten z.B. in der EP 0 148 605 , EP 0 205 564 , EP 0 209 539 , EP 0 267 678 oder EP 0 411 678 beschrieben.EPO is also known as the embryonic form of TPO and its variants are, for example, in the EP 0 148 605 . EP 0 205 564 . EP 0 209 539 . EP 0 267 678 or EP 0 411 678 described.

Die oben näher beschriebenen, beispielhaften Derivate und Varianten gelten in analoger Weise auch für die anderen genannten Wachstumsfaktoren.The exemplary ones described in more detail above Derivatives and variants apply analogously to the others growth factors mentioned.

Der Begriff Wachstumsfaktor ist folglich gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur auf die natürlich vorkommenden Formen beschränkt, sondern umfasst auch nicht natürlich vorkommende Formen bzw. Varianten oder Derivate. Der Begriff Wachstumsfaktor umfasst gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur Wachstumsförderer, sondern auch Wachstumsinhibitoren, wie z.B. Somatostatin, TGF beta und/oder Prostaglandine. Derartige Wachstumsinhibitoren eignen sich insbesondere zur Unterdrückung bzw. Hemmung des Wachstums von veränderten Zellen, wie z.B. Tumorzellen, indem diese gleichzeitig oder sequenziell beispielsweise auch mittels Hydrogele oder Slow-release Materialien hochkonzentriert, lokal eingesetzt werden.The term growth factor is consequently according to the present Invention not only on the course limited forms, but does not naturally include occurring forms or variants or derivatives. The term growth factor includes according to the present Invention not only growth promoters, but also growth inhibitors, e.g. Somatostatin, TGF beta and / or prostaglandins. Such growth inhibitors are suitable especially for suppression or inhibiting the growth of altered cells, e.g. Tumor cells by simultaneously or sequentially using, for example Hydrogels or slow-release materials highly concentrated, locally be used.

Der erfindungsgemäße Wachstumsprozess wird in einer für die jeweiligen Zellen geeigneten Kultur durchgeführt. Hierbei können mittels einer geeigneten Vorrichtung die sich gegebenenfalls während des Wachstumsprozesses bildenden Zellaggregate zerkleinert und gegebenenfalls eingekapselt und gegebenenfalls eingefroren werden.The growth process according to the invention is described in one for the appropriate cells performed culture. Here you can use a suitable device which may be during the Crushed growth process forming cell aggregates and if necessary encapsulated and frozen if necessary.

Als Vorrichtung eignet sich beispielsweise ein Gitter mit z.B. einer schneidenden Maschenstruktur von beispielsweise 500 μm Größe, die bewirkt, dass immer wieder neue Tochteraggregate von beispielsweise Hepatozyten entstehen können. Dies kann vorteilhafterweise in einem vollständig geschlossenen System geschehen. Insbesondere können berührungslose, automatisch oder manuell gesteuerte Pumpsysteme eingesetzt werden, die z.B. aus Kolbenpumpen bestehen oder magnetisch bzw. durch Druckluftkompression von Schläuchen erzeugte, gerichtete Ströme erzeugen. In Anwesenheit von Endothelzellen kann es durch den Scherstress in einem perfundierten Bioreaktor zu einer spontanten Konfluenz der Endothelzellen auf den Oberflächen der Aggregate kommen, was für die weitere Verwendung vorteilhaft sein kann.A device is suitable, for example Grid with e.g. a cutting mesh structure of, for example 500 μm size, the causes new subsidiary units from, for example Hepatocytes can arise. This can advantageously be done in a completely closed system. In particular can non-contact, automatically or manually controlled pump systems are used, e.g. consist of piston pumps or magnetically or by compressed air compression of hoses generated, directed currents produce. In the presence of endothelial cells, it can be caused by shear stress to a spontaneous confluence in a perfused bioreactor the endothelial cells come on the surfaces of the aggregates, what kind of further use may be advantageous.

Für die Einkapselung eignen sich dem Fachmann bekannte, geeignete Materialien, in die beispielsweise strukturierte Formen oder Räume integriert werden, die eine in situ Wachstumsstruktur bzw. Vergrößerung ermöglichen. Alternativ kann auf die Kapsel verzichtet werden und beispielsweise in Gegenwart von Endothelzellen eine Endothelialisierung und somit eine optimale Hämokompatibilität erreicht werden.For the encapsulation is suitable suitable materials known to the person skilled in the art, into which, for example, structured forms or spaces are integrated that enable an in situ growth structure or enlargement. Alternatively, the capsule can be dispensed with, for example an endothelialization in the presence of endothelial cells and thus optimal hemocompatibility achieved become.

In einer weiteren Ausführungsform wird der Wachstumsprozess der Zellen lokal eingeleitet bzw. terminiert und strukturell gelenkt, vorzugsweise durch eine biologische Matrix.In another embodiment the cell growth process is initiated or terminated locally and structurally directed, preferably through a biological matrix.

Die biologische Matrix wird hierbei beispielsweise mit einem der genannten Wachstumsfaktoren oder mit einer Kombination der genannten Wachstumsfaktoren als Mischung oder sequenziell behandelt. Hierdurch wird auch bei adulten Zellsystemen noch eine 3D-Regeneration und/oder eine artifizielle Lenkung einer Gewebereparatur bzw. Gewebezüchtung ermöglicht.The biological matrix here for example with one of the growth factors mentioned or with a combination of the growth factors mentioned as a mixture or treated sequentially. As a result, even with adult cell systems 3D regeneration and / or artificial steering of a tissue repair or tissue engineering allows.

