DE10221115B4

DE10221115B4 - Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung von in Proben enthaltenen chemischen oder biochemischen Partnern allgemeiner Rezeptor-Ligand-Systeme

Info

Publication number: DE10221115B4
Application number: DE2002121115
Authority: DE
Inventors: Andreas Dipl.-Phys. Katerkamp; Frank Dipl.-Ing. Grawe; Göran Dipl.-Biol. Dr. Key; Silke Dipl.-Ing. Weber; Inka Dipl.-Ing. Wolf; Jochen Dipl.-Ing. Uckelmann
Original assignee: ICB INST fur CHEMO und BIOSEN; Icb Institut fur Chemo- und Biosensorik GmbH
Current assignee: ICB INST fur CHEMO und BIOSEN; Icb Institut fur Chemo- und Biosensorik GmbH
Priority date: 2002-05-07
Filing date: 2002-05-07
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2022-05-08
Also published as: DE10221115A1

Abstract

Vorrichtung zur Bestimmung von in flüssigen Proben enthaltenen chemischen oder biochemischen Partnern von Rezeptor-Ligand-Systemen, bei der die flüssige Probe durch einen Kanal (1) strömt, der innerhalb eines in einem Zylinder (6) geführten Kolbens (5) ausgebildet ist und mindestens ein Austritt (2) des Kanals (1) vorhanden ist, der in Bezug zu einer auf einem optischen Element (4) vorhandenen Anströmfläche (3) ausgerichtet ist; wobei
das optische Element (4) einen stirnseitigen Abschluss des Kolbens (5) bildet,
der Austritt (2) des Kanals (1) und die Anströmfläche (3) in einem Abstand zueinander angeordnet sowie in Strömungsrichtung der flüssigen Probe nachfolgend an die Anströmfläche (3) mindestens ein Aufnahmeraum (9) für die flüssige Probe vorhanden ist,
auf der Anströmfläche (3) mindestens ein Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems immobilisiert ist;
Fluoreszenzanregungslicht (10) für einen an einen Partner des Rezeptor-Ligand-Systems gebundenen Markierungsstoff durch das optische Element (4) unter Totalreflexionsbedingungen, zur Ausbildung eines evanescenten Feldes im Bereich des...

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von in Proben enthaltenen chemischen oder biochemischen Partnern allgemeiner Rezeptor-Ligand-Systeme, wie dies beispielsweise Antikörper und Antigene, aber auch die verschiedensten Proteine, die solche Systeme bilden können, sind. Dabei ist ein solcher Partner, als Analyt in einer flüssigen Probe, beispielsweise einer Körperflüssigkeit, die einem vitalen Organismus entnommen worden ist, enthalten und es soll ein Nachweis für das Vorhandensein eines solchen Analyten, möglichst auch quantitativ durchgeführt werden können. Häufig ist es bei solchen Nachweisen erforderlich, auch die jeweilige Konzentration des entsprechenden Analyten relativ genau und in kurzer Zeit bestimmen zu können.
Hierzu greift die erfindungsgemäße Lösung an sich bekannte chemische und biochemische Erkenntnisse auf. Dabei wird an einen der Partner eines solchen Rezeptor-Ligand-Systems ein Markierungsstoff gebunden, der bei Bestrahlung mit elektromagnetischen Wellen in einem ganz spezifischen Wellenlängenbereich, der in der Regel relativ eng begrenzt ist, in einen angeregten Zustand übergeht und Fluoreszenzlicht mit einer anderer Wellenlänge emittiert wird.

Zur Sicherung einer hohen Selektivität ist es außerdem bekannt, die Fluoreszenz in einem definierten eng begrenzten Bereich anzuregen. Hierzu wird ein evanescentes Feld an einer Grenzfläche, auf der die letztendlich aneinander gebundenen Partner mit dem Markierungsstoff immobilisiert worden sind, ausgebildet. Die hierfür erforderlichen theoretischen und praktischen Voraussetzungen sind u.a. auch in DE 196 28 002 C1 beschrieben. Aus diesem Dokument geht außerdem hervor, dass es an sich vorteilhaft ist, während der Messung der Fluoreszenzintensität, die flüssige Probe durch einen Durchflusskanal unmittelbar über die Grenzfläche, auf der die aneinander gebundenen und markierten Partner immobilisiert sind, fließen zu lassen. Da aber für die Ausbildung eines evanescenten Feldes im Bereich eines solchen Durchflusskanals das Fluoreszenzanregungslicht auf die entsprechende Grenzfläche unter Einhaltung von Totalreflexionsbedingungen gerichtet werden muss, sind insbesondere die optischen Anforderungen an diese Komponenten bei dieser bekannten Vorrichtung entsprechend hoch, so dass die Herstellungskosten, auch wenn die Herstellung im ansonsten kostengünstigen Spritzgußverfahren erfolgt, relativ hoch sind.

Außerdem ist es aufwendig, in einer solchen bekannten Vorrichtung mehrere verschiedene Partner, als Analyten gleichzeitig detektieren zu können, da für die entsprechend verschiedenen komplementären Partner ausreichend verschiedene Markierungsstoffe vorhanden sein müssen, wodurch sich der Material- und Geräteaufwand deutlich erhöht.

Für das Durchströmen der den jeweiligen Analyten enthaltenden Probe durch die Vorrichtung und für die Aufnahme der Probe nach der Durchführung des jeweiligen Testformates, die üblicherweise auch als Assays bezeichnet werden, sind gesonderte zusätzliche Elemente erforderlich.

Des Weiteren ist in DE 197 47 572 C1 eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests beschrieben, bei der ein Lichtwellenleiter in einer in einem Kolben einer Kolben-Zylinder-Einheit ausgebildeten Messkammer aufgenommen ist. Die Messkammer ist über einen im Kolben ausgebildeten Zufluss mit dem Innenraum des Zylinders verbunden.

