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Die
Erfindung betrifft eine Sensor-Einheit, eine Sensor-Anordnung und ein
Verfahren zum Betreiben einer Sensor-Einheit.
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Das
Detektieren von makromolekularen Biopolymeren ist von großem Interesse
für viele
Bereiche der chemischen, biologischen und pharmazeutischen Analytik.
Insbesondere werden zeitlich parallel eine Vielzahl von Biopolymeren
in einer Lösung
simultan analysiert, wodurch ein hoher Durchsatz ermöglicht ist
("high-throughput-screening"). Dies ist beispielsweise
für die
Erforschung von neuartigen pharmazeutischen Wirkstoffen mittels
kombinatorischer Chemie von essentieller Bedeutung.
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In 1A, 1B ist ein Biosensor 100 gezeigt,
wie er in [1] beschrieben ist.
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Der
Sensor 100 weist zwei Elektroden 101, 102 aus
Gold auf, die in einer Isolatorschicht 103 aus elektrisch
isolierendem Material eingebettet sind. An die Elektroden 101, 102 sind
Elektrodenanschlüsse 104, 105 angeschlossen,
mittels derer ein elektrisches Potential an die Elektroden 101, 102 angelegt werden
kann. Auf jeder Elektrode 101, 102 sind DNA-Sondenmoleküle 106 (auch
als Fängermoleküle bezeichnet)
immobilisiert. Das Immobilisieren erfolgt unter Verwendung der Gold-Schwefel-Kopplung,
die eine besonders günstige
Kopplungschemie aufweist. Ein zu untersuchender Analyt, beispielsweise
ein Elektrolyt 107, ist in Wirkkontakt mit den Elektroden 101, 102 gebracht.
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Sind
in dem Elektrolyt 107 DNA-Stränge 108 mit einer
Basensequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA- Sondenmoleküle 106 komplementär ist, das
heißt
die zu den Fängermolekülen gemäß dem Schlüssel-Schloss-Prinzip
sterisch passen, so hybridisieren diese DNA-Stränge 108 mit den DNA-Sondenmolekülen 106,
vgl. 1B.
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Ein
Hybridisieren eines DNA-Sondenmoleküls 106 und eines DNA-Strangs 108 findet
nur statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Sondenmoleküls 106 und
des entsprechenden DNA-Strangs 108 zueinander
komplementär
sind. Ist dies nicht der Fall, so findet keine Hybridisierung statt.
Daher ist ein DNA-Sondenmolekül
einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage, einen bestimmten,
nämlich den
DNA-Strang mit dazu komplementärer
Sequenz, zu binden.
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Erfolgt
eine Hybridisierung, so verändert sich,
wie aus 1B ersichtlich,
der Wert der Impedanz zwischen den Elektroden 101 und 102.
Die möglicherweise
veränderte
Impedanz wird mittels Anlegens einer geeigneten elektrischen Spannung an
die Elektrodenanschlüsse 104, 105 und
mittels Erfassens des daraus resultierenden elektrischen Stroms
detektiert.
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Im
Falle einer Hybridisierung verändert
sich die Impedanz zwischen den Elektroden 101, 102. Dies
ist darauf zurückzuführen, dass
sowohl die DNA-Sondenmoleküle 106 als
auch die DNA-Stränge 108,
die möglicherweise
mit den DNA-Sondenmolekülen 106 hybridisieren,
elektrisch nichtleitend sind und somit anschaulich die jeweilige
Elektrode 101, 102 teilweise elektrisch abschirmen.
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Zum
Verbessern der Messgenauigkeit ist aus [2] bekannt, eine Mehrzahl
von Elektrodenpaaren zu verwenden und diese parallel zueinander
anzuordnen, wobei diese anschaulich miteinander verzahnt angeordnet
sind, wodurch sich eine sogenannte Interdigitalelektrode ergibt.
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Als
weiteres elektrisches Detektions-Verfahren ist das sogenannte Redox-Recycling-Verfahren bekannt.
Gemäß diesen werden
zu erfassende DNA-Halbstränge
mit einem derartigen Molekül-Label
versehen, mittels dem eine einsetzende Reduktion bzw. Oxidation
in Form eines elektrischen Stroms erfassbar ist. Grundlagen über einen
solchen Reduktions-/Oxidations-Recycling-Vorgang zum Erfassen makromolekularer
Biomoleküle
ist beispielsweise aus [1], [3] bekannt. Ein Redox-Recycling-Vorgang wird
im Weiteren anhand 2A bis 2C näher erläutert.
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In 2A ist ein Biosensor 200 mit
einer ersten Elektrode 201 und einer zweiten Elektrode 202 gezeigt,
die auf einer Isolatorschicht 203 aufgebracht sind. Auf
der ersten Elektrode 201 aus Gold ist ein Haltebereich 204 aufgebracht.
Der Haltebereich 204 dient zum Immobilisieren von DNA-Sondenmolekülen 205 auf
der ersten Elektrode 201. Auf der zweiten Elektrode 202 ist
ein solcher Haltebereich nicht vorgesehen.
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Sollen
mittels des Biosensors 200 DNA-Stränge 207 einer Sequenz,
die komplementär ist
zu der Sequenz der immobilisierten DNA-Sondenmoleküle 205,
erfasst werden, so wird der Sensor 200 mit einer zu untersuchenden
Lösung,
beispielsweise einem Elektrolyt 206, in Wirkkontakt gebracht, derart,
dass in der zu untersuchenden Lösung 206 eventuell
enthaltene DNA-Stränge 207 mit
einer zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 205 komplementären Sequenz
hybridisieren können.