Die biologische Matrix ist üblicherweise ein Implantat, z.B. ein Stent, ein Patch oder ein Katheter, ein Transplantat, z.B. ein Hauttransplantat, und/oder ein Trä germaterial zum Wachstum von Zellen, z.B. ein sogenanntes Slow-release Material, z.B. ein Hydrogel beispielsweise auf der Basis von Fibrin und/oder Polymere, wie z.B. Polylaktid oder Polyhydroxyalkanoat, und/oder Alginate, ein Knochenersatzmaterial, z.B. Tricalciumphosphat, ein allogenes, autologes oder xenogenes azellularisiertes oder nicht-azellularisiertes Gewebe, z.B. eine Herzklappe, Venenklappe, Arterienklappe, Haut, Gefäß, Aorta, Sehne, Comea, Knorpel, Knochen, Tracea, Nerv, Miniskus, Diskus intervertebralis, Ureteren, Urethra oder Blase (siehe z.B. EP 0 989 867 oder EP 1 172 120 ), eine Matrix wie z.B. eine Laminin-, Collagen IV- und/oder Matrigel-Matrix, vorzugsweise ein Feeder-Layer, wie z.B. Collagen I-, 3T3- und/oder MRC-S-Feeder Layer, oder ein Collagenfließ.The biological matrix is usually an implant, for example a stent, a patch or a catheter, a graft, for example a skin graft, and / or a carrier material for the growth of cells, for example a so-called slow-release material, for example a hydrogel on the Basis of fibrin and / or polymers, such as polylactide or polyhydroxyalkanoate, and / or alginates, a bone replacement material, e.g. tricalcium phosphate, an allogeneic, autologous or xenogeneic acellularized or non-acellularized tissue, e.g. a heart valve, venous valve, arterial valve, skin, vessel, Aorta, tendon, comea, cartilage, bone, tracea, nerve, miniscus, intervertebral disc, ureter, urethra or bladder (see e.g. EP 0 989 867 or EP 1 172 120 ), a matrix such as a laminin, collagen IV and / or Matrigel matrix, preferably a feeder layer, such as collagen I, 3T3 and / or MRC-S feeder layer, or a collagen flow.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die biologische Matrix mit Zellen, vorzugsweise gewebespezifischen Zellen, Vorläuferzellen, Knochenmarkszellen, peripheres Blut, Fettgewebe und/oder Fasergewebe, z.B. mit adulten Vorläuferzellen aus dem Knochenmark, nach dem Fachmann bekannten Verfahren vorbesiedelt. Dadurch kann erreicht werden, dass der in vivo Wundheilungsprozess in vitro vorweggenommen wird und damit nach Implantation in vivo eine verkürzte Reintegrationszeit erfolgt.In a further preferred embodiment the biological matrix with cells, preferably tissue-specific Cells, progenitor cells, bone marrow cells, peripheral blood, adipose tissue and / or fibrous tissue, e.g. with adults progenitor cells from the bone marrow, pre-colonized by methods known to those skilled in the art. It can thereby be achieved that the in vivo wound healing process in is anticipated in vitro and thus after implantation in vivo shortened Reintegration time takes place.

Als Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung werden insbesondere adulte Zellen, d. h. primär differenzierte Zellen, die bevorzugt keinen embryonalen oder fötalen Phänotyp mehr besitzen, verwendet und besonders bevorzugt humane adulte Zellen. Beispiele hiervon sind adulte Progenitorzellen, gewebespezifische Zellen, vorzugsweise Osteoblasten, Fibroblasten, Hepatozyten und/oder glatte Muskelzellen.As cells according to the present invention in particular, adult cells, i.e. H. primarily differentiated cells that preferably no longer have, uses, and embryonic or fetal phenotype particularly preferably human adult cells. Examples of this are adult progenitor cells, tissue-specific cells, preferably Osteoblasts, fibroblasts, hepatocytes and / or smooth muscle cells.

Es können aber auch veränderte Zellen, wie z.B. Tumorzellen, durch z.B. eine hochkonzentrierte, gleichzeitige oder sequenzielle Gabe von Wachstumsinhibitoren, wie Somatostatin, TGF Beta und/oder Prostaglandine unterdrückt bzw. inhibiert werden. Hierbei können die bereits erwähnten Hydrogele oder Slow-release Materialien eingesetzt werden, die mindestens einen der genannten Wachstumsin hibitoren enthalten oder damit angereichert sind, und lokal oder in der Nachbarschaft der veränderten Zellen appliziert werden.Modified cells, such as eg tumor cells, are suppressed or inhibited by, for example, a highly concentrated, simultaneous or sequential administration of growth inhibitors such as somatostatin, TGF beta and / or prostaglandins. The hydrogels or slow-release materials already mentioned which contain or are enriched with at least one of the growth inhibitors mentioned and can be applied locally or in the vicinity of the modified cells can be used here.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich somit insbesondere zur lokal spezifischen und/oder gerichteten Vermehrung, strukturellem Wachstum und nachfolgender Differenzierung adulter Zellen und/oder zur Regeneration von Knochen, Geweben und/oder endokriner Organe, z.B. von Herzklappen, Venenklappen, Arterienklappen, Haut, Gefäßen, Aorten, Sehnen, Comea, Knorpel, Knochen, Tracea, Nerven, Miniskus, Diskus intervertebralis, Ureteren, Urethra oder Blasen.The method according to the invention is therefore suitable especially for locally specific and / or targeted propagation, structural growth and subsequent adult differentiation Cells and / or for the regeneration of bones, tissues and / or endocrine Organs, e.g. of heart valves, venous valves, arterial valves, skin, vessels, aortas, Tendons, comea, cartilage, bones, tracea, nerves, miniscus, discus intervertebralis, ureters, urethra or blisters.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur lokalen Applikation in vivo eingesetzt werden, in dem die genannten Wachstumsfaktoren entweder allein oder in Kombination als Mischung oder sequenziell eingesetzt werden oder in Kombination mit den genannten biologischen Matrizes oder Trägerstrukturen, beispielsweise für die Geweberegeneration, wie z.B. die Lebenegeneration, Herzmuskelregeneration oder für die Wundheilung im Bereich Haut, z.B. bei diabetischen Ulzera, oder Gingiva. Beispielsweise kann z. B. TPO in einem Hydrogel, z.B. Fibrin und/oder ein Polymere, wie z.B. Polylaktid oder Polyhydroxyalkanoat, und/oder ein Alginat, auf die Resektionsfläche z.B. einer Leber zur Lebenegeneration aufgebracht werden oder bei z.B. akutem Leberversagen über einen Port mit Hilfe eines Katheters lokal oder systemisch appliziert werden.The inventive method can also local application can be used in vivo, in which the Growth factors either alone or in combination as a mixture or used sequentially or in combination with the above biological matrices or support structures, for example for tissue regeneration, e.g. the life generation, heart muscle regeneration or for the Wound healing in the skin area, e.g. in diabetic ulcers, or Gingiva. For example, B. TPO in a hydrogel, e.g. Fibrin and / or a polymer such as Polylactide or polyhydroxyalkanoate, and / or an alginate, on the resection surface e.g. a liver for life generation be applied or at e.g. acute liver failure over one Port applied locally or systemically using a catheter become.