Aus DE 199 16 430 C1 ist eine Vorrichtung zur Durchführung von Rezeptor-Ligand- und Affinitätstests bekannt, bei der ein Hohlkolben aus zumindest teilweise für Licht transparentem Material in einem mit einer temporär verschließbaren Öffnung versehenen Hohlzylinder aufgenommen und geführt ist. Der Hohlzylinder ist aus einem zumindest teilweise für Licht transparentes Material gebildet und mit einer verschließbaren Öffnung versehen. Eine in das Innere des Hohlzylinders weisende Stirnfläche ist aus einer porösen Trennschicht gebildet und im Hohlkolben ist parallel zu dieser porösen Trennschicht eine gas- und flüssigkeitsdichte translatorisch bewegbare Dichtplatte angeordnet.

Eine abklingende Abtastung eines biochemischen Arrays ist in DE 196 15 380 A1 beschrieben. Zur Erfassung einer Zielsubstanz in einem Pixelarray wird Licht einer Lichtquelle zur Anregung der Zielsubstanz eingesetzt. Dabei sollen die Bedingungen einer inneren Totalreflexion eingehalten und ein Lichtdetektor eingesetzt werden.

In DE 34 46 756 C1 ist ein Photometer zum Analysieren flüssiger Medien offenbart, bei der eine Küvette zur Aufnahme des zu untersuchenden Mediums, Mittel zum Zuführen dieses Mediums, Mittel zum Zuführen zuzugebender Reagenzien, Mittel zum Abführen von Reaktionsprodukten, eine monochromatische Lichtquelle und ein photoelektrischer Empfänger vorhanden sind.

Aus US 5,077,012 ist eine Vorrichtung zur Detektion von Markierungsstoffen bekannt, die einen zylindrischen Behälter, der an beiden Enden Öffnungen aufweist, einen quantitativen Testspeicher, der entfernbar an einem Ende des zylindrischen Behältnisses befestigt werden kann, aufweist. Dieser Testspeicher hat ein offenes Ende und eine Zellmembran, die dort befestigt ist. Zudem ist ein zylindrischer Hohlkolben, der eine definierte Kammer bildet, vorhanden. Im Kolben ist eine Öffnung für einen Fluidfluss ausgebildet und ein Probencontainer entfernbar am Kolben befestigt. Am Probencontainer sind eine befestigbare Membraneinheit mit immobilisierten Antikörpern und ein Filtergehäuse befestigt.

Aus US 4,775,637 ist eine Vorrichtung zur Durchführung von Immunoassays bekannt, bei der mindestens zwei Wellenleiter vorhanden sind. Außerdem werden eine Küvette und ein lichtleitendes Element, das im Kontakt mit der zu analysierenden Lösung steht, eingesetzt. Es können gleichzeitig zwei unterschiedliche Parameter in der Probenlösung detektiert werden.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Möglichkeiten zu schaffen, mit der verschiedene Partner allgemeiner Rezeptor-Ligand-Systeme, als Analyten kostengünstig, in kurzer Zeit, mit erhöhter Sensitivität und Messgenauigkeit detektiert werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer Vorrichtung, die die Merkmale des Anspruchs 1 sowie mit einem Verfahren gemäß Anspruch 19 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung, können mit den in den untergeordneten Ansprüchen bezeichneten Merkmalen erreicht werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet einen Kolben und einen Zylinder. Dabei ist innerhalb des im Zylinder geführten Kolbens ein Kanal ausgebildet, durch den, in der Regel mittels einer Relativbewegung von Kolben und Zylinder die flüssige Probe transportiert wird. Dabei gelangt die Probe aus dem Zylinderinneren durch den Kanal und trifft auf eine entsprechend in Bezug zum Austritt des Kanals angeordnete Anströmfläche. Auf dieser Anströmfläche wurde vorab zumindest ein komplementärer Partner des jeweiligen allgemeinen Rezeptor-Ligand-Systems immobilisiert. Die Anströmfläche ist auf einem optischen Element angeordnet, das wiederum einen stirnseitigen Abschluss des Kolbens und gleichzeitig die optische Grenzfläche für die Ausbildung eines evanescenten Feldes bildet. Der Austritt des Kanals und die Anströmfläche schließen dabei nicht bündig ab, so dass mit einem entsprechenden Abstand die Flüssigkeit vorbeifließen kann.

Gleichzeitig wird auf dieses optisches Element Fluoreszenzanregungslicht gerichtet und unter Einhaltung von Totalreflexionsbedingungen, das gewünschte und vorteilhafte evanescente Feld, innerhalb dem Fluoreszenz angeregt werden kann, ausgebildet. Für einen quantitativen Nachweis eines Partners, als Analyt in der flüssigen Probe kann die Intensität des Fluoreszenzlichtes mit mindestens einem optischen Detektor gemessen werden.

Die flüssige Probe, die auf die Anströmfläche auftrifft, kann dann anschließend in einen Aufnahmeraum geführt und dort innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung sicher aufbewahrt werden, so dass dieser Teil der Vorrichtung gemeinsam mit der flüssigen Probe für die Umwelt gefahrlos entsorgt werden kann. Vorteilhaft ist ein solcher Aufnahmeraum innerhalb des Kolbens im Anschluss an die Anströmfläche ausgebildet.

Der Austritt des Kanals, von dem der Flüssigkeitsstrahl ausgeht und auf die Anströmfläche trifft, kann besonders vorteilhaft in Form einer Düse ausgebildet sein, um neben einer Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit auch eine Fokussierung der Flüssigkeit in Richtung auf die Anströmfläche vornehmen zu können.

Im Gegensatz zu den bekannten Lösungen kann die Anströmfläche deutlich kleiner dimensioniert werden. So kann beispielsweise eine kreisförmige Anströmfläche einen Durchmesser ≤ 10 mm aufweisen. Bei der Wahl z.B. einer quadratischen bzw. rechteckigen Anströmfläche kann diese so dimensioniert sein, dass die Flächendiagonale ebenfalls ≤ 10 mm ist.