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In 2B ist der Fall gezeigt,
dass in der zu untersuchenden Lösung 206 die
zu erfassenden DNA-Stränge 207 enthalten
sind und bereits mit den DNA-Sondenmolekülen 205 hybridisiert
sind. Die DNA-Stränge 207 in
der zu untersuchenden Lösung sind
mit einem Enzym 208 markiert, mit dem es möglich ist,
die im weiteren beschriebenen Moleküle in elektrisch geladene Teilmoleküle zu spalten. Üblicherweise
ist die Anzahl von DNA-Sondenmolekülen 205 in der zu
untersuchenden Lösung 206 erheblich größer als
die Anzahl zu erfassender DNA-Stränge 207.
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Nachdem
in der zu untersuchenden Lösung 206 möglicherweise
enthaltene DNA-Stränge 207 mit immobilisierten
DNA-Sondenmolekülen 205 hybridisiert
sind, erfolgt eine Spülung
des Biosensors 200, wodurch die nicht hybridisierten DNA-Stränge 205 entfernt
werden und der Biosensorchip 200 von der zu untersuchenden
Lösung 206 gereinigt
wird. Einer zur Spülung
verwendeten Spüllösung wird
eine elektrisch ungeladene Substanz beigegeben, die Moleküle enthält, die
mittels des Enzyms 208 an den hybridisierten DNA-Strängen 207 gespalten
werden können,
in ein erstes Teilmolekül 210 mit
einer negativen elektrischen Ladung und in ein zweites Teilmolekül mit einer
positiven elektrischen Ladung.
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Die
negativ geladenen ersten Teilmoleküle 210 werden, wie
in 2C gezeigt, zu der
positiv geladenen ersten Elektrode 201 gezogen, was mittels eines
Pfeils 211 in 2C angedeutet
ist. Die negativ geladenen ersten Teilmoleküle 210 werden an der ersten
Elektrode 201, die ein positives elektrisches Potential
aufweist, oxidiert, und werden als oxidierte Teilmoleküle 213 an
die negativ geladene zweite Elektrode 202 gezogen, wo sie
wieder reduziert werden. Die reduzierten Teilmoleküle 214 wiederum wandern
zu der positiv geladenen ersten Elektrode 201. Auf diese
Weise wird ein elektrischer Kreisstrom generiert, der charakteristisch
ist für
die Anzahl der jeweils mittels der Enzyme 206 generierten
Ladungsträger.
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Gemäß einem
optischen Verfahren zum Detektieren von Biomolekülen werden diese mit einem Fluoreszenzfarbstoff
markiert. Infolge eines Hybridisierungsereignisses zwischen an einer
Sensoroberfläche
immobilisierten Fängermolekülen und
mit Fluoreszenzmarkern versehenen zu erfassenden Partikeln verändert sich
eine detektierbare Intensität
von elektromagnetischer Strahlung, die von den Fluoreszenzlabeln
nach entsprechender Anregung mit elektromagnetischer Primärstrahlung
reemittiert werden kann. Die Veränderung
der Intensität
ist charakteristisch für
die Anzahl der erfolgten Hybridisierungsereignisse.
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Allerdings
ist die Messunsicherheit bei den vorgestellten Verfahren erheblich.
Außerdem
sind die vorgestellten Biochipsysteme aufwendig zu kalibrieren.
Das Hauptproblem ist jedoch die hohe Messunsicherheit und die geringe
Reproduzierbarkeit der Ereignisse.
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Der
Erfindung liegt das Problem zugrunde, eine Sensor-Einheit bereitzustellen,
die gegenüber den
aus dem Stand der Technik bekannten Sensoren eine erhöhte Nachweisempfindlichkeit
und eine verbesserte Fehlerrobustheit aufweisen.
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Das
Problem wird durch eine Sensor-Einheit, durch eine Sensor-Anordnung
und durch ein Verfahren zum Betreiben einer Sensor-Einheit mit den Merkmalen
gemäß den unabhängigen Patenansprüchen gelöst.
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Die
erfindungsgemäße Sensor-Einheit
hat ein Substrat, auf dem Fängermoleküle immobilisierbar
sind. Ferner weist die Sensor-Einheit
eine elektrische Erfassungseinheit auf und/oder in dem Substrat auf,
die derart eingerichtet ist, dass damit ein in Zusammenhang mit
einem Hybridisierungsereignis zwischen in einem Analyt möglicherweise
enthaltenen zu erfassenden Partikeln und Fängermolekülen veränderter elektrischer Parameter
in Form eines ersten Signals erfassbar ist. Darüber hinaus hat die Sensor-Einheit
eine optische Erfassungseinheit auf und/oder in dem Substrat, die
derart eingerichtet ist, dass eine in Zusammenhang mit einem Hybridisierungsereignis
zwischen in einem Analyten möglicherweise
enthaltenen zu erfassenden Partikeln und Fängermolekülen veränderte auf die optische Erfassungseinheit
einfallende elektromagnetische Strahlungsintensität in Form
eines zweiten Signals erfassbar ist. Die Sensor-Einheit hat ferner
eine mit der elektrischen und optischen Erfassungseinheit gekoppelte
Auswerteeinheit, die derart eingerichtet ist, dass damit das erste
und das zweite Signal gemeinsam auswertbar sind.