Des weiteren kann eine biologische Matrix oder Trägerstruktur enthaltend mindestens einen der Wachstumsfaktoren TPO, EPO, GH, insbesondere HGH, Somatostatin, LIF und/oder CNTF als induktives Substrat für 3-D Wachstum und/oder Regeneration innerhalb einer Vermehrungsphase oder nach einer Vermehrungsphase zur Differenzierung oder zum Wachstumsarrest benutzt werden. Zum Beispiels kann mindestens einer der genannten Wachstumsfaktoren auf einen Stent in Kombination mit einem sogenannten Slow-release Material, wie oben beispielhaft beschrieben, aufgebracht werden.Furthermore, a biological Matrix or support structure containing at least one of the growth factors TPO, EPO, GH, in particular HGH, somatostatin, LIF and / or CNTF as inductive Substrate for 3-D growth and / or regeneration within a propagation phase or after a propagation phase for differentiation or growth arrest to be used. For example, at least one of the above Growth factors on a stent in combination with a so-called Slow-release material, as described above by way of example, applied become.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch eine biologische Matrix oder Trägerstruktur enthaltend mindestens einen der Wachstumsfaktoren Thrombopoietin (TPO), Erythropoietin (EPO) Wachstumsfaktor (GH), insbesondere "Human Growth Hormone" (HGH), Somatostatin, "Leukemia Inhibitory Factor" (LIF) und/oder "Ciliary Neurotropic Factor" (CNTF), wobei die biologische Matrix oder Trägerstruktur hierbei auch zusätzlich mindestens einen der Wachstumsfaktoren TGF Beta, Prostaglandin, GM-CSF, GHRH, TRH, GnRH, CRH, Dopamin, ADH, Oxytocin, Prolactin, Adrenocorticotropin, beta-Celltropin, Lutrotropin und/oder Vasopressin und gegebenenfalls zusätzlich einen oder mehrere Nervenregenerationsfaktoren, vorzugsweise "nerve growth factor" (NGF) und/oder einen oder mehrere Gefäßregenerationsfaktoren, vorzugsweise "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF) und/oder "Plateled Derived Growth Factor" (PDGF) enthalten kann.Another object of the present invention is therefore also a biological matrix or carrier structure containing at least one of the growth factors thrombopoietin (TPO), erythropoietin (EPO) growth factor (GH), in particular "Human Growth Hormone" (HGH), somatostatin, "Leukemia Inhibitory Factor "(LIF) and / or" Ciliary Neurotropic Factor "(CNTF), the biological matrix or carrier structure also at least additionally one of the growth factors TGF beta, prostaglandin, GM-CSF, GHRH, TRH, GnRH, CRH, dopamine, ADH, oxytocin, prolactin, adrenocorticotropin, beta-celltropin, lutrotropin and / or vasopressin and optionally additionally one or more nerve regeneration factors, preferably "nerve growth factor" (NGF) and / or one or several vascular regeneration factors, preferably "Vascular Endothelial Growth Factor "(VEGF) and / or" Plateled Derived Growth Factor "(PDGF) included can.

Die erfindungsgemäße biologische Matrix oder Trägerstruktur stellt beispielsweise ein Implantat, ein Transplantat und/oder ein Trägermaterial zum Wachstum von Zellen dar, wobei die biologische Matrix oder Trägerstruktur ein Stent, ein Katheter, eine Haut, ein Hydrogel, ein Knochenersatzmaterial, ein allogenes, autologes oder xenogenes, azellularisiertes oder nicht-azellularisiertes Gewebe, ein synthetisches Gewebe, ein Feeder-Layer oder ein Fließ, wie z.B. ein Fließ aus Collagen, Laminin und/oder Fibronektin mit oder ohne synthetischer oder anderweitiger Grundstruktur, wie z.B. Kunststoff oder eine biologische Matrix, sein kann. Beispielhafte Ausführungsformen sind bereits oben beschrieben.The biological matrix according to the invention or support structure sets, for example, an implant, a graft and / or support material for the growth of cells, the biological matrix or carrier structure a stent, a catheter, a skin, a hydrogel, a bone substitute, an allogeneic, autologous or xenogeneic, acellularized or non-acellularized tissue, a synthetic tissue, a feeder layer or a flow, such as. a flow out Collagen, laminin and / or fibronectin with or without synthetic or other basic structure, e.g. Plastic or a biological matrix. Exemplary embodiments are already described above.

Die biologische Matrix oder Trägerstruktur ist, wie oben bereits näher beschrieben, vorzugsweise bereits mit gewebespezifischen Zellen, Vorläuferzellen, Knochenmarkszellen, peripheres Blut, Fettgewebe und/oder Fasergewebe vorbesiedelt oder für die in vivo Besiedelung bzw. das induktive Remodelling in vitro bereits vorbereitet.The biological matrix or support structure is as detailed above described, preferably already with tissue-specific cells, Progenitor cells, Bone marrow cells, peripheral blood, adipose tissue and / or fibrous tissue pre-populated or for the in vivo colonization or inductive remodeling in vitro already prepared.

Die biologische Matrix oder Trägerstruktur kann auch mit einer (Bio)polymerschicht, die mindestens einen der genannten Wachstumsfaktoren enthält, beschichtet sein. Als (Bio)polymerschicht eignen sich z.B. Fibrin, Plasma, Collagen und/oder Polylaktide.The biological matrix or carrier structure can also with a (bio) polymer layer that contains at least one of the named Contains growth factors, be coated. Suitable as (bio) polymer layers are e.g. Fibrin, Plasma, collagen and / or polylactide.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen biologischen Matrix oder Trägerstruktur, bei dem eine gegebenenfalls aktivierte biologische Matrix oder Trägerstruktur mit mindestens einem der Wachstumsfaktoren TPO, EPO, GH, insbesondere HGH, Somatostatin, LIF und/oder CNTF beschichtet wird, wobei die genannte Matrix oder Trägerstruktur gegebenenfalls mit zusätzlich mindestens einem der Wachstumsfaktoren TGF Beta, Prostaglandin, GM-CSF, GHRH, TRH, GnRH, CRH, Dopamin, ADH, Oxytocin, Prolactin, Adrenocorticotropin, Beta-Celltropin, Lutrotropin und/oder Vasopressin und gegebenenfalls zusätzlich mit einem oder mehreren Nervenregenerationsfaktoren, vorzugsweise NGF und/oder einen oder mehreren Gefäßregenerationsfaktoren, vorzugsweise VEGF und/oder PDGF beschichtet werden kann.The present invention relates also refer to a method for producing a biological according to the invention Matrix or support structure, in which an optionally activated biological matrix or carrier structure with at least one of the growth factors TPO, EPO, GH, in particular HGH, Somatostatin, LIF and / or CNTF is coated, the said Matrix or support structure if necessary with additional at least one of the growth factors TGF beta, prostaglandin, GM-CSF, GHRH, TRH, GnRH, CRH, dopamine, ADH, oxytocin, prolactin, adrenocorticotropin, Beta-celltropin, lutrotropin and / or vasopressin and optionally additionally with one or more nerve regeneration factors, preferably NGF and / or one or more vascular regeneration factors, preferably VEGF and / or PDGF can be coated.