Günstig ist es außerdem, wenn die Anströmfläche orthogonal zur Längsachse des Kanals ausgerichtet ist, so dass der aus dem Austritt austretende Flüssigkeitsstrahl direkt auf die Anströmfläche trifft. Zur Vermeidung einer deutlich erhöhten Drosselwirkung sollten möglichst keine Elemente, die das Abfließen der flüssigen Probe von der Anströmfläche in einen Aufnahmeraum behindern können, vorhanden sein und ein Abstand zwischen dem Austritt des Kanals und der Anströmfläche eingehalten sein, der ebenfalls ein nahezu störungsfreies Abfließen der flüssigen Probe sichert. Der Abstand kann daher bis zu 10 mm zwischen Austritt und Anströmfläche betragen.

Zur gleichzeitigen Detektion mehrerer unterschiedlicher Analyte ist es vorteilhaft, die Anströmfläche in Segmente zu unterteilen und die einzelnen Segmente, bzw. auch bestimmte Bereiche mit jeweils unterschiedlichen entsprechend komplementären Partnern zu immobilisieren.

In diesem Fall kann es auch vorteilhaft sein, den Austritt des Kanals mit mehreren Düsen zu gestalten, aus denen Flüssigkeitsstrahlen gezielt auf die jeweiligen Segmente bzw. verschieden immobilisierten Bereiche der Anströmfläche gerichtet werden können.

Mit der erfindungsgemäßen Lösung besteht die Möglichkeit, ein relativ einfaches, kostengünstiges optisches Element, an dem die Anströmfläche für die Detektion vorhanden ist, einzusetzen, wohingegen an die übrigen Teile, was insbesondere auf den verwendeten Kolben und den Zylinder zutrifft, keine bestimmten Anforderungen, was die optischen Eigenschaften betrifft, gestellt werden.

Mit der Erfindung besteht die Möglichkeit, die Anregung der Fluoreszenz innerhalb des ausgebildeten evanescenten Feldes und auch die Detektion des Fluoreszenzlichtes auf unterschiedliche Art und Weise vornehmen zu können.

So besteht einmal die Möglichkeit, das Anregungslicht für die Fluoreszenz im freien Strahl auf und durch das optische Element zu richten, dabei gleichzeitig an der Grenzfläche, zumindest im Bereich, in der die Anströmfläche angeordnet ist, Totalreflexionsbedingungen einzuhalten, dadurch im Bereich der Anströmfläche ein evanescentes Feld auszubilden und durch entsprechende Anordnung, zumindest eines optischen Detektors die Intensität des Fluoreszenzlichtes im freien Strahl, gegebenenfalls unter Zwischenschaltung von optischen, strahlformenden Elementen zu detektieren.

Anstelle einer solchen, auch üblicherweise als Freistrahldetektion bezeichneten Lösung, besteht aber auch die Möglichkeit, das Anregungslicht für Fluoreszenz nicht unter der Bedingung der Totalreflexion auf die Anströmfläche zu richten und das Fluoreszenzlicht, durch das optische Element, das in diesem Fall zumindest bereichsweise als Lichtwellenleiter ausgebildet ist, unter Einhaltung von Totalreflexion durch dieses und von dort auf den zumindest einen optischen Detektor zu richten.

Es besteht aber auch die Möglichkeit, das Licht zur Anregung von Fluoreszenz durch ein solches, zumindest bereichsweise als Lichtwellenleiter ausgebildetes optisches Element zu führen. Dabei innerhalb des Bereiches, der einen Lichtwellenleiter bildet Totalreflexionsbedingungen einzuhalten, dadurch im Bereich der Anströmfläche ein evanescentes Feld auszubilden, innerhalb dessen Fluoreszenz angeregt werden kann und das Fluoreszenzlicht wiederum durch den Lichtwellenleiter oder als Freistrahl auf einen optischen Detektor zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität zu richten.

Mit der erfindungsgemäßen Lösung kann die für einen entsprechenden Nachweis erforderliche Zeit sehr klein gehalten werden, was einen Zeitraum zwischen 30 und 1000 s umfasst.

Hierzu kann eine sogenannte zeitaufgelöste Messung durchgeführt werden.

Dabei sollte der Transport der flüssigen Probe durch den Kanal in Richtung auf die Anströmfläche so durchgeführt werden, dass die aus dem Austritt des Kanals austretende flüssige Probe einen nahezu konstanten Volumenstrom innerhalb des jeweiligen für die Messung genutzten Zeitintervalls aufweist und der Stofftransport zur Anströmfläche im Wesentlichen durch Konvektion und nicht durch Diffusion erfolgt. Die flüssige Probe sollte mit einer Strömungsgeschwinigkeit zwischen 0,5 bis 200 μl/s durch den Kanal strömen.

Bei einer solchen zeitaufgelösten Messung kann aus dem Anstieg der gemessen Fluoreszenzintensität auf die Konzentration des in der jeweiligen flüssigen Probe, als Analyt enthaltenen Partners von allgemeinen Rezeptor-Ligand-Systemen geschlossen werden. Dabei wird ausgenutzt, dass mit dem gleichzeitigen Nach- und Abführen der flüssigen Probe über die Anströmfläche, auf der die jeweiligen entsprechenden komplementären Partner für den jeweiligen Analyten immobilisiert sind, ein entsprechendes kontinuierliches Anbinden von Partnern an die bereits vorab immobilisierten komplementären Partner auf der Anströmfläche erfolgt.

In diesem Fall ist es günstig und wünschenswert, den jeweiligen für den Partner komplementären Analyten auf der Anströmfläche im Überschuss zu immobilisieren, so dass in jedem Fall gesichert werden kann, dass jeder in der Probe enthaltene Partner nahe der Oberfläche der Anströmfläche an einen entsprechenden Partner, der vorab auf der Anströmfläche immobilisiert worden ist, anbinden kann.

Zumindest unter Einhaltung der letztgenannten Bedingungen kann davon ausgegangen werden, dass die mit dem optischen Detektor gemessene Fluoreszenzintensität, zumindest nahezu linear ansteigt und dementsprechend der Anstieg der gemessenen Fluoreszenzintensität proportional zur Konzentration des jeweiligen Analyten in der flüssigen Probe ist.