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Ferner
ist erfindungsgemäß eine Sensor-Anordnung
mit einer Mehrzahl von Sensor-Einheiten mit den oben genannten Merkmalen
geschaffen.
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Darüber hinaus
ist ein Verfahren zum Betreiben einer Sensor-Einheit mit den oben genannten Merkmalen
bereitgestellt, wobei gemäß dem Verfahren
ein Analyt in die Sensor-Einheit eingebracht wird, so dass in dem
Analyt möglicherweise
enthaltene zu erfassende Partikel mit den Fängermolekülen hybridisieren können. Ferner
wird ein in Zusammenhang mit einem Hybridisierungsereignis veränderter
elektrischer Parameter in Form eines ersten elektrischen Signals
mittels der elektrischen Erfassungseinheit erfasst. Eine in Zusammenhang
mit einem Hybridisierungsereignis veränderte auf die optische Erfassungseinheit
einfallende elektromagnetische Strahlungsintensität wird in
Form eines zweiten Signals mittels der optischen Erfassungseinheit
erfasst. Dann werden das erste und das zweite Signal mittels der
Auswerteeinheit gemeinsam ausgewertet.
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Eine
Grundidee der Erfindung besteht anschaulich darin, ein elektrisches
und ein optisches Messverfahren miteinander derart zu kombinieren, dass
mittels Erfassens eines Sensorereignisses unter Verwendung zweier
komplementärer
Detektions-Verfahren die Messgenauigkeit erhöht und die Fehlerrobustheit
des Sensors verbessert ist. Mit anderen Worten wird ein Sensorereignis
in Form zweier, jeweils mit unvermeidbaren statistischen und/oder systematischen
Fehlern behafteter Signale (optisch und elektrisch) detektiert.
Dadurch ist eine gegenseitige Kontrollmöglichkeit geschaffen, wodurch
der Grad der Verlässlichkeit
der Messung verbessert ist. Durch eine Mittelung der Signale wird
der Messfehler verringert. Die Abweichung der Messergebnisse voneinander
ist ein Maß für die Güte der Messung.
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Daher
ist eine Sensor-Einheit zum Detektieren von makromolekularen Biopolymeren
mit einer On-Chip-Detektion geschaffen, bei der ein elektrisches
und ein optisches Messverfahren im Rahmen der Auswertung miteinander
kombiniert werden, um eine verbesserte Genauigkeit zu erreichen.
Vorzugsweise werden auf einem Chip eine optische und eine elektrische
Erfassungseinheit ausgebildet und mit einer Auswerteeinheit gekoppelt
derart, dass sowohl ein optisches Messsignal infolge eines Hybridisierungsereignisses
zu erfassender makromolekularer Biopolymere als auch ein elektrisches
Messsignal aufgenommen werden können,
die unter Verwendung der Auswerteeinheit ausgewertet werden. Als elektrisches
Messverfahren kann zum Beispiel das oben beschriebenen Impedanzverfahren
oder das oben beschriebene Redox-Recycling-Verfahren verwendet werden.
Als optische Messgröße dient
beispielsweise eine erhöhte
Absorption elektromagnetischer Strahlung infolge eines Hybridisierungsereignisses
zu erfassender makromolekularer Biopolymere. Auch kann eine Emission
elektromagnetischer Strahlung durch mit zu erfassenden Biopolymeren gekoppelten
Farbstoffen (unter Verwendung der Phänomene der Fluoreszenz bzw.
der Chemolumineszenz) zum optischen Detektieren verwendet werden.
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Mittels
Kombinierens eines elektrischen und eines optischen Messverfahrens
wird die Messgenauigkeit bei der Detektion von makromolekularen Biomolekülen verbessert
und die Fehlerempfindlichkeit herabgesetzt.
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Bevorzugte
Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
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Bei
der Sensor-Einheit der Erfindung kann die Auswerteeinheit derart
eingerichtet sein, dass sie, wenn ein Vergleich zwischen dem ersten
und der zweiten Signal eine Ergebnis innerhalb eines vorgebbaren
Toleranzbereichs liefert, an einem Ausgang einen Messwert bereitstellt.
Wenn ein Vergleich zwischen dem ersten und dem zweiten Signal ein
Ergebnis außerhalb
des vorgebbaren Toleranzbereichs liefert, wird an einem Ausgang
ein Fehlersignal bereitgestellt.
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Die
Auswerteeinheit kann eine Integratoreinheit zum zeitlichen Integrieren
des ersten und/oder zweiten Signals aufweisen. Mittels Summierens
von Sensorereignissen über
ein vorgebbares Zeitintervall hinweg können hinsichtlich Amplitude
bzw. Anzahl der Hybridisierungsereignisse selbst sehr kleine Messsignale
erfasst werden (z.B. bei einem Analyten, der zu erfassende Partikel
in einer sehr geringen Konzentration aufweist). Dadurch ist die
Messgenauigkeit erhöht.
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Die
Sensor-Einheit kann ferner auf dem Substrat immobilisierte Fängermoleküle aufweisen,
die derart eingerichtet sind, dass in einem Analyt möglicherweise
enthaltene zu erfassende Partikel mit den Fängermolekülen hybridisieren können.
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Die
Fängermoleküle können auf
einer Halteschicht immobilisiert sein, die auf dem Substrat ausgebildet
sein kann. Mittels Auswählens
des Materials der Halteschicht kann eine besonders vorteilhafte Kopplungschemie
zwischen Fängermolekülen und der
Halteschicht erzielt werden.