Die Aktivierung der biologischen Matrix oder Trägerstruktur kann beispielsweise mittels Plasmaionisation, z.B. unter Verwendung von Wasserstoffperoxid, oder mittels Laseraktivierung erfolgen.Activation of biological Matrix or support structure can for example by means of plasma ionization, e.g. under use of hydrogen peroxide, or by means of laser activation.

Alternativ kann eine Beschichtung mit einer biodegradablen (Bio)polymerschicht, die den oder die genannten Wachstumsfaktoren) enthält, erfolgen. Hierzu eignen sich beispielsweise Fibrin, Plasma, Collagen und/oder Polylaktide.Alternatively, a coating with a biodegradable (bio) polymer layer, the or contains the growth factors mentioned). For example, fibrin, plasma, collagen and / or polylactides are suitable for this.

Ebenso kann gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die biologische Matrix oder Trägerstruktur in vitro mit Zellen, vorzugsweise gewebespezifischen Zellen, Vorläuferzellen, Knochenmarkszellen, peripheres Blut, Fettgewebe und/oder Fasergewebe, vorbesiedelt werden.Likewise, according to the method according to the invention the biological matrix or support structure in vitro with cells, preferably tissue-specific cells, progenitor cells, Bone marrow cells, peripheral blood, adipose tissue and / or fibrous tissue, be populated.

Die oben beschriebenen bevorzugten Merkmale bzw. Merkmalsbeispiele der vorliegenden Erfindung gelten in analoger Weise für das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren.The preferred ones described above Features or feature examples of the present invention apply in an analogous manner for the manufacturing method according to the invention.

Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf eine Vorrichtung zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, wobei ein perfundierter Bioreaktor insbesondere in Form eines geschlossenen Systems bevorzugt ist.The present invention extends also relates to a device for carrying out the method according to the invention, being a perfused bioreactor, particularly in the form of a closed one System is preferred.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.The following examples are intended to Invention closer explain, without restricting them.

Beispiele:Examples:

1. Knochenregeneration1. Bone regeneration

Ein phasenreines Beta Tricalciumphosphat wird mit einer Mikroporosität von z.B. > 15 μm als Granulat vorbereitet und in eine Form eines 3-D-Defektes entsprechend eines Patientenbedarfs geformt. Dies geschieht üblicherweise in einem Sinterungsprozess. Danach wird das Material mit Plasmaionisation behandelt, so dass eine Aktivierung der Oberflächen eintritt und das Konstrukt in eine Lösung mit Thrombopoietin, Erythropoietin und/oder Wachstumshormon (GH) eingelegt und damit in geringen Mengen definiert beschichtet wird. Alternativ kann eine Inkubation in einer Lösung ohne vorherige Oberflächenaktivierung oder eine Beschichtung mit einer biodegradablen (Bio)polymerschicht, die diese Wachstumsfaktoren enthält, erfolgen. Hier können z.B. Fibrin, Plasma, Collagen und/oder Polylaktide eingesetzt werden.A phase-pure beta tricalcium phosphate is with a microporosity from e.g. > 15 μm as granules prepared and in a form of a 3-D defect corresponding to one Shaped patient needs. This usually happens in a sintering process. Then the material is treated with plasma ionization so that an activation of the surfaces occurs and the construct in a solution with thrombopoietin, erythropoietin and / or growth hormone (GH) and therefore in small quantities is coated in a defined manner. Alternatively, an incubation in a solution without previous surface activation or a coating with a biodegradable (bio) polymer layer, that contains these growth factors respectively. Here e.g. Fibrin, plasma, collagen and / or polylactides can be used.

Dieses Konstrukt wird danach entweder sofort in einen Defekt eingebracht oder in vitro mit gewebespezifischen Zellen, Vorläuferzellen oder Knochemnarkszellen vorbesiedelt. Dadurch wird erreicht, dass der in vivo Wundheilungsprozess in vitro vorweggenommen wird und damit nach Implantation in vivo (z.B. nach 7 Tagen) eine verkürzte Reintegrationszeit erfolgen kann. Eine Kombination mit Faktoren der Nervenregeneration (NGF) oder Gefäßregeneration (VEGF, PDGF) ist möglich. Hierbei ist die Kombination mit den strukturbildenden Faktoren und Milieukonzepten interessant.This construct is then either immediately inserted into a defect or in vitro with tissue-specific Cells, progenitor cells or pre-colonized nodule cells. This ensures that the in vivo wound healing process is anticipated in vitro and thus a shorter reintegration time after implantation in vivo (e.g. after 7 days) can be done. A combination with factors of nerve regeneration (NGF) or vascular regeneration (VEGF, PDGF) is possible. Here is the combination with the structure-forming factors and milieu concepts Interesting.

In vivo und in vitro kommt es zur Integration des blutbildenden und stammzellreichen Knochenmarks wie auch zu einer beschleunigten Differenzierung von Osteoblasten und einer beschleunigten Resorption der Trägermatrix und einem Ersatz durch normalen Knochen. Durch die Rekruktierungskompetenz und den induktiven Charakter erfolgt eine ortspezifische Integration.In vivo and in vitro Integration of the blood-forming and stem cell-rich bone marrow as well as an accelerated differentiation of osteoblasts and an accelerated absorption of the carrier matrix and a replacement through normal bones. Through the recruiting skills and the Site-specific integration takes place inductively.

Diese kann weitergefördert werden, in dem bereits in vitro eine Übersiedlung an den externen Seiten mit Periost erfolgt.This can be promoted in which a move already in vitro done on the external sides with periosteum.