Nachfolgend soll die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden.
Dabei zeigen:
1 in schematischer Form eine Schnittdarstel lung eines Beispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
2 ein weiteres Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
3 Möglichkeiten zur Aufnahme von flüssigen Proben und das Betreiben von Vorrichtungen gemäß den Beispielen der 1 und 2;
4 in schematischer Form eine Teildarstellung, mit der die Strömungs- und optischen Verhältnisse im Bereich eines Austritts eines Kanals und einer Anströmfläche verdeutlicht worden sind;
5 eine schematische Teildarstellung mit einem in Düsenform ausgebildeten Austritt eines Kanals;
6 in schematischer Form eine Schnittdarstellung eines dritten Beispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und Möglichkeiten der Führung von Anregungslicht für Fluoreszenz und zu detektierendes Fluoreszenzlicht;
7 das Beispiel nach 6 mit veränderter Lichtführung für das Anregungslicht und für das Fluoreszenzlicht;
8 das dritte Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit wiederum veränderter Lichtführung für Anregungs- und Fluoreszenzlicht;
9 in schematischer Form die Anordnung optischer Elemente zur Fluoreszenzanregung und Detektion von Fluoreszenzlicht;
10 ein weiteres Beispiel für Möglichkeiten der Anordnung optischer Elemente zur Fluoreszenzanregung und Detektion von Fluoreszenzlicht;
11 eine dritte Möglichkeit für Anordnungen verschiedener optischer Elemente zur Fluoreszenzanregung und Fluoreszenzlichtdetektion;
12 eine weitere Möglichkeit für Anordnungen verschiedener optischer Elemente zur Fluoreszenzanregung und Fluoreszenzlichtdetektion;
13A in schematischer Form Möglichkeiten zur Durchführung eines Sandwich-Assays mit Antikörpern und
13B in schematischer Form Möglichkeiten zur Durchführung von Sandwich-Assays unter Verwendung von Biotin und zusätzlicher biotinbindender Komplexe.
In 1 ist ein erstes Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung schematisch in einer Schnittdarstellung gezeigt. Dabei wird ein Kolben 5 in einem Zylinder 6 geführt. Am Zylinder 6 ist eine Einlassöffnung 7 für die Aufnahme einer flüssigen Probe vorhanden. Diese Einlassöffnung 7 kann zumindest temporär verschlossen werden.
Im Kolben 5 ist ein Kanal 1, der bevorzugt parallel zur Bewegungsrichtung des im Zylinder 6 geführten Kolbens 5 ausgerichtet ist, ausgebildet. Durch diesen Kanal 1 kann bei entsprechender Relativbewegung von Kolben 5 und Zylinder 6 die flüssige Probe aus dem Zylinderinnenraum 8 in Richtung auf ein optisches Element 4 strömen und am Austritt 2, als Flüssigkeitsstrahl auf eine am optischen Element 4 vorhandene Anströmfläche 3 gerichtet werden.
Bevorzugt ist vor Aufnahme der flüssigen Probe über die Eintrittsöffnung 7 im Zylinderinnenraum 8 und/oder an entsprechenden Flächen des Kolbens 5, die in diese Richtung weisen, zumindest ein für einen Partner, als Analyt, der in der jeweiligen flüssigen Probe nachgewiesen werden soll, komplementärer Partner, der wiederum mit einem Markierungsstoff gebunden ist, bereits vorhanden. Diese beiden Partner können dann im Zylinderinnenraum 8 innerhalb einer bestimmten Inkubationszeit aneinander binden, und anschließend Kolben 5 und Zylinder 6 relativ zueinander bewegt werden, so dass die flüssige Probe, wie bereits erwähnt, aus dem Zylinderinnenraum 8, durch den Kanal 1, als Flüssigkeit auf die Anströmfläche 3 gerichtet wird.
Am Kolben 6 bildet das optische Element 4 einen stirnseitigen Abschluss, so dass die als Flüssigkeitsstrahl aus dem Austritt 2 des Kanals 1 austretende flüssige Probe von dort umgelenkt und in einen Aufnahmeraum 9, der ebenfalls im Kolben 5 ausgebildet ist, überführt und dort aufgenommen wird.
Das optische Element 4 ist zumindest teilweise aus einem optisch transparenten Material gebildet, wobei die optische Transparenz zumindest für die Wellenlän gen für das Anregungslicht 10, mit dem Fluoreszenz angeregt werden kann, und das Fluoreszenzlicht 11 gegegeben sein muss.
Wie deutlich wird, wird das Anregungslicht 10 auf und durch das optische Element 4 so geführt, dass an der Grenzfläche zum Kolbeninneren, auf der die Anströmfläche 3 ausgebildet ist, Totalreflexion auftritt und zumindest in einem definierten Bereich, ausgehend von dieser Grenzfläche, ein evanescentes Feld ausgebildet wird, um in einer definierten Eindringtiefe den einen bzw. auch mehrere Markierungsstoffe in einen angeregten Zustand zu überführen, so dass Fluoreszenzlicht emittiert wird.
Dieses Fluoreszenzlicht 11 tritt aus dem optischen Element 4 aus und kann mit einem hier nicht dargestellten optischen Detektor 21 gemessen werden.