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Die
Halteschicht weist vorzugsweise Siliziumdioxid und/oder Gold auf.
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Die
Fängermoleküle können Oligonukleotide,
DNA-Halbstränge,
Peptide, Proteine oder niedermolekulare Verbindungen sein.
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Insbesondere
können
die Fängermoleküle zum Hybridisieren
mit makromolekularen Biomolekülen
eingerichtet sein. In diesem Fall ist die Sensor-Einheit anschaulich
als Biosensor ausgestaltet.
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Das
Substrat kann Silizium aufweisen, wodurch die Vorzüge der Siliziummikroelektronik
ausgenutzt werden können.
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Darüber hinaus
kann die optische Erfassungseinheit eine Photodiode, eine Anordnung
von Photodioden, eine CMOS-Kamera ("complementary metal-oxide-semiconductor") oder eine CCD-Kamera ("charge coupled device") sein.
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Insbesondere
kann die optische Erfassungseinheit unterhalb der Halteschicht ausgebildet
sein.
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Das
erste Signal kann für
den Wert eines ohmschen Widerstands, einer elektrischen Spannung,
eines elektrischen Stroms oder einer Kapazität charakteristisch sein. Das
zweite Signal kann für
eine elektrische Spannung oder einen elektrischen Strom charakteristisch
sein.
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Die
elektrische Erfassungseinheit kann ein oder zwei Elektroden aufweisen,
die in einem Oberflächenbereich
des Substrats ausgebildet ist oder sind.
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Darüber hinaus
kann die Sensor-Einheit eine Fängermolekül-Entfern-Einrichtung
aufweisen, die derart eingerichtet ist, dass damit spezifisch solche Fängermoleküle von der
Sensor-Einheit entfernbar sind,
die von einer Hybridisierung mit von in einem Analyten möglicherweise
enthaltenen zu erfassenden Partikeln frei sind. Die Fängermolekül-Entfern-Einrichtung
ist vorzugsweise derart eingerichtet, dass damit eine Spüllösung in
Wirkkontakt mit der Sensor-Einheit gebracht werden kann, wodurch
aufgrund der Funktionalität
der Spüllösung nur
einsträngige,
nicht aber doppelsträngige
DNA von der Sensor-Einheit entfernt wird.
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Die
Fängermoleküle können ein
Fluoreszenzlabel aufweisen, das derart eingerichtet ist, dass bei
Einstrahlen elektromagnetischer Primärstrahlung auf das Fluoreszenzlabel
elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung von dem Fluoreszenzlabel
emittiert wird, die von der optischen Erfassungseinheit erfassbar
ist.
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Ferner
können
die Fängermoleküle derart eingerichtet
sein, dass bei Einstrahlen elektromagnetischer Strahlung auf das
Fängermolekül das Fängermolekül die elektromagnetische
Strahlung zumindest teilweise absorbiert, so dass eine verminderte
auf die optische Erfassungseinheit einfallende Strahlungsintensität erfassbar
ist.
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Darüber hinaus
können
die Fängermoleküle ein Chemolumineszenzlabel
aufweisen, das derart eingerichtet ist, dass infolge Einwirkens
eines Lumineszenzstoffs auf das Chemolumineszenzlabel elektromagnetische
Chemolumineszenzstrahlung emittiert wird, die von der optischen
Erfassungseinheit erfassbar ist.
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Die
Fängermoleküle können ein
Redoxlabel aufweisen, das derart eingerichtet ist, dass bei Einwirken
eines Redoxstoffs auf das Redoxlabel elektrische Ladungsträger generiert
werden, die von der elektrischen Erfassungseinheit erfassbar sind.
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Im
Weiteren wird die erfindungsgemäße Sensor-Anordnung,
die erfindungsgemäße Sensor-Einheiten
aufweist, näher
beschrieben. Ausgestaltungen der Sensor-Einheit gelten auch für die Sensor-Einheiten
aufweisende Sensor-Anordnung.
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Unterschiedliche
Sensor-Einheiten der erfindungsgemäßen Sensor-Anordnung können unterschiedliche
Fängermoleküle aufweisen.
Dadurch ist eine hochgradig parallele Analyse ermöglicht,
so dass simultan eine Vielzahl unterschiedlicher Komponenten eines
Analyten mittels der erfindungsgemäßen Sensor-Anordnung quantitativ
erfasst werden können.
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Die
Sensor-Anordnung kann als in einem Halbleiter-Chip integrierte Sensor-Anordnung
eingerichtet sein. Mit anderen Worten können die Komponenten der Sensor-Anordnung
in einem Halbleiter-Chip oder Wafer (z.B. aus Silizium) als integrierte Bauelemente
realisiert sein.
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Ausführungsbeispiele
der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden im Weiteren
näher erläutert.
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Es
zeigen:
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1A, 1B Querschnittsansichten
eines Sensors gemäß dem Stand
der Technik in unterschiedlichen Betriebszuständen,
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2A bis 2C einen
auf dem Prinzip des Redox-Recyclings basierenden Biosensor gemäß dem Stand
der Technik in unterschiedlichen Betriebszuständen,
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3A bis 3E Querschnittsansichten einer
Sensor-Anordnung
gemäß einem
ersten Ausführungsbeispiel
der Erfindung in unterschiedlichen Betriebszuständen,
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4A bis 4E Querschnittsansichten einer
Sensor-Anordnung gemäß einem
zweiten Ausführungsbeispiel
der Erfindung in unterschiedlichen Betriebszuständen.