2. Herzklappenregeneration und Herstellung urologischer Konstrukte2. Heart valve regeneration and manufacture of urological constructs

Eine biologische Matrix (allogene oder autologe Herzklappe mit und ohne Azellularisierung, eine synthetische Trägerstruktur aus Kunststoffen, die dem physiologischen Mikromilieu des kardiovaskulären Zielgewebes hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung der Kollagene und deren räumlicher Anordnung nahe kommt) wird mit Thrombopoietin und Erythropoietin als Wachstumsfaktoren vorbeschichtet.A biological matrix (allogeneic or autologous heart valve with and without acellularization, a synthetic support structure made of plastics that correspond to the physiological microenvironment of the cardiovascular target tissue with regard to the chemical composition of the collagens and their spatial Arrangement comes close) with thrombopoietin and erythropoietin pre-coated as growth factors.

Danach wird das Material mit Plasmaionisation behandelt (z.B. unter Verwendung von Wasserstoffperoxid, H2O2), wodurch zugleich eine Sterilisation erreicht wird, so dass eine Aktivierung der Oberflächen eintritt und das Konstrukt in eine Lösung mit Thrombopoietin, Erythopoietin und/oder Wachstumshormon (GH) eingelegt und damit in geringen Mengen definiert beschichtet wird. Alternativ kann eine Inkubation in einer Lösung ohne vorherige Oberflächenaktivierung oder eine Beschichtung mit einer biodegradablen (Bio)polymerschicht, die diese Wachstumsfaktoren enthält, erfolgen. Hier können z.B. Fibrin, Plasma, Collagen oder Polylaktide eingesetzt werden.The material is then treated with plasma ionization (e.g. using hydrogen peroxide, H 2 O 2 ), whereby sterilization is achieved at the same time, so that activation of the surfaces occurs and the construct in a solution with thrombopoietin, erythopoietin and / or growth hormone (GH ) inserted and thus coated in small quantities in a defined manner. Alternatively, incubation in a solution without prior surface activation or coating with a biodegradable (bio) polymer layer containing these growth factors can take place. For example, fibrin, plasma, collagen or polylactide can be used here.

Dieses Konstrukt wird danach entweder sofort an den Bedarfsort (Herzlappenposition, als Patch oder Gefäßersatz) eingebracht oder in vitro mit gewebespezifischen Zellen, Vorläuferzellen oder Knochenmarkszellen vorbesiedelt. Dadurch wird erreicht, dass der in vivo Wundheilungsprozess in vitro vorweggenommen wird und damit nach Implantation in vivo (z.B. nach 7 Tagen) eine verkürzte Reintegrationszeit erfolgen kann. Eine Kombination mit Faktoren der Nervenregeneration (NGF) oder Gefäßregeneration (VEGF, PDGF) ist möglich, aber nicht zwingend erforderlich.This construct is then either Immediately to the place of use (heart flap position, as a patch or vascular replacement) introduced or in vitro with tissue-specific cells, progenitor cells or pre-colonized bone marrow cells. This ensures that the in vivo wound healing process is anticipated in vitro and thus a shorter reintegration time after implantation in vivo (e.g. after 7 days) can be done. A combination with factors of nerve regeneration (NGF) or vascular regeneration (VEGF, PDGF) is possible but not absolutely necessary.

In vivo und in vitro kommt es zur Integration des blutbildenden und stammzellreichen Knochenmarks wie auch der beschleunigten Differenzierung von Fibroblasten und glatten Muskelzellen und einer beschleunigten Resorption der Trägermatrix und einen Ersatz durch normales kardiovaskuläres Gewebe. Durch die Rekrutierungskompetenz und den induktiven Charakter erfolgte eine ortspezifische Integration.In vivo and in vitro Integration of the blood-forming and stem cell-rich bone marrow as well as the accelerated differentiation of fibroblasts and smooth muscle cells and an accelerated absorption of the carrier matrix and replacement with normal cardiovascular tissue. Through the recruitment competence and the inductive character was a site-specific integration.

Diese kann weitergefördert werden, in dem bereits in vitro eine Übersiedlung an den externen Seiten mit Endothelzellen erfolgt.This can be promoted in which a move already in vitro done on the external sides with endothelial cells.

In entsprechender Weise können urologische Konstrukte hergestellt werden.Similarly, urological Constructs are made.

3. Vermehrung adulter Hepatozyten in Kokultur mit nichtparenchymalen Zellen3. Multiplication adult hepatocytes in coculture with non-parenchymal cells

Eine gemischte Leberzellpopulation aus einer Biopsie oder einem Teilsektat werden mit TPO und/oder EPO und/oder Wachstumshormon, z.B. HGH, in einer Konzentration von 10–50 ng/ml durch Zugabe zu dem Mediumüberstand behan delt. Die Aussaatzelldichte beträgt 10 000 Zellen/cm. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen mit 0,005% Collagenase und 0,01% Trypsin unter Zusatz von 2 g/l Albumin oder autologem Serum (10–20%) für 5 h behandelt. Danach werden die Zellen abgesaugt und in Kulturmedium (Williams E (Williams et al. (1971) Exprl. Cell Res., 69, 106) mit 2 g/1 Albumin dreifach gewaschen und danach zur Sedimentation in einer mit Collagen-beschichteten Petrischale gebracht.A mixed liver cell population a biopsy or a subsection is made with TPO and / or EPO and / or growth hormone, e.g. HGH, in a concentration of 10-50 ng / ml by adding to the medium supernatant treats. The seed cell density is 10,000 cells / cm. After reaching the cells are confluent with 0.005% collagenase and 0.01% Trypsin treated with the addition of 2 g / l albumin or autologous serum (10-20%) for 5 h. The cells are then aspirated and placed in culture medium (Williams E (Williams et al. (1971) Exprl. Cell Res., 69, 106) with 2 g / 1 albumin washed three times and then for sedimentation in a collagen-coated Brought petri dish.

Die Differenzierung der Zellen kann durch Überschichtung mit einer extrazellulären Matrix erreicht werden.Differentiation of cells can by overlaying with an extracellular Matrix can be achieved.

Alternativ können die Zellen wie üblich unter Bewegung an der Sedimentation gehindert werden und zur Aggregation zusammenkommen.Alternatively, the cells can be moved as usual be prevented from sedimentation and come together for aggregation.