Ebenfalls vor Durchführung, also zur Aufnahme der jeweiligen flüssigen Probe in den Zylinderinnenraum 8 sind auf der Anströmfläche 3 wiederum entsprechende komplementäre Partner eines allgemeinen Rezeptor-Ligand-Systems, in der Regel Fängerantikörper immobilisiert worden, an die zumindest der entsprechend andere Partner, als Analyt beim Anströmen der Flüssigkeit anbinden kann, so dass mit steigender Anzahl von zumindest Paaren aneinander gebundener Partner solcher Rezeptor-Ligand-Systeme, die jeweilige messbare Fluoreszenzintensität ansteigt.
Das in 2 gezeigte zweite Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, unterscheidet sich vom Beispiel nach 1, lediglich durch die Ausbildung des optischen Elementes 4. Dabei ist in beiden Fällen die äußere Mantelfläche des optischen Elementes 4 in einem Winkel konisch geneigt, wobei die Neigung in beiden Fällen jeweils entgegengesetzt ausgerichtet worden ist.
Das optische Element 4, kann über den Umfang der äußeren Mantelfläche lediglich einige solcher entsprechend konisch geneigter Bereiche aufweisen.
Es besteht aber auch die Möglichkeit, dieses optische Element 4 in Form von Kegel- oder Pyramidenstümpfen auszubilden.
Mit den 3A und 3B sollen Möglichkeiten zur Aufnahme und Führung flüssiger Proben für die Bestimmung von chemischen oder biochemischen Partnern allgemeiner Rezeptor-Ligand-Systeme verdeutlicht werden.
So kann, wie mit 3 angedeutet, die Einlassöffnung 7 des Zylinders 6, mittels einer Membran 13 verschlossen sein. Diese Membran ist gas- und flüssigkeitsdicht, so dass innerhalb des Zylinders 6 vorhandene sowie bereits an der Anströmfläche 3 immobilisierte Partner bzw. auch Markierungsstoffe unbeeinflusst über einen längeren Zeitraum vorgehalten werden können.
Die Membran 13 kann mit einer Kanüle 12 durchstoßen werden, so dass über die Kanüle 12 bei entsprechender Relativbewegung von Kolben 5 und Zylinder 6 der Zylinderinnenraum 8 vergrößert und in diesen die flüssige Probe aufgenommen werden kann.
Nach der bereits erwähnten Inkubationszeit, kann dann wie in 3B verfahren werden, nämlich die Relativbewegung zwischen Kolben 5 und Zylinder 6 in die entgegengesetzte Richtung durchgeführt werden. Dabei ist vorab die Kanüle 12 abgezogen und entfernt worden, wobei sich vorteilhaft die Membran 13 wieder vollständig verschließt und den Flüssigkeitsaustritt aus der Einlassöffnung 7 verhindert.
Anstelle einer solchen Membran 13 kann aber auch ein Ventil 13 oder ein anderer auf die Einlassöffnung 7 auf setzbarer Verschluss eingesetzt werden.
Bei entsprechend verschlossener Einlassöffnung 7 und gleichzeitiger Relativbewegung von Kolben 5 und Zylinder 6 wird die flüssige Probe durch den Kanal 1 in Richtung auf das optische Element 4 gefördert und tritt am Austritt 2 des Kanals 1, als Flüssigkeitsstrahl aus, der auf die Anströmfläche 3 auftrifft und von dort die flüssige Probe in den ebenfalls im Kolben ausgebildeten Aufnahmeraum 9, gelangen und dort aufbewahrt werden kann.
Es ist insbesondere vorteilhaft den Kolben 5 zumindest in der Phase, die mit 3B verdeutlicht worden ist, fixiert gehalten wird und die Relativbewegung ausschließlich über eine entsprechende Bewegung des Zylinders 6 realisiert wird.
Mit den 4 und 5 sollen schematisch die Strömungsverhältnisse, der als Flüssigkeitsstrahl aus dem Kanal 1 austretenden flüssigen Probe, sowie Möglichkeiten zur Lichtführung für Fluoreszenzanregungslicht 10 und Fluoreszenzlicht 11 innerhalb eines optischen Elementes 4 angedeutet werden. Dabei unterscheidet sich die Darstellung nach 5 von der nach 4 im Wesentlichen dadurch, dass hier ein Austritt 2 des Kanals 1, der in Düsenform ausgebildet ist, und zusätzliches aus dem Bereich der Anströmfläche 3 emittiertes Fluoreszenzlicht 11 ortsaufgelöst in schematischer Form dargestellt worden sind.
Mit den 4 und 5 soll verdeutlicht werden, wie die Flüssigkeitsströmung, ausgehend aus dem Kanal 1 auf die Anströmfläche 3 mit relativ kleiner Fläche gerichtet und von dort umgelenkt und in den Aufnahmeraum 9 strömen kann.
Des weiteren wird angedeutet, dass für die Einhaltung von Totalreflexionsbedingungen bestimmte Brechzahlverhältnisse zwischen dem optischen Element 4 mit n1 und jenseits der Grenzfläche des optischen Elementes 4, also hier im Inneren des Kolbens 5 mit n2, sowie bestimmte Winkelverhältnisse für das Fluoreszenzanregungslicht 10 eingehalten werden sollten, um ein definiertes evanescentes Feld, zumindest mit bekannter ausreichender Eindringtiefe im Bereich der Anströmfläche 3 auszubilden. Dabei müssen die Bedingungen n₁ > n₂ und α ≥ arcsin (n₂/n₁) eingehalten werden.
Das in den 6 gezeigte dritte Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, unterscheidet sich wiederum von den vorab bereits beschriebenen Beispielen durch die Ausbildung des optischen Elementes 4 und dabei wiederum durch unterschiedliche Möglichkeiten der Lichtführung für die Fluoreszenzanregung und die Fluoreszenzlichtdetektion.