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Im
Weiteren wird bezugnehmend auf 3A bis 3E eine
Sensor-Anordnung 300 gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel
der Erfindung beschrieben.
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Die
in 3A gezeigte Sensor-Anordnung 300 weist
eine erste Sensor-Einheit 301 und eine zweite Sensor-Einheit 302 auf.
Die Sensor-Anordnung 300 hat ein Silizium-Substrat 303.
Auf einem ersten Oberflächenbereich
des Silizium-Substrats 303 ist eine erste Gold-Halteschicht 304 aufgebracht, und
auf einem zweiten Oberflächenbereich
des Silizium-Substrats 303 ist eine zweite Gold-Halteschicht 305 aufgebracht.
Auf der ersten Gold-Halteschicht 304 ist ein erster DNA-Halbstrang 306 eines
ersten Typs von DNA-Halbsträngen
(d.h. erste Basensequenz) immobilisiert, und auf der zweiten Gold-Halteschicht 305 ist
ein zweiter DNA-Halbstrang 307 eines zweiten Typs von DNA-Halbsträngen (d.h.
zweite Basensequenz) immobilisiert. Ferner weist die erste Sensor-Einheit 301 ein
erstes Elektrodenpaar aus Elektroden 308a, 308b als
erste elektrische Erfassungseinheit auf. Das erste Elektrodenpaar 308a, 308b ist
derart eingerichtet, dass damit ein elektrischer Parameter, der
durch ein Hybridisierungsereignis zwischen in einem Analyten 309 möglicherweise enthaltenen
zu erfassenden Partikeln und einem ersten DNA-Halbstrang 306 charakteristisch
verändert wird,
in Form eines ersten Signals erfassbar ist. Darüber hinaus weist die erste
Sensor-Einheit 301 eine erste Photodiode 310 als
erste optische Erfassungseinheit in dem Silizium-Substrat 303 auf,
die derart eingerichtet ist, dass eine im Zusammenhang mit einem
Hybridisierungsereignis zwischen in dem Analyten 309 möglicherweise
enthaltenen zu erfassenden Partikeln und dem ersten DNA-Halbstrang 306 veränderte auf
die erste Photodiode 310 einfallende elektromagnetische
Strahlungsintensität
in Form eines zweiten Signals erfassbar ist.
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Ferner
weist die zweite Sensor-Einheit 302 als zweite elektrische
Erfassungseinheit ein zweites Elektrodenpaar aus einer dritten Elektrode 311a und einer
vierten Elektrode 311b auf, die derart eingerichtet ist,
dass damit ein in Zusammenhang mit einem Hybridisierungsereignis
zwischen in dem Analyten 309 möglicherweise enthaltenen zu
erfassenden Partikeln und dem zweiten DNA-Halbstrang 307 veränderter
elektrischer Parameter in Form eines dritten Signals erfassbar ist.
Darüber
hinaus hat die zweite Sensor-Einheit 302 eine zweite Photodiode 312 als zweite
optische Erfassungseinheit, die derart eingerichtet ist, dass eine
in Zusammenhang mit einem Hybridisierungsereignis zwischen in dem
Analyten 309 möglicherweise
enthaltenen zu erfassenden Partikeln und dem zweiten DNA-Halbstrang 307 veränderte auf die
zweite Photodiode 312 einfallende elektromagnetische Strahlungsintensität in Form
eines vierten Signals erfassbar ist. Ferner hat die Sensor-Anordnung 300 ein
mit dem Photodioden 310, 312 sowie den Elektroden 308a, 308b, 311a, 311b gekoppelte
Auswerteeinheit 313, die derart eingerichtet ist, dass
damit das erste und das zweite Signal bzw. das dritte und vierte
Signal jeweils gemeinsam auswertbar sind. Mittels der Auswerteeinheit 313 ist der
Wert eines elektrischen Photostroms der ersten Photodiode 310 infolge
des Einfallens elektromagnetischer Strahlung auf die erste Photodiode 310 auswertbar.
Ferner ist mittels der Auswerteeinheit 313 der Wert eines
zwischen der ersten Elektrode 308a und der zweiten Elektrode 308b fließenden elektrischen
Stroms und der Wert eines elektrischen Photostroms der zweiten Photodiode 312 infolge
des Einfallens elektromagnetischer Strahlung auf die zweite Photodiode 312 auswertbar.
Darüber
hinaus ist mittels der Auswerteeinheit 313 der Wert eines
zwischen der dritten Elektrode 311a und der vierten Elektrode 311b fließenden elektrischen
Stroms auswertbar.
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Der
erste DNA-Halbstrang 306 und der zweite DNA-Halbstrang 307 weisen
jeweils ein Chemolumineszenzlabel 314 auf, das derart eingerichtet
ist, dass unter Einwirkung eines Lumineszenzstoffs auf das Chemolumineszenzlabel 314 elektromagnetische
Chemolumineszenzstrahlung emittiert wird, die von der ersten Photodiode 310 bzw.
zweiten Photodiode 312 erfassbar ist. Ferner weisen die
DNA-Halbstränge 306, 307 jeweils
ein Redoxlabel 315 auf, das derart eingerichtet ist, dass
bei Einwirken eines Redoxstoffs auf das Redoxlabel 315 elektrische
Ladungsträger
generiert werden, die in Form eines zwischen der ersten und zweiten
Elektrode 308a, 308b bzw. zwischen der dritten
und vierten Elektrode 311a, 311b fließenden elektrischen
Stroms erfassbar sind. Die Gold-Halteschicht
ist so beschaffen, dass sie einerseits für solche elektromagnetische
Strahlung weitgehend durchlässig
ist, die von dem Chemolumineszenzlabel 314 (Farbstoff) emittiert
wird, und die andererseits eine geeignete Kopplungschemie für die DNA-Halbstränge 306, 307 aufweist.