Um eine zu starke Vergrößerung der Aggregate während dem Wachstumsprozess zu vermeiden, können die Zellen in einer entsprechenden Vorrichtung über ein Gitter mit einer schneidenden Maschenstruktur von 500 μm Größe geführt werden, so dass immer wieder neue Tochteraggregate entstehen können. Dies kann in einem vollständig geschlossenen System geschehen. Idealerweise werden berührungslose Pumpsysteme (keine Quetschung durch peristaltische Systeme, sondern magnetisch oder durch Druckluftkompression von Schläuchen erzeugte, gerichtete Ströme oder Kolbenpumpen – automatisch oder manuell) eingesetzt.To enlarge the Aggregates during To avoid the growth process, the cells can be placed in an appropriate Device over a grid with a cutting mesh structure of 500 μm in size is guided, so that new subsidiary units can always be created. This can be complete in one closed system happen. Ideally, be touchless Pump systems (no crushing by peristaltic systems, but generated magnetically or by compressed air compression of hoses, directed currents or piston pumps - automatically or manually).

Danach können die Zellen eingekapselt und eingefroren werden. In der Kapselstruktur, können strukturierte Formen und Räume integriert werden, die eine in situ Wachstumsstruktur und Vergrößerung ermöglicht.The cells can then be encapsulated and be frozen. In the capsule structure, structured shapes and Integrated spaces which enables an in situ growth structure and enlargement.

Alternativ kann auf die Kapsel verzichtet werden und durch die Präsenz der endothelialen Zellen in diesem System und gezielte Zugabe dieser Zellen eine Endothelialisierung und damit optimale Hämokompatibilität erreicht werden.Alternatively, the capsule can be dispensed with and through the presence of the endothelial cells in this system and targeted addition of these Cells reached endothelialization and thus optimal hemocompatibility become.

Durch den Scherstress in einem perfundierten Bioreaktor kommt es zu einer spontanen Konfluenz der Endothelzellen auf den Oberflächen der Aggregate. Bei Erreichen der Zielgröße können diese z.B. in den bereits Idealerweise zur Kultur verwendeten Beuteln eingefroren werden.Due to the shear stress in a perfused Bioreactor results in spontaneous confluence of the endothelial cells on the surfaces of the aggregates. When the target size is reached, these can e.g. in the already Ideally, bags used for culture should be frozen.

4. Weichteilgewebe (Muskelpatches, Nerven, Sehnen)4. Soft tissue (muscle patches, Nerves, tendons)

Für die Rekonstruktion von Bauchwanddefekten können Collagenfliese oder Fließe wie Laminin, Fibronektin mit oder ohne synthetische oder anderweitige Grundstruktur, wie z.B. Kunststoff oder eine biologische Matrix, oder räumlich definierte Strukturen (Röhren bei Nerven, Sehnen) entsprechend wie oben hergestellt werden. Diese Collagenfliese oder Strukturen werden geformt, mit TPO, EPO und/oder Wachstumshormon (GH) beschichtet und implantiert oder mit Zellen des Zielgewebes (z.B. Tendozyen, Neuronen) vorbesiedelt.For the reconstruction of abdominal wall defects can be collagen tile or tile such as laminin, Fibronectin with or without a synthetic or other basic structure, such as. Plastic or a biological matrix, or spatially defined structures (tubes for nerves, tendons) are produced as described above. This Collagen tiles or structures are formed with TPO, EPO and / or Growth hormone (GH) coated and implanted or with cells of the target tissue (e.g. Tendozyen, neurons) pre-populated.

Eine biologische Matrix (allogene oder autologe Herzklappe mit und ohne Azellularisierung, eine synthetische Trägerstruktur aus Kunststoffen, die dem physiologischem Mikromilieu des Zielgewebes hinsichtlich chemischer Zusammensetzung der Kollagene und deren räumlicher Anordnung nahe kommt) wird mit Thrombopoietin und Erythropoietin als Wachstumsfaktoren vorbeschichtet.A biological matrix (allogeneic or autologous heart valve with and without acellularization, a synthetic support structure made of plastics that respect the physiological micro-environment of the target tissue chemical composition of the collagens and their spatial Arrangement comes close) with thrombopoietin and erythropoietin as Growth factors pre-coated.

Danach wird das Material mit Plasmaionisation behandelt (z. B. unter Verwendung von Wasserstoffperoxid, H2O2) wodurch zugleich eine Sterilisation erreicht wird, so dass eine Aktivierung der Oberflächen eintritt und das Konstrukt in eine Lösung mit Thrombopoietin, Erythopoietin und/oder Wachstumshormon eingelegt und damit in geringen Mengen definiert beschichtet wird. Alternativ kann eine Inkubation in einer Lösung ohne vorherige Oberflächenaktivierung oder eine Beschichtung mit einer biodegradablen (Bio)polymerschicht, die diese Wachstumsfaktoren enthält, erfolgen. Hier kann z.B. Fibrin, Plasma, Collagen und/oder Polylaktide eingesetzt werden.The material is then treated with plasma ionization (e.g. using hydrogen peroxide, H 2 O 2 ), whereby sterilization is achieved at the same time, so that activation of the surfaces occurs and the construct in a solution with thrombopoietin, erythopoietin and / or growth hormone inserted and thus coated in small quantities. Alternatively, incubation in a solution without prior surface activation or coating with a biodegradable (bio) polymer layer containing these growth factors can take place. For example, fibrin, plasma, collagen and / or polylactides can be used here.

Dieses Konstrukt wird danach entweder sofort an den Bedarfsort (Bauchwand, Herzmuskel, Skelettmuskel als Patch) eingebracht oder in vitro mit gewebespezifischen Zellen, Vorläuferzellen oder Knochenmarkszellen vorbesiedelt. Dadurch wird erreicht, dass der in vivo Wundheilungsprozess in vitro vorweggenommen wird und damit nach Implantation in vivo (z.B. nach 7 Tagen) eine verkürzte Reintegrationszeit erfolgen kann. Eine Kombination mit Faktoren der Nervenregeneration (NGF) oder Gefäßregeneration (VEGF, PDGF) ist möglich, aber nicht zwingend erforderlich.This construct is then either immediately to the place of need (abdominal wall, heart muscle, skeletal muscle as Patch) or in vitro with tissue-specific cells, progenitor cells or pre-colonized bone marrow cells. This ensures that the in vivo wound healing process is anticipated in vitro and thus a shorter reintegration time after implantation in vivo (e.g. after 7 days) can be done. A combination with factors of nerve regeneration (NGF) or vascular regeneration (VEGF, PDGF) is possible but not absolutely necessary.

In vivo und in vitro kommt es zur Integration des blutbildenden und stammzellreichen Knochenmarks wie auch zu einer beschleunigten Differenzierung von Fibroblasten und glatten Muskelzellen und einer beschleunigten Resorption der Trägermatrix und einen Ersatz durch normales kardiovaskuläres Gewebe. Durch die Rekrutierungskompetenz und den induktiven Charakter erfolgte eine ortspezifische Integration.In vivo and in vitro Integration of the blood-forming and stem cell-rich bone marrow as well as an accelerated differentiation of fibroblasts and smooth muscle cells and accelerated absorption of the Carrier matrix and a replacement with normal cardiovascular tissue. Through the recruitment competence and the inductive character was a site-specific integration.