In diesem Fall ist das optische Element 4 so ausgebildet, dass zumindest ein Bereich, als Lichtwellenleiter ausgebildet worden ist.
Im übrigen unterscheidet sich das dritte Beispiel von den vorab bereits beschriebenen Beispielen nicht.
In 6 erfolgt die Lichtführung für Anregungslicht 10, ausgehend von einer hier nicht dargestell ten Lichtquelle, das in das optische Element 4 eingekoppelt wird und innerhalb des optischen Elementes 4 mehrfach total reflektiert, so dass die Ausbildung des gewünschten evanescenten Feldes dadurch erreicht werden kann. Das Fluoreszenzlicht 11 tritt hier in divergenter Form, als Freistrahl aus dem optischen Element 4 aus und kann, wie nachfolgend weiterhin beispielhaft noch erläutert werden soll, über zusätzliche optische Elemente auf mindestens einen optischen Detektor, hier ebenfalls nicht dargestellt, gerichtet werden.
Mit 7 soll verdeutlicht werden, dass die Möglichkeit besteht, das Anregungslicht 10 für die Fluoreszenz direkt durch das optische Element 4, als Freistrahlen zu richten und Bereiche des optischen Elementes 4, als Lichtwellenleiter für nach mehrfacher Totalreflexion aus dem optischen Element 4 austretendes Fluoreszenzlicht 11 zu nutzen.
Mit 8 soll verdeutlicht werden, dass auch die Möglichkeit besteht, sowohl das Fluoreszenzanregungslicht 10, wie auch das Fluoreszenzlicht 11 nach mehrfacher Totalreflexion innerhalb des optischen Elementes 4 in das optische Element ein- und auch wieder auszukoppeln.
In der 9 ist eine Anordnung von optischen Elementen für die Fluroeszenzanregung und die Detektion von Fluoreszenzlicht 11 gezeigt. Dargestellt ist das Fluoreszenzanregungslicht 10 als paralleler nahezu monochromatischer Lichtstrahl. Dieses kann entweder durch ein optisches Filter und eine entsprechende Lichtstrahlführung bei bekannten Lichtquellen, z.B. einem thermischen Strahler, wie Halogenlampen oder auch Entladungslampen, z.B. Xe-Blitzlampen erreicht werden oder es können entsprechende Laserlichtquellen, wie z.B. Halbleiterlaser oder Gaslaser eingesetzt werden.
Das Fluoreszenzanregungslicht 10 der Lichtquelle 15 gelangt auf und durch das optische Element 4, woraufhin innerhalb des evanescenten Feldes von dort gebundenen Partnern mit dem Markierungsstoff Fluoreszenzlicht 11 emittiert wird. Dieses gelangt, wie hier gezeigt, als divergenter Freistrahl über die optischen Linsen 19 und 20 zur Strahlformung in fokussierter Form auf einen optischen Detektor 21, mit dem die jeweilige Intensität des Fluoreszenzlichtes 11 bestimmt werden kann.
Im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes 11, hier unmittelbar vor dem optischen Detektor 21, ist eine optische Blende 30 angeordnet. Die optische Blende 30 kann als Strich- bzw. auch als Punktblende ausgebildet sein.
Durch die optische Blende 30 gelangt dementsprechend nur ein Teil des Fluoreszenzlichtes 11, aus einem bestimmten Detektionsbereich, von der Anströmfläche 3 auf den optischen Detektor 21. Durch entsprechende Bewegung der optischen Blende 30 können unterschiedliche Flächenbereiche auf der Anströmfläche 3, ohne störende Einflüsse von Fluoreszenzlicht 11, das von anderen Bereichen der Anströmfläche 3 ausgehend emittiert worden ist, detektiert werden.
Durch Variation des Abstandes der optischen Blende 30 zum optischen Detektor 21 kann die Ortsauflösung vergrößert bzw. verkleinert werden, so dass die jeweils detektierte Fläche ebenfalls veränderbar ist.
Mit einem solchen Beispiel einer Anordnung optischer Elemente für die Detektion von Fluoreszenzlicht 11 kann eine ortsaufgelöste Detektion relativ einfach und kostengünstig mit lediglich einem einzigen optischen Detektor 21 durchgeführt werden.
Es besteht aber auch die Möglichkeit, optische Blende 30 und den optischen Detektor 21 für eine ortsaufgelöste Messung gemeinsam zu bewegen.
Mit einer Anordnung unterschiedlicher optischer Elemente, wie sie 10 entnommen werden kann, ist eine ortsaufgelöste Messung möglich.
Prinzipiell ist wieder ein ähnlicher Aufbau und eine ähnliche Anordnung der optischen Elemente verwendet worden.
Mit dem Doppelpfeil wird angedeutet, dass sämtliche optischen Elemente, die für die eigentliche Fluoreszenzlichtanregung und -detektion genutzt werden, in Bezug zur Anströmfläche 3 am optischen Element 4 bewegt werden können, so dass eine entsprechende ortsaufgelöste Messung über den Flächenbereich der Anströmfläche 3 erreicht werden kann.
Das Beispiel nach 11 entspricht wiederum im Wesentlichen dem Aufbau, wie er in 9 gezeigt ist.
Der optische Detektor 21 besteht hier aus mehreren einzelnen optischen Detektoren, die in Form eines Arrays oder in einer Reihenanordnung vorhanden sind. Diese Anordnung ermöglicht ebenfalls eine ortsaufgelöste Messung.
Die 12 zeigt die mögliche Anordnung von unter schiedlichen optischen Elementen für die Fluoreszenzanregung und die Detektion des Fluoreszenzlichtes 11 bei zwei Wellenlängen.