Die Kopplung zwischen den DNA-Halbsträngen 306, 307 einerseits
und der jeweiligen Halte-Schicht 304 bzw. 305 andererseits
erfolgt jeweils über
eine Gold-Schwefel-Kopplung,
wobei ein schwefelhaltiger Endabschnitt der DNA-Halbstränge 306, 307 einer Thiol-Gruppe
(SH-Gruppe) mit Gold-Material
der Halte-Schichten 304 bzw. 305 gebunden ist.
Unterhalb der Halte-Schichten 304 bzw. 305 befindet
sich die erste Photodiode 310 bzw. die zweite Photodiode 312.
Die Elektroden 308a, 308b, 311a, 311b sind elektrisch
leitfähig
und aus einem solchen Material, dass die Fängermoleküle 306, 307 darauf
nicht oder nur in sehr geringem Ausmaß immobilisiert werden können. Die
DNA-Halbstränge 306, 307 sind
jeweils mit einem geeigneten Marker für das Redox-Recycling-Verfahren (Redoxlabel 315)
und für
das Chemolumineszenz-Verfahren (Chemolumineszenzlabel 314)
versehen.
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Im
Weiteren wird bezugnehmend auf 3A bis 3E die
Funktionalität
der Sensor-Anordnung 300 beschrieben.
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In 3B ist
gezeigt, dass nachdem in die Sensor-Anordnung 300 ein Analyt 309 eingefüllt ist, der
solche zu erfassenden Partikel aufweist, die zu dem ersten DNA-Halbstrang 306 komplementär sind, ein
Hybridisierungsereignis zwischen einem zu erfassenden DNA-Halbstrang 316 und
dem ersten DNA-Halbstrang 306 erfolgt
ist. Dadurch ist aus dem ersten DNA-Halbstrang 306 und dem zu erfassenden DNA-Halbstrang 316 ein
DNA-Doppelstrang generiert. Da der zweite DNA-Halbstrang 307 eine
Basensequenz aufweist, die zu der Basensequenz des zu erfassenden
DNA-Halbstrangs 316 nicht komplementär ist, erfolgt an dem zweiten
DNA-Halbstrang 307 kein Hybridisierungsereignis.
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Der
in 3C gezeigte Betriebszustand der Sensor-Anordnung 300 wird
erhalten, indem eine weitere Lösung
mit DNA-Nuklease der Sensor-Anordnung 300 hinzugegeben
wird. DNA-Nuklease weist eine solche Funktionalität auf, dass
nur einsträngige
DNA von den DNA-Nukleasen entfernt wird, nicht hingegen doppelsträngige. Dadurch
wird, wie in 3C gezeigt, der zweite DNA-Halbstrang 307 von
der zweiten Gold-Halteschicht 305 entfernt, wohingegen
der DNA-Doppelstrang aus erstem DNA-Halbstrang 306 und zu dem erfassenden DNA-Halbstrang 316 auf
der ersten Gold-Halteschicht 304 verbleibt. Mit anderen
Worten werden die einzelsträngigen
DNA-Moleküle
samt Chemolumineszenzlabel 314 und Redoxlabel 315 von
der Sensor-Anordnung
entfernt, es bleiben nur die Doppelstrangstücke zurück.
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In 3D ist
ein Betriebszustand der Sensor-Anordnung 300 gezeigt, nachdem
der Sensor-Anordnung 300 in dem Betriebszustand aus 3C ein
Lumineszenzstoff zugegeben ist. Dieser wechselwirkt mit dem Chemolumineszenzlabel 314 des
ersten DNA-Halbstrangs 306 derart, dass dort eine elektromagnetische
Lumineszenzstrahlung 317 generiert wird. Ein Teil der Lumineszenzstrahlung 317 trifft
auf die erste Photodiode 310 und erzeugt einen Photostrom,
der unter Verwendung der Auswerteeinheit 313 ortsaufgelöst gemessen
wird. Als Messgröße dient
das elektrische Signal der ersten Photodiode 310, alternativ
kann auch eine Photospannung erfasst werden. Der Photostrom der
ersten Photodiode 310 ist das erste Signal, das der Auswerteeinheit 313 bereitgestellt
wird.
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In 3E ist
ein weiterer Betriebszustand der Sensor-Anordnung 300 gezeigt, nachdem
in die Sensor-Anordnung 300 ein solcher Enzymkomplex eingefüllt ist,
mittels dem ein Redox-Recycling-Prozess (vgl. obige Beschreibung)
ausgelöst
wird. Der Enzymkomplex wechselwirkt mit dem Redoxlabel 315 derart,
dass dadurch elektrische Ladungsträger, nämlich ein positiver Ladungsträger 318a mit
einer positiven elektrischen Ladung und ein negativer elektrischer
Ladungsträgerteil 318b mit
einer negativen elektrischen Ladung generiert wird. Infolge einer
zueinander komplementären
Vorspannung der ersten Elektrode 308a und der zweiten Elektrode 308b werden
die Ladungsträger 318a, 318b infolge
einer elektrischen Kraft zu der jeweils entgegengesetzt geladenen
Elektrode 308a bzw. 308b gezogen. Die Strom-Spannungs-Charakteristik
wird über
die Elektroden 308a, 308b erfasst, und wird der
Auswerteeinheit 313 als zweites Signal bereitgestellt.