Diese kann weitergefördert werden, in dem bereits in vitro eine Übersiedlung an den externen Seiten mit Keratinozysten (Bauchmuskel), Schwannschen Zellen und/oder Fasergewebe erfolgt.This can be promoted in which a move already in vitro on the external sides with keratin cysts (abdominal muscles), Schwannschen Cells and / or fiber tissue takes place.

Claims (24)

Verfahren zur Vermehrung und Differenzierung von Zellen in vitro, dadurch gekennzeichnet, dass der Wachstumsprozess der Zellen durch den Einsatz der Wachstumsfaktoren Thrombopoietin (TPO) und/oder Erythropoietin (EPO), und/oder Wachstumshormon (GH), insbesondere "Human Growth Hormone" (HGH), und/oder Somatostatin und/oder "Leukemia Inhibitory Factor" (LIF) und/oder "Ciliary Neurotropic Factor" (CNTF) eingeleitet bzw. terminiert und strukturell gelenkt wird.A process for the proliferation and differentiation of cells in vitro, characterized in that the growth process of the cells by the use of the growth factors thrombopoietin (TPO) and / or erythropoietin (EPO), and / or growth hormone (GH), in particular "human growth hormone" (HGH), and / or somatostatin and / or "leukemia inhibitory factor" (LIF) and / or "Ciliary Neurotropic Factor" (CNTF) is initiated or terminated and structurally controlled. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Wachstumsfaktor zusätzlich "Transforming Growth Factor beta" (TGF beta), Prostaglandine, Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor (GM-CSF), "Growth Hormone Releasing Hormone" (GHRH), "Thyrotropinreleasing Homone" (TRH), "Gonadotropin-releasing Hormone" (GnRH), "Corticotropin-releasing Hormone" (CRH), Dopamin, "Antidiuretic Hormon" (ADH), Oxytocin, Prolactin, Adrenocorticotropin, beta-Celltropin, Lutrotropin und/oder Vasopressin eingesetzt wird.A method according to claim 1 or 2, characterized in that "Transforming Growth Factor beta "(TGF beta), prostaglandins, granulocyte macrophage stimulating factor (GM-CSF), "Growth Hormone Releasing Hormones "(GHRH)," Thyrotropin-releasing Homone "(TRH)," Gonadotropin-releasing Hormones "(GnRH)," Corticotropin-releasing Hormones "(CRH), dopamine," antidiuretic hormones "(ADH), oxytocin, prolactin, Adrenocorticotropin, beta-celltropin, lutrotropin and / or vasopressin is used. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich ein oder mehrere Nervenregenerationsfaktoren, vorzugsweise "nerve growth factor" (NGF) und/oder ein oder mehrere Gefäßregenerationsfaktoren, vorzugsweise "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF) und/oder "Plateled Derived Growth Factor" (PDGF), eingesetzt werden.A method according to claim 1 or 2, characterized in that additionally one or more nerve regeneration factors, preferably "nerve growth factor" (NGF) and / or one or several vascular regeneration factors, preferably "vascular endothelial Growth Factor "(VEGF) and / or "Plateled Derived Growth Factor "(PDGF), be used. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in Anwesenheit von Endothelzellen durchgeführt wird.Method according to at least one of claims 1 to 3, characterized in that that the procedure is carried out in the presence of endothelial cells. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Wachstumsprozess der Zellen lokal eingeleitet bzw. terminiert und strukturell gelenkt wird.Method according to at least one of claims 1 to 4, characterized in that that the growth process of the cells is initiated or terminated locally and is structurally controlled. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Wachstumsprozess der Zellen durch eine biologische Matrix oder durch eine Trägerstruktur lokal eingleitet bzw. terminiert und strukturell gelenkt wird.A method according to claim 5, characterized in that the Cell growth process through a biological matrix or through a support structure is initiated locally or scheduled and structurally controlled. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Matrix oder Trägerstruktur mit einem der genannten Wachstumsfaktoren oder mit einer Kombination der genannten Wachstumsfaktoren als Mischung oder sequenziell behandelt wird.A method according to claim 6, characterized in that the biological matrix or carrier structure with one of the growth factors mentioned or with a combination the growth factors mentioned are treated as a mixture or sequentially becomes. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass als biologische Matrix oder als Trägerstruktur ein Implantat, ein Transplantat und/oder ein Trägermaterial zum Wachstum von Zellen verwendet wird.A method according to claim 6 or 7, characterized in that an implant as a biological matrix or as a support structure, a graft and / or a carrier material is used to grow cells. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Matrix oder Trägerstruktur mit Zellen, vorzugsweise gewebespezifischen Zellen, Vorläuferzellen, Knochenmarkszellen, peripheres Blut, Fettgewebe und/oder Fasergewebe, vorbesiedelt oder für die in vivo Besiedelung bzw. das induktive Remodelling in vitro bereits vorbereitet wurde.Method according to at least one of claims 1 to 8, characterized in that that the biological matrix or carrier structure with cells, preferably tissue-specific cells, progenitor cells, Bone marrow cells, peripheral blood, adipose tissue and / or fibrous tissue, pre-populated or for in vivo colonization or inductive remodeling in vitro has already been prepared. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–9, dadurch gekennzeichnet dass als Zellen adulte Progenitorzellen und/oder gewebespezifische Zellen, vorzugsweise Osteoblasten, Fibroblasten, Hepatozyten und/oder glatte Muskelzellen eingesetzt werden.Method according to at least one of claims 1-9, characterized that as cells progenitor cells and / or tissue-specific Cells, preferably osteoblasts, fibroblasts, hepatocytes and / or smooth muscle cells are used. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–10 zur lokal spezifischen und/oder gerichteten Vermehrung, strukturellem Wachstum und nachfolgender Differenzierung adulter Zellen und/oder zur Regeneration von Knochen, Geweben und/oder endokriner Organe.Method according to at least one of claims 1-10 for locally specific and / or directed propagation, structural growth and subsequent Differentiation of adult cells and / or for the regeneration of bones, Tissues and / or endocrine organs. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mittels einer geeigneten Vorrichtung die sich gegebenenfalls während des Wachstumsprozesses bildenden Zellaggregate zerkleinert und gegebenenfalls eingekapselt und gegebenenfalls eingefroren werden.Method according to at least one of claims 1 to 4, characterized in that that by means of a suitable device which may while of the cell aggregates forming the growth process and, if necessary, encapsulated and frozen if necessary. Biologische Matrix oder Trägerstruktur enthaltend mindestens einen der Wachstumsfaktoren TPO, EPO, GH, insbesondere HGH, Somatostatin, LIF und/oder CNTF.Biological matrix or support structure containing at least one of the growth factors TPO, EPO, GH, especially HGH, somatostatin, LIF and / or CNTF. Biologische Matrix oder Trägerstruktur nach Anspruch 13 enthaltend zusätzlich mindestens einen der Wachstumsfaktoren TGF Beta, Prostaglandine, GM-CSF, GHRH, TRH, GnRH, CRH, Dopamin, ADH, Oxytocin, Prolactin, Adrenocorticotropin, beta-Celltropin, Lutrotropin und/oder Vasopressin und gegebenenfalls zusätzlich einen oder mehrere Nervenregenerationsfaktoren, vorzugsweise NGF und/oder einen oder mehrere Gefäßregenerationsfaktoren, vorzugsweise VEGF und/oder PDGF.Biological matrix or support structure according to claim 13 additionally containing at least one of the growth factors TGF beta, prostaglandins, GM-CSF, GHRH, TRH, GnRH, CRH, dopamine, ADH, oxytocin, prolactin, adrenocorticotropin, beta-celltropin, lutrotropin and / or vasopressin and optionally additionally one or more nerve regeneration factors, preferably NGF and / or one or more vascular regeneration factors, preferably VEGF and / or PDGF. Biologische Matrix oder Trägerstruktur nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Matrix oder Trägerstruktur ein Implantat, ein Transplantat und/oder ein Trägermaterial zum Wachstum von Zellen ist.Biological matrix or support structure according to claim 13 or 14, characterized in that the biological Matrix or support structure an implant, a graft and / or a carrier material for the growth of Cells is. Biologische Matrix oder Trägerstruktur nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Matrix oder Trägerstruktur ein Stent, ein Patch, ein Katheter, eine Haut, ein Hydrogel, ein Knochenersatzmaterial, ein allogenes, autologes oder xenogenes, azellularisiertes oder nicht-azellularisiertes Gewebe, ein synthetisches Gewebe, ein Feeder-Layer oder ein Fließ ist.Biological matrix or support structure according to one of the claims 13 to 15, characterized in that the biological matrix or support structure a stent, a patch, a catheter, a skin, a hydrogel, a Bone substitute material, an allogeneic, autologous or xenogeneic, acellularized or non-acellularized tissue, a synthetic Fabric, a feeder layer or a flow. Biologische Matrix oder Trägerstruktur nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Matrix oder Trägerstruktur mit Zellen, vorzugsweise gewebespezifischen Zellen, Vorläuferzellen, Knochenmarkszellen, peripheres Blut, Fettgewebe und/oder Fasergewebe, vorbesiedelt ist.Biological matrix or support structure according to one of the claims 13 to 16, characterized in that the biological matrix or support structure with cells, preferably tissue-specific cells, precursor cells, Bone marrow cells, peripheral blood, adipose tissue and / or fibrous tissue, pre-populated is. Biologische Matrix oder Trägerstruktur nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Matrix oder Trägerstruktur mit einer biodegradablen (Bio)polymerschicht enthaltend mindestens einen der genannten Wachstumsfaktoren beschichtet ist.Biological matrix or support structure according to one of the claims 13 to 17, characterized in that the biological matrix or support structure with a biodegradable (bio) polymer layer containing at least one of the growth factors mentioned is coated. Verfahren zur Herstellung einer biologischen Matrix oder Trägerstruktur nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine gegebenenfalls aktivierte biologische Matrix oder Trägerstruktur mit mindestens einem der Wachstumsfaktoren TPO, EPO, GH, insbesondere HGH, Somatostatin, LIF und/oder CNTF beschichtet wird.Process for the production of a biological matrix or support structure according to at least one of the claims 13 to 18, characterized in that an optionally activated biological matrix or carrier structure with at least one of the growth factors TPO, EPO, GH, in particular HGH, Somatostatin, LIF and / or CNTF is coated. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Matrix oder Trägerstruktw mit zusätzlich mindestens einem der Wachstumsfaktoren TGF beta, Prostaglandin, GM-CSF, GHRH, TRH, GnRH, CRH, Dopamin, ADH, Oxytocin, Prolactin, Adrenocorticotropin, beta-Celltropin, Lutrotropin und/oder Vasopressin und gegebenenfalls zusätzlich mit einem oder mehreren Nervenregenerationsfaktoren, vorzugsweise NGF und/oder einen oder mehreren Gefäßregenerationsfaktoren, vorzugsweise VEGF und/oder PDGF beschichtet wird.A method according to claim 19, characterized in that the called matrix or support structure with additional at least one of the growth factors TGF beta, prostaglandin, GM-CSF, GHRH, TRH, GnRH, CRH, dopamine, ADH, oxytocin, prolactin, Adrenocorticotropin, beta-celltropin, lutrotropin and / or vasopressin and if necessary additionally with one or more nerve regeneration factors, preferably NGF and / or one or more vascular regeneration factors, preferably VEGF and / or PDGF is coated. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung der biologischen Matrix oder Trägerstruktur mittels Plasmaionisation oder Laseraktivierung erfolgt.A method according to claim 19 or 20, characterized in that that the activation of the biological matrix or support structure by means of plasma ionization or laser activation. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte biologische Matrix oder Trägerstruktur in vitro mit Zellen, vorzugsweise gewebespezifischen Zellen, Vorläuferzellen, Knochenmarkszellen, peripheres Blut, Fettgewebe und/oder Fasergewebe, vorbesiedelt wird.Method according to at least one of claims 19 to 21, characterized in that that said biological matrix or carrier structure in vitro with cells, preferably tissue-specific cells, progenitor cells, bone marrow cells, peripheral blood, adipose tissue and / or fibrous tissue, is pre-colonized. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12 und 19 bis 22.Implementation device a procedure according to at least one of the claims 1 to 12 and 19 to 22. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein perfundierter Bioreaktor, vorzugsweise in Form eines geschlossenen Systems ist.Device according to claim 23, characterized in that the Device a perfused bioreactor, preferably in the form of a closed system.
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