Bei dem hier gezeigten Beispiel werden zwei verschiedene Lichtquellen 15 und 16 eingesetzt, die Licht 10 unterschiedlicher Wellenlänge emittieren. Diese Wellenlängen sind so ausgewählt, dass sie Fluoreszenz an unterschiedlichen Markierungsstoffen anregen können, die jeweils mit unterschiedlicher Wellenlänge Fluoreszenzlicht 11 emittieren.
Dabei gelangt das divergent aus dem optischen Element 4, vom Bereich der Anströmfläche 3 ausgehende Fluoreszenzlicht 11 über die optischen Linsen 19 und 20 infolge entsprechender Strahlformung in fokussierter Form auf den optischen Detektor 21, mit dem die Intensität des Fluoreszenzlichtes 11 gemessen werden kann.
Im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes 11 ist jeweils ein optisches Filter 17 oder 18, beim hier gezeigten Beispiel zwischen den optischen Linsen 19 und 20 angeordnet. Die optischen Filter 17 und 18 sind so ausgewählt, dass sie für das jeweilige Fluoreszenzlicht 11 durchlässig sind. Dementsprechend kann mittels von der Lichtquelle 15 angeregtes Fluoreszenzlicht 11 das optische Filter 17 passieren und mit dem optischen Detektor 21 detektiert werden.
Gleichzeitig kann in der hier dargestellten Form das Anregungslicht 10, das von der zweiten Lichtquelle 16 emittiert wird, mit dem optischen Filter 18 gesperrt werden, so dass für diese Wellenlänge keine Fluoreszenzanregung erfolgen kann und demzufolge auch kein entsprechender Fluoreszenzfremdlichteinfluss am opti schen Detektor 21 auftritt.
Vorteilhaft sind die optischen Filter 17 oder 18 entweder miteinander verbunden oder auf einem gemeinsamen Träger angeordnet, so dass sie gemeinsam entsprechend bewegt oder so verdreht werden können, dass sie die jeweiligen gewünschten Positionen für den Durchlass von Fluoreszenzlicht 11 bzw. das Sperren von Anregungslicht 10 einer der Lichtquellen 15 oder 16 sperren.
In nicht dargestellter Form besteht natürlich auch die Möglichkeit, die Anzahl der verschiedenen Lichtquellen für die Fluoreszenzanregung und die entsprechenden optischen Filter für das jeweilige Fluoreszenzlicht zu erhöhen.
In dieser gezeigten Form besteht die Möglichkeit der sequentiellen Messung unterschiedlicher Partner, als Analyte, ohne dass die Lichtquellen 15 und 16 in gesteuerter Form und getaktet ein- und ausgeschaltet werden müssen, also kontinuierlich betrieben werden können und es lediglich erforderlich ist, die optischen Filter 17 und 18 entsprechend zu positionieren.
In der 13 sind in schematischer Form unterschiedliche sogenannte Assayformate dargestellt. In beiden Fällen handelt es sich dabei um unterschiedliche Möglichkeiten für sogenannte Sandwich-Assays.
In der Darstellung nach 13A ist ein Markierungsstoff 23 (Fluorophor) an einen Detektorantikörper 24, als einen Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems gebunden und bilden einen Komplex. Dieser Komplex bindet wiederum an den jeweiligen Analyten 25. Diese Bindungen erfolgen bei der Vorinkubation innerhalb des Zylinders 7 nach dem Aufnehmen der flüssigen Probe.
Die so vorbereitete flüssige Probe gelangt dann, wie bereits beschrieben, durch den Kanal auf die Anströmfläche 3. Auf dieser Anströmfläche 3 wurden vorab Detektorantikörper 26, als komplementäre Partner auf der Oberfläche 27 immobilisiert. Beim Anströmen der flüssigen Probe binden die aus Markierungsstoff 23, Detektorantikörper 24 und Analyt 25 gebildeten Komplexe an immobilisierte Fängerantikörper 26 an.
Da in diesem Bereich ein evanescentes Feld ausgebildet worden ist, kann mittels des mit an die Fängerantikörper 26 gebundenen Markierungsstoffes 23 Fluoreszenz angeregt und entsprechend die Intensität des Fluoreszenzlichtes, die im Verhältnis der an die Fängerantikörper 26, die auf der Oberfläche 27 der Anströmfläche 3 angebunden sind, entsprechend ansteigt, gemessen werden.
Das in 13B schematisch angedeutete Assayformat unterscheidet sich von dem in 13A angedeuteten Assayformat dadurch, dass auf der Oberfläche 27 keine Fängerantikörper 26, sondern ein biotinbindender Komplex 28, wie beispielsweise Neutravidin, Avidin oder Streptavidin immobilisiert worden ist und außerdem bei der Vorinkubation zusätzlich an die gebildeten Komplexe, bestehend aus Detektorantikörper 24, Markierungsstoff 23, Analyt 25 der Fängerantikörper 26, markiert mit Biotin 29, gebunden worden ist. Die Bindung dieser Komplexe erfolgt dann auf der Anströmfläche 3, oberhalb der Oberfläche 27 während des Anströmens der flüssigen Probe aus dem Kanal 1 durch die Bindung zwischen dem Biotin 29 und dem auf die der Oberfläche 27 immobilisierten biotinbindenden Komplex 28.
Die Messung der jeweiligen Fluoreszenzintensität innerhalb des oberhalb der Oberfläche 27 ausgebildeten evanescenten Feldes kann dann in den beschriebenen Formen erfolgen.