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Mit
anderen Worten ist gemäß dem beschriebenen
Ausführungsbeispiel
das Hybridisierungsereignis zwischen dem ersten DNA-Halbstrang 306 und
dem zu erfassenden DNA-Halbstrang 316 zunächst optisch
erfasst und anschließend
elektrisch erfasst. Alternativ kann auch zuerst das elektrische Erfassen
(Redox-Recycling-Messung) erfolgen und danach das optische Erfassen
(Messung der Chemolumineszenzstrahlung).
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Die
Auswerteeinheit 313 wertet das erste und das zweite Signal
gemeinsam aus und gibt bei ausreichender Übereinstimmung einen Messwert aus.
Falls eine ausreichend gute Übereinstimmung nicht
erzielt werden kann, wird ein Fehlersignal bereitgestellt. Ein Wert
für eine
gerade noch akzeptable Abweichung zwischen den beiden Messergebnissen ist
beispielsweise mittels Einstellens eines Toleranzbereiches vorgebbar.
Gegebenenfalls kann die Messung wiederholt werden.
-
Gemäß dem beschriebenen
Ausführungsbeispiel
wird das erste und das zweite Signal jeweils über mehrere Minuten hinweg
integriert. Dies erfolgt unter Verwendung einer On-Chip vorgesehenen
Integratorstufe der Auswerteeinheit 313.
-
Als
Chemolumineszenzmarker 314 wird Horseradish Peroxidase
(HRP) verwendet. Als Lumineszenzstoff wird Luminol (3-Aminophthalsäure-hydrazid)
in Verbindung mit Wasserstoffperoxid verwendet.
-
Unter
Verwendung eines Biotin-Streptavidin Systems kann das zu detektierende
Lichtsignal unter Verwendung von Multiplikationseffekten verbessert werden,
indem eine Signalverstärkung über eine
Enzymkaskade erzielt wird.
-
Sowohl
die Auswerteeinheit 313 als auch die Photodioden 310, 312 bzw.
die Elektroden 308a, 308b, 311a, 311b sind
in das Silizium-Substrat 303 integriert. Damit ist anschaulich
die Sensor-Anordnung 300 als integrierter Schaltkreis ausgebildet.
-
Bei
der Sensor-Anordnung 300 ist eine kontinuierliche Messung
auf jedem der Sensor-Einheiten 301, 302 ermöglicht.
Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn ein Vorgang, der eine
Reaktionskinetik betrifft, untersucht werden soll.
-
Im
Weiteren wird bezugnehmend auf 4A bis 4E eine
Sensor-Anordnung 400 gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel
der Erfindung beschrieben. Solche Elemente, die bei der Sensor-Anordnung 400 identisch
ausgebildet sind wie bei der Sensor-Anordnung 300, sind
mit den gleichen Bezugsziffern versehen.
-
Abweichend
von der Sensor-Anordnung 300 ist bei der in 4A gezeigten
Sensor-Anordnung 400 mit einer ersten Sensor-Einheit 401 und
einer zweiten Sensor-Einheit 402 für jede der Sensor-Einheiten 401, 402 jeweils
nur eine Elektrode 403 bzw. 404 als elektrische
Erfassungseinheit vorgesehen. Ferner sind der erste DNA-Halbstrang 306 und
der zweite DNA-Halbstrang 307 sowohl von einem Chemolumineszenzlabel
als auch von einem Redoxlabel frei.
-
Die
erste Elektrode 403 und die zweite Elektrode 404 sind
wiederum aus einem derartigen Material, dass die DNA-Halbstränge 306, 307 daran
nicht oder nur in unwesentlicher Menge immobilisiert werden.
-
Nach
Zugabe einer Lösung
mit einem zu erfassenden DNA-Halbstrang 316 wird
der in 4B gezeigte Betriebszustand
der Sensor-Anordnung 400 erhalten. Da der zu erfassende
DNA-Halbstrang 316 zu
dem ersten DNA-Halbstrang 306 komplementär ist und
zu dem zweiten DNA-Halbstrang 307 nicht komplementär ist, erfolgt
ein Hybridisierungsereignis nur zwischen dem zu erfassenden DNA-Halbstrang 316 und
dem ersten DNA-Halbstrang 306.
-
Die
Sensor-Anordnung 400 in dem in 4C gezeigten
Betriebszustands wird erhalten, nachdem eine Lösung mit DNA-Nukleasen der Sensor-Anordnung 400 zugegeben
wird, welche DNA-Nukleasen derart eingerichtet sind, dass nur einzelsträngige DNA
dadurch abgebaut wird, wohingegen doppelsträngige DNA von den DNA-Nukleasen
unbeeinflusst bleibt. Dadurch wird der zweite DNA-Halbstrang 307 von
der zweiten Gold-Halteschicht 305 entfernt, wohingegen
der DNA-Doppelstrang
aus erstem DNA-Halbstrang 306 und zu erfassendem DNA-Halbstrang 316 auf
der ersten Gold-Halteschicht 304 unverändert zurückbleibt.