Claims

Vorrichtung zur Bestimmung von in flüssigen Proben enthaltenen chemischen oder biochemischen Partnern von Rezeptor-Ligand-Systemen, bei der die flüssige Probe durch einen Kanal (1) strömt, der innerhalb eines in einem Zylinder (6) geführten Kolbens (5) ausgebildet ist und mindestens ein Austritt (2) des Kanals (1) vorhanden ist, der in Bezug zu einer auf einem optischen Element (4) vorhandenen Anströmfläche (3) ausgerichtet ist; wobei das optische Element (4) einen stirnseitigen Abschluss des Kolbens (5) bildet, der Austritt (2) des Kanals (1) und die Anströmfläche (3) in einem Abstand zueinander angeordnet sowie in Strömungsrichtung der flüssigen Probe nachfolgend an die Anströmfläche (3) mindestens ein Aufnahmeraum (9) für die flüssige Probe vorhanden ist, auf der Anströmfläche (3) mindestens ein Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems immobilisiert ist; Fluoreszenzanregungslicht (10) für einen an einen Partner des Rezeptor-Ligand-Systems gebundenen Markierungsstoff durch das optische Element (4) unter Totalreflexionsbedingungen, zur Ausbildung eines evanescenten Feldes im Bereich des auf der Anströmfläche (3) immobilisierten Part ners des Rezeptor-Ligand-Systems gerichtet und zur Detektion von Fluoreszenzlicht (11) mindestens ein optischer Detektor (21) vorhanden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Austritt (2) in Form mindestens einer Düse ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anströmfläche (3) einen Durchmesser oder eine Länge einer Flächendiagonale ≤ 10 mm aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anströmfläche (3) orthogonal zur Längsachse des Kanals (1) ausgerichtet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Austritt (2) des Kanals (1) in einem Abstand ≤ 10 mm von der Anströmfläche (3) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Aufnahmeraum (9) für die flüssige Probe im Anschluss an die Anströmfläche (3) innerhalb des Kolbens (5) ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass am Zylinder (6) eine verschließbare Öffnung (7) zur Aufnahme der Probe in den Zylinder (6) vorhanden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Öffnung (7) mit einer Membran (13), einem Ventil oder einem Verschlusselement verschlossen ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf unterschiedlichen Bereichen/Segmenten der Anströmfläche (3) verschiedene Partner von Rezeptor-Ligand-Systemen immobilisiert sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass innerhalb des Zylinders (6) mindestens ein Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems enthalten ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die äußere Mantelfläche des optischen Elementes (4) zumindest bereichsweise in einem Winkel konisch in Bezug zur Längsachse des Kanals (1) geneigt ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (4) als Kegel- oder Pyramidenstumpf ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (4) zumindest im Bereich der Anströmfläche (3) als Lichtwellenleiter ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen optischem Element (4) und optischem Detektor (21) mindestens ein optisches Filter (17, 18) oder mindestens ein optisches Filter (17, 18) und eine optische Blende angeordnet ist/sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Position der optischen Blende (30) in Bezug zur Anströmfläche (3) für eine ortsaufgelöste Messung veränderbar ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Position mindestens einer Lichtquelle (15, 16), eines optischen Filters (17, 18) und eines optischen Detektors (21) in Bezug zur Anströmfläche (3) für eine ortsaufgelöste Messung veränderbar ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere optische Filter (17, 18) miteinander verbunden oder auf einem gemeinsamen Träger angeordnet und in Bezug zum optischen Detektor (21) und Lichtquellen (15, 16) für eine wellenlängenselektive Messung positionierbar sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Detektor (21) als Reihen- oder Arrayanordnung einzelner optischer Detektoren ausgebildet ist.
Verfahren zur Bestimmung von in flüssigen Proben enthaltenen chemischen oder biochemischen Partnern von Rezeptor-Ligand-Systemen, bei dem die flüssige Probe durch eine Öffnung (7) in einen Zylinder (6) aufgenommen, die Öffnung (7) verschlossen und danach infolge einer Relativbewegung eines Kolbens (5) und des Zylinders (6) durch einen im Kolben (5) ausgebildeten Kanal (1) strömend geführt und nach Verlassen mindestens eines Austritts (2) des Kanals (1) auf eine an einem optischen Element (4), das einen stirnseitigen Abschluss des Kolbens (5) bildet, angeordnete Anströmfläche (3), auf der mindestens ein Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems immobilisiert ist, gerichtet, dabei Fluoreszenzanregungslicht (10) zur Ausbildung eines evanescenten Feldes in einem Bereich des auf der Anströmfläche (3) immobilisierten Partners des Rezeptor-Ligand-Systems unter Totalreflexionsbedingungen durch das optische Element (4) gerichtet und angeregtes Fluoreszenzlicht mindestens eines an einem der Partner des Rezeptor-Ligand-Systems gebundenen Markierungsstoffes mit einem optischen Detektor (21) detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass nach Aufnahme der flüssigen Probe im Zylinder (6) eine Inkubation mit mindestens einem Partner des jeweiligen Rezeptor-Ligand-Systems durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation mit mindestens einem Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems, an den ein Markierungsstoff gebunden ist, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die flüssige Probe von der Anströmfläche (3) in mindestens einem innerhalb des Kolbens (5) ausgebildeten Aufnahmeraum (9) aufgenommen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe am Austritt (2) des Kanals (1) in mindestens zwei Teilstrahlen unterschiedlicher Strömungsrichtung geteilt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass auf verschiedenen Bereichen/Segmenten der Anströmfläche (3) unterschiedliche Partner von Rezeptor-Ligand-Systemen immobilisiert worden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass für verschiedene Partner verschiedene Markierungsstoffe und für die jeweiligen Markierungsstoffe spezifische Lichtquellen (15, 16) zur Fluoreszenzanregung verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration eines Partners eines Rezeptor-Ligand-Systems, als Analyt einer Probe, mittels zeitaufgelöster Intensitätsmessung des Fluoreszenzlichtes (11) bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das die Konzentration eines Analyten durch Bestimmung des Anstiegs der mit dem optischen Detektor (21) gemessenen Intensität des Fluoreszenzlichtes (11) innerhalb vorgebbarer Zeitintervalle bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung auf der Anströmfläche (3) ortsaufgelöst durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (15) oder (16) für das Fluoreszenzlicht (11) gezielt bewegt wird, so dass die Anströmfläche (3) sukzessive punktuell beleuchtet wird.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Detektor (21) und eine optische Blende (30) in Bezug zur Position der Anströmfläche (3) bewegt werden.
Verfahren nach Anspruch 19 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung mehrerer spezifischer Lichtquellen (15, 16) entsprechende wellenlängenselektive optische Filter (17, 18) sequentiell in den Strahlengang des Fluoreszenzlichtes (11) zwischen Anströmfläche (3) und optischem Detektor (21) bewegt werden.
Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung der optischen Filter (17, 18) so durchgeführt wird, dass ein jeweils anderes optisches Filter (17, 18) gleichzeitig das Fluoreszenzanregungslicht (10) der jeweils anderen Lichtquelle (15, 16) in Richtung auf das optische Element (4) sperrt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die flüssige Probe durch Relativbewegung von Kolben (5) und Zylinder (6) durch eine verschließbare Öffnung (7) in den Zylinder (6) aufgenommenen, mindestens ein Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems, als Analyt an einen anderen Partner, der mit oder ohne Markierungsstoff vorliegt, anbindet, im Nachgang zu dieser Inkubation die flüssige Probe bei verschlossener Öffnung (7) durch Relativbewegung von Kolben (5) und Zylinder (6) aus dem Zylinder (6) durch den Kanal (1) auf die Anströmfläche (3) gerichtet und dabei die Intensität des Fluoreszenzlichtes (11) mit dem optischen Detektor (21) gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass an mindestens einen Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems zusätzlich Biotin (29) gebunden ist, das an einen auf der Oberfläche (27) der Anströmfläche (3) immobilisierten biotinbindenden Komplex (28) gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 32 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Anstieg der Intensität des Fluoreszenzlichtes (11) bestimmt wird.