-
Bei
dem in 4D gezeigten Betriebszustand
der Sensor-Anordnung 400 wird
die Sensor-Anordnung 400 mit elektromagnetischer Strahlung 405 einer
Leuchtdiode (nicht gezeigt) bestrahlt. Infolge einer teilweisen
Absorption der elektromagnetischen Strahlung 405 durch
die Doppelstrang-DNA aus erstem DNA-Halbstrang 306 und dem
zu erfassenden DNA-Halbstrang 316 ist
die Intensität
der Strahlungsintensität
und daher der Photostrom der ersten Photodiode 310 gegenüber dem Photostrom
der zweiten Photodiode 312 verringert. Auch ist der Photostrom
der ersten Photodiode 310 gegenüber einem Betriebszustand verringert,
bei dem die Photodiode 310 nur mit dem ersten DNA-Halbstrang 306 belegt
ist, aber von dem zu erfassenden DNA-Halbstrang 316 frei
ist. Das veränderte
Signal, d.h. der veränderte
Photostrom, der ersten Photodiode 310 wird als Detektionssignal
verwendet.
-
In
dem in 4E gezeigten Betriebszustand der
Sensor-Anordnung 400 wird
unter Verwendung einer Impedanzmessung (z.B. Anlegen einer Wechselspannung
zwischen erste Elektrode 403 und eine Gegenelektrode und
Erfassen des Wechselstromsignals) ein infolge des Hybridisierungsereignisses
an der Oberfläche
der ersten Sensor-Einheit 401 veränderter Wert der Impedanz erfasst.
-
Alternativ
zu dem beschriebenen Verfahren kann auch zuerst die Impedanzmessung
erfolgen und anschließend
die Messung der elektromagnetischen Absorption. Die zugehörigen Sensorsignale werden
der Auswerteeinheit 313 bereitgestellt. In der Auswerteeinheit 313 werden
die Messergebnisse miteinander verglichen und bei ausreichend guter Übereinstimmung
wird ein beispielsweise gemittelter Messwert ausgegeben. Wird eine
ausreichend gute Übereinstimmung
zwischen den beiden Messungen nicht erreicht, wird ein Fehlersignal
ausgegeben und die Messung wird als fehlerhaft markiert. Dann kann die
Messung gegebenenfalls wiederholt werden.
-
In
diesem Dokument sind folgende Veröffentlichungen zitiert:
- [1] Hintsche, R, Paeschke, M, Uhlig, A, Seitz,
R (1997) „Microbiosensors
using Electrodes made in Sitechnology", Frontiers in Biosensorics, Fundamental
Aspects, Scheller, FW, Schubert, F, Fedrowitz, J (eds.), Birkhauser
Verlag Basel, Schweiz, S.267-283
- [2] van Gerwen, P (1997) „Nanoscaled
Interdigitated Electrode Arrays for Biochemical Sensors", IEEE, International
Conference on Solid-State Sensors and Actuators, 16.-19. Juni 1997, Chicago,
S.907-910
- [3] Paeschke, M, Dietrich, F, Uhlig, A, Hintsche, R (1996) „Voltammetric
Multichannel Measurements Using Silicon Fabricated Microelectrode Arrays", Electroanalysis,
Vol. 7, No.1, S.1-8
-
- 100
- Sensor
- 101
- Elektrode
- 102
- Elektrode
- 103
- Isolator
- 104
- Elektrodenanschluss
- 105
- Elektrodenanschluss
- 106
- DNA-Sondenmolekül
- 107
- Elektrolyt
- 108
- DNA-Stränge
- 200
- Biosensor
- 201
- erste
Elektrode
- 202
- zweite
Elektrode
- 203
- Isolatorschicht
- 204
- Haltebereich
erste Elektrode
- 205
- DNA-Sondenmolekül
- 206
- Elektrolyt
- 207
- DNA-Strang
- 208
- Enzym
- 209
- spaltbares
Molekül
- 210
- negativ
geladenes erstes Teilmolekül
- 211
- Pfeil
- 212
- weitere
Lösung
- 213
- oxidiertes
erstes Teilmolekül
- 214
- reduziertes
erstes Teilmolekül
- 300
- Sensor-Anordnung
- 301
- erste
Sensor-Einheit
- 302
- zweite
Sensor-Einheit
- 303
- Silizium-Substrat
- 304
- erste
Gold-Halteschicht
- 305
- zweite
Gold-Halteschicht
- 306
- erster
DNA-Halbstrang
- 307
- zweiter
DNA-Halbstrang
- 308a
- erste
Elektrode
- 308b
- zweite
Elektrode
- 309
Analyt
-
- 310
- erste
Photodiode
- 311a
- dritte
Elektrode
- 311b
- vierte
Elektrode
- 312
- zweite
Photodiode
- 313
- Auswerteeinheit
- 314
- Chemolumineszenzlabel
- 315
- Redoxlabel
- 316
- zu
erfassender DNA-Halbstrang
- 317
- Lumineszenzstrahlung
- 318a
- positiver
elektrischer Ladungsträger
- 318b
- negativer
elektrischer Ladungsträger
- 400
- Sensor-Anordnung
- 401
- erste
Sensor-Einheit
- 402
- zweite
Sensor-Einheit
- 403
- erste
Elektrode
- 404
- zweite
Elektrode
- 405
- elektromagnetische
Strahlung